Summary
Vi beskriver produksjonen av blandede kulturer av astrocytter og oligodendrocyttforløperceller avledet fra føtal eller voksne nevrale stamceller som skiller seg inn i modne oligodendrocytter, og in vitro modellering av skadelige stimuli. Koblingen med en cellebasert screeningteknikk med høyt innhold bygger et pålitelig og robust legemiddelscreeningssystem.
Abstract
Det viktigste hinderet for å utvikle narkotikascreeningsteknikker for å vurdere effekten av terapeutiske strategier i komplekse sykdommer er å finne en balanse mellom in vitro forenkling og gjenskaping av det komplekse in vivo-miljøet, sammen med hovedmålet, delt av alle screeningstrategier, for å oppnå robuste og pålitelige data, svært prediktivt for in vivo-oversettelse.
Innen demyeliniserende sykdommer er flertallet av narkotikascreeningstrategiene basert på udødelighetscellelinjer eller rene kulturer av isolerte primære oligodendrocyttforløperceller (OPCer) fra nyfødte dyr, noe som fører til sterke fordommer på grunn av mangel på aldersrelaterte forskjeller og av enhver reell patologisk tilstand eller kompleksitet.
Her viser vi oppsettet av et in vitro-system som tar sikte på å modellere den fysiologiske differensiering / modning av nevrale stamceller (NSC) -avledede OPCer, lett manipulert for å etterligne patologiske forhold som er typiske for demyeliniserende sykdommer. Videre inkluderer metoden isolasjon fra foster og voksne hjerner, noe som gir et system som dynamisk skiller seg fra OPC til modne oligodendrocytter (OLs) i en spontan samkultur som også inkluderer astrocytter. Denne modellen fysiologisk ligner skjoldbruskhormonmediert myelinering og myelin reparasjonsprosessen, slik at tilsetning av patologiske interferenter hvilke modell sykdomsmekanismer. Vi viser hvordan man etterligner de to hovedkomponentene i demyeliniserende sykdommer (dvs. hypoksi/iskemi og betennelse), gjenskaper deres effekt på utviklingsal myelinering og voksen myelinreparasjon og tar hensyn til alle cellekomponentene i systemet gjennom hele, samtidig som de fokuserer på å differensiere OPCer.
Denne spontane blandede modellen, kombinert med cellebaserte screeningteknologier med høyt innhold, gjør det mulig å utvikle et robust og pålitelig legemiddelscreeningssystem for terapeutiske strategier for å bekjempe de patologiske prosessene som er involvert i demyelinering og å indusere remyelinasjon.
Introduction
I sentralnervesystemet (CNS) er myelindannende celler (oligodendrocytter, OLs) og deres forløpere (oligodendrocyttforløperceller, OPCer) ansvarlige for utviklings myelinasjon, en prosess som oppstår i peri- og postnatalperiodene, og for myelinomsetning og reparasjon (remyelinasjon) i voksen alder1. Disse cellene er svært spesialiserte, samhandler anatomisk og funksjonelt med alle de andre gliale og nevronale komponentene, noe som gjør dem til en grunnleggende del av CNS struktur og funksjon.
Demyelinerende hendelser er involvert i forskjellige CNS-skader og sykdommer2, og virker hovedsakelig på OPCer og OLer ved hjelp av multifaktoriske mekanismer, både under utvikling og voksen alder. De undifferentiated forløperne er drevet av differensieringsfaktorer, hovedsakelig skjoldbruskhormon (TH), i en synkronisert prosess3 som fører opc til å gjenkjenne og svare på spesifikke stimuli som induserer spredning, migrasjon til ikke-myelinert axon og differensiering til modne OLer som igjen utvikler myelinhylsen4. Alle disse prosessene er fint kontrollert og forekommer i et komplekst miljø.
På grunn av den komplekse karakteren av myelinasjon, remyelination og demyelination hendelser, er det et stort behov for en forenklet og pålitelig in vitro-metode for å studere de underliggende mekanismene og utvikle nye terapeutiske strategier, med fokus på den viktigste cellulære spilleren: OPC5.
For at et in vitro-system skal være pålitelig, må det tas hensyn til en rekke faktorer: kompleksiteten i det cellulære miljøet, aldersrelaterte celleintrinsiske forskjeller, fysiologisk TH-mediert differensiering, patologiske mekanismer og robustheten til dataene6. Faktisk er det udekkede behovet i feltet en modell som etterligner kompleksiteten i in vivo-tilstanden, ikke vellykket oppnådd ved bruk av isolerte rene OPC-kulturer. I tillegg involverer de to hovedkomponentene i demyeliniserende hendelser, betennelse og hypoksi/iskemi (HI), direkte andre cellekomponenter som indirekte kan påvirke den fysiologiske differensiering og modning av OPCer, et aspekt som ikke kan studeres i over-forenklede in vitro-modeller.
Fra et svært prediktivt kultursystem er den påfølgende og mer generelle utfordringen produksjon av robuste og pålitelige data. I denne sammenhengen er cellebasert høyinnholdsscreening (HCS) den mest passende teknikken7, siden vårt mål er først å analysere hele kulturen i en automatisk arbeidsflyt, unngå skjevheten ved å velge representative felt, og for det andre å oppnå automatisk og samtidig generering av bildebehandlingsbaserte data med høyt innhold8.
Gitt at hovedbehovet er å oppnå den beste balansen mellom in vitro forenkling og in vivo-mimicking kompleksitet, her presenterer vi en svært reproduserbar metode for å skaffe OPCer avledet fra nevrale stamceller (NSC) isolert fra fosteret forebrain og den voksne sub-ventrikkelsonen (SVZ). Denne in vitro-modellen omfatter hele OPC-differensieringsprosessen, fra multipotent NSC til moden/myeliniserende OL, på en fysiologisk TH-avhengig måte. Den resulterende kulturen er et dynamisk differensierings-/modningssystem som resulterer i en spontan samkultur som hovedsakelig består av differensiering av OPC og astrocytter, med en lav prosentandel nevroner. Denne primærkulturen etterligner bedre det komplekse in vivo-miljøet, mens stamcelleavledningen gjør det mulig å utføre enkle manipulasjoner for å oppnå ønsket cellelinjeberikelse.
Tvert imot andre narkotikascreeningsstrategier ved hjelp av cellelinjer eller rene kulturer av primære OPCer, tillater metoden beskrevet her studiet av effekten av patologiske interferenter eller terapeutiske molekyler i et komplekst miljø, uten å miste fokus på ønsket celletype. Den beskrevne HCS-arbeidsflyten tillater en analyse av celle levedyktighet og avledningsspesifikasjon, samt avlinjespesifikke celledøds- og morfologiske parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller som er beskrevet her, ble utført i henhold til EUs fellesskapsrådsdirektiver (86/609/EEC) og overholder retningslinjene som er publisert i NIH-veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr.
1. Løsninger og reagenser
- Forbered standard medium: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1 % P/S); 1x B27; 1x N-2.
- Forbered neurosphere medium: legg til 10 ng / ml bFGF; 10 ng/ml EGF til standard medium.
- Forbered oligosfære/OPC-medium: tilsett 10 ng/ml bFGF; 10 ng/ml PDGF-AA til standard medium.
- Forbered oligodendroctye differensieringsmedium: tilsett 50 nM T3; 10 ng/ml CNTF; 1x N-acetyl-L-cystein (NAC) til standard medium.
- Forbered ikke-enzymatisk dissosiasjonsbuffer: tilsett 1 % P/S til ikke-enzymatisk dissosiasjonsbuffer og hold isen kald.
- Forbered sukroseløsning: HBSS, 0,3 g/ml sukrose.
- Klargjør BSA vaskeløsning: EBSS, 40 mg/ml BSA, 0,02 ml/l HEPES.
- Forbered enzymatisk dissosiasjonsbuffer: HBSS, 5,4 mg/ml D-glukose, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/ml Trypsin, 0,7 mg/ml Hyaluronidase, 80 U/ml DNase.
- Forbered cytokinblanding: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 og IFN-γ (20 ng/ml hver).
- Klargjør cytokinblandingskjøretøy: 0,04% av lageret (10% glyserol / 100 nM glycin / 25 nM Tris, pH 7,3).
- Forbered oksygenglukosemangelmedium: standard medium ved bruk av DMEM m/o glukose. Avhengig av strengheten til ønsket glukosemangeltilstand, er det mulig å fjerne også B27 og / eller N2 fra mediet for å unngå glukoserelaterte forbindelser (f.eks. D-Galaktose i B27).
2. Disseksjon og NSC-isolasjon
MERK: Fetal og voksen NSC ble isolert fra E13.5 foster forebrain eller 2,5 måneder gammel voksen sub-ventrikkel sone (SVZ), etter Ahlenius og Kokaia protokoll9 med modifikasjoner.
- Fetal NSC kulturer
MERK: Før du starter avhandlingene, klargjør du 1,5 ml rør som inneholder 150 μL ikke-enzymatisk dissosiasjonsbuffer hver; rengjør Petri-retter og tilsett iskald HBSS.- Samle embryoene på E13,5 - 14,5 fra tidsinnstilte gravide mus og legg i en Petri-tallerken som inneholder kald HBSS.
- Decapitate embryoene ved hjelp av tang.
- Legg hodene på embryoene i en ren Petri-tallerken som inneholder iskald PBS og fjern huden fra skallen med tang, ved hjelp av forstørrelsesglass eller et stereoskop.
- Når hjernen er synlig og ryddet av huden, klem den ut ved å påføre trykk på sidene med tang.
- Fjern cerebellum, hold bare forebrain og fjern meningene med tang.
- Plasser det isolerte vevet i den ikke-enzymatiske dissosiasjonsbufferen og gjenta disseksjonstrinnene med de andre embryoene. Sett vevet fra 2–3 dyr inn i hvert rør som inneholder bufferen.
- Inkuber ved 37 °C i 15 minutter under kontinuerlig risting.
- Etter inkubasjon, tilsett 850 μL standard medium og bland ved pipettering til suspensjonen er fri for klumper.
- Hvis ikke-dissosiert vev fortsatt er synlig, vent i 2 min på RT til det avleiringer på bunnen av røret.
- Når dissosiasjonen er fullført, tell cellene og plate dem i suspensjon med en tetthet på 10-50 celler / μL i en T-25 eller T-45 kolbe som inneholder 10-30 ml nevrosfæremedium, holdt i vertikal stilling for å unngå celleadhesjon.
-
Voksne NSC-kulturer
- Ofre dyr ved cervical dislokasjon.
- Samle hjerner fra 4-5 mus i et 50 ml rør som inneholder iskald HBSS.
- Plasser hjernen på en kald steril overflate. Til dette formål, bruk en T-25 kolbe fylt med vann og plassert ved -20 °C over natten. På tidspunktet for eksperimentet, dekk kolben med steril aluminiumsfolie.
- Plasser hjernens ventrale side nedover, i rostro-kaudal retning, og fjern de olfaktoriske pærene ved hjelp av et barberblad.
- Bruk et barberblad, kutt 2-3 koronalskiver med 1 mm tykkelse, fra cortex til optisk chiasma.
- Plasser skivene på den kalde overflaten i en ventro-dorsal posisjon og identifiser corpus callosum og de to laterale ventriklene.
- Bruk forstørrelsesglass eller et stereoskop, isoler veggene i laterale ventrikler, pass på at du ikke bærer biter av corpus callosum.
- Sett det isolerte vevet i den enzymatiske dissosiasjonsbufferen (5-10 ml) og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Bland oppløsningen, pipettering flere ganger (minst 50), og inkuber igjen ved 37 °C i 10 minutter.
- Nøytraliser trypsin ved å legge til 5 ml standard kulturmedium og filtrer løsningen ved hjelp av et 70 μm filter.
- Sentrifuger den filtrerte oppløsningen i 5 min ved 400 x g.
- Resuspend pellet i sukroseoppløsningen og sentrifugen i 10 min ved 500 x g.
- Resuspend pellet i BSA vaskeløsning og sentrifuge i 7 min ved 400 x g.
- Resuspend pellet i standardkulturmediet, telle cellene og utføre plating som beskrevet ovenfor (i trinn 2.1.10).
3. Primære nevrosfærer
- Legg til vekstfaktorene (bFGF/EGF) annenhver dag.
- Hver 4-6 dager (avhengig av celletetthet), endre halvparten av mediet som følger:
- Overfør hele cellefjæringen til et 15 eller 50 ml rør.
- Sentrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Fjern halvparten av volumet.
- Tilsett samme mengde friskt medium, bland forsiktig ved pipettering, og legg til vekstfaktorer.
4. Oligosfærer
MERK: Oligodendrocyttdifferensiering utføres etter Chen-protokollen10 med modifikasjoner.
- Når nevrosfærene når en diameter på 100-150 μm, er de klare til å bli passert. For å gjøre dette, overfør hele cellefjæringen til et 15 eller 50 ml rør, og sentrifuger i 5 min ved 400 x g.
- Vurder raskt diameteren ved å ta bilder av sfærene ved hjelp av et invertert overført lysmikroskop og åpne dem av ImageJ-programvare.
- Klikk Analyser -menyen, og velg Skalalinjei Verktøy -vinduet.
- Angi 150 μm som Bredde i mikron og sammenlign skalalinjen med kulene.
- Fjern hele volumet ved inversjon og resuspend pellet i 180 μL fersk standard kultur medium. Pipette 50 ganger for å tillate opptjening av kulene.
- Tilsett 810 μL fersk standardkulturmedium, tell cellene og re-plate dem som beskrevet for nevrosfærene.
- Tilsett bFGF/PDGF-AA 10 ng/ml annenhver dag.
- Hver 4-6 dager (avhengig av celletetthet), endre halvparten av mediet som følger:
- Overfør hele cellefjæringen til et 15 eller 50 ml rør.
- Sentrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Fjern halvparten av volumet.
- Tilsett samme mengde friskt medium, bland forsiktig ved pipettering, og legg til vekstfaktorer.
5. Platebelegg
- Poly-D,L-ornitin/lamininbelegg: minst 2 dager før du plating OPCene, tilsett 50 μg/ml poly-D,L-ornitinoppløsning, fortynnet i PBS, til hver brønn (40 μL/brønn for 96-brønnsplater) og inkuber ved RT over natten.
- Neste dag, fjern væsken og vask tre ganger med destillert sterilt vann.
- La platene tørke på RT over natten. Neste dag, tilsett en lamininoppløsning fortynnet i PBS (5 μg/ml; 40 μL/brønn for 96-brønnsplater) og inkuber i 2 timer ved 37 °C.
6. Celle såing
- Når oligosfærene når en diameter på 100-150 μm, er de klare til å bli dissosiert og frøet på poly-D, L-ornitin / laminine belagte plater. For å gjøre dette, overfør hele cellefjæringen til et 15 eller 50 ml rør, og sentrifuger i 5 min ved 400 x g (som angitt i trinn 4.1)
- Fjern hele volumet ved inversjon og resuspend pellet i 180 μL fersk standard kultur medium. Pipette 50 ganger for å tillate opptjening av kulene.
- Tilsett 810 μL fersk standardkulturmedium og tell cellene.
- Fjern lamininoppløsningen fra brønnene og plate cellene ved 3000 celle/cm2 tetthet (100 μL/brønn for 96-brønnsplater).
7. OPC differensiering induksjon
- Etter 3 dager, fjern hele mediet og legg til samme volum oligodendrocytt differensieringsmedium.
- Bytt halvparten av mediet hver fjerde dag og tilsett fersk differensieringsblanding (T3/CNTF/NAC) annenhver dag.
8. Induksjon av betennelsesmediert differensieringsblokk
- Etter nevrosfære dissosiasjon og oligosfæreproduksjon (avsnitt 4), legg cytokinblandingen til kulturmediet og hold oligosfærer utsatt for cytokiner for hele sfærenes formasjonstrinn.
MERK: Volumet avhenger av antall celler, siden for sfærene som danner celler er frøet ved 10-50 celler / μL. - Hvis mediet må endres, endrer du hele volumet og legger til cytokinblandingen igjen.
9. Induksjon av oksygen-glukosemangelcelledød
- Ved -1 DIV (2 dager etter cellesåing i flerwellplater), fjern mediet og spar det i en ny multiwell plate.
- Tilsett halvparten av volumet (50 μL for 96-brønnsplater) av OGD-medium (OGD-gruppe) eller friskt medium (kontrollgruppe). Den halve mengden volum brukes til å redusere utvekslingen av oksygen mellom væsken og luften.
- Plasser OGD-gruppekulturene i et lufttett hypoksikammer mettet med 95% N2 og 5% CO2. For å oppnå metning av kammeret, la gassblandingen strømme i 6 min ved 25 l/min før du lukker kammerrørene.
- Inkuber det hypoksiske kammeret i inkubatoren i 3 timer. Kontrollgruppen og platene som inneholder mediet fjernet og konservert i trinn 9.1, bør også stå igjen i inkubatoren.
- Fjern den glukosefrie (OGD-gruppen) eller det nye mediet (kontrollgruppen) og tilsett mediet som er fjernet og bevart i trinn 9.1.
10. Immunocytokjemi
- På ønsket tidspunkt, fest cellene med kald 4% paraformaldehyd i 20 min ved RT.
- Vask to ganger med PBS (10 min inkubasjon for hver vask ved RT).
- Inkuber 1 time ved RT med blokkeringsløsningen (PBS Triton 0,3% inneholder 1% BSA og 1% esel / geit normalt serum).
- Inkuber med primær antistoffblanding (Tabell 1), fortynnet i PBS triton 0,3 %, over natten ved 4 °C.
- Vask to ganger med PBS (10 min inkubasjon for hver vask ved RT).
- Inkuber med sekundært antistoff (Tabell 1) oppløsning fortynnet i PBS triton 0,3% tilsett Hoechst 33258 i 30 min ved 37 °C.
- Vask to ganger med PBS (10 min inkubasjon for hver vask ved RT).
11. HCS-analyse av celle levedyktighet, avledningssammensetning og avledningsspesifikk celledød
MERK: HCS-representative bilder og arbeidsflyt vises i figur 2A,B.
- Velg algoritmen for avdelingsanalyse fra hovedmenyen i programvaren (HCS Studio v 6.6.0) og velg Skann fra hovedmenyen Utvikle analyse/skanneplate.
- Velg Ny i iDev-vinduet, og velg deretter Verktøy for måling av generell intensitet fra malen Utvikle analyse.
- Klikk på Opprett på høyre side av menyen, og velg 10x-målet.
- Dette åpner menyen Konfigurer anskaffelse . I dette vinduet velger du følgende parametere: (a) antall kanaler: den første for Hoechst kjernefysiske flekker (BGRFR_386) og en for hver avstamningsspesifikk markør som brukes i reaksjonen (b) velger programvarefokus på kanal 1 og autofokusintervall som 1 (c) velg platemodellen fra listen.
- Fra oppkjøpsmenyen ser du på kvaliteten på fargingen i forskjellige brønner og forskjellige felt, og manuelt velger du eksponeringstiden ved å velge Fast eksponeringstid i menyen.
- Når anskaffelsesparametrene er angitt, velger du Mini Scan øverst på menyen og velger ti felt per brønn i to brønner per eksperimentell tilstand. Dette gjør det mulig å sette opp alle analyseparameterne i et delsett av felt for hele platen.
- Når miniskanningen er fullført, klikker du på Konfigurer analyseparameter for å konfigurere algoritmen til analysen.
- Klikk på Konfigurer grupper på høyre side av vinduet og dra og slipp brønnene i miniskanneren. Klikk Legg til -knappen i underdelen Grupper for å konfigurere de forskjellige gruppene.
- Følg arbeidsflyten til venstre i vinduet trinn for trinn for å utvikle hele algoritmen. Velg først Prosessbilde for hver kanal og klikk på Bakgrunnsfjerning og på ønsket nivå.
- Først identifisere og velge kjernen ved kjernefysisk farging. Klikk på Identifiser primærobjekt - Kanal 1 for å velge den virkelige kjernen og unngå å analysere artefakt og rusk. Til dette formål, zoom inn et representativt bilde av kjernefysisk farging og sjekk om kjernene er godt omgitt av omkretsen bygget av programvaren. Det er mulig å endre terskelverdien og bruke segmenteringsalgoritmer for bedre å identifisere enkeltkjerner.
- Når kjernene er riktig definert, klikker du på følgende trinn: Valider primært objekt. Velg Object.BorderObject.Ch1 for å unngå analyse av kjerner ved kanten av hvert feltbilde. Velg Object.Area.Ch1, og fjern alle identifiserte rusk eller store objekter som tilsvarer aggregater eller artefakter, ved å flytte de "lave" og "høye" stolpene i histogrammene.
- Sjekk alle mini scan representative bilder av alle eksperimentelle forhold for å være sikker på at de valgte parametrene passer med dem alle.
- Klikk på Identifiser flekker for hver kanal som tilsvarer de spesifikke avstamningsmarkørene, og velg ringeverdiene: Bredde = 3 og Avstand = 0. Dette vil tillate identifisering av cytoplasmatisk fluorescens. I henhold til celletettheten kan disse verdiene tilpasses. Programvaren vil automatisk unngå overlapping mellom tilstøtende ringer.
- Velg Referansenivåer i arbeidsflyten for å bygge analysen. Innstillingen av referansenivåene vil tillate automatisk telling av kondenserte kjerner, basert på kjernefysisk størrelse og kjernefysisk fargingsintensitet, og av spesifikke markørpositive celler, basert på den cytoplasmatiske fluorescensen identifisert av ringen.
- Klikk først på Object.Area.Ch1. I miniskanningsbildene velger du en kondensert kjerne og flytter "LOW"-linjen på histogrammer for å velge som "kondensert" alle kjernene under denne størrelsen.
- Klikk Object.AvgIntensity.Ch1. I miniskanningsbildene velger du en kondensert kjerne og flytter "HIGH"-linjen på histogrammer for å velge som "kondensert" alle kjernene over denne fluorescensintensiteten.
- Klikk på Object.RingAvgIntensity for hver kanal med avledningsspesifikke markører. Velg i miniskanningsbildene en positiv celle og flytt "HIGH" -linjen på histogrammer for å velge som "positiv" alle cellene over denne fluorescensintensiteten.
- Sjekk alle mini scan representative bilder av alle eksperimentelle forhold for å være sikker på at de valgte parametrene passer med dem alle.
- Velg Populasjonskarakterisering på den øverste menyen, og velg Delbefolkning av hendelser.
- Som type 1-hendelse velger du ObjectAreaCh1 i listen til venstre, klikker og > og til slutt velger du ObjectAvgIntensityCh1. Dette vil tillate identifisering av kondenserte kjerner, som en kombinasjon av lavt område og høy intensitet.
- Fjern merket for alle skannegrensene i samme vindu.
- Klikk på Velg funksjoner som skal lagres i toppmenyen, for å velge parametrene du vil beholde i analysen.
- Velg Brønnfunksjoner, og flytt fra listen til venstre bare de ønskede parameterne: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (For hver kanal i de spesifikke avgrensningsmarkørene).
MERK: Denne analysen vil gi som avlesning det totale antallet celler, prosentandelen kondenserte kjerner og prosentandelen av avledningsspesifikke positive celler for hver analyserte markør på det totale cellenummeret. Hvis prosentandelen av de forskjellige avgrensningene bare er nødvendig på aktive celler, er det mulig å enten beholde verdien "High_RingAvgIntensity" for kanalen (absolutt antall positive celler) og beregne prosentandelen på totale celletall på nytt etter subtraksjonen av prosentandelen av døde celler.- Alternativt er det mulig å fjerne dødcellene fra analyseinnstillingen de samme parametrene som brukes til å identifisere kondenserte kjerner (trinn 11.14-11.15) på nukleivalideringen (trinn 11.11).
- Velg Skann plate fra hovedmenyen og klikk på platesymbolet på undermenyen Skanneinnstilling på den øverste delen for å identifisere brønnen som skal analyseres.
- Skriv navnet på eksperimentet og beskrivelsen, og når alle innstillingene er fullført, trykker du på avspillingssymbolet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første fasen av kulturen kan variere i varighet, avhengig av såddtetthet og om sfærene er av foster- eller voksen opprinnelse. Videre viser oligosfærer en redusert befolkningsdobling sammenlignet med nevrosfærer (Figur 1B). Videre er sfærer produksjon fra voksent vev langsommere, og det kan ta 2-3 uker å generere oligosfærer sammenlignet med foster som kan ta 1-2 uker, avhengig av såddtettheten.
Når de er sådd, kan hele differensieringsfasen av kulturene overvåkes ved hjelp av avledningsspesifikke antistoffer. Siden målet med denne protokollen er å studere den endelige fasen av differensiering, presenteres ikke kultursammensetningen ved 0 DIVer. Men i den første kulturfasen vil cellene fortsatt være nestinpositive, som representerer nevrale forløpere, og de fleste celler er også NG2-positive (OPCer)11. CNPase-positive celler, som tilsvarer preOL-fasen, vil være påvisbare 3-6 dager etter T3-mediert differensieringsinduksjon, mens MBP-positive celler vil vises mellom 6 og 12 DIVer (modne OLs; se figur 2C for kultursammensetningen på slutten av differensieringsfasen).
HCS-analysen gjør det mulig å oppdage hver enkelt celle i kulturen gjennom kjernefysisk farging og analyse av fluorescensintensiteten i de resterende kanalene (Figur 2A,B). Sammensetningen av kulturen på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer) varierer avhengig av om kulturene er av foster- eller voksen opprinnelse, med fosterkulturer som er mer lydhøre for T3-mediert differensiering og når en høyere prosentandel av modne OLs12.
Gjennom hele kulturprosessen er rundt 40% -50% av cellene astrocytter (GFAP-positive celler), mens en liten prosentandel (mindre enn 0% -10%) er nevroner (beta-III-tubulin-positive celler; Figur 2C). Kultursammensetningen kan variere fra 10% mellom ulike kulturforberedelser. Voksen- og fosterkulturer varierer for utbyttet av moden OLs-produksjon på slutten av differensieringsfasen, med fosterceller som viser høy prosentandel av modne OLer, lav prosentandel av forløpere og rundt 30% -40% av astrocytter. På den annen side presenterer voksne kulturer flere astrocytter (rundt 45% -55%) og mindre differensierte celler etter 12 DIVer differensieringsinduksjon.
For å la programvaren gjenkjenne cellene og gi en riktig objektiv analyse av kultursammensetningen, er det viktig at såddtettheten er riktig, og unngår overlapping mellom tilstøtende celler. Når NSC-avledede OPCer er sådd med høy tetthet, har de en tendens til å aggregere veldig raskt, noe som fører til at hele overflaten av brønnen blir okkupert av astrocytter etter noen dager. Videre vil modne OLer med sin karakteristiske edderkoppnettform ikke være synlige på grunn av det begrensede rommet (Figur 3A, B).
Den betennelsesmedierte differensieringsblokken er reproduserbar av denne in vitro-analysen og genererer en sterk reduksjon i preOLer og modne OLer oppdaget av CNPase og MBP-farging i både foster- og voksenkulturer. En økning i antall OPCer forekommer også i voksne kulturer (Figur 4A,B). Cytokinblandingssammensetningen ble valgt fra in vivo-eksperimenter i en rottemodell av multippel sklerose13, og ble testet som en in vitro-modell for den betennelsesmediert differensieringsblokken som forekommer i denne sykdommen.
Mens fetal og voksen OPC viser samme sårbarhet for inflammatorisk cytokineksponering, er bare fosteravledede kulturer følsomme for OGD-toksisitet (Figur 5A, B), som viser en økning i celledød og differensieringshemming på grunn av deres forskjellige metabolske profil14.
Figur 1: Neural stamcelle-avledet oligodendrocytt forløper cellekultur oppsett og differensieringsprotokoll. (A) Ordningen med den eksperimentelle prosedyren. (B) Representative bilder av nevrosfærer ved 2, 5 og 7 DIVer, og graf som viser populasjonens dobling av nevrosfærer og oligosfærer. Skalalinje: 100 μm. (C) Representative bilder av frøet oligosphere-avledede OPCer som viser de forskjellige stadiene av differensiering, fra nestin- og NG2-positive celler ved 0 DIV (nevral forløper / OPCer), gjennom CNPase-positive celler ved 6 DIVer (preOLer) og CNPase / MBP doble positive celler på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer; GFAP-positive celler (astrocytter) og en liten prosentandel av beta-III-tubulin positive celler (nevroner) er til stede gjennom hele kulturen. Skalastenger: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cellebaserte arbeidsflyter for screening av høyt innhold og forventet differensieringsavlesning. (A) Representative bilder av HCS oppkjøp av en hel brønn (96-brønns plate) og et isolert enkeltfelt ervervet med et 10x mål om en 12 DIVs kultur av NSC-avledede OPCer. (B) Arbeidsflyttrinn for HCS-analyse, inkludert visualisering, identifisering og konstruksjon av nuklearing for å identifisere cytoplasmatisk farging og markøridentifikasjon. (C) Graf som viser forventet kultursammensetning på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer). Markører for OPCer (PDGFαR, NG2), preOLer (CNPase, APC), modne OLer (MBP), astrocytter (GFAP) og nevroner (β-III-tubulin) vises for både foster- og voksen-avledede kulturer. Avrundede prosenter for hver cellemarkør er inkludert i diagrammet, vær oppmerksom på at dette er et representativt eksperiment, og prosenter kan være forskjellige omtrent 5%-10%. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt screeningbilde av høy innhold av en kultur med høy tetthet. (A) Representativt bilde av et brønnbilde (96-brønnsplate) ervervet med 10x objektivt og merket for MBP-uttrykk på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer). (B) Representativt trukket ut feltbilde som uthever tilstedeværelsen av aggregerte celler og overlappende kjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forventet effekt av cytokinbehandling på foster- og voksenavledede OPC-kulturer. (A) Graf som viser prosentandelen av variasjon av føtal- og voksen-avledede OPC-kulturer sammenlignet med standardkulturer, inkludert kvantifisering av OPCer (NG2), preOLer (CNPase) og modne OLer (MBP) på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer). (B) Representative bilder av voksne kulturer på slutten av differensieringsfasen (12 DIVer) behandlet med kjøretøy eller cytokinblanding og merket for NG2 eller CNPase /MBP. Skalalinje: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Forventet effekt av OGD-eksponering på fosteravledede OPC-kulturer. (A) Graf som viser prosentandelen kondenserte kjerner kvantifisert av cellebaserte HCS i kontroll (ctrl) og OGD-eksponerte kulturer. (B) Representative bilder av HCS-bearbeidede objekter som fremhever de identifiserte kondenserte kjernene (hvite piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff | Art | Fortynning | |
| anti-β-III-tubulin (FoU-system) | mus | 1:3000 | |
| anti-GFAP (Dako) | kanin | 1:1000 | |
| anti-NG2 (millipore) | kanin | 1:350 | |
| anti-PDGFαR (Santa Cruz bioteknologi) | kanin | 1:300 | |
| anti-CNPase (Millipore) | mus | 1:500 | |
| IgG2b anti-APC, klone CC1 (Calbiochem) | mus | 1:100 | |
| Anti-MBP (Dako) | kanin | 1:250 | |
| Anti-nestin (Millipore) | mus | 1:500 | |
| Alexa Fluor 488-konjugert antimus (ThermoFisher Scientific) | esel | 1:500 | |
| Alexa Fluor 647-konjugert antimus IgG2b (ThermoFisher Scientific) | geit | 1:500 | |
| Alexa 568-konjugert antikanin (ThermoFisher Scientific) | esel | 1:500 | |
Tabell 1: Liste over primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den komplekse karakteren av myelinasjons-/remyelinasjonsprosesser og demyelinerende hendelser gjør utviklingen av prediktive in vitro-systemer ekstremt utfordrende. De mest brukte in vitro narkotika screening systemer er for det meste menneskelige cellelinjer eller primære rene OL-kulturer, med økende bruk av mer komplekse co-kulturer eller organotypiske systemer15. Selv om slike systemer er kombinert med høyinnholdsteknologier, forblir rene OL-kulturer den valgte metoden når du utvikler screeningplattformer16.
Den spontane blandede kulturen som er beskrevet her representerer et nyttig in vitro-system, som tar hensyn til alle hovedvariablene: fysiologisk T3-mediert OPC-differensiering, patologiske interferenter med prosessen, andre cellulære komponenter og aldersrelaterte forskjeller. Prosedyren inneholder en rekke variabler som stammer fra opprinnelsen til cellene (dyrets alder) og sfæroidenes dannelse og manipulasjon. Faktisk er et kritisk trinn celletettheten til NSC-såing etter isolasjonen fra vevet, fordi i optimal tilstand bør en enkelt sfære komme fra en enkelt spredningscelle. Siden vi har sett at isolerte NSC-er har en tendens til å aggregere og at de trenger sine egne utskilte parakrinefaktorer, er såing dem i en rekkevidde på 10-50 celler / μL, i en t25 eller t75 kolbe, det beste kompromisset for å unngå celleaggregering, men likevel tillate celler å kommunisere ved å utskille faktorer.
De viktigste begrensningene i teknikken er mangelen på en funksjonell axonal myelinasjon og en direkte interaksjon med nevroner, siden metoden bare tar hensyn til OPC-differensiering til scenen med modne OLer: CNPase / MBP-doble positive celler med en edderkoppnettmorfologi. Til dette formål er primære OPCer dyrket på isolert dorsal rot ganglia fortsatthovedmetodikken 17. Imidlertid er muligheten til å skille disse cellene fra dyr i alle aldre et grunnleggende punkt i oversettelsesprosessen, siden det tillater test av forbindelser og skadelige stimuli på celler isolert fra interessealderen. Som beskrevet her, kan faktisk NSC isoleres fra både fosteret og den voksne hjernen. Siden utviklingsmessig myelinasjon og remyelinasjon i voksen alder deler det samme målet, det vil si å nå naken axon og skape myelinhylsen, ble det opprinnelig hypoteset at de to prosessene var identiske i alle aspekter, og genererte den såkalte recapitulation hypotesen18. Det er imidlertid nå klart at de to prosessene ikke kan betraktes som like, og at celle-iboende aldersrelaterte forskjeller er til stede og bør tas i betraktning når du velger den mest passende in vitro-modellen for det eksperimentelle spørsmålet19. Adult NSCs-avledede OPCer viser faktisk sterke forskjeller i fysiologisk TH-drevet differensiering og sårbarhet for skadelige stimuli14,20 samt primære OPCer21,22. Det er også heterogenitet av OPCs og OLs befolkning i voksenvev, spesielt relevant for patologiske forhold23. Protokoller for primær OPCs isolasjon fra voksenvev er tilgjengelig24 og bør vurderes når det eksperimentelle spørsmålet er adressert til molekyler som virker på remyelination i voksen alder.
Differensiering av OPCer fra NSC tillater in vitro-representasjon av hele differensieringsprosessen, fra uavklart forløper til moden OL. Denne prosessen ligner in vivo-tilstanden, hvor TH er hoveddriveren for prosessen, som virker gjennom spesifikke nukleære reseptorer, og det tillater eksperimentell interferens med denne mekanismen for å etterligne patologiske forhold i en oversettelsesvisning13.
Den endelige grunnleggende egenskapen til modellen er den konstante tilstedeværelsen av astrocytter gjennom hele kulturen. Selv om dette gjør kulturen vanskeligere å analysere, utgjør den komplekse cellesammensetningen en klar fordel. Måten astrocytter bidrar til responsen på skadelige hendelser i blandede nevronkulturer25 er allment kjent, og fraværet av denne hovedkomponenten i CNS gjør in vitro-systemet dårlig forutsigbart og oversettbart. På den annen side, for denne egenskapen, har NSC-avledede kulturer ulempen med å være mindre ensartede enn encellede type systemer, og dette kan føre til en partisk analyse. Den cellebaserte HCS-teknikken tillater imidlertid en analyse av hele kulturen og av alle cellepopulasjonene, og fjerner også randomisering av representative felt for analyse. Forutsatt at cellekulturen som brukes til eksperimentet er av pålitelig såingskvalitet, vil HCS gi et fullstendig bilde av de eksperimentelle forholdene, generere statistisk robuste data og en rekke automatiske fluorescensbaserte analyser.
Avslutningsvis beskriver dagens protokoll prosedyren for isolering og differensiering av NSC-avledede OPCer fra foster- og voksenhjerne. Hele protokollen tar rundt 30 dager, avhengig av dyrenes alder og de eksperimentelle målene. Spesielt kan sfærdannelse fra voksen opprinnelse ta dobbelt tid sammenlignet med fosteret, med samme såddtetthet. Tiden på 15 dager (fra -3 til 12 DIVer) etter sådd på 2D-overflate for differensieringsinduksjon er imidlertid en fast tid under alle forhold. Den fullstendige protokollen tillater studiet av hele TH-medierte differensieringsprosessen i et komplekst cellulært miljø, interferens gjennom spesifikke patologiske mekanismer (dvs. inflammatoriske cytokiner og HI) og den påfølgende testingen av nye strategier for å overvinne disse problemene. Koblingen av kulturmodellen med HCS-teknikken genererer en robust og overførbar screeningplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Støttes av MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744) og Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Spesiell takk til IRET Foundation for å være vert for det eksperimentelle arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates - untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R.
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A.
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H.
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
