Summary
Chronische Pankreatitis (CP) ist eine Krankheit, die durch Entzündungen und Fibrose der Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist, die oft mit hartnäckigen Bauchschmerzen verbunden sind. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verfeinerung der Technik, um ein Mausmodell von CP durch Gallengangsinfusion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) zu erzeugen.
Abstract
Chronische Pankreatitis (CP) ist eine komplexe Erkrankung mit Pankreasentzündung und Fibrose, Drüsenatrophie, Bauchschmerzen und anderen Symptomen. Mehrere Nagetiermodelle wurden entwickelt, um CP zu untersuchen, von denen das Gallengang 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) Infusionsmodell die Merkmale neuropathischer Schmerzen bei CP repliziert. Die Infusion von Gallengangsmedikamenten bei Mäusen ist jedoch technisch anspruchsvoll. Dieses Protokoll demonstriert das Verfahren der Gallengangs-TNBS-Infusion zur Erzeugung eines CP-Mausmodells. TNBS wurde durch die Ampulle von Vater im Zwölffingerdarm in die Bauchspeicheldrüse infundiert. Dieses Protokoll optimierte das Arzneimittelvolumen, die chirurgischen Techniken und die Handhabung während des Eingriffs. TNBS-behandelte Mäuse zeigten Merkmale von CP, die sich in Gewichtsreduktionen des Körpergewichts und der Bauchspeicheldrüse, Veränderungen des schmerzbedingten Verhaltens und einer abnormalen Pankreasmorphologie widerspiegeln. Mit diesen Verbesserungen war die Mortalität im Zusammenhang mit der TNBS-Injektion minimal. Dieses Verfahren ist nicht nur entscheidend für die Erstellung von Pankreaserkrankungsmodellen, sondern auch für die lokale Verabreichung von Pankreasmedikamenten.
Introduction
Chronische Pankreatitis (CP) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch Atrophie der Bauchspeicheldrüse, Fibrose, Bauchschmerzen und eventuellen Verlust exokriner und endokriner Funktionen gekennzeichnet ist1. Aktuelle medizinische und chirurgische Behandlungen sind nicht heilend, sondern werden durchgeführt, um Symptome zu lindern, die die Folge der Krankheit sind: refraktäre Bauchschmerzen, endokrine und exokrine Dysfunktion. Daher sind wirksamere Behandlungen dringend erforderlich2. Tiermodelle sind ein wesentliches Werkzeug, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu entwickeln und potenzielle Therapeutika zu untersuchen3. Es wurden mehrere Mausmodelle für CP entwickelt, von denen Cerulein- und/ oder Alkoholmodelle häufig verwendet werden. Cerulein, ein Oligopeptid, das die Pankreassekretion stimuliert, hat gezeigt, dass es ein CP-Modell mit Pankreasatrophie, Fibrose und anderen reproduzierbar induziert4. Ein anderes gängiges Modell verwendet serielle Injektionen von L-Arginin, das eine exokrine Insuffizienz erzeugt, die der bei menschlichen Patienten beobachtetenähnelt 5. CP kann auch durch vollständige oder partielle Pankreasgangligatur sowie Pankreasganghypertonie6,7induziert werden. Trotz der Vielfalt der für CP verfügbaren Tiermodelle reproduziert keines dieser Modelle effektiv die Bauchschmerzen von CP-Patienten8.
Frühere Studien zeigten, dass die lokale Pankreasinjektion von 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) die anhaltenden Schmerzen von CP-Patienten repliziert9,10,11. TNBS-behandelte Mäuse zeigten abdominale Überempfindlichkeit und erhöhtes schmerzbedingtes Verhalten sowie eine "generalisierte Überempfindlichkeit" gegen schmerzhafte Reize, ein Phänomen, das bei CP-Patienten beobachtet wurde10. Neben der genauen Nachahmung von CP-Schmerzen repliziert das TNBS-Modell auch andere pathologische Merkmale des menschlichen Zustands wie Fibrose, mononukleäre Zellinfiltration und Ersatz von Acinarzellen durch Fettgewebe10,12. Die TNBS-Infusion über den Gallengang ist jedoch ein technisch anspruchsvolles Verfahren bei Mäusen, das zum Tod führen kann. Unseres Wissens gibt es kein visuelles Protokoll, um zu zeigen, wie die Gallengangsinfusion durchgeführt wird. In diesem Artikel demonstrieren wir das Verfahren der Gallenabduktion von TNBS zur Erzeugung eines CP-Mausmodells. Dieses Verfahren wird dazu beitragen, wertvolle Tiermodelle für die Untersuchung von CP und anderen Pankreaserkrankungen zu generieren und kann verwendet werden, um andere Materialien (z. B. Virus, Zellen) in die Bauchspeicheldrüse einzuschmeißen13.
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Protocol
Alle Verfahren wurden mit Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees an der Medical University of South Carolina und dem Ralph H. Johnson Medical Center durchgeführt. C57BL/6J männliche Mäuse im Alter von 8-10 Wochen wurden in dieser Studie verwendet. Mäuse wurden unter einem Standard-12-Licht- / 12-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Herstellung von TNBS-Injektionslösung
- Bereiten Sie 10% Ethanol in 0,9% Kochsalzlösung vor. TNBS -Stamm (siehe Materialtabelle)in 10% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 7,5 mM auflösen, indem 7,5 μL TNBS in 1 ml 10% Ethanol zugefüllt werden.
ACHTUNG: TNBS stellt eine chemische Gefahr dar. Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug vor und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel, um direkten Kontakt mit TNBS zu vermeiden. - Laden Sie 50 μL 0,75% TNBS-Lösung mit einer 31-Gauge-Nadel in eine Insulinspritze. Laden Sie 50 μL 10% Ethanol in Kochsalzlösung in eine Spritze der gleichen Größe wie die Fahrzeugsteuerung. Legen Sie die Spritzen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht, bis sie benötigt werden.
2. Mausvorbereitung und Operation
- Rasieren Sie die Haare aus dem abdominalen Operationsbereich.
- Injizieren Sie vor der Operation eine präventive Dosis des Analgetikums (z. B. Buprenorphin 0,1 mg/kg i.p.).
- Induzieren und erhalten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Betäubung, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf einen Mangel an Reflex beobachten.
- Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes Operationspad. Tragen Sie tierärztliche Salbe auf jedes Auge auf, wenn die Maus unter Betäubung steht.
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie den Operationsbereich 3x mit 2% Jod abwischen, gefolgt von 70% Alkohol (Materialtabelle).
- Führen Sie eine Laparotomie mit einer Mikroschere durch, um einen Schnitt von 0,5-1 cm zu erzeugen.
- Legen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig frei und lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang mit Wattestäbchen (Materialtabelle).
- Legen Sie einen geraden Mikro-Hämoclip ( Materialtabelle ) über den proximalengemeinsamenKanal, um den Fluss von TNBS oder Vehikellösungen in die Leber und die Gallenblase zu verhindern (Abbildung 1A, B).
- Legen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig frei und führen Sie die Nadel durch die Papille von Vater in den Pankreasgang ein.
- Sobald sich die Nadel im Kanal befindet, legen Sie einen gekrümmten Mikro-Hämoclip (Materialtabelle) über den Zwölffingerdarm, der die Nadel umgibt (Abbildung 1A), um die Nadel an Ort und Stelle zu sichern und zu verhindern, dass die injizierte Lösung in den Zwölffingerdarm gelangt.
- Die Lösung (TNBS oder Vehikel) wird im Laufe von einer Minute schrittweise in den Pankreasgang einfließen.
HINWEIS: TNBS muss langsam über eine Minute infundiert werden, und es ist einfach, die Infusionsgeschwindigkeit zu kontrollieren, wenn die Bauchspeicheldrüse mit einer Insulinspritze mit einer 5/16 Zoll und 31G Nadel perfundiert wird. Halten Sie die Hand so stabil wie möglich, um ein Stechen des Gallengangs zu vermeiden. Wenn TNBS erfolgreich injiziert wird, kann gelbe Farbe in der Bauchspeicheldrüse sichtbar sein. - Entfernen Sie nach der Infusion vorsichtig die Mikroklemme in der Nähe der Leber und entfernen Sie dann die Mikroklemme, die die Nadel und den Zwölffingerdarm hält.
- Bringen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig in seine ursprüngliche Position zurück.
- Lassen Sie 0,5 ml warme sterile Kochsalzlösung (36-37 ° C) vor dem Verschluss in der Bauchhöhle, um dem Zwölffingerdarm zu helfen, in seine ursprüngliche Position zurückzukehren und die Wiederherstellung der Peristaltik zu unterstützen.
- Schließen Sie den Schnitt in der Muskelschicht mit einer kontinuierlichen Naht mit einem 5-0-Stich. Schließen Sie die Haut mit unterbrochener Naht mit einem 4-0-Stich.
- Stellen Sie den Käfig mit Mäusen auf ein Heizkissen, um die Genesung von der Anästhesie zu ermöglichen.
- Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse warm und zu spontanen Bewegungen fähig sind, bevor Sie sie in den Haltungsraum zurückbringen.
- Stellen Sie weiterhin alle 12 Stunden ein Analgetikum (z. B. Buprenorphin 0,1 mg / kg i.p.) und 48 Stunden nach der Operation zusätzliche Wärme zur Verfügung.
3. Überwachung des Mausverhaltens
- Entfernen Sie die Nähte am Tag 7 nach der Operation.
- Überwachen Sie die Gesundheit und das Verhalten der Maus täglich in der ersten Woche nach der Operation. Achten Sie auf Anzeichen von Stress wie Vokalisieren, gebückte Rückenhaltung oder reduzierte Fortbewegung. Messen Sie das Körpergewicht jeden zweiten Tag.
- Verwenden Sie Von Frey Monofilamente (VFFs), um die abdominale mechanische Überempfindlichkeit vor und 2, 3 Wochen nach der Operation wie beschrieben zu messen9,14.
- Tragen Sie VFFs verschiedener aufgebrachter Kräfte in aufsteigender Reihenfolge 10x alle 1-2 s auf den oberen Bauchbereich auf. Betrachten Sie das Anheben, Zurückziehen oder Lecken des Bauches (Entzugsreaktion) als positive Reaktion.
- Wenden Sie einen stärkeren Reiz an, wenn keine positive Reaktion beobachtet wird, und einen schwächeren Reiz, wenn eine positive Reaktion beobachtet wird. Die Entzugsschwelle ist die Kraft, mit der die Maus 50% der Zeit reagiert.
4. Sammlung und histologische Analyse von Pankreasgewebe
- Opfern Sie die Mäuse unter Anästhesie durch zervikale Dislokation und sezieren Sie vorsichtig die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und anderen Organen.
- Fixieren Sie die Bauchspeicheldrüse 24 Stunden lang in 10% Paraformaldehyd, betten Sie sie in Paraffin ein, schneiden Sie Gewebeabschnitte von 5 μm Dicke und legen Sie sie zur Färbung auf Glasobjektträger.
- Führen Sie Hämatoxylin-Eosin und Massons Trichromfärbung mit Standardmethoden durch, wie zuvor berichtet4.
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Representative Results
Die Gallengangsinfusionsverfahren wurden optimiert, um die mit diesem Verfahren verbundene Maussterblichkeit zu reduzieren10. TNBS wurde zunächst in einem Gesamtvolumen von 35 μL oder 50 μL verabreicht. Die Injektion von TNBS in einem Volumen von 50 μL könnte die gesamte Bauchspeicheldrüse erreichen und einen homogeneren Krankheitsphänotyp induzieren (Abbildung 1B). Darüber hinaus könnte die Injektion von TNBS mit einer Insulinspritze mit 31G-Nadel die Infusionsgeschwindigkeit im Vergleich zu normalen Spritzen und Nadelgrößen besser kontrollieren. Frisch zubereitetes TNBS, das auf Eis gelagert und innerhalb einer Stunde nach der Arzneimittelzubereitung verwendet wurde, lieferte auch ein besseres Ergebnis im Vergleich zu TNBS, das länger als eine Stunde zubereitet wurde. Mit diesen Verbesserungen wurde die Sterblichkeit der Empfänger kontrolliert und blieb unter 10%.
Mäuse in der Kontrollgruppe verloren in den ersten 3 Tagen nach der Operation etwa 6% ihres ursprünglichen Körpergewichts und erholten sich dann allmählich (104,6% des ursprünglichen Körpergewichts am Tag 21) (Abbildung 1C). Im Gegensatz dazu verloren Mäuse, die TNBS erhielten, in den ersten 5 Tagen durchschnittlich etwa 15% ihres ursprünglichen Körpergewichts und nahmen danach wieder an Gewicht zu (99,8% des ursprünglichen Körpergewichts am Tag 21) (Abbildung 1C). Darüber hinaus zeigten TNBS-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen 2 und 3 Wochen nach der TNBS-Injektion eine erhöhte abdominale mechanische Überempfindlichkeit(Abbildung 1D),die wahrscheinlich mit erhöhten Bauchschmerzen verbunden war10.
Um zu bestätigen, dass die Gallengangs-TNBS-Infusion effektiv Pankreasveränderungen induzierte, die die menschliche CP nachahmen, sammelten wir 3 Wochen nach der Operation Pankreasgewebe von TNBS oder fahrzeugbehandelten Kontrollmäusen. Sowohl die Größe als auch das Gewicht pro Körpergewicht der Bauchspeicheldrüse waren bei TNBS-Mäusen im Vergleich zu Den Kontrollen signifikant reduziert (Abbildung 2A, B), was auf eine ausgeprägte Pankreasatrophie hindeutet, die mit den Befunden bei Menschen mit schwerer und langfristiger CP übereinstimmt. Darüber hinaus erschien die Bauchspeicheldrüse der Kontrollmäuse ohne offensichtliche morphologische Veränderungen normal, während TNBS-Mäuse eine Vakuolisierung mit massivem Verlust von Azinarzellen zeigten, die durch Fettzellinfiltration und Fibrose ersetzt wurden (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse stimmten mit Berichten aus anderen Studien überein9,10.
Abbildung 1: TNBS-Gallengangsinfusion zur Erzeugung von CP-Mäusen. (A) Abbildung der Gallengangsinjektion. (B) Gallengang nach Injektion von 50 μL Tinte. (C) Durchschnittswerte der Körpergewichtsveränderung bei Mäusen, die TNBS oder Vehikel erhalten. (D) Abdominale Ansprechschwelle bei TNBS und Kontrollmäusen 3 Wochen nach der Infusion. Die Daten wurden mit verfügbarer Analysesoftware (z.B. GraphPad 8.2.1) analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem t-Test des Schülers analysiert, ** p < 0,01 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Charakterisierung von CP bei TNBS-behandelten Mäusen. (A) Mikroaufnahmen der Bauchspeicheldrüse von Kontroll- (CTR) und TNBS-Mäusen. (B) Das durchschnittliche Gewicht der Bauchspeicheldrüse geteilt durch das Körpergewicht der Maus bei CTR- und TNBS-Mäusen. (C) Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Pankreasabschnitten von CTR- und TNBS-Mäusen. Maßstabsleiste =100 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. **, p < 0,01 durch student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Gallengangsinfusion von TNBS zur Induktion einer chronischen Pankreatitis ist bei Mäusen technisch anspruchsvoll, da bis zu 22,5% der Mäuse innerhalb von 3-4 Tagen nach der Medikamenteninfusion sterben können10. Hier verfeinerte dieser Bericht das Verfahren auf der Grundlage früherer Studien und reduzierte die frühe Maussterblichkeit auf <10%. Zum Beispiel kann das erhöhte Arzneimittelvolumen (von 35 μL auf 50μL) sicherstellen, dass die Medikamente die gesamte Bauchspeicheldrüse erreichen. Die Verwendung einer Insulinspritze und einer kleineren Nadelgröße (31G) reduziert mögliche Schäden am Pankreasgang und das Austreten von Galle in die Gallenblase oder den Bauch, was höchstwahrscheinlich innerhalb der ersten Tage nach der Operation zum Tod der Maus führen würde. Das Klemmen beider Enden des Gallengangs kann verhindern, dass TNBS in die Gallenblase und den Darm austritt, was zur Mortalität führen kann. Die Hämo-Clips halten TNBS in der injizierten Bauchspeicheldrüse zurück, verbessern die Wirksamkeit und reduzieren gleichzeitig Schäden an anderen Geweben. Darüber hinaus ist TNBS bei Temperaturen über 0 °C nicht stabil. Daher erzielte die CP-Induktion durch die Verwendung von frisch zubereitetem TNBS stabile Ergebnisse.
Dieses Protokoll induziert effektiv CP bei männlichen C57BL / 6J-Mäusen im Alter von 8-12 Wochen und generiert ein Modell, das die Hauptsymptome der chronischen Pankreatitis nachahmt, einschließlich Körpergewichtsverlust, Pankreasatrophie, Fibrose und wahrscheinlich Bauchschmerzen. Im Vergleich zu anderen CP-Mausmodellen wird das TNBS-Modell häufig verwendet, um analgetische Wirkungen zusätzlich zu Entzündungen zu bewerten10,15,16. Der andere Vorteil des TNBS-Modells besteht darin, dass das Medikament direkt in die Bauchspeicheldrüse injiziert wird, was Schäden an anderen Organen reduziert, die die Studie stören können17. Dieses TNBS CP Mausmodell kann verwendet werden, um Pathogenese sowie Behandlungsmöglichkeiten zusammen mit anderen chronischen Pankreatitis-Modellen zu untersuchen.
Eine Einschränkung dieser Studie ist, dass nur Mäuse im Alter zwischen 8-10 Wochen verwendet wurden. Da Mäuse in unterschiedlichem Alter unterschiedliche Pankreasgrößen haben können, die folglich die TNBS-CP-Entwicklung beeinflussen. Daher muss getestet werden, ob Mäuse in unterschiedlichem Alter / Größe eine andere Dosis TNBS erhalten sollten. Dennoch zeigt diese Studie die Verfahren zur erfolgreichen Durchführung einer Pankreasganginfusion, die bei Studien mit Schwerpunkt auf Pankreaserkrankungen helfen kann.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) unterstützt, und das National Institute of Health gewährt HW # 1R01DK105183, DK120394 und DK118529. Wir danken Dr. Hongju Wu für den Austausch technischer Erfahrungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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