Summary
Denne arbejdsgang kan bruges til at udføre antibiotika modtagelighed test ved hjælp af en etableret ex vivo model af bakteriel biofilm i lungerne hos personer med cystisk fibrose. Anvendelsen af denne model kan øge den kliniske validitet af MBEC -assays (minimal koncentration af biofilmudryddelse).
Abstract
Den effektive recept på antibiotika til bakterielle biofilm, der findes i lungerne hos personer med cystisk fibrose (CF), er begrænset af en dårlig sammenhæng mellem resultaterne af antibiotikafølsomhedstest (AST) ved hjælp af standarddiagnostiske metoder (f.eks. bouillonmikrodilution, diskspredning eller Etest) og kliniske resultater efter antibiotikabehandling. Forsøg på at forbedre AST ved brug af off-the-shelf biofilm vækstplatforme viser ringe forbedring i resultaterne. Den begrænsede evne til in vitro biofilm systemer til at efterligne den fysisk-kemiske miljø CF lunge og derfor bakteriel fysiologi og biofilm arkitektur, fungerer også som en bremse på opdagelsen af nye behandlinger for CF-infektion. Her præsenterer vi en protokol til at udføre AST af CF patogener dyrket som modne, in vivo-lignende biofilm i en ex vivo CF lunge model bestående af svin bronchiolar væv og syntetisk CF sputum (ex vivo svin lunge, EVPL).
Der findes flere in vitro-assays til biofilmfølsomhedstest, der enten anvender standardlaboratoriemedium eller forskellige formuleringer af syntetisk CF-spyt i mikrotiterplader. Både vækstmedium og biofilmsubstrat (polystyrenplade vs. bronchiolarvæv) vil sandsynligvis påvirke biofilmens antibiotikatolerance. Vi udviser øget tolerance over for kliniske Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus isolater i ex vivo-modellen; virkningerne af antibiotikabehandling af biofilm er ikke korreleret med den minimale hæmmende koncentration (MIC) i standardanalyser af mikrodilution eller en følsom/resistent klassificering i diskforståelsesanalyser.
Ex vivo-platformen kunne bruges til skræddersyet biofilm AST af patientprøver og som en forbedret testplatform for potentielle antibiofilmmidler under farmaceutisk forskning og udvikling. Forbedring af recept eller acceleration af antibiofilm lægemiddel opdagelse ved hjælp af mere in vivo-lignende testplatforme kunne drastisk forbedre sundhedsmæssige resultater for personer med CF, samt reducere omkostningerne ved klinisk behandling og opdagelse forskning.
Introduction
Kroniske biofilminfektioner påvirker personer, hvis normale immunforsvar er kompromitteret. Risikogrupper omfatter personer med den genetiske tilstand cystisk fibrose (CF)1. Kolonisering af det unormalt tykke, klæbende slim i luftvejene i tidlig barndom fører til vanskelige biofilminfektioner i bronchiolerne2,3. Væksten af bakterier som omfattende matrix-indkapslede biofilm er en faktor, der adskiller kroniske infektioner hos immunkompromitterede mennesker fra akutte infektioner hos raske værter, og biofilmtilstanden beskytter begge bakterier mod antibiotikaeksponering (på grund af reduceret diffusion gennem matrixen) og reducerer deres antibiotikafølsomhed (f.eks. gennem induktion af quiescence eller opregulering af effluxpumper)4,5. Sygdomsspecifikke ændringer i værtsvævsfysiologi og kemi ændrer imidlertid yderligere bakteriel fysiologi fra den, der observeres i akutte infektioner eller i standardlaboratorievækstforhold. Nøgleeksempler i CF omfatter brugen af usædvanlige kulstofkilder, såsom fedtsyrer og aminosyrer frigivet fra lungeaktivt overfladeaktivt middel og produceret ved mikrobiel nedbrydning af mucin, frigivelse af mikronæringsstoffer, såsom jern fra beskadiget væv, og mikroaerobiose6,7,8.
De specifikke fysiskkemiske tilstande i en bestemt biofilminfektionssammenhæng kan derfor påvirke reaktionerne på antibiotika. For det første afhænger strukturen og dybden af den ekstracellulære matrix af lokale miljøforhold, såsom næringsstoffer eller forskydningskræfter. For det andet kan miljømæssige signaler udløse udtryk for specifikke antibiotikaresistens gener. For eksempel viser CF-patogenet Pseudomonas aeruginosa øget udtryk for en beta-lactamase og reduceret ekspression af poriner i CF-sputum versus in vitro9, mens en anden CF-patogen, Burkholderia cenocepacia, upregulates beta-lactamases og efflux pumper, når de dyrkes i CF sputum10. For det tredje kan in-host betingelser cue en fysiologisk eller genetisk skifte til antibiotika-tolerante fænotyper, som er svære at opsummere in vitro. Disse omfatter små kolonivarianter af CF-patogenet Staphylococcus aureus11,12.
Alle disse data tyder på, at når diagnostiske laboratorier isolere individuelle kloner fra patogene biofilm og udføre AST på planktoniske eller agar-plade dyrkede kulturer i standard laboratoriemedier (bouillon mikrodilution, disk diffusion eller Etest), resultaterne ofte ikke forudsige, hvilke antibiotika rent faktisk vil arbejde in vivo. Selv hvis der anvendes in vitro-biofilmanalyser, må de ikke give næring til en in vivo-lignende biofilmphoenotype på grund af forskelle i den anvendte medium- og fastgørelsesoverflade, så assays ved hjælp af flowceller eller mikropladeplatforme med høj gennemstrømning kan overvurdere antibiotikafølsomheden13. Det samme problem gælder for forskere i den akademiske verden og industrien, der søger at udvikle nye antibiofilmmidler: Test af lægemiddelpotentiale ved hjælp af in vitro-platforme som flowceller, mikrotiterplader eller Center for Disease Control biofilmreaktorer kan indstille biofilmeffektivitetsbjælken for lavt og producere falske positiver i forsknings-, udviklingspipeline.
Den dårlige sammenhæng mellem AST resultater og kliniske resultat efter antibiotikabehandling i CF er velkendt. Mange klinikere simpelthen ignorere diagnostiske lab AST, da der ikke er nogen ensartede, CF-specifikke retningslinjer for fortolkning af disse resultater og i stedet gøre sag-til-sag beslutninger for ordination. Der er gjort forsøg på at forbedre CF AST ved hjælp af Calgary biofilm enhed, der bruger biofilm dyrket på overfladen af plastpløkker, der er fastsat i brøndene på en mikroplade, der indeholder standard AST medium (f.eks kation-justeret Muller-Hinton bouillon)14,15. Denne analyse gør ikke bedre til at forudsige, hvilke antibiotika vil arbejde in vivo end standard planktonisk AST16. Indvirkningen på patienter med CF er skarp. På trods af gentagen indgift af antibiotika (almindelig inhaleret antibiotika og en median på 27 dage om året, der modtager intravenøs antibiotika for personer med CF i Det Forenede Kongerige)fører hyppigeog uforudsigelige episoder med akut lungeforværring til progressiv lungeskade og i ca. 90 % af tilfældene død som følge af respirationssvigt. I en nylig analyse, bakteriel lungeinfektion var den stærkeste prædiktor for medicin omkostninger i CF, tilføjer i gennemsnit € 3.6K/patient/ år til direkte udgifter til sundhedspleje18,19.
For akutte infektioner af ellers raske individer er aktuel forskning og politik med fokus på hurtig AST baseret på for eksempel point-of-care genomisk forudsigelse ideel20. Men i tilfælde af kroniske CF-infektioner er det klart, at der er behov for en anden tilgang: implementeringen af AST i værtslignende modeller, der bedre opsummerer in vivo-miljøet og patogenmetabolisk tilstand og giver mulighed for dannelse af realistisk biofilmstruktur.
Vi har tidligere udviklet en CF biofilm model, der omfatter dele af svin bronchiole inkuberet i syntetisk CF sputum og inficeret med P. aeruginosa eller S. aureus. Upåvirket EVPL bevarer normal histopatologi i 7 dage, men lab eller kliniske isolater af P. aeruginosa og S. aureus reproducerbart form i vivo-lignende aggregater omkring vævet, efterligner etiologi af CF-infektion21,22,23. Vi præsenterer en protokol for brug af denne høj gyldighed, høj gennemstrømningshastighedsmodel som en skræddersyet biofilm AST-platform til CF og præsenterer eksemplariske resultater, der viser den høje tolerance over for patogenbiofilm til klinisk anvendte antibiotika, når de dyrkes i modellen. Modellen kunne let indarbejdes i forskning, udviklingspipelines til styring eller forebyggelse af biofilmdannelse og potentielt i diagnostisk AST. Det meste af det anvendte udstyr (se Materialetabel) kan let findes i et typisk mikrobiologisk laboratorium, selv om en perlebanker er afgørende, og vi har fundet ud af arbejdet med samarbejdspartnere, at et passende ultraviolet germicidalskab muligvis også skal indkøbes. Da lungerne kommer fra kommercielle slagtere eller slagterier, giver modellen ingen etiske bekymringer.
Protocol
Denne protokol anvender svine lunger stammer fra et kommercielt slagteri, der leverer kød til konsum. I henhold til britisk lovgivning kræver anvendelse af sidestensvæv fra dyr, der slagtes til kød, ikke etisk godkendelse. vi råder læserne til at tjekke relevante lokale love og institutionelle retningslinjer, før de påbegynder arbejdet.
1. Forberedelse af syntetiske CF Sputum Media (SCFM)
- For at gøre SCFM til brug med EVPL-væv, følg opskriften skitseret af Palmer et al.24 med den ændring, at glukose fjernes fra opskriften.
BEMÆRK: Palmer et al.'s opskrift indeholder frie aminosyrer, kationer, anioner og laktat i koncentrationer, der er repræsentative for de gennemsnitlige koncentrationer, der findes i et udvalg af spytprøver fra CF-patienter. Det har vist sig at cue sammenlignelige kulstofforbrug veje og udtryk for quorum sensing signaler fra P. aeruginosa PA14 til vækst i medium lavet af lyophilised patient sputum24. En opskrift på 1 L modificeret SCFM findes i tabel S1. - SCFM steriliseres umiddelbart efter tilberedningen, og den opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
2. Dissektion og infektion af ex vivo svines lungevæv (EVPL)
- Før dissektion, forberede en agar plade / s af nødvendige bakteriestammer til infektion ved hjælp af, hvad agar er standard i laboratoriet for P. aeruginosa/S. aureus (f.eks lysogeny bouillon + 1,2% agar).
- Beregn, hvor mange svin bronchiolar vævsstykker der kræves til forsøget, herunder uinficerede kontrolvævsstykker. Multiplicer dette tal med to for at gentage eksperimentet i to replikerede lunger for at bekræfte gentagelse af resultater.
- Det samlede antal vævsstykker, der kræves af 0,5 for at bestemme mængden af SCFM agarose (mL), der er nødvendigt for at fremstille agarosepuder, til at fremstille tilstrækkeligt medium til 400 μL/vævsstykke plus ekstra SCFM agar for at tage højde for eventuelle rørfejl eller fordampning under forberedelsen.
- Der tilsættes 0,12 g agarose til hver 15 mL SCFM, der kræves for at opnå den ønskede samlede mængde SCFM med 0,8% vægt/volumen agarose.
- Varm SCFM agaroseopløsningen, indtil agarose er helt opløst. En mikrobølgeovn i hjemmet ved lav effekt anbefales. Den tid, der kræves, afhænger af mikrobølgens watt. Agarose afkøles til ca. 50 °C (varm at røre ved, men behagelig at holde). Lad ikke afkøle yderligere.
- Ved hjælp af en pipette tilsættes 400 μL af SCFM agarose til en brønd af en 24-brønds plade pr. nødvendigt vævsstykke.
- Steriliser SCFM agarose-holdige 24-brønds plade / s under ultraviolet lys i 10 min.
- Forbered tre replikatvasker til hver intakt lunge, der dissekeres ved hjælp af 20 mL steril Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) plus 20 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suppleret med 50 μg/mL ampicillin.
- Lav en aliquot på 40 mL SCFM som en sidste vask for hver intakt lunge, der dissekeres. Alle vaske kan opbevares natten over ved 4 °C eller anvendes med det samme.
- Få lunger fra den angivne kilde så hurtigt som muligt efter slagtningen, idet det sikres, at de holdes kolde ved transport til laboratoriet i en køleboks til hjemmet.
BEMÆRK: Lunger tættere på slagtedagen viser mindre blå mærker fra opbevaring, men væv, der opbevares på køleopbevaring i op til 4 dage fra slagtning, kan også bruges. Da køleboksen skal tages med ind i slagterens butik eller slagteri, skal den dekontamineres efter lokale laboratorieretningslinjer efter hver brug og opbevares uden for mikrobiologilaboratoriet, når den ikke er i brug, for at reducere risikoen for kontaminering og brud på indeslutning. - Arbejde på en steriliseret overflade og under en flamme, placere lungerne på en ren plast skærebræt dækket med autoklaveret aluminiumsfolie. Kontroller, at bronchiolerne forbliver intakte. Hvis der er sket skader på slagteriet eller under transporten, er lungerne ikke egnede til brug.
- Varm en paletkniv under en flamme og rør meget kort kniven til det område af lungen, der omgiver bronchiolen for at sterilisere vævets overflade.
- Skær overfladevævet omkring bronchiolen væk ved hjælp af et sterilt monteret barberblad. Lav snit parallelt med bronchiolen for at forhindre skader.
- Når bronchiolen er blevet udsat, skal du lave et tværsnitsindsnit gennem bronchiolen på det højeste punkt, der er synligt for at frigøre bronchiolen.
- Brug sterile pincet, hold let den frie ende af bronchiolen og skær eventuelt resterende uønsket væv væk ved hjælp af et sterilt monteret barberblad. Lav et sidste tværsnitsindsnit over bronchiolen, før nogen forgrening er synlig for at fjerne bronchiolen fra lungerne.
- Placer bronchiole i den første DMEM / RPMI 1640 vask. Bronchiolen skal efterlades i vasken og gentages trin 2.11-2.14 for at høste yderligere dele af bronchiol fra samme lunge, som kræves for at give tilstrækkelige vævssektioner til det planlagte forsøg.
- Placer eventuelle yderligere bronchiolar sektioner fra samme lunge i vasken (trin 2,16). Lad i vasken i mindst 2 min.
- Bronchiolerne fjernes fra den første DMEM/RPMI 1640-vask, og prøverne anbringes i en steril petriskål.
- Hold hverbronchiole let ved hjælp af sterile pincet, og sørg for ikke at beskadige vævet. Fjern så meget resterende blødt væv som muligt og skær vævet i ~ 5 mm brede strimler ved hjælp af steril dissektion saks.
- Placer alle bronchiolar væv strimler i den anden DMEM / RPMI 1640 vask. Lad i vasken i mindst 2 min.
- Fjern vævsstrimlerne fra den anden vask ved hjælp af sterile pincet, og pas på ikke at beskadige vævet. Placer vævet i en ren, steril petriskål.
- Fjern eventuelt resterende blødt væv, der er fastgjort til bronchiolen, og skær strimlerne i firkanter (~5 mm x 5 mm) ved hjælp af steril dissektionssaks.
- Tilsæt den tredje DMEM/RPMI 1640 vask i petriskålen. Bland let vævsstykkerne i vasken ved at hvirvle skålen.
- Hæld den tredje vask ud af petriskålen uden at fjerne vævsstykkerne.
- Tilsæt den endelige SCFM-vask til den vævsholdige petriskål, hvilket sikrer, at alle vævsstykkerne er dækket.
- Steriliser vævsstykkerne i SCFM under UV-lys i 5 min.
- Brug sterile pincet til at overføre hver steriliseret bronchiolar væv stykke i individuelle brønde af en 24-brønds plade / s indeholder SCFM agarose puder.
- For at inficere hvert vævsstykke med den ønskede bakteriestamme skal du røre ved en koloni dyrket på en agarplade med spidsen af en 29 G nål fastgjort til en steril 0,5 mL insulinsprøjte. Rør derefter kolonien på vævsstykket og prik forsigtigt vævsoverfladen.
BEMÆRK: Ved hjælp af en insulinsprøjte, der er udstyret med en 29 G-nål, kan nålen holdes præcist og komfortabelt, samtidig med at fingrene holdes i sikker afstand fra både nåle- og lungevævet. Det er muligt at udføre dette trin ved hjælp af 29 G nåle, der ikke er fastgjort til en sprøjte, men det kræver større fingerfærdighed og øger risikoen for en nålestiksskade. Insulinsprøjter er let tilgængelige. - For de uinficerede kontroller skal du forsigtigt stikke overfladen af hvert vævsstykke med spidsen af en 29 G nål fastgjort til en steril 0,5 mL insulinsprøjte.
- Brug en pipette til at tilføje 500 μL SCFM til hver brønd.
- Steriliser en åndbar tætningsmembran for hver 24-brønds plade under ultraviolet lys i 10 minutter (Tabel over materialer).
- Låget/låget/båndene tages ud af 24-brøndspladen/-pladerne og udskiftes med den åndbare membran.
- Pladerne inkuberes ved 37 °C i den ønskede inkubationstid (infektion) uden at ryste. Kontroller, at der ikke er nogen synlig vækst af det podede patogen på de uinficerede kontrolstykker (forureningskontrol).
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan der tilsættes ampicillin til SCFM agarose pads i trin 2.5 og dækker SCFM i trin 2.30 til en endelig koncentration på 20 μg/mL. Dette vil undertrykke væksten af de fleste endogene bakterier på lungerne uden at påvirke P. aeruginosa eller S. aureus vækst, men da tilstedeværelsen af ampicillin kan påvirke modtagelighed for andre antibiotika, læseren er overladt til at træffe dette valg afhængigt af stammer og antibiotika, de ønsker at teste.
3. Bestemmelse af antibiotikaeffektivitet
BEMÆRK: Figur S1indeholder en skematisk beskrivelse af trinnene i denne analyse.
- For at måle antibiotikatolerancen over for biofilm, der dannes på EVPL, skal der under dissektionen og infektionen opstilles replikeringssæt af lungestykker fra mindst to uafhængige lunger. Et sæt stykker er påkrævet for en negativ kontrol (ingen antibiotikabehandling), og et sæt er påkrævet for hver koncentration af antibiotika, der skal testes.
- Efter 48 timers inkubation skal du visuelt inspicere de uinficerede vævsstykker. En vis vækst af bakterier endogene til svin lunge kan have fundet sted, hvilket fører SCFM omkring disse sektioner til at være uklar. Hvis der observeres en vækst, der er typisk for de udvalgte forsøgsarter (f.eks. blågrøn pigmenteringsdiagnostik af P. aeruginosa), skal forsøget startes igen med friske lunger.
- Hvis de uinficerede vævssektioner ikke eller kun udviser minimal bakterievækst, skal der fremstilles en 24-brønds vaskeplade og en 24-brøndsbehandlingsplade, der hver indeholder 500 μL frisk SCFM uden antibiotika eller med antibiotika af interesse pr. brønd pr. lungevævsstykke.
- Fjern hvert inficeret vævsstykke fra inkubationspladen med flammesteriliserede pincet, hvirvel kortvarigt i en frisk brønd på vaskepladen for at fjerne eventuelle ikke-biofilmrelaterede bakterieceller og overføre til den passende brønd på behandlingspladen.
- Forsegl behandlingspladerne med frisk åndbar membran.
- Inkuber behandlingspladen/-pladerne ved 37 °C uden at ryste i 18-24 timer.
- Ved hjælp af flammesteriliserede pincet fjernes hvert lungestykke fra 24-brøndspladen og anbringes i et sterilt 2 mL homogeniseringsrør, der indeholder 1 mL fosfatbufferet saltvand (PBS) og 1 g metalperler (Tabel over materialer).
- Perleslag i 40 sekunder ved 4 m/s.
BEMÆRK: Perlebank med de specifikke perler og homogenisatorer, der foreslås i materialetabellen, forårsager ikke signifikant lysis af bakterier, men hvert laboratorium, der anvender protokollen, bør kontrollere virkningerne af deres valgte perler og homogenisator, inden AST-assays påbegyndes. - Lunge homogenatet fortyndes serielt ved hjælp af PBS og plade på Lysogeny Broth (LB) agar for at bestemme koloniformningsenhederne (CFU) i individuelle ubehandlede og antibiotikabehandlede vævsstykker efter standardbelægningsmetoder.
BEMÆRK: Valgfrit: Forbered dublerede plader på selektive medier for at bekræfte koloniidentiteter; f.eks. ved brug af mannitolsalt agar til S. aureus.
Representative Results
EVPL-modellen giver en analyseplatform med høj gennemstrømning, der gør det muligt at screene et stort antal bakterielle isolater for antibiotikafølsomhed på én gang (Figur 1 og 2) eller at screene stammer mod en række antibiotikakoncentrationer i et forsøg (figur 3). Med praksis har vi konstateret, at ca. 200 bronchiolar vævssektioner kan fremstilles af lunger på 2 timer. Hele eksperimentet for AST kan gennemføres inden for normal arbejdstid. Væksten i Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus isolater og etableringen af 48 timers biofilm i modellen er pålidelig og producerer, når den overvåges af levedygtig celletælling, ensartede bakteriebelastninger (Figur 1 og 2). Billeder af vævsrelaterede biofilm af Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus dyrket i EVPL kan findes sammen med protokoller til forberedelse til lysmikroskopi og histologisk farvning i vores publikationer21,23. Reproducerbarheden af CFU-tællinger varierer dog for forskellige bakteriearter. Dette kan kvantificeres ved hjælp af standardberegninger af repeterbarhed efter ANOVA25; vi har konstateret, at der typisk er større variation mellem CFU i replikere lungeprøver for S. aureus end for P. aeruginosa. Vi anbefaler, at der ved et laboratoriums vedtagelse af modellen foretages gentagne beregninger af pilotforsøg for at optimere forsøgsteknikker og bestemme stikprøvestørrelser, der skal anvendes i endelige forsøg (et eksempel på dette kan findes i datatillægget for Sweeney etal. 26).
Når biofilm af P. aeruginosa og S. aureus dyrkes i EVPL, udviser de øget tolerance over for antibiotika sammenlignet med modtagelighed i standard, industrigodkendt bouillonMI (Figur 1) og skiveanalyser ved hjælp af standardmedier (Figur 2). De forskellige virkninger af forskellige antibiotika på EVPL etablerede biofilm kan skelnes, for eksempel P. aeruginosa drab opnås i EVPL med 4-16X MIC ciprofloxacin, men ikke med 4-8X MIC chloramphenicol (Figur 1). En dobbelt daglig dosis på 600 mg linezolid opnår en serumkoncentration over MIC90 for modtagelige patogener (4 μg/mL)27 og betragtes som tilstrækkelig eksponering uden bivirkninger28. Data i figur 2 viser, at S. aureuspopulationer, der er modtagelige for linezolid i skiveanalysen, er i stand til at overleve målserumkoncentrationer og højere (12 μg/mL) i EVPL. Der er ingen klar sammenhæng mellem MIC og antibiotika virkninger på EVPL-dyrkede biofilm for P. aeruginosa (Figur 1). Det er vigtigt at opnå et mere præcist mål for in vivo-antibiotikatolerance, fordi suboptimal dosering af antibiotika kan øge risikoen for udvælgelse til resistens ved kronisk infektion.
Det er velkendt, at biofilm væksttilstanden kan reducere bakteriel modtagelighed for antibiotika betydeligt. Dette har ført til udvikling af mange in vitro biofilm assays og brugen af minimum biofilm udryddelse koncentration (MBEC)14,15 i stedet for MIC som en mere præcis forudsigelse af modtagelighed i kronisk infektion. Brugen af SCFM (i forskellige formuleringer) er også blevet anbefalet til brug i MIC- eller MBEC-test29. Her viser vi, at selv en optimeret in vitro assay ikke præcist kan forudsige P. aeruginosa modtagelighed for colistin i EVPL. Mængden af antibiotika, der kræves for at opnå 3 log10-aflivning af EVPL-dyrkede bakterier, er ofte betydeligt højere end MIC eller MBEC beregnet ud fra standard in vitro-assays, selv når SCFM anvendes til disse assays (Figur 3). Dette er i overensstemmelse med en Cochrane-gennemgang, der rapporterede, at de nuværende implementeringer af in vitro-biofilmfølsomhedstest ikke giver nogen øget prædiktiv effekt til antibiotikaordination i CF sammenlignet med standard susceptibilitetstest16.
Det er også nemt at bruge modellen til at vurdere antibiotikas indvirkning på biofilmbakterier over tid, da tilstrækkelige replikastykker af lungerne kan vaccineres for at tillade destruktiv prøveudtagning. Ud over at skelne mellem antimikrobielle stoffer kan modellen fremhæve ændringer i modtagelighed i forskellige bakterielle vækststadier eller alder af biofilm og for forskellige antibiotikadoseringsintervaller. Figur 4 illustrerer den stigende tolerance over for P. aeruginosa biofilm til meropenem, når de modnes. Dette kunne være nyttigt at bestemme effekten af nye stoffer, for eksempel om de er mere effektive under hurtig celledeling. Det kan også være en vigtig overvejelse ved fastsættelsen af et eksperiments begrænsninger, da det kan være nødvendigt at standardisere og validere biofilmalderen for at undgå, at alderen har indflydelse på resultaterne.
I figur 5blev S. aureus overlevelse målt ved 4 timer og 24 timer efter eksponering for flucloxacillin, og det var muligt at observere forskelle i reduktionen for bakteriecelletællinger over tid og mellem isolater. Dette kan være nyttigt for lægemiddeludvikling, f.eks.
Variationer i bakteriebelastning øges ofte med udvidede kulturtider. Dette kan ses i den ubehandlede kontrol i figur 5 efter 48 timers biofilmudvikling og yderligere 24 timers eksponering for at tage højde for antibiotika doseringsintervallet. Variation er uløseligt forbundet med modellen; hver lungeprøve er uafhængig af andre og afspejler den naturlige variation i lungerne. Det er derfor vigtigt at sikre, at der medtages et tilstrækkeligt antal replikater til at muliggøre validering og en nøjagtig fortolkning af resultaterne. Vi henviser læseren tilbage til vores anbefaling om at foretage gentagne beregninger på dataene for at muliggøre valg af robuste stikprøvestørrelser.
For nemheds skyld har vi fremlagt repræsentative data taget fra replikerede vævssektioner erhvervet fra et enkelt par lunger i hvert forsøg, men i praksis er det nødvendigt at udføre gentagne forsøg på vævssektioner taget fra replikerede dyr. Dette bør gøres for at tage højde for enhver biologisk variation mellem de enkelte svin, og vi henviser læseren til vores offentliggjorte arbejde for eksempler på, hvor konsistente resultaterne kan være mellem væv taget fra replikerede svin, og hvordan denne variation er taget højde for i statistisk analyse af data ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) / generelle lineære modeller (GLM)21,26.
Figur 1. Total CFU på 11 CF Pseudomonas aeruginosa kliniske isolater genvundet fra EVPL-modellen efter behandling med antibiotika. Repræsentative resultater af antibiotikabehandling af P. aeruginosa i EVPL-modellen. Hver stamme blev dyrket på EVPL væv i 48 timer derefter overført til antibiotika (trekanter) eller PBS som en kontrol (cirkler) i 18 timer og CFU / lunge bestemt. MIC for det relevante antibiotikum bestemt i standardkation-justeret MHB er vist i parentes ved siden af hver stamme (x-akse). Stammerne er bestilt ved at øge MIC værdier. Data blev analyseret ved hjælp af t-test, når det var relevant, og Mann-Whitney U-test for ikke-parametriske datasæt. Signifikante forskelle mellem antibiotikabehandlet og ubehandlet væv er betegnet med stjerner (P < 0,05). A. Det er ikke så lidt. Genvundne levedygtige tællinger fra P. aeruginosa-biofilm, der dyrkes i EVPL-modellen og behandles med 64 μg/mL chloramphenicol (højeste registrerede MIC-værdi). For hvert isoleret middel blev den standardiserede gennemsnitsforskel i CFU mellem kloramphenicolbehandlede og ubehandlede vævssektioner beregnet ved hjælp af Cohens d. Der var ingen sammenhæng mellem MIC-værdien i standardtesten og faldet i levedygtige celletal i EVPL-modellen målt ved Cohens d (Spearmans rangkorrelation, rs = 0,45, p = 0,16) B. Resultater af P. aeruginosa-biofilm, der dyrkes i EVPL-modellen og behandles med 64 μg/mL ciprofloxacin (højeste registrerede MIC-værdi). Værdierne under den stiplede linje lå under registreringsgrænsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Samlet CFU på 8 Staphylococcus aureus CF kliniske isolater genvundet fra EVPL-modellen efter behandling med linezolid. Hver stamme blev dyrket på EVPL væv i 48 timer derefter overført til linezolid (trekanter) i 24 timer eller blev ubehandlet som en kontrol (cirkler). Alle stammer blev anset for at være følsomme over for linezolid ved hjælp af standard disk diffusion assay efter EUCAST retningslinjer30 (zone af hæmning > 21 mm). Data blev analyseret ved hjælp af t-test, når det var relevant, og Mann-Whitney U-test for ikke-parametriske datasæt (P < 0,05). Der blev ikke fundet signifikante forskelle mellem antibiotikabehandlede og ubehandlede for nogen af stammerne. Værdierne under den stiplede linje lå under registreringsgrænsen. A. Det er ikke så lidt. Resultater af S. aureusbiofilm i EVPL-modellen behandlet med 4 μg/mL linezolid (klinisk brudpunkt for følsom/resistent i henhold til EUCAST-klassifikation31). B. Resultater af S. aureusbiofilm i EVPL-modellen behandlet med 12 μg/mL linezolid (data gengivet fra Sweeney etal. 23). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Levedygtige Pseudomonas aeruginosa celletal af laboratoriestammen PA14 og 4 CF kliniske isolater genvundet fra EVPL-modellen efter behandling med stigende koncentrationer af colistin. Hver stamme blev dyrket på EVPL-væv i 48 timer og derefter udsat for colistin i 18 timer. MIC bestemt i standard kation-justeret MHB medium er vist i parentes ved siden af hver stamme navn. De lodrette linjer viser MBEC-værdien bestemt i MHB (solid) og SCFM (stiplet), med undtagelse af SED6, hvor værdien var den samme i begge medier. De ubesatte datapunkter repræsenterer den laveste koncentration af testede colistiner, som resulterede i ≥ 3-log10-reduktion i CFU/lungcompared til de ubehandlede prøver (0 μg/mL colistin) (data gengivet fra Sweeney etal. 26). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative levedygtige Pseudomonas aeruginosa celletal fra et tidsforløb af vækst på EVPL-modellen over 24 timer og efterfølgende behandling med 64 μg/mL meropenem. Laboratoriestammen P. aeruginosa PA14 og 3 CF kliniske isolater blev dyrket på EVPL-væv i den tid, der blev vist på x-aksen, derefter overført til meropenem (trekanter) i 24 timer eller efterladt ubehandlet som en kontrol (cirkler). CFU/lungerne blev derefter bestemt. MIC bestemt i kation-justeret MHB medium er vist i parentes ved siden af hver stamme navn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative levedygtige Staphylococcus aureus-celletal efter vækst på EVPL-modellen behandles derefter med 5 μg/mL flucloxacillin over et tidsforløb på 24 timer. Kontrolstammen ATCC29213 og to kliniske CF-isolater blev dyrket på EVPL-væv i 48 timer og derefter overført til flucloxacillin (trekanter) eller efterladt ubehandlet som en kontrol (cirkler) i 4 timer og 24 timer, før CFU/lunger blev bestemt (data gengivet fra Sweeney etal. 23). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1. Klik her for at downloade dette tal.
Tabel S1. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Ex vivo-lungemodellen er høj gennemløb og billig, og fordi den bruger affald fra kødindustrien efter forbrug, giver den ingen etiske betænkeligheder. Det er designet til at efterligne kronisk inficerede menneskelige CF-luftveje bedre end i øjeblikket tilgængelige, in vitro AST-platforme. Resultater præsenteret her viser, at det mere præcist kan forudsige antibiotika modtagelighed under disse omstændigheder.
Kritiske trin i protokollen, der sikrer pålidelige og reproducerbare resultater, omfatter følgende:
- Brug konsistente tids- og opbevaringsmetoder mellem slagtning, indsamling og behandling af lungeprøver. Det er vigtigt at bruge lungerne så hurtigt som muligt efter slagtningen og at holde risikoen for kontaminering på et minimum. Forskelle i forsøgskulturernes evne til at vokse i lungerne, hvis de ikke er så friske som muligt, er blevet observeret.
- Det er vigtigt at opretholde sterilitet i produktionen af SCFM og dissektion af lungestykker. Sunde lunger er ikke sterile, og derfor kan tilstedeværelsen af commensale bakterier afspejle et "naturligt" miljø for kronisk infektion. Ikke desto mindre, som tidligere nævnt, bakterielle interaktioner inden for multiartspopulationer kan ændre resultater og modtagelighed for antibiotika, så forurening bør undgås, og lungerne bør steriliseres før brug. Vi går ind for brugen af UV-sterilisering, da det ikke ser ud til at forårsage ændringer tinvævsintegritet og om nødvendigt yderligere antibiotiske vaske. Antibiotika bør dog anvendes med forsigtighed, da de kan påvirke resultaterne ved at indføre selektive tryk og kan ændre genekspressionen i testbakterielle populationer.
- Brug mock-inficerede, negative kontrol vævsprøver og celletal plader dyrket på en ikke-selektiv, rig medium til at fremhæve væksten af eventuelle forurenende eller commensal bakterier, der ikke er blevet fjernet under sterilisering. Dette er vigtigt for at afbøde for enhver indvirkning af disse bakterier på AST. Det er også nyttigt at producere duplikerede, selektive agar, celletællingsplader, der er specifikke for den pågældende organisme, da duplikerede plader fremskynder koloniidentifikation og celleoptælling.
- Udfør pilotforsøg, når du først bruger modellen, og når du bruger den med nye stammer eller genotype af bakterier til at vurdere biofilm CFU variationer mellem vævssektioner, så udvælgelsen af optimale eksperimentelle prøvestørrelser (f.eks. hvor mange replikere væv sektioner til at erhverve fra hvor mange replikere lunger) ved hjælp af effekt beregninger.
- Analysen bruger et ikke-standardiseret inoculum, da dette giver mulighed for hurtig inokulering efter 48 timers inkubation og dannelsen af relativt konsekvente biofilmbelastninger (især for P. aeruginosa). For at analysere antibakteriel effekt i tidlige biofilm vækststadier, overveje at vaccinere med en standardiseret CFU af koloni-dyrkede bakterier suspenderet i ASM. Vi anbefaler ikke at vaccinere med planktoniske bakterier: tidlige pilotforsøg viste, at dette fører til akut, invasiv vækst, ikke pålidelig biofilmdannelse.
Denne protokol producerer en robust prototypemodel til brug med P. aeruginosa, med et stort udviklingspotentiale til brug med S. aureus, men den har nogle begrænsninger, der skal løses for visse applikationer i fremtiden. Væv blev podet fra enkelte kolonier for at muliggøre udviklingen af klonpopulationer. Resultaterne viser, at for P. aeruginosahar dette ringe indflydelse på cellenumre ved 48 timer. Der blev dog observeret større variation i bakteriebelastningen for S. aureus, og da forskellige bakterier kan vokse forskelligt inden for modellen, kan en standardiseret start inoculum og streng produktion af vævsprøver af samme størrelse og vægt være afhængig af forsøgsorganismen. Der kan også være forskelle mellem laboratorier på grund af forskelle i præcise dissektion / infektion teknikker eller lokale svin race / landrace. For at vurdere bakteriepopulationernes reproducerbarhed ved individuelle implementeringer af modellen foreslår vi, at der anvendes repeterbarhedsberegninger som en del af den statistiske analyse af resultat25 og anvendelse af repeterbarheds-/effektberegninger baseret på pilotforsøg til at beregne den optimale prøvestørrelse til deres anvendelse i endelige forsøg.
En af de vigtigste fordele ved EVPL i forhold til traditionelle pladeanalyser er, at i stedet for at teste for bakterier, der vokser planktonisk eller på abiotiske overflader, giver det mulighed for rumlig strukturering af bakterielle biofilm i et værtsmiljø og med celledifferentiering. Dette har vigtige konsekvenser for at overveje virkningen af fysiokemiske og næringsstofgradienter på antimikrobielle stoffers aktivitet samt levering og tilgængelighed af aktive terapier ved forskellige mikromiljøer inden for en kronisk infektion og cellecelleinteraktion mellem bakterier. Sidstnævnte punkt er særlig vigtigt, da multiartsinfektioner rutinemæssigt observeres i CF og bliver stadig vigtigere for infektioner forbundet med andre luftvejssygdomme, såsom astma og kronisk obstruktiv lungesygdom. Der er potentiale til at udvikle denne model for AST for individualiseret patient sputum prøveudtagning i den kliniske diagnostik. En analog forsøg er allerede i gang ved hjælp af et sår-efterligne in vitro model for vækst og AST af debrided biofilm fra kroniske sår (Southwest Regional Wound Care Center i Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).
Desuden bruger modellen post mortem-væv, så værts immunresponsets indflydelse på antibiotikafølsomheden er begrænset. Nuværende in vitro-modeller tager heller ikke højde for værtens immunrespons, så vi ser ikke dette som en hindring for den fremtidige brug af modellen i AST-applikationer. Immunresponset tages dog i betragtning, når farmakokinetiske og farmakodynamiske parametre og retningslinjer for dosering af antibiotika bestemmes. Selvom vores undersøgelser har vist tegn på resterende immunceller og reaktioner i vævet23 (og S. Azimi, personlig kommunikation), er dette et førsteklasses område for yderligere optimering og udvikling af modellen, hvis der ønskes et større match til in vivo-forhold.
Give mere klinisk gyldig AST for CF vil bidrage til at opfylde en vigtig anbefaling fra den britiske Health, Social Care Act 2008, at "procedurer bør være på plads for at sikre en forsigtig ordination og antimikrobiel forvaltning." Vi mener, at EVPL er en ideel kandidatmodel til at hjælpe med at opfylde dette behov.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle vores medforfattere på de originale papirer, hvorfra vi har taget eksemplariske resultater. Arbejdet blev finansieret af en MRC New Investigator Research Grant (tilskud nummer MR/R001898/1)tildelt FH; af ph.d.-studerende fra BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP), der tildeles NEH og IA og af University of Warwick Undergraduate Research Support Scheme's tildeling til FA til at gennemføre en sommerferie forskningsprojekt. Vi takker Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) og John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) for at levere lunger. Vi vil også gerne anerkende hjælp fra Media Preparation Facility i School of Life Sciences ved University of Warwick, med særlig tak til Cerith Harries og Caroline Stewart, og hjælp fra Anita Catherwood på Warwick Antimicrobial Screening Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
| 24-well culture plates | |||
| 70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
| Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
| Agarose | |||
| Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
| Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
| Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
| Bunsen burner | |||
| Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
| Coolbox to transport lungs to lab | |||
| Dissection scissors in different sizes | |||
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
| Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
| Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
| Germicidal UV cabinet | |||
| Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
| Large pallet knife | |||
| LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
| Mounted razor blades | |||
| Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
| Petri dishes | |||
| Phosphate-buffered saline | |||
| Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
| SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
| Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
| Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
| Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |
References
- Elborn, J. S.
- Høiby, N., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 125, 339-343 (2017).
- Bjarnsholt, T., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).
- Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. 20 (4), 5286 (2015).
- Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients. Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O'Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).
- Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).
- Drevinek, P., et al. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 8, 121 (2008).
- Goerke, C., Wolz, C. Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection. International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).
- Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
- Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).
- Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).
- Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).
- Trust, C. F. Annual Data Report 2019. , (2019).
- Angelis, A., et al. Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom. BMC Health Services Research. 15 (1), 428 (2015).
- Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany. Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).
- Longitude Prize. , Available from: http://longitudeprize.org (2020).
- Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. Building a better biofilm - Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection. Biofilm. 2, 100024 (2020).
- Harrison, F., Diggle, S. An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).
- Sweeney, E., et al. An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection. Microbiology. , DOI: 10.1099/mic.0.000987 (2020).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists. Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).
- Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).
- Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).
- Ager, S., Gould, K. Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).
- Kirchner, S., et al. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 8.0. , Available from: www.eucast.org (2020).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. , Available from: http://www.eucast.org (2020).
