Test di efficacia antibiotica in un modello ex vivo di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms nel polmone della fibrosi cistica

Summary

Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici utilizzando un modello ex vivo stabilito di biofilm batterico nei polmoni di individui con fibrosi cistica. L'uso di questo modello potrebbe migliorare la validità clinica dei test MBEC (concentrazione minima di eradicazione del biofilm).

Abstract

L'efficace prescrizione di antibiotici per i biofilm batterici presenti nei polmoni di individui con fibrosi cistica (CF) è limitata da una scarsa correlazione tra i risultati dei test di suscettibilità agli antibiotici (AST) utilizzando metodi diagnostici standard (ad esempio, microdiluizione del brodo, diffusione del disco o Etest) e risultati clinici dopo il trattamento antibiotico. I tentativi di migliorare l'AST mediante l'uso di piattaforme di crescita di biofilm preconfezionati mostrano scarsi miglioramenti nei risultati. La limitata capacità dei sistemi di biofilm in vitro di imitare l'ambiente fisico-chimico del polmone CF e, quindi, la fisiologia batterica e l'architettura del biofilm, funge anche da freno alla scoperta di nuove terapie per l'infezione da CF. Qui presentiamo un protocollo per eseguire AST di agenti patogeni CF coltivati come biofilm maturi, simili a in vivo in un modello polmonare CF ex vivo composto da tessuto bronchiolare di maiale e eputo CF sintetico (polmone di maiale ex vivo, EVPL).

Esistono diversi saggi in vitro per test di suscettibilità al biofilm, utilizzando mezzi di laboratorio standard o varie formulazioni di cf espettorato sintetico in piastre di microtito. Sia il mezzo di crescita che il substrato di biofilm (piastra di polistirolo rispetto al tessuto bronchiolare) possono influenzare la tolleranza agli antibiotici del biofilm. Mostriamo una maggiore tolleranza degli pseudomoni clinici aeruginosa e stafilococco aureo isolati nel modello ex vivo; gli effetti del trattamento antibiotico dei biofilm non sono correlati con la concentrazione minima inibitoria (MIC) nei saggi standard di microdiluizione o con una classificazione sensibile/resistente nei saggi di diffusione del disco.

La piattaforma ex vivo potrebbe essere utilizzata per biofilm su misura AST di campioni di pazienti e come piattaforma di test migliorata per potenziali agenti antibiofilm durante la ricerca e lo sviluppo farmaceutico. Migliorare la prescrizione o l'accelerazione della scoperta di farmaci antibiofilm attraverso l'uso di piattaforme di test più in vivo potrebbe migliorare drasticamente i risultati sanitari per le persone con CF, oltre a ridurre i costi del trattamento clinico e della ricerca sulla scoperta.

Introduction

Le infezioni croniche da biofilm colpiscono individui le cui normali difese immunitarie sono compromesse. I gruppi a rischio comprendono quelli con la condizione genetica fibrosi cistica (CF)¹. La colonizzazione del muco adesivo anormalmente spesso nelle vie respiratorie all'inizio della prima infanzia porta a infezioni da biofilm intrattabili dei bronchiole^2,3. La crescita dei batteri come vasti biofilm incapsulati da matrici è un fattore che distingue le infezioni croniche delle persone immunocompromanti dalle infezioni acute di ospiti sani e lo stato del biofilm protegge i batteri dall'esposizione agli antibiotici (a causa della ridotta diffusione attraverso la matrice) e diminuisce la loro suscettibilità agli antibiotici (ad esempio, attraverso l'induzione della quiescenza o l'upregulation delle pompe efflux)^4,5. Tuttavia, alterazioni specifiche della malattia nella fisiologia e nella chimica dei tessuti ospiti alterano ulteriormente la fisiologia batterica da quella osservata nelle infezioni acute o in condizioni standard di crescita di laboratorio. Esempi chiave in CF includono l'uso di fonti di carbonio insolite, come acidi grassi e amminoacidi rilasciati dal tensioattivo polmonare e prodotti dalla degradazione microbica della mucina, il rilascio di micronutrienti, come il ferro proveniente da tessuti danneggiati, e la microaerobiosi^6,7,8.

Le specifiche condizioni fisicochimiche in un particolare contesto di infezione da biofilm possono quindi influenzare le risposte agli antibiotici. In primo luogo, la struttura e la profondità della matrice extracellulare dipendono dalle condizioni ambientali locali, come i nutrienti o le forze di taglio. In secondo luogo, gli segnali ambientali possono innescare l'espressione di specifici geni di resistenza agli antibiotici. Ad esempio, l'agente patogeno CF Pseudomonas aeruginosa mostra una maggiore espressione di una beta-lattamasi e una ridotta espressione di porine nell'espettorato di CF rispetto allo vitro⁹, mentre un altro agente patogeno CF, Burkholderia cenocepacia, upreula beta-lattamasi e pompe efflux quando coltivato in CF sputum¹⁰. In terzo luogo, le condizioni nell'ospite possono insospettare un passaggio fisiologico o genetico a fenotipi tolleranti agli antibiotici, difficili da ricapitolare in vitro. Questi includono piccole varianti di colonia dell'agente patogeno CF Staphylococcus aureus^11,12.

Tutti questi dati indicano che quando i laboratori diagnostici isolano i singoli cloni dal biofilm patogeno ed eseguono L'AST su colture coltivate a placche planctoniche o agar nei supporti di laboratorio standard (microdiluizione del brodo, diffusione del disco o Etest), i risultati spesso non prevedono quali antibiotici funzioneranno effettivamente in vivo. Anche se vengono utilizzati saggi di biofilm in vitro, non possono individuare un fenotipo di biofilm in vivo a causa delle differenze nel mezzo e nella superficie di attacco utilizzata, quindi i saggi che utilizzano cellule di flusso o piattaforme di micropiatta ad alta produttività possono sovrastimare la sensibilità agli antibiotici¹³. Lo stesso problema si applica ai ricercatori del mondo accademico e industriale che cercano di sviluppare nuovi agenti antibiofilm: testare il potenziale di farmaci utilizzando piattaforme in vitro come cellule di flusso, piastre di microtitolo o reattori biofilm center for Disease Control può impostare la barra di efficacia del biofilm troppo bassa e produrre falsi positivi nella pipeline di ricerca, sviluppo.

La scarsa correlazione tra i risultati dell'AST e l'esito clinico dopo il trattamento antibiotico in CF è ben nota. Molti medici ignorano semplicemente l'AST del laboratorio diagnostico in quanto non esistono linee guida uniformi specifiche per l'interpretazione di questi risultati e prendono invece decisioni caso per caso per la prescrizione. Si è cercato di migliorare la CF AST utilizzando il dispositivo biofilm Calgary, che utilizza biofilm coltivati sulla superficie di pioli di plastica incastonati nei pozzi di una micropiatta contenente mezzo AST standard (ad esempio, brodo Muller-Hinton regolato dal catione)^14,15. Questo saggio non fa meglio a prevedere quali antibiotici funzioneranno in vivo rispetto al planctonico standard AST¹⁶. L'impatto sui pazienti con CF è forte. Nonostante la somministrazione ripetuta di antibiotici (antibiotici inalati regolari e una mediana di 27 giorni all'anno che ricevono antibiotici per via endovenosa per individui con CF nel Regno Unito)¹⁷, episodi frequenti e imprevedibili di esacerbazione polmonare acuta portano a danni polmonari progressivi e, in circa il 90% dei casi, alla morte per insufficienza respiratoria. In una recente analisi, l'infezione polmonare batterica è stato il predittore più forte dei costi dei farmaci in CF, aggiungendo in media € 3,6K / paziente / anno per dirigere i costi sanitari^18,19.

Per le infezioni acute di individui altrimenti sani, la ricerca e la politica attuali incentrate sulla rapida AST basata, ad esempio, sulla previsione genomica del punto di cura è^{l'ideale 20}. Ma nel caso di infezioni croniche da CF, è chiaro che è necessario un approccio diverso: l'implementazione dell'AST nei modelli di imitazione dell'ospite che ricapitolano meglio l'ambiente in vivo e lo stato metabolico patogeno e consentono la formazione di una struttura realistica del biofilm.

In precedenza abbiamo sviluppato un modello di biofilm CF che comprende sezioni di bronchiolo di maiale incubato nell'espettorato cf sintetico e infettato da P. aeruginosa o S. aureus. L'EVPL non infetto mantiene la normale istopatologia per 7 giorni, ma gli isolati di laboratorio o clinici di P. aeruginosa e S. aureus formano riproducibilmente aggregati in vivo intorno al tessuto, imitando l'eziologia dell'infezione da CF^21,22,23. Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di questo modello ad alta validità e ad alta produttività come piattaforma AST biofilm su misura per CF e presentiamo risultati esemplari che mostrano l'alta tolleranza dei biofilm patogeni agli antibiotici clinicamente usati quando coltivati nel modello. Il modello potrebbe essere facilmente incorporato nelle condotte di ricerca, sviluppo per la gestione o la prevenzione della formazione di biofilm e potenzialmente nell'AST diagnostica. La maggior parte delle attrezzature utilizzate (vedi Tabella dei materiali) può essere facilmente trovata in un tipico laboratorio di microbiologia, anche se un battitore di perline è essenziale, e abbiamo scoperto dal lavoro con i collaboratori che potrebbe anche essere necessario procurarsi un armadio germicida ultravioletto adatto. Poiché i polmoni provengono da macellai commerciali o mattatoi, il modello non presenta preoccupazioni etiche.

Protocol

Questo protocollo utilizza polmoni di suino provenienti da un mattatoio commerciale che fornisce carne per il consumo umano. Secondo la legislazione britannica, l'utilizzo di tessuti rimanenti provenienti da animali macellati per la carne non richiede l'approvazione etica; consigliamo ai lettori di controllare le leggi locali pertinenti e le linee guida istituzionali prima di iniziare a lavorare.

1. Preparazione di supporti sintetici cf sputo (SCFM)

1. Per rendere SCFM per l'uso con tessuto EVPL, seguire la ricetta delineata da Palmer et^al.
   NOTA: La ricetta di Palmer et al. È stato dimostrato che cue percorsi di utilizzo del carbonio comparabili ed espressione dei segnali di rilevamento del quorum da P. aeruginosa PA14 alla crescita in mezzo fatto di espettorato paziente lyophilised²⁴. Una ricetta per 1 L SCFM modificato è fornita nella tabella S1.
2. Filtrare sterilizzare l'SCFM immediatamente dopo la preparazione e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.

2. Dissezione e infezione del tessuto polmonare suino ex vivo (EVPL)

1. Prima della dissezione, preparare una piastra/i di agar di ceppo/i batterico richiesto per l'infezione utilizzando qualsiasi agar sia standard in laboratorio per P. aeruginosa/S. aureus (ad esempio, brodo di lisogenia + 1,2% agar).
2. Calcola quanti pezzi di tessuto bronchiolare suino sono necessari per l'esperimento, inclusi i pezzi di tessuto di controllo non infetti. Moltiplicare questo numero per due per ripetere l'esperimento in due polmoni replicati per confermare la ripetibilità dei risultati.
3. Moltiplicare il numero totale di pezzi di tessuto necessari per 0,5 per determinare il volume di agar SCFM (mL) necessario per realizzare tamponi di agarosio per rendere abbastanza mezzo per 400 μL / pezzo di tessuto più agar SCFM di ricambio per tenere conto di eventuali errori di pipettazione o evaporazione durante la preparazione.
4. Aggiungere 0,12 g di agarosio a ogni 15 mL di SCFM necessario per realizzare il volume totale desiderato di SCFM con agarosio peso/volume dello 0,8%.
5. Riscaldare la soluzione di agarosio SCFM fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto. Si consiglia un forno a microonde domestico a bassa potenza. Il tempo richiesto dipende dalla potenza del microonde. Lasciare raffreddare l'agarosio a circa 50 °C (caldo al tatto ma comodo da tenere). Non permettere di raffreddare ulteriormente.
6. Utilizzando una pipetta, aggiungere 400 μL dell'agarosio SCFM a un pozzo di una piastra da 24 pozzetti per pezzo di tessuto necessario.
7. Sterilizzare la piastra/i contenente agarosio SCFM contenente 24 pozze di pozzo sotto la luce ultravioletta per 10 minuti.
8. Preparare tre lavaggi replica per ogni polmone intatto sezionato utilizzando 20 mL di mezzo eagle modificato (DMEM) sterile di Dulbecco più 20 mL di roswell park memorial institute sterile (RPMI) 1640 integrato con 50 μg / mL ampicillina.
9. Fare un'aliquota di 40 mL SCFM come lavaggio finale per ogni polmone intatto sezionato. Tutti i lavaggi possono essere conservati durante la notte a 4 °C o utilizzati immediatamente.
10. Ottenere i polmoni dalla fonte designata il prima possibile dopo la macellazione, assicurandosi che siano tenuti freddi trasportando in laboratorio in una cassetta della mente domestica.
    NOTA: I polmoni più vicini al giorno della macellazione mostrano meno lividi dallo stoccaggio, ma possono essere utilizzati anche tessuti tenuti in conservazione a freddo per un massimo di 4 giorni dalla macellazione. Poiché la cassetta di raffreddamento deve essere portata nella macelleria o nel mattatoio, deve essere decontaminata seguendo le linee guida locali di laboratorio dopo ogni utilizzo e conservata al di fuori del laboratorio di microbiologia quando non è in uso, per ridurre il rischio di contaminazione e una violazione del contenimento.
11. Lavorando su una superficie sterilizzata e sotto una fiamma, posizionare i polmoni su un tagliere di plastica pulito coperto con foglio di alluminio autoclavato. Controllare che i bronchili rimangano intatti. Se ci sono stati danni al mattatoio o durante il trasporto, i polmoni non sono adatti all'uso.
12. Scaldare un coltello a palette sotto una fiamma e toccare molto brevemente il coltello nell'area del polmone che circonda il bronchiolo per sterilizzare la superficie del tessuto.
13. Tagliare il tessuto superficiale che circonda il bronchiolo usando una lama di rasoio sterile montata. Fare incisioni parallele al bronchiolo per prevenire eventuali danni.
14. Una volta esposto il bronchiolo, fare un'incisione trasversale attraverso il bronchiolo nel punto più alto visibile per liberare il bronchiolo.
15. Utilizzando forcep sterili, tenere leggermente l'estremità libera del bronchiolo e tagliare via qualsiasi tessuto indesiderato rimanente utilizzando una lama di rasoio sterile montata. Effettuare un'incisione finale della sezione trasversale attraverso il bronchiolo prima che qualsiasi ramificazione sia visibile per rimuovere il bronchiolo dai polmoni.
16. Posizionare il bronchiolo nel primo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciare il bronchiolo nel lavaggio e ripetere i passaggi 2.11-2.14 per raccogliere ulteriori sezioni di bronchiolo dallo stesso polmone necessarie per produrre sezioni tissutali sufficienti per l'esperimento pianificato.
17. Posizionare eventuali sezioni bronchiolari aggiuntive dallo stesso polmone nel lavaggio (fase 2.16). Lasciare nel lavaggio per almeno 2 minuti.
18. Rimuovere i bronchioli dal primo lavaggio DMEM/RPMI 1640 e posizionare i campioni in una piastra di Petri sterile.
19. Tenere ogni bronchiolo leggermente usando forcep sterili, assicurandosi di non danneggiare il tessuto. Rimuovere il più possibile il tessuto molle rimanente e tagliare il tessuto a strisce larghe ~ 5 mm usando forbici sterili per la dissezione.
20. Posizionare tutte le strisce di tessuto bronchiolare nel secondo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciare nel lavaggio per almeno 2 minuti.
21. Rimuovere le strisce di tessuto dal secondo lavaggio utilizzando forcelle sterili, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto. Mettere il tessuto in una piastra di Petri pulita e sterile.
22. Rimuovere i tessuti molli rimanenti attaccati al bronchiolo e tagliare le strisce in quadrati (~ 5 mm x 5 mm) usando forbici sterili per la dissezione.
23. Aggiungere il terzo lavaggio DMEM/RPMI 1640 nella piastra di Petri. Mescolare leggermente i pezzi di tessuto nel lavaggio ruotando il piatto.
24. Versare il terzo lavaggio dalla piastra di Petri senza rimuovere i pezzi di tessuto.
25. Aggiungere il lavaggio SCFM finale alla piastra di Petri contenente tessuti, assicurando che tutti i pezzi di tessuto siano coperti.
26. Sterilizzare i pezzi di tessuto in SCFM sotto la luce UV per 5 minuti.
27. Utilizzare forcelle sterili per trasferire ogni pezzo di tessuto bronchiolare sterilizzato in singoli pozzi di una piastra/s da 24 pozzetti contenente tamponi di agarosio SCFM.
28. Per infettare ogni pezzo di tessuto con il ceppo batterico desiderato, toccare una colonia coltivata su una piastra di agar con la punta di un ago da 29 G attaccato a una siringa sterile per insulina da 0,5 ml. Quindi toccare la colonia sul pezzo di tessuto, pungendo delicatamente la superficie del tessuto.
    NOTA: L'uso di una siringa per insulina dotata di un ago da 29 G consente di tenere l'ago in modo accurato e confortevole mantenendo le dita a distanza di sicurezza sia dall'ago che dal tessuto polmonare. È possibile eseguire questo passaggio utilizzando aghi da 29 G che non sono attaccati a una siringa, ma ciò richiede una maggiore destrezza e aumenta il rischio di una lesione da ago. Le siringhe per insulina sono prontamente disponibili.
29. Per i controlli non infetti, pungere delicatamente la superficie di ciascuno dei pezzi di tessuto con la punta di un ago da 29 G attaccato a una siringa sterile per insulina da 0,5 ml.
30. Utilizzare una pipetta per aggiungere 500 μL di SCFM a ciascun pozzo.
31. Sterilizzare una membrana di tenuta traspirante per ogni piastra a 24 pozzetti sotto la luce ultravioletta per 10 minuti(Tabella dei materiali).
32. Rimuovere il coperchio/i dalla piastra/i a 24 po' e sostituirla con la membrana traspirante.
33. Incubare le piastre a 37 °C per il tempo di incubazione (infezione) desiderato senza tremare. Verificare che non vi sia crescita visibile dell'agente patogeno inoculato sui pezzi di controllo non infetti (controllo della contaminazione).
    NOTA: Se lo si desidera, l'ampicillina può essere aggiunta alle pastiglie di agarosio SCFM nel passaggio 2.5 e coprire l'SCFM nel passaggio 2.30 ad una concentrazione finale di 20 μg/mL. Ciò sopprimerà la crescita della maggior parte dei batteri endogeni sui polmoni senza influire sulla crescita di P. aeruginosa o S. aureus ma, poiché la presenza di ampicillina può influire sulla suscettibilità ad altri antibiotici, il lettore è lasciato a fare questa scelta a seconda dei ceppi e degli antibiotici che desiderano testare.

3. Determinazione dell'efficacia antibiotica

NOTA: Nella figura S1 è disponibile uno schema che descrive in dettaglio i passaggi di questo saggio.

1. Per misurare la tolleranza antibiotica dei biofilm formati su EVPL, è necessario impostare serie replicate di pezzi polmonari, provenienti da almeno due polmoni indipendenti, durante la dissezione e l'infezione. Per un controllo negativo (nessun trattamento antibiotico) è necessaria una serie di pezzi ed è necessario un set per testare ogni concentrazione di antibiotico.
2. Dopo 48 ore di incubazione, ispezionare visivamente i pezzi di tessuto non infetti. Potrebbe essersi verificata una certa crescita di batteri endogeni al polmone suino, portando l'SCFM intorno a queste sezioni ad essere torbido. Se si osserva una crescita tipica delle specie di studio selezionate (ad esempio, diagnostica di pigmentazione blu-verde di P. aeruginosa),riac ricominciare l'esperimento con polmoni freschi.
3. Se le sezioni di tessuto non infette non mostrano una crescita batterica minima o solo minima, preparare una piastra di lavaggio a 24 pozzetti e una piastra di trattamento da 24 pozzetti, ognuna contenente 500 μL di SCFM fresco senza antibiotici o con l'antibiotico di interesse per pozzo per pezzo di tessuto polmonare.
4. Rimuovere ogni pezzo di tessuto infetto dalla piastra di incubazione con forcelle sterilizzate a fiamma, ruotare brevemente in un pozzo fresco della piastra di lavaggio per rimuovere eventuali cellule batteriche associate a non biofilm e trasferirlo nel pozzo appropriato della piastra di trattamento.
5. Sigillare le piastre di trattamento con membrana fresca traspirante.
6. Incubare la piastra/i di trattamento a 37 °C senza tremare per 18-24 ore.
7. Utilizzando forcep sterilizzati a fiamma, rimuovere ogni pezzo polmonare dalla piastra a 24 pozzetti e mettere in un tubo di omogeneizzazione sterile da 2 ml contenente 1 ml di soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS) e 1 g di perline metalliche(tabella dei materiali).
8. Perline battere per 40 secondi a 4 m/s.
   NOTA: Il battito di perline con le perline specifiche e l'omogeneizzatore suggerito nella tabella dei materiali non causa una lisi significativa dei batteri, ma ogni laboratorio che utilizza il protocollo deve controllare gli effetti delle perline e dell'omogeneizzatore scelti prima di iniziare i test AST.
9. Diluire serialmente l'omogeneato polmonare utilizzando PBS e piastra su agar Lysogeny Broth (LB) per determinare le unità di formazione della colonia (CFU) in singoli pezzi di tessuto non trattati e trattati con antibiotici secondo metodi di placcatura standard.
   NOTA: Facoltativo: preparare lastre duplicate su supporti selettivi per confermare le identità della colonia; ad esempio, usando l'agar sale di manitolo per S. aureus.

Representative Results

Il modello EVPL fornisce una piattaforma di dosaggio ad alta produttività, che consente di migliorare un gran numero di isolati batterici per la suscettibilità agli antibiotici contemporaneamente(figure 1 e 2)o di schermare i ceppi rispetto a una serie di concentrazioni di antibiotici in un unico esperimento(figura 3). Con la pratica, abbiamo scoperto che circa 200 sezioni di tessuto bronchiolare possono essere preparate dai polmoni in 2 ore. L'intero esperimento per l'AST può essere completato entro il normale orario di lavoro. La crescita degli isolati Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus e la creazione di biofilm da 48 ore nel modello sono affidabili e, se monitorati da un numero di cellule vitale, producono carichi batterici coerenti(figure 1 e 2). Immagini di biofilm associati ai tessuti di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus coltivati in EVPL possono essere trovate, insieme ai protocolli per la preparazione per la microscopia ottica e la colorazione istologica, nelle^{nostre pubblicazioni 21,23}. Tuttavia, la riproducibilità del conteggio della CFU varia per diverse specie batteriche. Questo può essere quantificato utilizzando calcoli di ripetibilità standard dopo ANOVA^25; abbiamo scoperto che c'è tipicamente una variazione maggiore tra CFU nei campioni polmonari replicati per S. aureus che per P. aeruginosa. Si raccomanda che, all'atto dell'adozione del modello da parte di un laboratorio, si svolgano calcoli ripetuti su esperimenti pilota per ottimizzare le tecniche sperimentali e determinare le dimensioni dei campioni da utilizzare negli esperimenti finali (un esempio di ciò può essere trovato nel supplemento di dati per Sweeney et al²⁶).

Se coltivati nell'EVPL, i biofilm di P. aeruginosa e S. aureus dimostrano una maggiore tolleranza agli antibiotici rispetto alla suscettibilità nel MIC di brodo standard approvato dall'industria(figura 1)e i saggi a disco utilizzando supporti standard (Figura 2). I vari effetti di diversi antibiotici sul biofilm stabilito dall'EVPL sono distinguibili, ad esempio l'uccisione di P. aeruginosa si ottiene in EVPL con ciprofloxacina MIC 4-16X ma non con cloramfenicolo MIC 4-8X(Figura 1). Una dose due volte al giorno di 600 mg di linezolid raggiunge una concentrazione sierice superiore al_{MIC 90} per gli agenti patogeni sensibili (4 μg/mL)²⁷ ed è considerata un'esposizione adeguata senza effetti collaterali negativi²⁸. I dati presentati nella figura 2 mostrano che le popolazioni di S. aureus, suscettibili al linezolid nel saggio del disco, sono in grado di sopravvivere alle concentrazioni bersaglio di siero e superiori (12 μg/mL), nell'EVPL. Non esiste una chiara correlazione tra MIC ed effetti antibiotici sui biofilm coltivati con EVPL per P. aeruginosa (Figura 1). Ottenere una misura più accurata della tolleranza antibiotica in vivo è importante perché il dosaggio non ottimale degli antibiotici potrebbe aumentare il rischio di selezione per la resistenza all'infezione cronica.

È noto che la modalità di crescita del biofilm può ridurre significativamente la suscettibilità batterica agli antibiotici. Ciò ha portato allo sviluppo di molti saggi di biofilm in vitro e all'uso della concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC)^14,15 invece del MIC come predittore più accurato della suscettibilità nelle infezioni croniche. L'uso di SCFM (in formulazioni variabili) è stato raccomandato anche per l'uso in test MIC o MBEC²⁹. Qui mostriamo che anche un saggio ottimizzato in vitro non può prevedere con precisione la suscettibilità di P. aeruginosa alla colistina nell'EVPL. La quantità di antibiotico necessaria per ottenere_{l'abbattimento di batteri coltivati} con 3 log 10 è spesso significativamente superiore al MIC o all'MBEC calcolata sulla base di saggi standard in vitro, anche quando per questi saggi viene utilizzato SCFM(figura 3). Ciò è coerente con una revisione di Cochrane che ha riferito che le attuali implementazioni dei test di suscettibilità al biofilm in vitro non forniscono alcun aumento del potere predittivo per la prescrizione di antibiotici in CF rispetto ai test di suscettibilità standard¹⁶.

È anche semplice utilizzare il modello per valutare l'impatto degli antibiotici sui batteri del biofilm nel tempo, poiché è possibile inoculare un numero sufficiente di pezzi di polmone replica per consentire il campionamento distruttivo. Oltre a distinguere le differenze tra agenti antimicrobici, il modello può evidenziare cambiamenti nella suscettibilità in diversi stadi di crescita batterica o età del biofilm e per diversi intervalli di dosamento degli antibiotici. La figura 4 illustra la crescente tolleranza dei biofilm P. aeruginosa al meropenem man mano che maturano. Questo potrebbe essere utile per determinare l'efficacia dei nuovi agenti, ad esempio se sono più efficaci durante la rapida divisione cellulare. Può anche essere una considerazione importante quando si vengono imposti i vincoli di un esperimento, in quanto potrebbe essere necessario standardizzare e convalidare l'età del biofilm per evitare che l'età abbia un'influenza sui risultati.

Nella figura 5, la sopravvivenza di S. aureus è stata misurata a 4 ore e 24 ore dopo l'esposizione alla flucloxacillina ed è stato possibile osservare differenze nella riduzione del numero di cellule batteriche nel tempo e tra gli isolati. Ciò può essere utile per lo sviluppo di farmaci, ad esempio quando si definiscono parametri farmacocinetici e farmacodinamici o quando si chiarisce la modalità di azione di un nuovo agente.

Le variazioni della carica batterica spesso aumentano con tempi di coltura prolungati. Ciò può essere visto nel controllo non trattato nella figura 5 dopo lo sviluppo di biofilm di 48 ore e un'ulteriore esposizione di 24 ore per tenere conto dell'intervallo di dosamento degli antibiotici. La variazione è intrinseca al modello; ogni campione polmonare è indipendente dagli altri e riflette la variazione naturale dei polmoni. È quindi importante garantire che sia incluso un numero sufficiente di repliche per consentire la convalida e un'interpretazione accurata dei risultati. Rimando il lettore alla nostra raccomandazione di eseguire calcoli ripetuti sui dati per consentire la selezione di campioni robusti.

Per semplicità, abbiamo presentato dati rappresentativi tratti da sezioni di tessuto replicate acquisite da una singola coppia di polmoni in ogni esperimento, ma in pratica è necessario eseguire esperimenti ripetuti su sezioni tissutali prelevate da animali replicati. Questo dovrebbe essere fatto al fine di tenere conto di eventuali variazioni biologiche tra i singoli suini, e rimando il lettore al nostro lavoro pubblicato per esempi di quanto possano essere coerenti i risultati tra i tessuti prelevati dai suini replicati e come questa variazione sia contabilizzata nell'analisi statistica dei dati utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA)/modelli lineari generali (GLM)^21,26.

Figura 1. CFU totale di 11 isolati clinici CF Pseudomonas aeruginosa recuperati dal modello EVPL dopo il trattamento con antibiotici. Risultati rappresentativi del trattamento antibiotico di P. aeruginosa nel modello EVPL. Ogni ceppo è stato coltivato su tessuto EVPL per 48 h, quindi trasferito in antibiotico (triangoli) o PBS come controllo (cerchi) per 18 ore e il CFU / polmone determinato. Il MIC per l'antibiotico appropriato determinato in MHB standard regolato dal catione è mostrato tra parentesi accanto a ciascun ceppo (asse x). I ceppi sono ordinati aumentando i valori MIC. I dati sono stati analizzati utilizzando test t quando appropriato e test Mann-Whitney U per set di dati non parametrici. Differenze significative tra tessuti trattati con antibiotici e tessuti non trattati sono denotati da asterischi(P < 0,05). A. La commissione per l'a Conteggi validi recuperati dai biofilm P. aeruginosa coltivati nel modello EVPL e trattati con 64 μg/mL di cloramfenicolo (valore MIC più elevato registrato). Per ogni isolato, la differenza media standardizzata in CFU tra sezioni di tessuto trattato con cloramfenicolo e non trattate è stata calcolata utilizzando la d di Cohen. Non c'era correlazione tra il valore MIC nel test standard e la diminuzione del numero di cellule vitali nel modello EVPL misurata dalla d di Cohen (correlazione di rango di Spearman, r_s = 0,45, p = 0,16) B. Risultati dei biofilm P. aeruginosa coltivati nel modello EVPL e trattati con ciprofloxacina 64 μg/mL (valore MIC più elevato registrato). I valori al di sotto della linea tratteggiata erano inferiori al limite di rilevamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. CFU totale di 8 isolati clinici Staphylococcus aureus CF recuperati dal modello EVPL dopo il trattamento con linezolid. Ogni ceppo è stato coltivato su tessuto EVPL per 48 h, quindi trasferito al linezolid (triangoli) per 24 ore o non è stato trattato come controllo (cerchi). Tutti i ceppi sono stati trovati sensibili al linezolid utilizzando il saggio standard di diffusione del disco seguendo le linee guida EUCAST³⁰ (zona di inibizione > 21 mm). I dati sono stati analizzati utilizzando test t quando appropriato e test Mann-Whitney U per set di dati non parametrici(P < 0.05). Non sono state riscontrate differenze significative tra antibiotici trattati e non trattati per nessuno dei ceppi. I valori al di sotto della linea tratteggiata erano inferiori al limite di rilevamento. A. La commissione per l'a Risultati dei biofilm S. aureus nel modello EVPL trattati con linezolid 4 μg/mL (punto di rottura clinico per sensibili/resistenti secondo la classificazione EUCAST³¹). B. La commissione per l' Risultati dei biofilm S. aureus nel modello EVPL trattati con linezolid da 12 μg/mL (dati riprodotti da Sweeney et al^23). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Il numero di cellule pseudomonas aeruginosa vitali del ceppo di laboratorio PA14 e 4 isolati clinici CF recuperati dal modello EVPL dopo il trattamento con concentrazioni crescenti di coleinina. Ogni ceppo è stato coltivato su tessuto EVPL per 48 h, quindi esposto alla colistina per 18 ore. Il MIC determinato in mezzo MHB standard regolato dal catione è mostrato tra parentesi accanto a ciascun nome di deformazione. Le linee verticali mostrano il valore MBEC determinato in MHB (solido) e SCFM (tratteggiato), ad eccezione di SED6, in cui il valore era lo stesso in entrambi i supporti. I punti dati non riempiti rappresentano la più bassa concentrazione di colistina testata che ha comportato una riduzione ≥ di 3 log₁₀ del CFU/polmone rispetto ai campioni non trattati (0 μg/mL di colistina) (dati riprodotti da Sweeney et al²⁶). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. La cellula rappresentativa valida Pseudomonas aeruginosa conta da un corso di tempo di crescita sul modello EVPL superiore a 24 ore e dal successivo trattamento con meropenem da 64 μg/mL. Il ceppo di laboratorio P. aeruginosa PA14 e 3 isolati clinici CF sono stati coltivati sul tessuto EVPL per il tempo mostrato sull'asse x, quindi trasferiti al meropenem (triangoli) per 24 ore o lasciati non trattati come controllo (cerchi). Il CFU/polmone è stato quindi determinato. Il MIC determinato nel mezzo MHB regolato dal catione è mostrato tra parentesi accanto a ciascun nome di deformazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. La cellula stafilococco aurea rappresentativa e vitale conta in seguito alla crescita sul modello EVPL, quindi trattata con 5 μg/mL di flucloxacillina in un corso di 24 ore. Il ceppo di controllo ATCC29213 e due isolati clinici CF sono stati coltivati su tessuto EVPL per 48 h, quindi trasferiti alla flucloxacillina (triangoli) o lasciati non trattati come controllo (cerchi) per 4 ore e 24 ore, prima che fosse determinato CFU / polmone (dati riprodotti da Sweeney et al²³). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il modello polmonare ex vivo è ad alta produttività ed economico e, poiché utilizza rifiuti post-consumo dell'industria della carne, non presenta preoccupazioni etiche. È progettato per imitare le vie aeree CF umane cronicamente infette meglio di quanto attualmente disponibili, piattaforme AST in vitro. I risultati qui presentati mostrano che può prevedere più accuratamente la suscettibilità agli antibiotici in queste circostanze.

I passaggi critici del protocollo, che garantiranno risultati affidabili e riproducibili includono i seguenti:

1. Utilizzare metodi di conservazione e tempo coerenti tra la macellazione, la raccolta e l'elaborazione dei campioni polmonari. È importante utilizzare i polmoni il prima possibile dopo la macellazione e ridurre al minimo il potenziale di contaminazione. Sono state osservate differenze nella capacità delle colture sperimentali di crescere nei polmoni se non sono il più fresche possibile.
2. Mantenere la sterilità nella produzione di SCFM e la dissezione dei pezzi polmonari è essenziale. I polmoni sani non sono sterili e quindi la presenza di batteri commenali può riflettere un ambiente "naturale" per l'infezione cronica. Tuttavia, come notato in precedenza, le interazioni batteriche all'interno delle popolazioni multispecie possono alterare i risultati e la suscettibilità agli antibiotici, quindi la contaminazione dovrebbe essere evitata e i polmoni dovrebbero essere sterilizzati prima dell'uso. Sosteniamo l'uso della sterilizzazione UV, in quanto non sembra causare cambiamenti nell'integrità del tessuto di stagno e, se necessario, lavaggi antibiotici aggiuntivi. Tuttavia, gli antibiotici devono essere usati con cautela, in quanto possono influenzare i risultati introducendo pressioni selettive e possono alterare l'espressione genica nelle popolazioni batteriche in esame.
3. Utilizzare campioni di tessuto di controllo negativo finti e piastre di conteggio cellulare coltivati su un mezzo ricco e non selettivo per evidenziare la crescita di eventuali batteri contaminanti o commensali che non sono stati rimossi durante la sterilizzazione. Questo è essenziale per mitigare qualsiasi impatto di questi batteri sull'AST. È anche utile produrre agar duplicati e selettivi, piastre di conteggio cellulare specifiche dell'organismo di interesse, poiché le placche duplicate accelerano l'identificazione della colonia e l'enumerazione cellulare.
4. Condurre esperimenti pilota quando si utilizza per la prima volta il modello e quando lo si utilizza con nuovi ceppi o genotipi di batteri per valutare le variazioni di CFU del biofilm tra le sezioni tissutali, consentendo la selezione di dimensioni sperimentali ottimali del campione (ad esempio, quante sezioni di tessuto replicate acquisire da quanti polmoni replicati) attraverso l'uso di calcoli di potenza.
5. Il saggio utilizza un inoculo non standardizzato, in quanto ciò consente una rapida inoculazione dopo 48 ore di incubazione e la formazione di carichi di biofilm relativamente coerenti (specialmente per P. aeruginosa). Per saggiare l'efficacia antibatterica nelle prime fasi di crescita del biofilm, considera di inoculare con un CFU standardizzato di batteri coltivati a colonia sospesi in ASM. Non consigliamo di inoculare con batteri planctonici: i primi esperimenti pilota hanno dimostrato che questo porta a una crescita acuta e invasiva non a una formazione affidabile di biofilm.

Questo protocollo produce un robusto modello prototipo da utilizzare con P. aeruginosa, con un grande potenziale di sviluppo per l'uso con S. aureus, ma ha alcune limitazioni che dovranno essere affrontate per alcune applicazioni in futuro. Il tessuto è stato inoculato da singole colonie per consentire lo sviluppo delle popolazioni clonali. I risultati mostrano che, per P. aeruginosa, questo ha un impatto minimo sui numeri delle cellule a 48 ore. Tuttavia, è stata osservata una maggiore variabilità nella carica batterica per S. aureus e, dato che batteri diversi possono crescere in modo diverso all'interno del modello, un inoculo iniziale standardizzato e una rigorosa produzione di campioni di tessuto di dimensioni e peso identici possono dipendere dall'organismo di studio. Ci possono anche essere differenze tra i laboratori a causa delle differenze nelle tecniche di dissezione / infezione precise o nella razza / razza di terra dei suini locali. Per valutare la riproducibilità delle popolazioni batteriche per le singole implementazioni del modello, suggeriamo l'uso di calcoli di ripetibilità come parte dell'analisi statistica dei^{risultati 25} e l'uso di calcoli di ripetibilità/potenza basati su esperimenti pilota per calcolare la dimensione ottimale del campione per il loro utilizzo negli esperimenti finali.

Uno dei principali vantaggi dell'EVPL rispetto ai test tradizionali delle lastre è che, piuttosto che testare i batteri che crescono planctonicamente o su superfici abiotiche, consente la strutturazione spaziale di biofilm batterici all'interno di un ambiente ospite e con differenziazione cellulare. Ciò ha importanti implicazioni per considerare l'impatto dei gradienti fisiochimici e nutritivi sull'attività degli agenti antimicrobici, nonché la consegna e la disponibilità di terapie attive in diversi microambientati all'interno di un'infezione cronica e interazione cellula-cellula tra batteri. Quest'ultimo punto è particolarmente significativo, in quanto le infezioni da multispecie sono regolarmente osservate in CF e stanno diventando sempre più importanti per le infezioni associate ad altre condizioni respiratorie, come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva. Esiste il potenziale per sviluppare questo modello per l'AST per il campionamento individualizzato dell'espettorato del paziente nella diagnostica clinica. Uno studio analogo è già in corso utilizzando un modello in vitro per la crescita e L'AST di biofilm debrided da ferite croniche (Southwest Regional Wound Care Center a Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).

Inoltre, il modello utilizza tessuto post-mortem, quindi l'influenza della risposta immunitaria dell'ospite sulla suscettibilità agli antibiotici è limitata. Anche gli attuali modelli in vitro non tengono conto delle risposte immunitarie dell'ospite, quindi non lo vediamo come una barriera all'uso futuro del modello nelle applicazioni AST. Tuttavia, la risposta immunitaria viene presa in considerazione quando vengono determinati parametri farmacocinetici e farmacodinamici e linee guida per il dosamento degli antibiotici. Sebbene i nostri studi abbiano mostrato prove di cellule immunitarie residue e risposte all'interno^{del tessuto 23} (e S. Azimi, comunicazione personale), questa è un'area privilegiata per un'ulteriore ottimizzazione e sviluppo del modello se si desidera una maggiore corrispondenza con le condizioni in vivo.

Fornire un AST più clinicamente valido per cf aiuterà a soddisfare una raccomandazione chiave del Uk Health, Social Care Act 2008 che "dovrebbero essere in atto procedure per garantire una prescrizione prudente e una gestione antimicrobica". Crediamo che l'EVPL sia un modello candidato ideale per aiutare a soddisfare questa esigenza.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes	MP Biomedicals	116004500	FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates	Diversified Biotech	BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner
Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes	Thermo Fisher	15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads	Thermo Fisher	15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached.	VWR	BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit	Thermo Fisher	10474415	For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.