Antibiotikaeffekttestning i en Ex vivo-modell av Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus Biofilms i cystisk fibros lunga

Summary

Detta arbetsflöde kan användas för att utföra antibiotikakänslighetstestning med hjälp av en etablerad ex vivo-modell av bakteriell biofilm i lungorna hos individer med cystisk fibros. Användning av denna modell kan förbättra den kliniska giltigheten av MBEC (minimal biofilm utrotning koncentration) analyser.

Abstract

Den effektiva förskrivningen av antibiotika för bakteriella biofilmer som finns i lungorna hos individer med cystisk fibros (CF) begränsas av en dålig korrelation mellan ast-resultat (antibiotic susceptibility testing) med hjälp av standarddiagnosmetoder (t.ex. buljongmikrodilution, diskdiffusion eller Etest) och kliniska resultat efter antibiotikabehandling. Försök att förbättra AST genom användning av off-the-shelf biofilm tillväxtplattformar visar liten förbättring av resultaten. Den begränsade förmågan hos in vitro biofilmsystem att efterlikna den fysikaliskkemiska miljön i CF lungan och, därför bakteriell fysiologi och biofilm arkitektur, fungerar också som en broms på upptäckten av nya terapier för CF-infektion. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra AST av CF patogener odlas som mogna, in vivo-liknande biofilmer i en ex vivo CF lungmodell bestående av gris bronkiolär vävnad och syntetisk CF sputum (ex vivo gris lunga, EVPL).

Flera in vitro-analyser finns för biofilmskänslighetstestning, med antingen standard laboratoriemedium eller olika formuleringar av syntetisk CF-sputum i mikrotiterplattor. Både tillväxtmedium och biofilmssubstrat (polystyrenplatta vs. bronkolär vävnad) kommer sannolikt att påverka biofilmantibiotiska tolerans. Vi visar ökad tolerans för kliniska Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus isolat i ex vivo modellen; Effekterna av antibiotikabehandling av biofilmer är inte korrelerade med den lägsta hämmande koncentrationen (MIC) i standardanalyser för mikrodilution eller en känslig/resistent klassificering i diskdiffusionsanalyser.

Ex vivo-plattformen skulle kunna användas för skräddarsydd biofilm AST av patientprover och som en förbättrad testplattform för potentiella antibiofilmsmedel under läkemedelsforskning och utveckling. Att förbättra receptet eller accelerationen av antibiofilm läkemedelsupptäckt genom användning av mer in vivo-liknande testplattformar kan drastiskt förbättra hälsoresultaten för individer med CF, samt minska kostnaderna för klinisk behandling och upptäcktsforskning.

Introduction

Kroniska biofilmsinfektioner drabbar individer vars normala immunförsvar äventyras. Riskgrupper inkluderar de med det genetiska tillståndet cystisk fibros (CF)¹. Kolonisering av onormalt tjock, självhäftande slem i luftvägarna i tidig barndom leder till svårbehandlade biofilminfektioner i bronkiolerna^2,3. Tillväxten av bakterier som omfattande matrisinkapslade biofilmer är en faktor som skiljer kroniska infektioner hos immunkomprometterade människor från akuta infektioner hos friska värdar och biofilmstillståndet skyddar båda bakterier från antibiotikaexponering (på grund av minskad diffusion genom matrisen) och minskar deras antibiotikakänslighet (t.ex. genom induktion av quiescence eller uppreglering av effluxpumpar)^4,5. Sjukdomsspecifika förändringar i värdvävnadsfysiologi och kemi förändrar dock ytterligare bakteriefysiologin från den som observerats vid akuta infektioner eller i normala laboratorietillväxtförhållanden. Viktiga exempel inom CF inkluderar användning av ovanliga kolkällor, såsom fettsyror och aminosyror som frigörs från lungsurfaktant och produceras genom mikrobiell nedbrytning av mucin, frisättning av mikronäringsämnen, såsom järn från skadade vävnader, och mikroatobios^6,7,8.

De specifika fysikalisk-kemiska förhållandena i ett visst biofilmsinfektionssammanhang kan därför påverka svaren på antibiotika. För det första beror strukturen och djupet på den extracellulära matrisen på lokala miljöförhållanden, såsom näringsämnen eller savkrafter. För det andra kan miljösignaler utlösa uttryck för specifika antibiotikaresistensgener. Till exempel visar CF patogenen Pseudomonas aeruginosa ökat uttryck för en beta-laktamas och minskat uttryck av poriner i CF sputum kontra in vitro⁹, medan en annan CF patogen, Burkholderia cenocepacia, uppreglerar beta-laktamaser och efflux pumpar när de odlas i CF sputum¹⁰. För det tredje kan värdförhållanden leda till en fysiologisk eller genetisk övergång till antibiotikatoleranta fenotyper, som är svåra att rekapitulera in vitro. Dessa inkluderar små kolonivarianter av CF patogen staphylococcus aureus^11,12.

Alla dessa data indikerar att när diagnostiska laboratorier isolerar enskilda kloner från patogen biofilm och utför AST på planktoniska eller agarplåtodlade kulturer i standard laboratoriemedier (buljongmikrodilution, diskdiffusion eller Etest), förutspår resultaten ofta inte vilka antibiotika som faktiskt kommer att fungera in vivo. Även om biofilmsanalyser in vitro används får de inte visa en in vivo-liknande biofilms fenotyp på grund av skillnader i den medium- och fästyta som används, så analyser med hjälp av flödesceller eller mikroplåtsplattformar med högt genomströmning kan överskatta antibiotikakänsligheten¹³. Samma problem gäller forskare inom akademi och industri som försöker utveckla nya antibiofilmsmedel: att testa läkemedelspotentialen med hjälp av in vitro-plattformar som flödesceller, mikrotiterplattor eller Biofilmreaktorer för center for Disease Control kan sätta biofilmseffektstången för låg och producera falska positiva resultat i forsknings-, utvecklingspipeline.

Den dåliga korrelationen mellan AST resultat och kliniska resultatet efter antibiotiska behandling i CF är välkänd. Många kliniker ignorerar helt enkelt diagnostiska lab AST eftersom det inte finns några enhetliga, CF-specifika riktlinjer för att tolka dessa resultat och istället fatta beslut från fall till fall för förskrivning. Försök har gjorts att förbättra CF AST med hjälp av Calgary biofilm enhet, som använder biofilm som odlas på ytan av plastpinnar som är inställda i brunnarna i en mikroplatta som innehåller standard AST medium (t.ex. katjonjusterad Muller-Hinton buljong)^14,15. Denna analys gör inte bättre på att förutsäga vilka antibiotika som kommer att fungera in vivo än standard planktonISK AST¹⁶. Påverkan på patienter med CF är stark. Trots upprepad antibiotika administrering (regelbunden inhalerad antibiotika och en median på 27 dagar/år som får intravenös antibiotika för individer med CF i Storbritannien)¹⁷, leder frekventa och oförutsägbara episoder av akut lungförvärring till progressiva lungskador och, i cirka 90% av fallen, död från andningssvikt. I en nyligen genomförd analys var bakteriell lunginfektion den starkaste prediktorn för läkemedelskostnader i CF, vilket i genomsnitt lade till € 3.6K / patient / år för att rikta^{sjukvårdskostnaderna 18,19}.

För akuta infektioner hos annars friska individer är aktuell forskning och politik med fokus på snabb AST baserad på till exempel point-of-care genomisk förutsägelse idealisk²⁰. Men när det gäller kroniska CF-infektioner är det uppenbart att ett annat tillvägagångssätt behövs: genomförandet av AST i värd-härmande modeller som bättre rekapitulera in vivo-miljön och patogenmetaboliskt tillstånd och möjliggör bildandet av realistisk biofilmstruktur.

Vi har tidigare utvecklat en CF biofilm modell som omfattar delar av gris bronkiol inkuberas i syntetisk CF sputum och infekteras med P. aeruginosa eller S. aureus. Oinfekterad EVPL behåller normal histopatologi i 7 dagar men lab eller kliniska isolat av P. aeruginosa och S. aureus bildar reproducerbart in vivo-liknande aggregat runt vävnaden, härma etiologin för CF-infektion^21,22,23. Vi presenterar ett protokoll för att använda denna hög giltighets-, höggenomströmningsmodell som en skräddarsydd biofilm AST-plattform för CF och presenterar exemplariska resultat som visar den höga toleransen för patogena biofilmer till kliniskt använda antibiotika när de odlas i modellen. Modellen skulle lätt kunna införlivas i forskning, utvecklingspipeline för hantering eller förebyggande av biofilmsbildning och potentiellt i diagnostisk AST. De flesta utrustningar som används (se Tabell över material) kan lätt hittas i ett typiskt mikrobiologilaboratorium, även om en pärlslagare är nödvändig, och vi har funnit från arbete med samarbetspartners att ett lämpligt ultraviolett germicidalskåp också kan behöva anskaffas. Eftersom lungorna kommer från kommersiella slaktare eller slakterier utgör modellen inga etiska problem.

Protocol

Detta protokoll använder grislungor som kommer från ett kommersiellt slakteri som levererar kött som livsmedel. Enligt brittisk lagstiftning kräver användning av överbliven vävnad från djur som slaktats för kött inte etiskt godkännande. Vi råder läsarna att kontrollera relevanta lokala lagar och institutionella riktlinjer innan de börjar arbeta.

1. Förberedelse av syntetiska CF Sputum Media (SCFM)

1. För att göra SCFM för användning med EVPL-vävnad, följ receptet som beskrivs av Palmer et al.²⁴ med ändringen att glukos tas bort från receptet.
   OBS: Palmer et al.s recept innehåller fria aminosyror, cations, anjoner och laktat vid koncentrationer som är representativa för de genomsnittliga koncentrationer som finns i ett urval av sputum prover från CF patienter. det har visat sig cue jämförbara kolanvändning vägar och uttryck för kvorum avkänning signaler av P. aeruginosa PA14 till tillväxt i medium gjord av lyophilised patienten sputum²⁴. Ett recept på 1 L modifierad SCFM levereras i tabell S1.
2. Filtrera sterilisera SCFM omedelbart efter beredningen och förvara vid 4 °C i upp till 1 månad.

2. Dissekering och infektion av ex vivo gris lungvävnad (EVPL)

1. Före dissekering, förbered en agarplatta/s av nödvändig bakteriestam/s för infektion med vilken agar som helst som är standard i labbet för P. aeruginosa/S. aureus (t.ex. lysogen buljong + 1,2% agar).
2. Beräkna hur många svin bronkiolvävnadsbitar som krävs för experimentet, inklusive oinfekterade kontrollvävnadsbitar. Multiplicera detta tal med två för att upprepa experimentet i två replikerade lungor för att bekräfta repeterbarhet av resultaten.
3. Multiplicera det totala antalet vävnadsbitar som krävs enligt 0,5 för att bestämma volymen SCFM-agarosa (mL) som behövs för att göra agaroskuddar för att göra tillräckligt med medium för 400 μL/ vävnadsstycke plus reserv SCFM-agar för att ta hänsyn till eventuella rörfel eller avdunstning under beredningen.
4. Tillsätt 0,12 g agarose till varje 15 ml SCFM som krävs för att göra önskad total volym SCFM med 0,8% vikt / volym agarose.
5. Värm SCFM-agaroslösningen tills agarosen är helt upplöst. En inhemsk mikrovågsugn med låg effekt rekommenderas. Den tid som krävs beror på mikrovågsugnens wattal. Låt agarosen svalna till ca 50 °C (varm vid beröring men bekväm att hålla). Låt inte svalna ytterligare.
6. Använd en pipett och tillsätt 400 μL SCFM-agarosa till en brunn med en 24-brunnsplatta per vävnadsbit som behövs.
7. Sterilisera SCFM-agaroshaltiga 24-brunnsplattan/plattan/s under ultraviolett ljus i 10 minuter.
8. Förbered tre replikattvättar för varje intakt lunga som dissekeras med 20 ml sterilt Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) plus 20 ml sterilt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kompletterat med 50 μg/mL ampicillin.
9. Gör en alikvot på 40 ml SCFM som en sluttvätt för varje intakt lunga som dissekeras. Alla tvättar kan förvaras över natten vid 4 °C eller användas omedelbart.
10. Få lungor från den angivna källan så snart som möjligt efter slakt, se till att de hålls kalla genom att transportera till laboratoriet i en inhemsk kylbox.
    OBS: Lungor närmare slaktdagen visar mindre blåmärken från lagring, men vävnad som hålls på kylförvaring i upp till 4 dagar från slakt kan också användas. Eftersom kylboxen måste tas in i slaktarens butik eller slakteri måste den saneras enligt lokala labbriktlinjer efter varje användning och lagras utanför mikrobiologilabbet när den inte används, för att minska risken för kontaminering och brott mot inneslutningen.
11. Arbeta på en steriliserad yta och under en flamma, placera lungorna på en ren plasthackbräda täckt med autoklaverad aluminiumfolie. Kontrollera att bronkolerna förblir intakta. Om det har upp varit några skador på slakteriet eller under transporten är lungorna inte lämpliga för användning.
12. Värm en palettkniv under en flamma och rör mycket kort kniven till lungområdet som omger bronkiolen för att sterilisera vävnadens yta.
13. Skär bort ytvävnaden som omger bronkiolen med ett sterilt monterat rakblad. Gör snitt parallellt med bronkiolen för att förhindra skador.
14. När bronkiolen har exponerats, gör ett tvärsnittssnitt genom bronkiolen vid den högsta punkten synlig för att frigöra bronkiolen.
15. Använd sterila tångar, håll lätt bronkiolens fria ände och skär bort eventuell återstående oönskad vävnad med ett sterilt monterat rakblad. Gör ett sista tvärsnittssnitt över bronkiolen innan någon förgrening är synlig för att ta bort bronkiolen från lungorna.
16. Placera bronkiolen i den första DMEM/RPMI 1640 tvätten. Lämna bronkiolen i tvätten och upprepa steg 2.11-2.14 för att skörda ytterligare delar av bronkiol från samma lunga som krävs för att ge tillräckliga vävnadssektioner för det planerade experimentet.
17. Placera eventuella ytterligare bronkolsektioner från samma lunga i tvätten (steg 2.16). Låt tvätta i minst 2 minuter.
18. Ta bort bronkolerna från den första DMEM/RPMI 1640-tvätten och placera proverna i en steril Petri-skål.
19. Håll varje bronkiol lätt med sterila tångar, se till att inte skada vävnaden. Ta bort så mycket kvarvarande mjukvävnad som möjligt och skär vävnaden i ~ 5 mm breda remsor med steril dissekeringssax.
20. Placera alla bronkiolvävnadsremsor i den andra DMEM/RPMI 1640-tvätten. Låt tvätta i minst 2 minuter.
21. Ta bort vävnadsremsorna från den andra tvätten med sterila tångar, var försiktig så att vävnaden inte skadas. Placera vävnaden i en ren, steril Petri-skål.
22. Ta bort eventuell återstående mjukvävnad som är fäst vid bronkiolen och skär remsorna i rutor (~ 5 mm x 5 mm) med steril dissekeringssax.
23. Tillsätt den tredje DMEM/RPMI 1640-tvätten i Petri-skålen. Blanda vävnadsbitarna lätt i tvätten genom att virvla runt skålen.
24. Häll den tredje tvätten ur Petri-skålen utan att ta bort vävnadsbitarna.
25. Tillsätt den slutliga SCFM-tvätten i den vävnadsinnehållande Petri-skålen och se till att alla vävnadsbitar är täckta.
26. Sterilisera vävnadsbitarna i SCFM under UV-ljus i 5 minuter.
27. Använd sterila tångar för att överföra varje steriliserad bronkiolär vävnadsbit till enskilda brunnar av en 24-brunnsplatta/s som innehåller SCFM-agarosakuddar.
28. För att infektera varje vävnadsbit med önskad bakteriestam, rör vid en koloni som odlas på en agarplatta med spetsen av en 29 G nål fäst vid en steril 0,5 ml insulinspruta. Rör sedan kolonin på vävnadsbiten och stick försiktigt vävnadsytan.
    OBS: Om du använder en insulinspruta utrustad med en 29 G-nål kan nålen hållas exakt och bekvämt samtidigt som fingrarna hålls på säkert avstånd från både nålen och lungvävnaden. Det är möjligt att utföra detta steg med 29 G nålar som inte är fästa vid en spruta, men detta kräver större fingerfärdighet och ökar risken för en nålsticksskada. Insulinsprutor är lätt tillgängliga.
29. För de oinfekterade kontrollerna, stick försiktigt ytan på var och en av vävnadsbiten med spetsen av en 29 G nål fäst vid en steril 0,5 ml insulinspruta.
30. Använd en pipett för att tillsätta 500 μL SCFM till varje brunn.
31. Sterilisera ett tätningsmembran som andas för varje 24-brunnsplatta under ultraviolett ljus i 10 min(Materialförteckning).
32. Ta bort locket/locken från 24-brunnsplattan/plattan/plattan och byt ut med det ventilerande membranet.
33. Inkubera plattorna vid 37 °C under önskad inkubationstid utan skakningar. Kontrollera att det inte finns någon synlig tillväxt av den inokulerade patogenen på de oinfekterade kontrollbitarna (kontamineringskontroll).
    OBS: Om så önskas kan ampicillin tillsättas SCFM-agaroskuddarna i steg 2.5 och täcka SCFM i steg 2.30 till en slutlig koncentration på 20 μg/ml. Detta kommer att undertrycka tillväxten av de flesta endogena bakterier på lungorna utan att påverka P. aeruginosa eller S. aureus tillväxt men, eftersom förekomsten av ampicillin kan påverka mottagligheten för andra antibiotika, läsaren lämnas att göra detta val beroende på de stammar och antibiotika de vill testa.

3. Bestämning av antibiotikaeffekt

OBS: Ett schema med detaljerade detaljer om stegen i denna analys finns i figur S1.

1. För att mäta antibiotikatoleransen hos biofilmer som bildas på EVPL måste replikera uppsättningar av lungbitar, från minst två oberoende lungor, ställas in under dissekeringen och infektionen. En uppsättning bitar krävs för en negativ kontroll (ingen antibiotikabehandling), och en uppsättning krävs för att varje koncentration av antibiotika ska testas.
2. Efter 48 timmars inkubation, inspektera de oinfekterade vävnadsbitarna visuellt. Viss tillväxt av bakterier endogena till gris lungan kan ha inträffat, vilket leder SCFM runt dessa avsnitt att vara grumlig. Om tillväxt som är typisk för de utvalda studiearterna observeras (t.ex. blågrön pigmenteringsdiagnostik av P. aeruginosa),starta experimentet med färska lungor igen.
3. Om de oinfekterade vävnadssektionerna inte visar någon eller endast minimal bakterietillväxt, förbered en 24-brunns tvättplatta och en 24-brunnsbehandlingsplatta, som var och en innehåller 500 μL färsk SCFM utan antibiotika eller med antibiotika av intresse per brunn per lungvävnadsbit.
4. Ta bort varje infekterad vävnadsbit från inkubationsplattan med flamsteriliserade tångar, snurra kort i en frisk brunn på tvättplattan för att ta bort eventuella icke-biofilm associerade bakterieceller och överföra till lämplig brunn på behandlingsplattan.
5. Försegla behandlingsplattorna med färskt andningsbart membran.
6. Inkubera behandlingsplattan/behandlingsplattan vid 37 °C utan att skaka i 18-24 timmar.
7. Använd flamsteriliserade tångar, ta bort varje lungstycke från 24-brunnsplattan och lägg i ett sterilt 2 ml homogeniseringsrör som innehåller 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 1 g metallpärlor (Materialförteckning).
8. Pärlan slog i 40 sekunder på 4 m/s.
   OBS: Pärlor som slår med de specifika pärlor och homogenisatorer som föreslås i materialförteckningen orsakar inte signifikant lys av bakterier, men varje labb som använder protokollet bör kontrollera effekterna av sina valda pärlor och homogenisator innan AST-analyser påbörjas.
9. Späd lunghomogenatet seriellt med PBS och plattan på Lysogeny Broth (LB) agar för att bestämma koloniformningsenheterna (CFU) i enskilda obehandlade och antibiotikabehandlade vävnadsbitar enligt standardpläteringsmetoder.
   OBS: Valfritt: Förbered dubblettplattor på selektiva medier för att bekräfta koloniidentiteter; t.ex. användning av mannitolsalt agar för S. aureus.

Representative Results

EVPL-modellen ger en plattform för hög genomströmningsanalys, vilket gör det möjligt att screena ett stort antal bakterieisolat för antibiotikakänslighet på en gång (figur 1 och 2) eller att screena stammar mot en rad antibiotikakoncentrationer i ett experiment (figur 3). Med övning har vi funnit att cirka 200 bronkiolära vävnadssektioner kan förberedas från lungor på 2 timmar. Hela experimentet för AST kan slutföras inom normal arbetstid. Tillväxten av Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureusisolat och etableringen av 48 h biofilm i modellen är tillförlitlig och, när den övervakas av livskraftigt cellantal, producerar konsekvent bakteriebelastning (figurerna 1 och 2). Bilder av vävnadsrelaterade biofilmer av Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus odlas i EVPL kan hittas, tillsammans med protokoll för förberedelse för ljusmikroskopi och histologisk färgning, i våra publikationer^21,23. CFU:s reproducerbarhet varierar dock för olika bakteriearter. Detta kan kvantifieras med hjälp av standardberäkningar av repeterbarhet efter ANOVA^25; vi har funnit att det vanligtvis finns större variation mellan CFU i replikerade lungprover för S. aureus än för P. aeruginosa. Vi rekommenderar att upprepade beräkningar utförs på pilotexperiment för att optimera experimentella tekniker och bestämma provstorlekar som ska användas i slutliga experiment (ett exempel på detta finns i datatillägget för Sweeney et al²⁶).

När biofilmerna P. aeruginosa och S. aureus odlas i EVPL visar de ökad tolerans mot antibiotika jämfört med känslighet i standard, branschgodkänd buljongmikrofon(figur 1)och skivanalyser med hjälp av standardmedier(figur 2). De olika effekterna av olika antibiotika på EVPL etablerad biofilm är urskiljbara, till exempel P. aeruginosa dödande uppnås i EVPL med 4-16X MIC ciprofloxacin men inte med 4-8X MIC kloramfenikol (Figur 1). En två gånger dagligen dos på 600 mg linezolid uppnår en serumkoncentration över MIC₉₀ för mottagliga patogener (4 μg/ml)²⁷ och anses vara tillräcklig exponering utan biverkningar²⁸. Data som presenteras i figur 2 visar att S. aureuspopulationer, mottagliga för linezolid i skivanalysen, kan överleva målserumkoncentrationer och högre (12 μg/ml) i EVPL. Det finns inget tydligt samband mellan MIC och antibiotikaeffekter på EVPL-odlade biofilmer för P. aeruginosa (Figur 1). Att få ett mer exakt mått på in vivo-antibiotikatolerans är viktigt eftersom suboptimal dosering av antibiotika kan öka risken för urval för resistens vid kronisk infektion.

Det är välkänt att biofilmsläget för tillväxt avsevärt kan minska bakteriell mottaglighet för antibiotika. Detta har lett till utvecklingen av många in vitro biofilm analyser och användningen av minsta biofilm utrotning koncentration (MBEC)^14,15 istället för MIC som en mer exakt prediktor för mottaglighet vid kronisk infektion. Användning av SCFM (i olika formuleringar) har också rekommenderats för användning vid MIC- eller MBEC-testning²⁹. Här visar vi att även en optimerad in vitro-analys inte exakt kan förutsäga P. aeruginosa mottaglighet för colistin i EVPL. Den mängd antibiotika som krävs för att uppnå 3 log_10-avlivning av EVPL-odlade bakterier är ofta betydligt högre än MIC eller MBEC beräknat utifrån standardin vitro-analyser, även när SCFM används för dessa analyser (figur 3). Detta överensstämmer med en Cochrane-granskning som rapporterade att nuvarande implementeringar av in vitro biofilm mottaglighet testning inte ger någon ökad prediktiv effekt för antibiotika förskrivning i CF jämfört med standard känslighet testning¹⁶.

Det är också enkelt att använda modellen för att bedöma antibiotikas inverkan på biofilmsbakterier över tid, eftersom tillräckliga replika bitar av lungan kan vaccinerars för att möjliggöra destruktiv provtagning. Förutom att skilja skillnader mellan antimikrobiella medel kan modellen belysa förändringar i mottaglighet vid olika bakterietillväxtstadier eller biofilmsålder och för olika antibiotikadämpande intervaller. Figur 4 illustrerar den ökande toleransen för P. aeruginosa biofilms till meropenem när de mognar. Detta kan vara användbart för att bestämma effekten av nya medel, till exempel om de är mer effektiva under snabb celldelning. Det kan också vara en viktig faktor när man fastställer begränsningarna för ett experiment, eftersom det kan vara nödvändigt att standardisera och validera biofilmåldern för att undvika att åldern påverkar resultaten.

I figur 5 mättes S. aureus överlevnad vid 4 h och 24 h post exponering för flucloxacillin och det var möjligt att observera skillnader i minskningen för bakteriella cellantal över tid och mellan isolat. Detta kan vara användbart för läkemedelsutveckling, till exempel vid definition av farmakokinetiska och farmakodynamiska parametrar eller när man belyser ett nytt medels verkningssätt.

Variationer i bakteriebelastning ökar ofta med förlängda odlingstider. Detta kan ses i den obehandlade kontrollen i figur 5 efter 48 h biofilmsutveckling och ytterligare 24 h exponering för att ta hänsyn till antibiotikadämpande intervall. Variation är inneboende i modellen; varje lungprov är oberoende av andra och återspeglar den naturliga variationen av lungor. Det är därför viktigt att se till att ett tillräckligt antal replikat ingår för att möjliggöra validering och en korrekt tolkning av resultaten. Vi hänvisar läsaren tillbaka till vår rekommendation att göra upprepade beräkningar på data för att möjliggöra val av robusta provstorlekar.

För enkelhetens skull har vi presenterat representativa data från replikerade vävnadssektioner som förvärvats från ett enda par lungor i varje experiment, men i praktiken är det nödvändigt att utföra upprepade experiment på vävnadssektioner som tagits från replikerade djur. Detta bör göras för att ta hänsyn till eventuella biologiska variationer mellan enskilda grisar, och vi hänvisar läsaren till vårt publicerade arbete för exempel på hur konsekvent resultaten kan vara mellan vävnader som tagits från replikerade grisar och hur denna variation beaktas i statistisk analys av data med hjälp av variansanalys (ANOVA)/allmänna linjära modeller (GLM)^21,26.

Figur 1. Total CFU av 11 CF Pseudomonas aeruginosa kliniska isolat återhämtade sig från EVPL-modellen efter behandling med antibiotika. Representativa resultat av antibiotikabehandling av P. aeruginosa i EVPL-modellen. Varje stam odlades på EVPL vävnad i 48 h sedan överförs till antibiotikum (trianglar) eller PBS som en kontroll (cirklar) för 18 h och CFU/lung bestämd. Mikrofonen för lämpligt antibiotikum som bestäms i standard katjonjusterad MHB visas inom parentes bredvid varje stam (x-axel). Stammarna beställs genom att öka MIC-värdena. Data analyserades med hjälp av t-tester när det var lämpligt och Mann-Whitney U-tester för icke-parametriska datamängder. Signifikanta skillnader mellan antibiotikabehandlade och obehandlade vävnader betecknas med asterisker (P < 0,05). A. Återvunna livskraftiga antal från P. aeruginosa biofilmer som odlas i EVPL-modellen och behandlas med 64 μg/ml kloramfenikol (högsta registrerade MIC-värde). För varje isolat beräknades den standardiserade genomsnittliga skillnaden i CFU mellan kloramfenikolbehandlade och obehandlade vävnadssektioner med Cohens d. Det fanns inget samband mellan MIC-värdet i standardtestet och minskningen av livskraftiga cellnummer i EVPL-modellen mätt med Cohens d (Spearmans rankkorrelation, r₌ 0,45, p = 0,16) B. Resultat av biofilmerna P. aeruginosa som odlas i EVPL-modellen och behandlas med 64 μg/mL ciprofloxacin (högsta registrerade MIC-värde). Värdena under den streckade linjen låg under detektionsgränsen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2. Total CFU av 8 Staphylococcus aureus CF kliniska isolat återhämtade sig från EVPL modellen efter behandling med linezolid. Varje stam odlades på EVPL vävnad i 48 h sedan överförs till linezolid (trianglar) i 24 h eller var obehandlade som en kontroll (cirklar). Alla stammar visade sig vara känsliga för linezolid med hjälp av standarddiskens diffusionsanalys enligt EUCAST:s^{riktlinjer 30} (> 21 mm). Data analyserades med hjälp av t-tester när det var lämpligt och Mann-Whitney U-tester för icke-parametriska datamängder(P < 0,05). Inga signifikanta skillnader mellan antibiotikabehandlade och obehandlade hittades för någon av stammarna. Värdena under den streckade linjen låg under detektionsgränsen. A. Resultat av S. aureus biofilms i EVPL-modellen som behandlats med 4 μg/ml linezolid (klinisk brytpunkt för känslig/resistent enligt EUCAST-klassificering³¹). B. Jag är inte så bra på Resultat av S. aureus biofilms i EVPL-modellen behandlade med 12 μg/ml linezolid (data som återges från Sweeney et al²³). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 3. Livskraftiga Pseudomonas aeruginosa cellantal av laboratoriestammen PA14 och 4 CF kliniska isolat återhämtade sig från EVPL-modellen efter behandling med ökande koncentrationer av colistin. Varje stam odlades på EVPL vävnad i 48 h sedan exponeras för kolistin i 18 h. Mikrofonen som bestäms i standard katjonjusterat MHB-medium visas inom parentes bredvid varje stamnamn. De lodräta linjerna visar MBEC-värdet som bestäms i MHB (solid) och SCFM (streckad), med undantag för SED6, där värdet var detsamma i båda mediet. De ofyllda datapunkterna representerar den lägsta koncentrationen av kolistintest som resulterade i ≥ 3-log_10-minskning av CFU/lungkompilerade till obehandlade prover (0 μg/mL colistin) (data som reproducerats från Sweeney et al²⁶). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4. Representativ livskraftiga Pseudomonas aeruginosa cell räknas från en tidsförloppet av tillväxt på EVPL modellen över 24 h, och efterföljande behandling med 64 μg/mL meropenem. Laboratoriestammen P. aeruginosa PA14 och 3 CF kliniska isolat odlades på EVPL vävnad för den tid som visas på x-axeln, sedan överförs till meropenem (trianglar) för 24 h eller lämnas obehandlad som en kontroll (cirklar). CFU/lungan fastställdes sedan. Den MIC som bestäms i katjonjusterat MHB-medium visas inom parentes bredvid varje stamnamn. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5. Representativ livskraftig Staphylococcus aureus cell räknas efter tillväxt på EVPL-modellen sedan behandlas med 5 μg/mL flucloxacillin över en 24 h tid kurs. Kontrollstammen ATCC29213 och två CF kliniska isolat odlades på EVPL vävnad i 48 h sedan överförs till flucloxacillin (trianglar) eller lämnades obehandlade som en kontroll (cirklar) i 4 h och 24 h, innan CFU/lung fastställdes (data reproduceras från Sweeney et al²³). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur S1. Klicka här för att ladda ner den här siffran.  

Bord S1. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.  

Discussion

Ex vivo-lungmodellen är hög genomströmning och billig, och eftersom den använder avfall efter konsument från köttindustrin utgör den inga etiska problem. Det är utformat för att efterlikna kroniskt infekterade mänskliga CF-luftvägar bättre än vad som för närvarande finns tillgängligt, in vitro AST-plattformar. Resultaten som presenteras här visar att det mer exakt kan förutsäga antibiotikakänslighet under dessa omständigheter.

Kritiska steg i protokollet som säkerställer, tillförlitliga och reproducerbara resultat inkluderar följande:

1. Använd konsekventa tids- och lagringsmetoder mellan slakt, insamling och bearbetning av lungprover. Det är viktigt att använda lungor så snart som möjligt efter slakt och att minimera risken för kontaminering. Skillnader i experimentella kulturers förmåga att växa i lungor om de inte är så färska som möjligt har observerats.
2. Att upprätthålla sterilitet vid produktion av SCFM och dissekering av lungbitar är viktigt. Friska lungor är inte sterila och därför kan förekomsten av kommensala bakterier återspegla en "naturlig" miljö för kronisk infektion. Som tidigare nämnts kan bakterieinteraktioner inom populationer med flera bröstarter dock förändra resultat och mottaglighet för antibiotika, så kontaminering bör undvikas och lungor bör steriliseras före användning. Vi förespråkar användning av UV-sterilisering, eftersom det inte verkar orsaka förändringar i tennvävnadens integritet och, om nödvändigt, ytterligare antibiotikatvättar. Antibiotika bör dock användas med försiktighet, eftersom de kan påverka resultaten genom att införa selektiva tryck och kan förändra genuttrycket i testbakteriella populationer.
3. Använd mockinfekterade, negativa kontrollvävnadsprover och cellräkningsplattor som odlas på ett icke-selektivt, rikt medium för att belysa tillväxten av eventuella främmande eller kommensala bakterier som inte har avlägsnats under steriliseringen. Detta är viktigt för att mildra eventuella effekter av dessa bakterier på AST. Det är också användbart att producera duplicerad, selektiv agar, cellräkningsplattor som är specifika för organismen av intresse, eftersom dubbla plattor påskyndar koloniidentifiering och celluppräkning.
4. Utför pilotexperiment när du först använder modellen och när du använder den med nya stammar eller genotyp av bakterier för att bedöma biofilm CFU-variationer mellan vävnadssektioner, vilket gör det möjligt att välja optimala experimentella provstorlekar (t.ex. hur många replikationsvävnadssektioner som ska förvärvas från hur många replikerade lungor) genom användning av effektberäkningar.
5. Analysen använder ett icke-standardiserat inokulat, eftersom detta möjliggör snabb inokulering efter 48 timmars inkubation och bildandet av relativt konsekventa biofilmbelastningar (särskilt för P. aeruginosa). För att analysera antibakteriell effekt i tidiga biofilm tillväxt stadier, överväga att vaccinera med en standardiserad CFU av koloni-odlade bakterier suspenderas i ASM. Vi rekommenderar inte inokulera med planktoniska bakterier: tidiga pilotexperiment visade att detta leder till akut, invasiv tillväxt inte tillförlitlig biofilmsbildning.

Detta protokoll producerar en robust prototypmodell för användning med P. aeruginosa, med stor potential för utveckling för användning med S. aureus, men det har vissa begränsningar som kommer att behöva åtgärdas för vissa applikationer i framtiden. Vävnad var inokulerad från enstaka kolonier för att möjliggöra utvecklingen av klonurcancer populationer. Resultaten visar att för P. aeruginosahar detta liten inverkan på cellnummer vid 48 h. Större variation i bakteriebelastning observerades dock för S. aureus och med tanke på att olika bakterier kan växa olika inom modellen kan en standardiserad startinokulat och rigorös produktion av vävnadsprover av identisk storlek och vikt vara beroende av organismen i studien. Det kan också finnas skillnader mellan laboratorier på grund av skillnader i exakta dissekerings-/infektionstekniker eller lokal grisras/landrace. För att bedöma bakteriepopulationernas reproducerbarhet för enskilda implementeringar av modellen föreslår vi att repeterbarhetsberäkningar används som en del av den statistiska analysen av resultat²⁵ och användningen av repeterbarhet/effektberäkningar baserade på pilotexperiment för att beräkna den optimala provstorleken för deras användning i slutliga experiment.

En av de viktigaste fördelarna med EVPL jämfört med traditionella plattanalyser är att i stället för att testa för bakterier som växer planktoniskt eller på abiotiska ytor möjliggör det rumslig strukturering av bakteriella biofilmer i en värdmiljö och med cell differentiering. Detta har viktiga konsekvenser för att överväga effekten av fysiokemiska och näringsmässiga gradienter på aktiviteten hos antimikrobiella medel samt leverans och tillgänglighet av aktiva terapier vid olika mikromiljöer inom en kronisk infektion och cellcellsinteraktion mellan bakterier. Denna senare punkt är särskilt viktig, eftersom multispecies infektioner observeras rutinmässigt i CF och blir allt viktigare för infektioner i samband med andra andningsbesvär, såsom astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom. Det finns potential att utveckla denna modell för AST för individualiserad patienten sputum provtagning i den kliniska diagnostiken. En analog studie pågår redan med hjälp av en sår-härma in vitro-modell för tillväxt och AST av debrided biofilm från kroniska sår (Southwest Regional Wound Care Center i Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).

Dessutom använder modellen post-mortem vävnad, så påverkan av värden immunsvar på antibiotika mottaglighet är begränsad. Nuvarande in vitro-modeller tar inte heller hänsyn till värd immunsvar, så vi ser inte detta som ett hinder för den framtida användningen av modellen i AST-applikationer. Immunsvaret beaktas dock när farmakokinetiska och farmakodynamiska parametrar och riktlinjer för dosering av antibiotika fastställs. Även om våra studier har visat bevis på kvarvarande immunceller och svar inom^{vävnaden 23} (och S. Azimi, personlig kommunikation), är detta ett utmärkt område för ytterligare optimering och utveckling av modellen om en större matchning till in vivo villkor önskas.

Att tillhandahålla mer kliniskt giltig AST för CF kommer att hjälpa till att uppfylla en viktig rekommendation från UK Health, Social Care Act 2008 att "förfaranden bör finnas för att säkerställa försiktig förskrivning och antimikrobiell förvaltning." Vi anser att EVPL är en idealisk kandidatmodell för att hjälpa till att möta detta behov.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes	MP Biomedicals	116004500	FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates	Diversified Biotech	BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner
Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes	Thermo Fisher	15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads	Thermo Fisher	15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached.	VWR	BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit	Thermo Fisher	10474415	For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.