Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

Abstract

Caenorhabditis elegans מוכר באופן נרחב עבור התועלת המרכזית שלה כמודל בעלי חיים תרגום לחקור ביעילות מנגנונים טיפולים של מחלות אנושיות מגוונות. תולעים מתאימות במיוחד למסכי תפוקה גבוהה של תפוקה גנטית ותרופות כדי לקבל תובנה עמוקה יותר על מטרות וטיפולים טיפוליים על ידי ניצול מחזור הפיתוח המהיר שלהם, גודל הגוזלים גדול, תוחלת חיים קצרה, שקיפות מיקרוסקופית, עלויות תחזוקה נמוכות, חבילה חזקה של כלים גנומיים, מאגרי מוטציות ומתודולוגיות ניסיוניות לחקור הן בפיזיולוגיה של vivo והן בפיזיולוגיה של ex vivo. פעילות לוקומוטור תולעת מייצגת פנוטיפ רלוונטי במיוחד כי הוא נפגע לעתים קרובות במחלה מיטוכונדריאלית, אשר הוא הטרוגניים מאוד בגורמים וביטויים אבל באופן קולקטיבי חולק יכולת לקויה לייצר אנרגיה תאית. בעוד שחבילת מתודולוגיות שונות עשויה לשמש לחקר התנהגות התולעת, אלה משתנות מאוד בעלויות ניסיוניות, מורכבות ושירות עבור מסכי תפוקה גנומיים או סמים. כאן הושוו התפוקה היחסית, היתרונות והמגבלות של 16 מתודולוגיות ניתוח פעילות שונות המכמתות קטר נמטודה, חבטות, שאיבת הלוע ו/או הכימוטקסיה באוכלוסיות תולעים בודדות או תולעים של C. elegans בשלבים, גילאים ומשכי ניסוי שונים. פרוטוקולים מפורטים הודגמו עבור שתי שיטות חצי אוטומטיות כדי לכמת פעילות locomotor נמטודה המייצגים יישומים חדשניים של כלי תוכנה זמינים, כלומר, ZebraLab (גישה תפוקה בינונית) ו- WormScan (גישה תפוקה גבוהה). נתונים מיישום שיטות אלה הדגימו דרגות דומות של פעילות בעלי חיים מופחתת התרחשו בשלב L4 זחל, והתקדמו ביום 1 מבוגרים, במחלה I קומפלקס מיטוכונדריאלי (גז-1(fc21)) תולעים מוטנטיות ביחס לסוג בר (N2 בריסטול) C. elegans. נתונים אלה מאמתים את השירות עבור יישומים חדשניים אלה של שימוש בכלי התוכנה ZebraLab או WormScan כדי לכמת פעילות לוקומוטור תולעת ביעילות ובאובייקטיביות, עם יכולת משתנה לתמוך בהקרנת תרופות בתפוקה גבוהה על התנהגות תולעים במודלים חייתיים פרה-חוליניים של מחלות מיטוכונדריאליות.

Introduction

Caenorhabiditis elegans מוכר באופן נרחב כמודל יוצא מן הכלל במדעי המוח המבוססים על כך שיש לו 302 נוירונים המתאמים את כל התנהגויות התולעת, כולל הזדווגות, האכלה, הטלת ביצים, צואה, שחייה וקטר על מדיה מוצקה1. נמטודות הרמפרודיטיות אלה משמשות גם הן להבנת מגוון רחב של מנגנוני מחלות אנושיות, המתאפשרות על ידי הגנום המאופיין היטב שלה והומולוגיה גבוהה של ~ 80% גנים בין C. elegans ובני אדם2,3,4. C. elegans שימשו זמן רב לחקור מחלה מיטוכונדריאלית אנושית5,6,7,8,9,10, שהיא קבוצה הטרוגנית גנטית ופנוטיפית מאוד של הפרעות מטבוליות תורשתיות החולקות יכולת לקויה לייצראנרגיהתאית ולעתים קרובות נוכחת קלינית עם תפקוד עצבי שרירי לקוי באופן משמעותי, חוסר סובלנות לפעילות גופנית ועייפות11 ,12,13,14. לכך, השימוש במודלים C. elegans מאפשר מידול פרה-אקליני של היבטים כמותיים של פעילות בעלי חיים ותפקוד עצבי-שרירי בתת-סוגים גנטיים שונים של מחלה מיטוכונדריאלית, כמו גם את תגובתם לטיפולים מועמדים שעשויים לשפר את תפקודם הנוירו-שרירי ואת הפעילות הכוללת שלהם.

פעילות עצבית-שרירית ב- C. elegans ניתנת למדידה אובייקטיבית על ידי מגוון מתודולוגיות ניסיוניות, כולל גישות ידניות והן גישות אוטומטיות למחצה המאפשרות ניתוחים פונקציונליים במדיה מוצקה או נוזלית (טבלה 1)1,15. כמות מדויקת של פעילות C. elegans הוכיחה חשיבות כדי לאפשר תגליות הקשורות לתפקוד ופיתוח של מערכת השרירים והעצבים16,17,18. מחקר זה מסכם ומשווה דרישות ניסיוניות, יתרונות ומגבלות של 17 בדיקות שונות שניתן לבצע במעבדות מחקר להערכת תפקוד ופעילות נוירו-שרירית בארבע תוצאות מרכזיות במודלים של מחלות C. elegans, הן בבסיס במגוון שלבים וגילאים התפתחותיים והן בתגובה על ניתוחי המועמדים (טבלה 1 ). ואכן, המחקר מספק סקירה מפורטת של מגוון הגישות הניסיוניות הזמינות לאפיון שיעורי החבטות של C. elegans (כיפופי גוף לדקה), פעילות לוקומוטור, שאיבת הלוע, וכימיה - בכל מקרה המציין את המתודולוגיה הניסיונית והאנליטית שבה נעשה שימוש, את היתרונות והמגבלות של כל שיטה, את הציוד והתוכנה הדרושים לביצוע ולנתח כל בדיקת ערך, ויכולת התפוקה של כל שיטה לתמיכה בשימוש בה למטרות הקרנה גנטית או סמים בעלת תפוקה גבוהה. קיבולת התפוקה של כל בדיקת אסאי מתוארת כנמוכה, בינונית או גבוהה בהתבסס על מורכבות הפרוטוקול הניסיוני, כולל תחזוקת תולעים, זמן עיבוד, שימוש בלוחות יחידים או רב-באריים ו/או זמן ההתנסות הדרוש להשלמת ההגדרה הניסיונית וניתוחי הנתונים.

ניתוחים ידניים שלחבטות 19, פעילות לוקומוטור20, שאיבת הלוע17,21, ו chemotaxis22,23 הם מתודולוגיות מבוססות היטב להערכת פעילות תולעת הדורשות סטריאומיקוסקופ24. בעוד מדידת פעילות חבטות של תולעים דורש ניתוח במדיה נוזלית כדי לקבוע את תדירות כיפופי הגוף לדקה, פעילות locomotor תולעת ניתן למדוד או על מדיה מוצקה או במדיה נוזלית. עם זאת, ניתוחים ידניים של פעילות תולעת בודדת גוזלים זמן מהדורת ומערבים הטיה בלתי נמנעת שנוצרה על ידי המשתמש. אוטומציה של ניתוחי פעילות תולעים ממזערת הטיה שנוצרה על ידי המשתמש ויכולה להגדיל מאוד את התפוקה הניסיונית25. הקלטות וידאו של פעילות חבטות תולעת במדיה נוזלית ניתן לנתח באמצעות wrMTrck, תוסף ImageJ26. עם זאת, ההגדרות הניסיוניות המקוריות שפותחו עבור wrMTrck הגבילו את השירות שלה, שכן תולעים רבות מדי בטיפת נוזל אחת הובילו לחפיפה של תולעים שהקשו על מעקב מדויק. בעוד מגבלה ניסיונית זו נפתרה27, שיטת wrMTrck אינה מסוגלת לתמוך הקרנה בתפוקה גבוהה.

קיימות מגוון שיטות לכימות פעילות לוקומוטור תולעת בבסיס ובתגובה טיפולים מועמדים במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans. אלה כוללים ZebraLab (ViewPoint מדעי החיים), מעקב Tierpsy28, פלטפורמת מעקב נמטודה רחבה של שדה הראייה (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, צ'יפ אינפיניטי32, ו- WMicrotracker One33 (טבלה 1). שיטות אלה מאפשרות ניתוח בו-זמני של קטר בזני תולעים מרובים או בתנאים מרובים, בדרך כלל על לוחות מרובי בארות, ובכך תומכים ביישומי הקרנת סמים בעלי תפוקה גבוהה יותר. לחלק משיטות אלה יש שיקולים ייחודיים שעשויים להגביל או לשפר את השירות הכללי שלהן, כגון הצורך בציוד יקר לעומת תוכנה לגישה פתוחה, וקלות משתנה של ביצוע פרוטוקולים ניסיוניים. בסך הכל, אין מערכת ניסיונית אחת או פרוטוקול מתאים באופן אידיאלי לכל ניסויי פעילות locomotor C. elegans. במקום זאת, חשוב לבחור בקפידה איזו שיטה מתאימה ביותר למטרות ולדרישות הניסיוניות של החוקר הספציפי.

שאיבת הלוע מייצגת תוצאה חשובה נוספת להערכת הפעילות הנוירו-שרירית ב- C. elegans. הלוע C. elegans מורכב מ -20 תאי שריר, 20 נוירונים, ו -20 תאים אחרים המאפשרים בליעה של Escherichia coli (E. coli) בקצה האחורי של דרכי העלייה של התולעת34,35,36. מספר שיטות ידניות הוקמו כדי לקבוע את שיעורי שאיבת הלוע17,21,37,38. רוב השיטות מבוססות על שימוש סטריאומיקוסקופ ומצלמה לדמיין ולהקליט תדירות שאיבת הלוע עם ספירה ישירה על ידי הצופה הניסיוני21. ניתוח אוטומטי של קצב שאיבת הלוע אפשרי על ידי ביצוע הקלטה חוץ-תאית המכונה electropharyngeogram (EPG), המספקת מידע נוסף על משך כל משאבה39. ניתוח קצב שאיבת הלוע אפשרי גם במערכת מיקרופלואידית, WormSpa, שבה תולעים בודדות מוגבלות בתאים40,41. שיטה מסחרית הזמינה כדי להקל על ניתוח קצב משאבת הלוע היא מערכת ScreenChip (InVivo Biosystems), המודדת, מדמה ומנתחת את ההיבטים הנוירו-שריריים של התנהגות האכלה בתולעת אחת משותקת בשבב מותאם אישית. גישה זו של כמות שאיבה הלוע יכולה לשמש להערכת תגובות עצביות ופיזיולוגיות לתרופות, הזדקנות וגורמים אחרים42,43,44,45.

Chemotaxis מתאר את התנועה של C. elegans בתגובה ריח שהונח הרחק התולעים באזור מוגדר של צלחת מדיה צמיחה נמטודה (NGM). הערכת תגובת הכימוטקסיס מספקת מדד משולב של פעילות עצבית ונוירו-שרירית תולעת הניתנת לכימות על ידי התבוננות ומדידת המרחק הפיזי שעברו תולעים לכיוון הריח בפרק זמן מוגדר46. מעקב תולעים מרובות היא שיטה אוטומטית שניתן להשתמש בה כדי לשפר את היעילות הניסיונית של כימות המרחק שעברו תולעים לכיוון מושך או מדוחה47.

כאן, הפרוטוקול המפורט עבור שתי שיטות חדשניות, חצי אוטומטיות שנקבעו לכימות פעילות תולעת מתואר. הגישה הראשונה משתמשת ב-ZebraLab תוכנה מסחרית שפותחה במקור כדי לחקור את פעילות השחייה של דניו ריו (דג זברה), עבור יישום חדשני בעל תפוקה בינונית כדי לכמת את פעילות הלוקומוטור הכוללת במדיה נוזלית של C. elegans בהתבסס על שינויי פיקסלים במהלך התנועה(טבלה 1, איור 1). פלט נתונים מתקבל במהירות ממספר רב של תנאים ודגימות בו-זמנית המנותחים בשקופית זכוכית, אם כי שיטה זו אינה מתאימה לתבנית צלחת מרובת בארות. הגישה השנייה היא עיבוד חדשני למתודולוגיית WormScan48,49 (איור 2),המשתמש בסורק שטוח כדי ליצור תמונה דיפרנציאלית של שתי סריקות רציפות שניתן להשתמש בהן באופן שונה עם תוכנת קוד פתוח כדי לאפשר ניתוח כמותי אוטומטי למחצה של תוצאות פיזיולוגיות משולבות כגון פוריות והישרדות. כאן, עיבוד חדשני בעל תפוקה גבוהה למתודולוגיית WormScan כדי לכמת את פעילות לוקומוטור התולעת במדיה נוזלית באוכלוסיות של 15 תולעים בשלב זחל 4 (L4) לכל באר של צלחת שטוחה 96 היטב פותחה. מתודולוגיה זו של WormScan חצי אוטומטית ובעלות נמוכה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה, כמו גם לנתחים של שלבים שונים של בעלי חיים וגילאי48,49.

כאן, הפרוטוקול והיעילות של ניתוח פעילות לוקומוטור C. elegans באמצעות זברהלאב ו- WormScan שיטות חצי אוטומטיות מודגמת במודל C. elegans מבוסס היטב עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי I, גז-1(fc21). גז-1 (באנגלית: gas-1) הוא גן אורתולוגיה של NDUFS2 אנושי (NADH: ליבת אוקסידורדוקטאז אוביקינון) (חלבון ברזל-גופרית) 2)(איור 3). זן מוטציה C. elegans gas-1(fc21)נושא מוטציה של homozygous p.R290K באורתולוגיה האנושית של NDUFS250, מה שגורם לירידה משמעותית בפרוות ובתוחלת החיים, שרשרת זרחן חמצונית לקויה (OXPHOS)קיבולת 51, כמו גם ירידה במסה המיטוכונדריאלית ובפוטנציאל הממברנה עם לחץ חמצוני מוגבר5,8 . למרות השימוש המבוסס שלה בשני העשורים האחרונים כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות, פעילות לוקומוטור של מוטציות גז-1(fc21)לא דווחה בעבר. כאן, זברהלאב ושיטות WormScan הוחלו כדי לכמת באופן עצמאי את פעילות locomotor של גז-1(fc21) בהשוואה תולעים מסוג פראי (WT, N2 בריסטול), הן כדרך לאמת את השיטות, כמו גם כדי להפגין את התועלת ההשוואתית שלהם ואת היעילות של פרוטוקולים ניסיוניים וניתוחים אינפורמטיקה. תוכנת ZebraLab אפשרה כמות מהירה של מספר תנאים בו-זמנית של פעילות לוקומוטור תולעת במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans, עם יישום פוטנציאלי לבדיקת תרופות ממוקדות או מחקרי אימות. ניתוח WormScan, בפרט, מתאים היטב כדי לאפשר בקלות מסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה של ספריות מורכבות ולתעדף לידים המשפרים את התפקוד הנוירו-שרירי של בעלי החיים ואת פעילות הלוקומוטור במודלים פרה-קליניים C. elegans של מחלה מיטוכונדריאלית ראשונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניתוח פעילות לוקומוטור תולעת במדיה נוזלית על שקופיות זכוכית באמצעות תוכנת ZebraLab

  1. צמיחה וטיפול בנמטודה
    1. לגדל C. elegans על לוחות פטרי המכילים מדיה צמיחה נמטודה (NGM) ולהפיץ עם Escherichia coli OP50 כמקור מזון. שמור על תרבות התולעת ב 20 °C (50 °F), כפי שתואר בעבר8.
    2. סנכרן תולעים המבצעות ביצה מתוזמנת52 ולומד תולעים בשלב הרצוי. בפרוטוקול זה נותחו תולעי שלב L4.
    3. הגדל שליטה ותולעת מוטנטית זנים על לוחות NGM עם ובלי טיפולים תרופתיים להיבדק או בקרת חיץ. כדי להעריך את ההשפעות הטיפול התרוממתי, להכין את ריכוז מלאי התרופה הרצוי בפתרון S. basal; פזר את אמצעי האחסון הספציפי המחושב על לוחות ה-NGM ואפשר לו להתייבש. מעבירים את התולעים בשלב מסוים של זחל או מבוגר ושומרים על צלחת הטיפול התרופתי למשך הזמן הרצוי לפני הניתוח.
  2. מערך ניסיוני של תולעים להקלטת וידאו פעילות לוקומוטור וניתוח ZebraLab
    1. בחר 5 תולעי L4 מסונכרנות לכל מאמץ ומצב באמצעות בחירת תולעת. Pipette טיפה בודדת של 20 μL של פתרון בזאלי על מגלשת זכוכית הממוקמת מתחת סטרימוקוסקופ מחובר למצלמה ולהעביר 5 תולעים לתוכו(איור 1A,B). העבר את 5 התולעים מצלחת פטרי המכילה NGM ו- E. coli OP50 לירידה הנוזלית רק ברגע שקדם להקלטה.
      הערה: המשך לתחזק את התולעים האחרות על צלחת פטרי עד שהסרטון הקודם יוקלט. זה ימנע את הנזק שנגרם על התולעים האחרות עקב התייבשות של 20 טיפות μl במהלך ההליך (זמן יבש ~ 15-20 דקות).
    2. Pipette טיפות מרובות בשקופית אחת כדי להשיג שכפולים טכניים מרובים(איור 1A). בחר תולעים מלוחות גז טבעי נוזלי שונים (שכפול ביולוגי). אין להשתמש בתלוש כיסוי.
    3. התאם את מרחק העבודה של המיקרוסקופ כדי להציג באופן חזותי את האזור המלא של טיפה אחת. הגדר וחזק רזולוציית וידאו נמוכה (<1024 x 768) כדי להעלות את הקבצים בתוכנה.
    4. אפשר לתולעים להתאקלם בשקופית בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לפני ההקלטה.
    5. תיעד את פעילות השחייה של התולעת בטיפה אחת למשך דקה אחת ב-15 פריימים לשנייה (fps). חזור על ההדמיה עבור כל טיפה נוספת על הצלחת.
  3. ג. elegans locomotor פעילות הקלטה ניתוח בתוכנת ZebraLab
    1. השתמש באפשרות ZEBRALAB AVI כדי להעלות קטעי וידאו לתוכנה. לחץ על האפשרות כימות עם קבצי AVI (איור 1C).
    2. כדי ליצור פרוטוקול חדש, בחר קובץ > צור פרוטוקולולאחר מכן הוסף את מספר האזורים שנבחרו עבור הניתוח. בחר ספירת מיקומים: 1.
    3. פתחו את פרמטרי הפרוטוקול ובחרו דקה אחת בחלון משך ניסוי. בחר משך ניסיוני שונה עבור משכי זמן ניסיוניים שונים. בחרו או בטלו את הבחירה בחלון ללא סל זמן ובחרו 'תקופת שילוב', בהתאם לפלט הנתונים הרצוי. במחקר זה לא נבחר סל זמן ( איור1D).
      הערה: סל הזמן הוא הזמן שבו הפעילות תהיה ממוצעת.
    4. אם כבר נוצר פרוטוקול, בחר פתח פרוטוקול ובחר את הפרוטוקול שנשמר (בתבנית .vte).
    5. בחר קובץ ופתח סרט כדי להעלות כל קובץ וידאו בודד שהוקלט בעבר.
    6. בחר בסמל אזור המצוין באיור 1E (חץ שחור) כדי לבנות אזור זיהוי יחיד וליצור אזור סביב טיפת הנוזל כולה שבה ממוקמות תולעים. לחץ על בחרולאחר מכן על סמל העיגול הירוק (חץ אפור) תחת אזורים > בנה > סימוני נקה.
      הערה: הפעילות של כל התולעים בטיפה המוגדרת תזוהה באזור שנבחר(איור 1E,F).
    7. עבור אל קנה מידה של ציור > צייר ( איור1E) וצייר קו אופקי משמאל לימין אזור הווידאו. ציין את המרחק האמיתי לכיול. לאחר מכן בחר החל על קבוצה.
    8. בטלו את הבחירה בסמל שנבחר לבניית האזור (חץ באיור 1E) ובחרו או בטלו את הבחירה באפשרות 'שקוף'.
      הערה: במחקר זה, שקוף נבחר ונתן תוצאות טובות יותר.
    9. התאם רגישות לזיהוי וסף פעילות כדי לאפשר זיהוי של כל זני תולעת C. elegans השונים שנותחו.
      הערה: בניסוי זה, רגישות הזיהוי נקבעה על 8 עם ערכי פרץ והקפאה של 15 ו- 2, בהתאמה (איור 1F).
    10. הגדר את קנה מידה תצוגה ב- 70 כדי לדמיין את המסלול שנעשה על-ידי החיה בזמן ניתוח הפעילות מתבצע. לאחר מכן בחר החל על קבוצה ( איור1F).
    11. לחץ על > התנסות > שמור בשםולאחר מכן התחל. נפתח חלון. בחר האם ברצונך לעבד את מדיית הווידאו במהירות מחשב מקסימלית? כדי לנתח את הווידאו במהירות (למשל, הקלטת וידאו של דקה אחת מנותחת על ידי תוכנת ZebraLab ב- 5 שניות).
    12. נפתח חלון נוסף: ניסוי ריצה; לחץ על התחל כדי להמשיך בניסוי.
    13. לאחר השלמת הקלטת הווידאו, הניתוח נפסק. לחץ על ניסוי > עצור. פעולה זו שומרת את הפעילות המנותחת מטיפה בודדת בגיליון אלקטרוני.
    14. חזור על הניתוח עבור כל סרטון של טיפה בודדת. כל טיפה היא שכפול טכני אחד.
  4. פלט וניתוח של נתוני ZebraLab
    הערה: לאחר הניסוי, נתונים מכל סרטון נשמרים בנפרד כגליונות אלקטרוניים נפרדים בתיקיה שנבחרה. בקובץ פלט הנתונים, רמת הפעילות המשולבת של כל התולעים הנעות בטיפה בודדת נרשמת כאשר פיקסל משתנה תחת actinteg.
    1. פתח כל גיליון אלקטרוני המתקבל מהניתוח של כל סרטון. בצע הידור ידני לקובץ יחיד.
      לנרמל את מוטציה ונתונים מסוג פראי לאחוז של שליטה. כאן בוצעו ניתוחים סטטיסטיים כדי להשוות בין קבוצות רמות פעילות ממוצעות.

2. ניתוח פעילות לוקומוטור תולעת במדיה נוזלית בפורמט צלחת 96-well על ידי ניתוח תוכנה WormScan

  1. צמיחה וטיפול בנמטודה
    1. לגדל C. elegans כמתואר בסעיף 1.1.1.
    2. סנכרן תולעים כמתואר בסעיף 1.1.2.
    3. לגדל תולעים על מדיה ספציפית כמתואר בסעיף 1.1.3 עד שלב L4 או יום 1 מבוגר.
  2. מערך ניסיוני של תולעים בצלחת 96-באר לניתוח פעילות WormScan
    1. הוסף 50 μL של 2% משקל לכל נפח של E. coli OP50 במתלים נוזליים ב S. basal בינוני לכל באר של 96-טוב, ברור, שטוח התחתון, microplate, כפי שתואר בעבר49,53.
    2. תחת סטריאומיקוסקופ, בחר באופן ידני 15 תולעים מסונכרנות בשלב L4 או יום אחד מבוגר אחד מלוחות הגז הטבעי הטבעי שלהם למדיה נוזלית בתוך כל באר ניסיונית של המיקרו-לוח 96-well. אפשר לתולעים להתאקלם למדיה הנוזלית למשך 20 דקות לפני הסריקה.
      הערה: ניתן להחליף בקלות את השלבים והגילאים של בעלי החיים במחקר.
  3. ניתוח פעילות סריקת תולעת בצלחת 96-באר וייצוא נתונים לגיליון אלקטרוני.
    1. סרוק כל 96 טוב, ברור, שטוח תחתון, microplate פעמיים ברצף באמצעות סורק שטוח סטנדרטי, עם פחות מ -10 s בין סריקות.
      הערה: כאן, סורק התמונות ברזולוציה של 1,200 נקודות/in וגווני אפור של 16 סיביות שימש להפקת תמונות jpeg. הזמן הנדרש לסריקת ארבע צלחות 96 בארות באמצעות סורק התמונות הוא פחות מ -10 דקות.
    2. ישר את שתי הסריקות הרציף (איור 2A) באמצעות תוכנת קוד פתוח49.
      הערה: התוכנה יוצרת תמונת הבדל כדי להעריך את שינויי הפיקסלים בין שתי התמונות הרצופות עבור אזור מעניין (איור 2B) לבין ציון WormScanיחסי. ציון WormScan זה שקול לשינויים בתגובת הלוקומוטור בהתבסס על עוצמת האור המיוצרת על-ידי הסורק כאשר הוא מוגדר לסף פיקסלים של 5 (איור 2C).
    3. יצא את הנתונים מ- WormScan כגליונות אלקטרוניים. שמור את הגיליון האלקטרוני המכיל את הנתונים במחשב המקומי. לנרמל את הנתונים כאחוז שליטה (POC) ולהשוות על פני ניסויים שכפול ביולוגי עבור מוטציה מגוונת או תנאי טיפול. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות מוטציה ושליטה פירושו באמצעות סטודנט t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח של פעילות locomotor C. elegans בתקשורת הנוזלית יכול בקלות ללכוד פנוטיפ משולב של מודלים תולעת מחלה מיטוכונדריאלית כי לא ניתן לכמת בקלות על מדיה מוצקה. ZebraLab שימשה לכימות פעילות לוקומוטור של קומפלקס המיטוכונדריאלי מבוסס I disease gas-1(fc21) ביחס לתולעי WT במדיה נוזלית בשלב הזחל L4. הפעילות של 5 תולעים בירידה נוזלית אחת נרשמה במשך דקה אחת, עם סך של 19 קטעי וידאו (שכפולים טכניים) שנרשמו עבור כל זן, וכתוצאה מכך סך הניתוח של 95 תולעים לכל זן. ארבעה ניסויים ביולוגיים לשכפול הושגו לכל זן. פעילות התולעת מוצגת כשינוי פיקסלים(איור 3A)וכאחוז שליטה (POC) כאשר היא מנורמלת לבקרת WT של N2 בריסטול(איור 3B). התולעים gas-1(fc21)(62% ± 16% שינוי פיקסלים, כלומר ± SD, n = 19) היו ירידה משמעותית של 38% (p < 0.001, t-test) בפעילות הלוקומוטור שלהם בשלב L4 בהשוואה לתולעי WT (100% ± 11.35%, כלומר ± SD, n = 95 תולעים לכל תנאי ב -19 שכפולים טכניים מעל 4 שכפולים ביולוגיים).

ניתוח WormScan בוצע גם כדי לכמת את פעילות הלוקומוטור של גז-1שלב L4 (fc21) ותולעי WT במדיה נוזלית. נתונים נאספו עבור שלושה ניסויי שכפול ביולוגיים, שבהם כל לוח שכפול ביולוגי הוערך על ידי שתי תמונות רציפים שנסרקו באמצעות סורק שטוח סטנדרטי. פעילות התולעת של התמונות הדיפרנציאליות הושוותה כשינוי פיקסלים ונורמלה לבקרת N2 בריסטול WT בו זמנית. באופן דומה, כפי שנראה בשיטת ההקרנה של התנהגות דגי הזברה, ניתוח מבוסס WormScan הראה כי תולעי gas-1(fc21)(65.9 ± 6.1, כלומר ± SD, n = 13 בארות) היו ירידה משמעותית בפעילות locomotor על ידי 34% (p < 0.001, t-test)לעומת N2 תולעים מסוג בר בריסטול (100% ± 4.8%, כלומר ± SEM, n = 12 בארות)(איור 3C). ניתוח באמצעות תולעים סריקה ביום 1 גז למבוגרים -1(fc21)תולעים (50.1% ± 10.7%, כלומר ± SD, n = 7 בארות) הראה ירידה בפעילות לוקומוטורים ב -49% (p < 0.001, t-test)בהשוואה לתולעי WT (100% ± 16.2%, כלומר ± SD, n = 6 בארות)(איור 3D).

טבלה 1: סקירה השוואתית של נסיונים ניסיוניים הזמינים להערכת הפעילות הנוירו-שרירית C. elegans. סקירה מפורטת מסופקת של מגוון רחב של 16 טכניקות ניסיוניות שונות שניתן להשתמש בהן כדי לכמת פעילות עצבית-שרירית תולעת על התוצאות הפנוטיפיות של חבטות, קטר, שאיבת הלוע ו / או כימוטקסי ב- C. elegans. פורמט קריאה, מתודולוגיה, יכולת תפוקה ניסיונית, דרישות תוכנה ו / או ציוד, כמו גם יתרונות ומגבלות של כל בדיקת תפוקה מפורטים. הפניות ואתרים רלוונטיים עבור כל בדיקת כלי ותוכנה מסופקים גם כן. יכולת התפוקה של כל מבדק מתוארת כנמוכה, בינונית או גבוהה, בהתבסס על המורכבות הניסיונית, השימוש בלוחות יחידים או רב-באריים ו/או זמן ההתנסות הדרוש להשלמת ההגדרה הניסיונית וניתוחי הנתונים. * מציין כי המתודולוגיות יכולות לשמש גם להערכת הקטר. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 1
איור 1: C. elegans ניתוח פעילות לוקומוטור באמצעות תוכנת ZebraLab. (א,ב) פרוטוקול ניסיוני להקלטות וידאו תולעת. חמש תולעים הוצגו לכל טיפה (20 μL) של פתרון S. basal, עם ארבע טיפות להציב על שקופית זכוכית אחת תחת סטרימוקרופ. כל טיפה של 5 תולעים ייצגה ניסוי שכפול טכני והוקלטה במשך דקה אחת בסרט נפרד באמצעות מצלמת התקן טעון (CCD). (C-F) הגדרות ניסיוניות ב ZebraLab כפי שהותאמו להערכת פעילות לוקומוטור ב C. elegans. (C)בחירת כימות עם קבצי AVI כדי לכמת את פעילות לוקומוטור התולעת של כל סרטון מוקלט. (D)הגדרות פרמטר פרוטוקול, כאשר דקה אחת נבחרה כמשך ניסוי. (E)בנה אזור כדי לבחור את אזור העניין. האזור נבחר ונבנה סביב טיפת פתרון אחת שבה הוצבו 5 תולעים. (ו)הזיהוי נקבע על סמך סף בקנה מידה אפור כדי לזהות את כל הגוף של כל תולעת (אדום). במקטע הסף, נבחרו ערכי פרץ והקפאה כדי לנתח את פעילות התולעת כאשר הפיקסלים משתנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: C. elegans locomotor ניתוח פעילות באמצעות מתודולוגיית WormScan. (A)באמצעות סורק v800 שטוח של Epson, שתי סריקות רציפים מיידיות של צלחת 96 באר נלכדו ברזולוציה של 1,200 נקודות / ב וגווני אפור 16 סיביות כדי לייצר תמונות jpeg. (B)שתי תמונות רצפיות אלה של לוח 96 בארות היו מיושרות אז לאזור התייחסות של עניין (ROI), של תולעי WT. (C)ניתוח תמונה מבוסס על ציון תמונה הפרש המחושב עבור כל ROI עם 15 תולעים / באר עבור N2 בריסטול. תמונת ההבדל הייתה מנורמלת ודווחה כאחוז שליטה (POC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח השוואתי של פעילות לוקומוטור על ידי ZebraLab ו- WormScan תוכנה בודקת גז-1(fc21) תולעי מחלה מיטוכונדריאלית ביחס לתולעים מסוג N2 בריסטול. (A,B)WT ו- gas-1(fc21) פעילות תולעים בטיפות נוזליות (5 תולעים / טיפה) תועדה בסרטון במשך דקה אחת וכימתה כמו (A) פיקסלים משתנים או ( B (B ) אחוז שליטה מסוג פראי באמצעות תוכנת ZebraLab. בסך הכל, ניתוח פעילות תולעים מבוסס ZebraLab הראה ירידה משמעותית של 38% בגז-1(fc21) L4 תולעי במה בהשוואה לבקרות מסוג בר (*** p < 0.001). הגרף מציג משמעותו ± SD של כל הנתונים, כאשר כל נקודה מעבירה את הפעילות הכוללת של חמש תולעים לכל טיפת בזלת S. כל טיפה מייצגת שכפול טכני, עם סך של ארבעה שכפולים ביולוגיים שנחקרו לכל תנאי. בסך הכל תועדו 19 סרטונים (סרטון אחד לכל טיפה של 5 תולעים), על פני 95 תולעים בודדות שנחקרו לפי תנאי. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tסטודנט במנסרה -GraphPad v6. (C)תולעי WT ו- gas-1(fc21) בשלב L4 נותחו על ידי סריקה שטוחה כדי לייצר שתי תמונות רצפיות שניתחו בתוכנת WormScan כדי להניב תמונה הבדלית. שלושה ניסויים ביולוגיים לשכפול בוצעו עם 15 תולעים לבאר בצלחת 96. הפעילות של תולעי WT שימשה כבסיס לנרמול אחוז השליטה (POC). פעילות gas-1(fc21)ירדה ב-34% בהשוואה לבקרה מסוג בר (*** p < 0.001). תרשימי עמודות מעבירים ממוצע וסטיית תקן על פני שלושה ניסויים ביולוגיים לשכפול. (D)N2 וגז-1(fc21) תולעים בשלב יום למבוגרים 1 נותחו באופן דומה כמפורט עבור לוח C. גז-1(fc21) פעילות ביום 1 מבוגרים ירדה ב -49.1% ביחס לתולעי בקרה מסוג בר (*** p < 0.001). תרשימי עמודות מעבירים ממוצע וסטיית תקן של שינויי פיקסלים בשכפול ביולוגי אחד המשווה בין N2 (n = 6 בארות של 15 תולעים/באר) ו- gas-1(fc21) (n = 7 בארות של 15 תולעים/באר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, המחקר סיכם מידע מפורט ורציונלים לחקר הפעילות הנוירו-שרירית C. elegans ברמה של תוצאות מגוונות, כולל חבטות תולעים, קטר, שאיבת הלוע וכימוטקסיס. ההשוואה בין 16 מתודולוגיות שונות לניתוח פעילות בוצעה במונחים של התפוקה היחסית, היתרונות והמגבלות של כימות פעילויות נמטודה באוכלוסיות תולעת או תולעת בודדות בגילאים שונים ובמקופות ניסוי שונות. בין אלה, שני עיבודים חדשניים ויישומים של ניתוחים אוטומטיים למחצה הודגשו כדי להפגין ירידה משמעותית בפעילות לוקומוטור בתולעים בשלב הזחל בשלב ההתפתחותי L4 זחל וביום 1 צעירים של קומפלקס מיטוכונדריאלי מבוסס I מחלת C. elegans זן, גז-1(fc21) ביחס לבקרות WT.

בפרט, C. elegans תפקוד עצבי-שרירי ופעילות locomotor נחקר בהרחבה על מדיה מוצקה מאז תנועת תולעי WT הוא קבוע מאוד בדפוסי גל סינוסואידי. חריגות של נתיב התנועה הרגיל שלהם ואת המהירות ניתן לזהות מיקרוסקופית באופן ידני על ידי הצופה הניסיוני, בבדיקות כי הם לעתים קרובות תפוקה נמוכה ומייגעת. כדי להגדיל את התפוקה הניסיונית, יש לבחור שיטות אוטומטיות ובעלות תפוקה גבוהה. פעילות לקויה של תולעים יכולה להיות ניתנת לכימות במדיה נוזלית, שם ניתן לכמת את הפעילות הכוללת של תולעים בטיפות על שקופיות זכוכית או בלוחות מרובי בארות שניתן להקליט ולכומת באופן אוטומטי למחצה או אוטומטי עם כלי תוכנה שונים. ואכן, הנתונים שלנו מדגישים את התועלת של פעילות לוקומוטור נמטודה אובייקטיבית ויעילה הן על ידי יישום חדשני של תוכנת ZebraLab כדי לכמת פעילות לוקומוטור בסרטונים של תולעים בטיפות נוזליות על שקופיות זכוכית (גישה של קיבולת סינון בתפוקה בינונית), והן על ידי שימוש בתוכנת WormScan כדי לכמת פעילות לוקומוטור תולעת בתמונות סריקה שטוחות דיפרנציאליות של תולעים בגישת מדיה נוזלית צלחת 96 היטב54, 55,56 (גישה קיבולת סינון תפוקה גבוהה). הגישה תוכנת ZebraLab נחשבת לבדיקת תפוקה בינונית שכן היא דורשת להשתמש בלוחות בודדים עבור כל תנאי שנלמד, ללא פרוטוקול מפותח נוכחי עבור פורמטים צלחת רב-באר. בעוד שהשימוש בגישת התוכנה ZebraLab דורש זמן מינימלי בעת ניתוח פעילות C. elegans במספר תנאים, זמן הניסוי גדל כאשר מוחל על תנאים מרובים. כאן, זמן הניסוי היה כ 2 שעות להעביר תולעים לתוך טיפות נוזליות להקליט קטעי וידאו של הפעילות שלהם, בהתחשב 18 שכפולים טכניים עבור כל תנאי. הזמן שהושקע בניתוח של קטעי וידאו אלה באמצעות תוכנת ZebraLab היה כ 1 שעות. לשם השוואה, שיטת WormScan היא תפוקה גבוהה מכיוון שהיא משלבת תבנית צלחת מרובת בארות המאפשרת ניתוח בו-זמני של ארבע לוחות 96 בארות בפחות מ -10 דקות והקמת צלחת 96 באר עם BISOter COPAS הוא גם פחות מ 10 דקות.

שתי המתודולוגיות הראו פעילות מופחתת באופן דומה בגז-1(fc21) של מחלות מיטוכונדריאליות ביחס לתולעי WT, ובכך תוקף את שתי הגישות הייחודיות לכימות הבדלים בהתנהגות התולעים. יתר על כן, ניתוח WormScan שימש כדי להוכיח בקלות כי ירידה הדרגתית בפעילות לוקומוטור בעלי חיים התרחשה עם הגיל בתולעים גז-1(fc21) כפי שניכר על ידי היום 1 שלב מבוגר.

היתרונות העיקריים של התאמת תוכנת ZebraLab שפותחה לניתוח שחייה של דגי זברה לניתוח פעילות C. elegans הוא שזה פשוט וזול מבחינה ניסיונית ללכוד באופן אובייקטיבי תנועת תולעים בסרטונים, עם ניתוח כמותי אוטומטי למחצה בקבצי סרט שהועלו לתוכנת ZebraLab הדורשים שניות בלבד לכל שכפול טכני ומסיר הטיה מבוססת חוקר הקיימת במתודולוגיות כמות ידניות. יתר על כן, בעל כלי תוכנה אחד זה במעבדת המחקר שימושי כדי לכמת פעילות locomotor בשני מינים מודל בעלי חיים, כלומר, דגי זברה ו C. elegans. החיסרון הוא שמדובר בתוכנה מסחרית הדורשת סרטוני רכישה ותולעים שיש להעלות באופן ידני לתוכנה, אם כי תהליך ההעלאה הוא פשוט וזמן ניתוח התוכנה מהיר יחסית. בסך הכל, היישום החדש המתואר כאן של שימוש בתוכנת ZebraLab כדי לכמת את פעילות locomotor C. elegans מחזיק פוטנציאל ישיר להעריך השפעות סמים על התנהגות תולעים, אם כי התפוקה שלה נשאר נמוך עד בינוני בהתחשב בדרישות ברזולוציה גבוהה שלה מחייב כי סרטים להילכד של תולעים נע בטיפות מדיה להציב על שקופיות זכוכית.

התאמנו גם את תוכנת WormScan כדי לכמת ביעילות את יכולת הלוקומוטור של התולעים במדיה נוזלית בלוח של 96 באר. גישה זו מציעה שיטה ניסיונית בעלת תפוקה גבוהה ובעלות נמוכה המשתמשת בסורק שטוח סטנדרטי כדי לכמת באופן אובייקטיבי את פוריות בעלי החיים והישרדותם, ושימשה בעבר למסכי תפוקה גבוהה ב- C. elegans49. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי זה נוח מאוד הקרנה תפוקה גבוהה, המאפשר השוואות מקבילות של מספר רב של תנאים בכל שלב או גיל, עם קלות שימוש, עלות התקנה נמוכה, וניתוח מהיר בצורה אובייקטיבית על ידי תוכנת WormScan כי הוא חופשי וזמין לציבור49. החיסרון של WormScan הוא שזה יכול רק לחקור את השינוי המתרחש בין סריקות רציפות, אשר במוטציות או תנאים מסוימים לא יכול להיות רגיש מספיק כדי לזהות דרגות קטנות של שינוי פנוטיפי. בנוסף, כמו הן ZebraLab והן שיטות WormScan להסתמך באופן בלעדי על שינויים פיקסל תמונה כדי assay פעילות בעלי חיים, הבדלים משמעותיים בגודל התולעת שעלולים להתרחש בין זנים או בתגובה לטיפול מסוים לאורך זמן ייתכן שיהיה צורך לשקול ו /או לשמש כגורם נורמליזציה עבור שתי השיטות, כדי לאפשר באופן ספציפי יותר הערכה והשוואה של מוטציה ו /או השפעות טיפול על פעילות locomotor בעלי חיים.

בסך הכל, מגוון רחב של שיטות ניסיוניות ניתן להשתמש כדי להעריך פעילות neuromuscular נמטודה על תוצאות פנוטיפי משולבות של חבטות, קטר, שאיבת הלוע, ו /או chemotaxis. השווינו 16 שיטות אלה (טבלה 1),המדגישות את הדרישות הניסיוניות והאנליטיות הספציפיות שלהן, היתרונות, המגבלות ויכולת התפוקה שלהן. בין אלה, סיפקנו פרוטוקולים ניסיוניים מפורטים עבור שני יישומים חדשניים של כלי תוכנה קיימים, ZebraLab (גישה בעלת תפוקה בינונית) ו- WormScan (גישה בעלת תפוקה גבוהה), אשר שימושיים במיוחד לפעילות אוטומטית, אובייקטיבית ומהירה של פעילות קטר תולעים במדיה נוזלית. שתי הגישות הניסיוניות חשפו ירידה דומה במידת פעילות הקטר התרחשה במחלות מיטוכונדריאליות(גז-1(fc21)) ביחס לזני WT C. elegans בשלב L4, עם ירידה הדרגתית בפעילות הלוקומוטורים על ידי שלב הצעירים בתולעי גז -1(fc21). נתונים אלה מדגימים את תוקפן של גישות ניסיוניות אלה המניבות נתונים עקביים פנימיים. יתר על כן, מגוון שיטות זה הוא רב-תכליתי ביותר, ומאפשר מגוון רחב של מדדי פעילות לוקומוטור תולעת באטיולוגיות מחלות מגוונות, שלבים וגילאים של בעלי חיים, ובתגובה למידול טיפולי מועמד או מסכי תרופות בעלי תפוקה גבוהה שימושיים להערכה פרה-אקלינית של מטרות עופרת למחלות אנושיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מ.ל., נ.ד.M, נ.ס. וא.נ.ו. אין גילויים פיננסיים רלוונטיים. M.J.F. הוא מייסד שותף של MitoCUREia, Inc., חבר הוועדה המדעית המייעצת עם עניין ההון העצמי RiboNova, Inc. וחבר דירקטוריון מדעי כיועץ בתשלום עם Khondrion, ו Larimar Therapeutics. M.J.F. היה או עוסק כיום עם מספר חברות המעורבות במחלות מיטוכונדריאליות פיתוח פרה-קליני ו/או קליני כיועץ בתשלום (Astellas [לשעבר Mitobridge] פארמה בע"מ, רכיבה על אופניים טיפוליים, אפיריום ביו, Imel Therapeutics, מינוביה תרפיוטיקס, NeuroVive, Reneo Therapeutics, BioTherapeutics התגנבות, Zogenix, Inc. ) ו / או משתף פעולה מחקר ממומן (AADI Therapeutics, קרדרו טיפולית, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, מינוביה תרפיוטיקס בע"מ, טיפולי משימה, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics, וביותרפוטיקה התגנבות).

Acknowledgments

אנו מודים לאנתוני רוזנר, PhD, על תמיכתו הארגונית בהכנה המוקדמת של פרויקט זה, ולארין האוס על תרומתה לניתוח פרוטוקולים. עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר מחלות מיטוכונדריאליות של ג'וליה FBXL4, קרן המחקר ג'אקסון פלינט C12ORF65, ומכוני הבריאות הלאומיים (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 ו- T32-NS007413). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המממנים או המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

התנהגות בעיה 170 תולעים C. elegans פעילות לוקומוטור שאיבת הלוע כימוטסיס חבטות ZebraLab WormScan קיבולת הקרנה בתפוקה גבוהה gas-1(fc21)
ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים <em>בקאנורבדיטיס אלגנס</em> מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter