Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Сравнительный анализ экспериментальных методов количественной оценки активности животных в моделях митохондриальной болезни Caenorhabditis elegans

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

В этом исследовании представлены протоколы для двух полуавтоматических подходов к анализу локомоторной активности у червей C. elegans complex I disease gas-1(fc21),а именно ZebraLab (анализ со средней пропускной способностью) и WormScan (высокопроизводительный анализ) и сравнительный анализ среди широкого спектра методов исследования для количественной оценки поведения нематод и интегрированной нервно-мышечной функции.

Abstract

Caenorhabditis elegans широко признан за его центральную полезность в качестве трансляционной модели животных для эффективного опроса механизмов и методов лечения различных заболеваний человека. Черви особенно хорошо подходят для высокопроизводительных генетических и лекарственных скринингов, чтобы получить более глубокое представление о терапевтических мишенях и методах лечения, используя их быстрый цикл развития, большой размер расплода, короткую продолжительность жизни, микроскопическую прозрачность, низкие затраты на обслуживание, надежный набор геномных инструментов, хранилища мутантов и экспериментальные методологии для опроса физиологии как in vivo, так и ex vivo. Двигательная активность червя представляет собой особенно актуальный фенотип, который часто нарушается при митохондриальных заболеваниях, которые очень неоднородны по причинам и проявлениям, но в совокупности разделяют нарушенную способность производить клеточную энергию. Хотя набор различных методологий может быть использован для опроса о поведении червей, они сильно различаются по экспериментальным затратам, сложности и полезности для геномных или лекарственных высокопроизводительных скринингов. Здесь сравнивалась относительная пропускная способность, преимущества и ограничения 16 различных методологий анализа активности, которые количественно оценивают передвижение нематод, метание, накачку глотки и / или хемотаксис у отдельных червей или популяций червей C. elegans на разных стадиях, возрастах и экспериментальных продолжительностях. Были продемонстрированы подробные протоколы для двух полуавтоматических методов количественной оценки локомоторной активности нематод, которые представляют собой новые приложения доступных программных инструментов, а именно ZebraLab (подход со средней пропускной способностью) и WormScan (высокопроизводительный подход). Данные применения этих методов продемонстрировали, что аналогичные степени снижения активности животных наблюдались на стадии личинок L4 и прогрессировали на 1-й день взрослых особей, при митохондриальном комплексе I заболевания(gas-1(fc21))мутантных червей относительно диких (N2 Bristol) C. elegans. Эти данные подтверждают полезность для этих новых приложений использования программных инструментов ZebraLab или WormScan для эффективной и объективной количественной оценки двигательной активности червей с переменной способностью поддерживать высокопроизводительный скрининг лекарств на поведение червей в доклинических моделях митохондриальных заболеваний на животных.

Introduction

Caenorhabiditis elegans широко признана как выдающаяся модель в нейробиологии, основанная на том, что она имеет 302 нейрона, которые координируют все поведение червей, включая спаривание, кормление, яйцекладку, дефекацию, плавание и передвижение на твердых носителях1. Эти гермафродитные нематоды также широко используются для понимания широкого спектра механизмов заболеваний человека, что стало возможным благодаря его хорошо охарактеризованным геному и высокой гомологии ~ 80% генов между C. elegans и людьми2,3,4. C. elegans уже давно используются для опроса митохондриальныхзаболеваний человека5,6,7,8,9,10,которые представляют собой высоко генетически и фенотипически гетерогенную группу наследственных метаболических нарушений, которые имеют нарушенную способность генерировать клеточную энергию и часто клинически присутствуют с существенно нарушенной нервно-мышечной функцией, непереносимостью физических упражнений и усталостью11 ,12,13,14. С этой целью использование моделей C. elegans позволяет доклиническое моделирование количественных аспектов активности животных и нервно-мышечной функции у различных генетических подтипов митохондриальных заболеваний, а также их реакции на кандидаты в терапии, которые могут улучшить их нервно-мышечную функцию и общую активность.

Нервно-мышечная активность у C. elegans объективно измерима с помощью ряда экспериментальных методологий, включая как ручные, так и полуавтоматические подходы, позволяющие проводить функциональный анализ в твердых или жидких средах(таблица 1)1,15. Точное количественное значение активности C. elegans оказалось важным для открытия, связанных с функцией и развитием мышечной и нервной системы16,17,18. В этом исследовании обобщены и сопоставлены экспериментальные требования, преимущества и ограничения 17 различных анализов, которые могут быть выполнены в исследовательских лабораториях для оценки нервно-мышечной функции и активности по четырем ключевым исходам в моделях заболеваний C. elegans, как на исходном уровне на различных стадиях развития и возраста, так и в ответ на кандидаты в терапию(таблица 1). ). Действительно, исследование дает подробный обзор диапазона доступных экспериментальных подходов к характеристике скорости метания C. elegans (изгибы тела в минуту), двигательной активности, накачки глотки и хемотаксиса - в каждом случае с указанием используемой экспериментальной и аналитической методологии, преимуществ и ограничений каждого метода, оборудования и программного обеспечения, необходимого для выполнения и анализа каждого анализа, и пропускная способность каждого метода поддерживать его использование для высокопроизводительного генетического скрининга или скрининга лекарств. Пропускная способность каждого анализа описывается как низкая, средняя или высокая на основе сложности экспериментального протокола, включая обслуживание червя, время обработки, использование одно- или многоядерных пластин и/или время экспериментатора, необходимое для завершения экспериментальной установки и анализа данных.

Ручной анализ трешинга19,двигательной активности20,глоточного насоса17,21и хемотаксиса22, 23 являются хорошо заявильными методологиями оценки активности червей, которые требуют стереомикроскопа24. В то время как измерение метательной активности червей требует анализа в жидких средах для определения частоты изгибов тела в минуту, двигательная активность червя может быть измерена как на твердых средах, так и в жидких средах. Тем не менее, ручной анализ активности отдельных червей по своей сути отнимает много времени и включает в себя неизбежную предвзятость, создаваемую пользователем. Автоматизация анализа активности червей минимизирует предвзятость, генерируемую пользователем, и может значительно увеличить экспериментальную пропускную способность25. Видеозаписи активности метания червей в жидких средах могут быть проанализированы с помощью wrMTrck, плагина ImageJ26. Однако первоначальные экспериментальные установки, которые были разработаны для wrMTrck, ограничивали его полезность, поскольку слишком много червей в одной капле жидкости приводило к перекрытию червей, что затруднялось точное отслеживание. Хотя это экспериментальное ограничение было разрешено27,метод wrMTrck не способен поддерживать высокопроизводительный скрининг.

Существует ряд методов количественной оценки локомоторной активности червей на исходном уровне и в ответ на кандидаты в терапию в моделях митохондриальных заболеваний C. elegans. К ним относятся ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,платформа отслеживания нематод с широким полем зрения (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32и WMicrotracker One33 (таблица 1). Эти методы позволяют одновременно анализировать локомоцию в нескольких штаммах или условиях червей, как правило, на пластинах с несколькими скважинами, тем самым поддерживая более высокопроизводительный скрининг лекарств. Некоторые из этих методов имеют уникальные соображения, которые могут ограничить или повысить их общую полезность, такие как потребность в дорогостоящем оборудовании по сравнению с программным обеспечением открытого доступа и различная простота выполнения экспериментальных протоколов. В целом, ни одна экспериментальная система или протокол не идеально подходит для всех экспериментов с двигательной активностью C. elegans. Скорее, важно тщательно выбирать, какой метод лучше всего подходит для экспериментальных целей и требований конкретного исследователя.

Глоточная накачка представляет собой еще один важный результат для оценки нервно-мышечной активности у C. elegans. Глотка C. elegans состоит из 20 мышечных клеток, 20 нейронов и 20 других клеток, которые позволяют проглатывать кишечную палочку (E. coli)на переднем конце пищеварительного тракта червя34,35,36. Было установлено несколько ручных методов для определения скорости глотки откачки17,21,37,38. Большинство методов основаны на использовании стереомикроскопа и камеры для визуализации и записи частоты накачки глотки с прямым подсчетом экспериментальным наблюдателем21. Автоматизированный анализ скорости накачки глотки возможен путем выполнения внеклеточной записи, названной электрофарингеограммой (EPG), которая предоставляет дополнительную информацию о продолжительности каждого насоса39. Анализ скорости накачки глотки также возможен в микрофлюидной системе WormSpa, где отдельные черви заключены в камеры40,41. Коммерческим методом, доступным для облегчения анализа скорости глоточного насоса, является система ScreenChip (InVivo Biosystems), которая измеряет, визуализирует и анализирует нервно-мышечные аспекты пищевого поведения у одного червя, который иммобилизован в пользовательском чипе. Этот подход к количественному накачке глотки может быть использован для оценки как нейронных, так и физиологических реакций на лекарства, старение и другие факторы42,43,44,45.

Хемотаксис описывает движение C. elegans в ответ на одорант, помещенный от червей в определенную область пластины среды роста нематод (NGM). Оценка реакции хемотаксиса обеспечивает интегрированную меру нейронной и нервно-мышечной активности червя, которая поддается количественной оценке путем наблюдения и измерения физического расстояния, пройденного червями к одоранту за определенный периодвремени 46. Multi-Worm Tracker - это автоматический метод, который может быть использован для повышения экспериментальной эффективности количественной оценки расстояния, пройденное червями к аттрактанту или от репеллента47.

Здесь описан подробный протокол для двух новых, полуавтоматических методов, созданных для количественной оценки активности червей. Первый подход использует ZebraLab - коммерческое программное обеспечение, которое было первоначально разработано для изучения плавательной активности Danio rerio (рыбки данио), для нового приложения со средней пропускной способностью для количественной оценки общей локомоторной активности в жидких средах C. elegans на основе изменений пикселей во время движения(таблица 1, рисунок 1). Вывод данных быстро получается из большого количества параллельных условий и образцов, проанализированных на стеклянной горке, хотя этот метод не подходит для формата пластины с несколькими скважинами. Второй подход представляет собой новую адаптацию методологии WormScan48,49 (рисунок 2),которая использует планшетный сканер для создания дифференциального изображения двух последовательных сканирований, которые могут по-разному использоваться с программным обеспечением с открытым исходным кодом для обеспечения полуавтоматического количественного анализа интегрированных физиологических результатов, таких как плодовитость и выживаемость. Здесь была разработана новая высокопроизводительная адаптация методологии WormScan для количественной оценки локомоторной активности червей в жидких средах в популяциях пятнадцати червей 4-й стадии (L4) на скважину плиты с плоским дном из 96 скважин. Эта полуавтоматизированная и недорогая методология WormScan может быть легко адаптирована к высокопроизводительный скринингу лекарств, а также к анализу различных стадий животных и возрастов48,49 лет.

Здесь протокол и эффективность анализа двигательной активности C. elegans с использованием полуавтоматических методов ZebraLab и WormScan демонстрируется в хорошо заведомо заданной модели C. elegans для митохондриального комплекса I заболевания, gas-1(fc21). газ-1 (ген K09A9.5) является ортологом человеческого NDUFS2 (NADH: ядро убихиноноксидоредуктазы (железо-серный белок) субъедицы 2)(рисунок 3). Мутантный штамм C. elegans gas-1(fc21)несет гомозиготную мутацию p.R290K в ортологе человека NDUFS250,вызывая значительное снижение плодовитости и продолжительности жизни, нарушение способности окислительного фосфорилирования дыхательной цепи (OXPHOS)51,а также снижение митохондриальной массы и мембранного потенциала с повышенным окислительным стрессом5,8 . Несмотря на его хорошо заявленное использование в течение последних двух десятилетий для изучения митохондриальных заболеваний, о двигательной активности мутантов газа-1(fc21)ранее не сообщалось. Здесь методы ZebraLab и WormScan были применены для независимой количественной оценки локомоторной активности газа-1(fc21)по сравнению с червями дикого типа (WT, N2 Bristol), как для проверки методов, так и для демонстрации их сравнительной полезности и эффективности экспериментальных протоколов и анализа информатики. Программное обеспечение ZebraLab позволило быстро количественно оценить несколько одновременных состояний двигательной активности червей в моделях митохондриальных заболеваний C. elegans с потенциальным применением для целевого скрининга лекарств или валидационных исследований. Анализ WormScan, в частности, хорошо подходит для обеспечения высокопроизводительного скрининга лекарств в библиотеках соединений и определения приоритетов лидов, которые улучшают нервно-мышечную функцию животных и двигательную активность в доклинических моделях C. elegans первичных митохондриальных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Анализ двигательной активности червей в жидких средах на стеклянных слайдах с помощью программного обеспечения ZebraLab

  1. Рост нематод и обращение с ними
    1. Выращивайте C. elegans на пластинах Петри, содержащих среду роста нематод (NGM), и распространяйте с Escherichia coli OP50 в качестве источника пищи. Поддерживать культуру червей при 20 °C, как описаноранее 8.
    2. Синхронизируйте червей, выполняющих по времени откладываемяйца 52 и изучайте червей на нужном этапе. В этом протоколе были проанализированы черви стадии L4.
    3. Рост контроля и штаммов мутантных червей на пластинах NGM с и без лекарственного лечения, которое должно быть протестировано или буферный контроль. Для оценки эффекта лекарственного лечения готовят желаемую концентрацию запаса препарата в S. базальном растворе; распределите расчетный удельный объем на пластины NGM и дайте ему высохнуть. Переносят глистов на определенную личиночную или взрослую стадию и выдерживая на лекарственной пластине обработки в течение нужного времени перед анализом.
  2. Экспериментальная установка червей для видеозаписи двигательной активности и анализа ZebraLab
    1. Выберите 5 синхронизированных червей L4 на штамм и состояние с помощью червячного отмычка. Пипетку одной каплей 20 мкл базального раствора S. на стеклянный слайд, расположенный под стереомикроскопом, подключенным к камере, и переведите в нее 5 червей(рис. 1А,В). Перенесите 5 червей из чашки Петри, содержащей NGM и E. coli OP50, в каплю жидкости только в момент, предшествующий записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте поддерживать других червей на чашке Петри до тех пор, пока не будет записано предыдущее видео. Это позволит избежать повреждений, нанесенных другим глистам из-за высыхания капель 20 мкл во время процедуры (время высыхания ~ 15-20 мин).
    2. Пипетка несколько капель на один слайд для получения нескольких технических реплик(рисунок 1А). Выбирайте червей из разных пластин NGM (биологические реплики). Не используйте крышку.
    3. Отрегулируйте рабочее расстояние микроскопа, чтобы визуализировать полную площадь одной капли. Установите и поддерживайте низкое разрешение видео (<1024 x 768) для загрузки файлов в программное обеспечение.
    4. Дайте червям акклиматизироваться на слайде при комнатной температуре за 1 мин до записи.
    5. Запишите активность плавания червя в 1 капле в течение 1 мин со скоростью 15 кадров в секунду (fps). Повторите изображение для каждой дополнительной капли на пластине.
  3. C. Анализ записи двигательной активности C. elegans в программном обеспечении ZebraLab
    1. Используйте опцию ZEBRALAB AVI для загрузки видео в программное обеспечение. Нажмите на опцию Квантование с файлами AVI (рисунок 1C).
    2. Чтобы создать новый протокол, выберите Файл > Создать протокол,а затем добавьте количество областей, выбранных для анализа. Выберите Количество местоположений: 1.
    3. Откройте Параметры протокола и выберите 1 мин в окне Продолжительность эксперимента. Выберите другую продолжительность эксперимента для разных экспериментальных длительности. Выберите или снимите флажок Без времени и выберите Период интеграциив зависимости от требуемого вывода данных. В этом исследовании был выбран No Time Bin (рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Time bin - это время, в течение которого действие будет усреднено.
    4. Если протокол уже создан, выберите Открыть протокол и выберите сохраненный протокол (в формате VTE).
    5. Выберите Файл и Открыть фильм, чтобы загрузить каждый отдельный видеофайл, который был ранее записан.
    6. Выберите значок Area, указанный на рисунке 1E (черная стрелка), чтобы построить одну область обнаружения и создать область вокруг всей капли жидкости, где находятся черви. Нажмите «Выбрать»,затем значок зеленого круга (серая стрелка) в разделе «Области > «Построить > »Очистить метки».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность всех червей в определенном падении будет обнаружена в выбранной области(рисунок 1E,F).
    7. Перейдите в > Калибровка шкалы рисования (рисунок 1E)и нарисуйте горизонтальную линию слева направо от области видео. Укажите реальное расстояние для калибровки. Затем выберите Применить к группе.
    8. Снимите флажок, выбранный для построения области (стрелка на рисунке 1E),и выберите или снимите флажок Прозрачный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании был выбран Transparent и дал лучшие результаты.
    9. Отрегулируйте чувствительность обнаружения и порог активности, чтобы обеспечить обнаружение всех различных анализируемых штаммов червей C. elegans.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте чувствительность обнаружения была установлена на уровне 8 со значениями Burst и Freezing 15 и 2 соответственно(рисунок 1F).
    10. Установите Display Scale на 70, чтобы визуализировать след, сделанный животным во время анализа активности. Затем выберите Применить к группе (рисунок 1F).
    11. Щелкните Эксперимент > Выполнить > Сохранить как, а затем на Запустить. Откроется окно. Выберите Вы хотите обрабатывать видеоносим на максимальной скорости компьютера? для быстрого анализа видео (например, 1-минутная видеозапись анализируется программным обеспечением ZebraLab за 5 с).
    12. Откроется другое окно: Запуск эксперимента; нажмите кнопку Пуск, чтобы продолжить эксперимент.
    13. После завершения видеозаписи анализ прекращается. Нажмите эксперимент > остановить. Это сохраняет проанализированное действие из одного капли в электронной таблице.
    14. Повторите анализ для каждого видео отдельного падения. Каждая капля является одной технической репликой.
  4. Вывод и анализ данных ZebraLab
    ПРИМЕЧАНИЕ: После эксперимента данные из каждого видео отдельно сохраняются в виде отдельных электронных таблиц в выбранной папке. В выходном файле данных интегрированный уровень активности всех червей, движущихся в отдельном падении, записывается как изменения пикселей в actinteg.
    1. Откройте каждую электронную таблицу, полученную из анализа каждого видео. Скомпилируйте их вручную в один файл.
      Нормализуйте мутантные и дикие данные до процента контроля. Здесь был проведен статистический анализ для сравнения средних уровней активности между группами.

2. Анализ двигательной активности червей в жидких средах в формате пластины 96 скважин с помощью программного анализа WormScan

  1. Рост нематод и обращение с ними
    1. Выращивайте C. elegans, как описано в разделе 1.1.1.
    2. Синхронизируйте червей, как описано в разделе 1.1.2.
    3. Выращивайте червей на определенных средах, как описано в разделе 1.1.3, до стадии L4 или 1-го дня взрослого человека.
  2. Экспериментальная установка червей в 96-скважинной плите для анализа активности WormScan
    1. Добавьте 50 мкл 2% массы на объем E. coli OP50 в жидкой суспензии в S. базальной среде к каждой скважине из 96-скважинной, прозрачной, плоскодонной, микропластины, как описаноранее 49,53.
    2. Под стереомикроскопом вручную выберите 15 синхронизированных червей на стадии L4 или взрослого взрослого человека 1-го дня из их пластин NGM в жидкую жидкую жиму в каждой экспериментальной скважине 96-луночной микропластины. Дайте червям акклиматизироваться к жидкой среде в течение 20 минут перед сканированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие стадии и возраст животных могут быть легко заменены изучением.
  3. Анализ активности WormScan в 96-скважинной пластине и экспорт данных в электронную таблицу.
    1. Сканируйте каждую 96-хорошую, четкую, плоскую дно, микропластинку дважды последовательно с помощью стандартного планшетного сканера, с менее чем 10 с между сканированиями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для получения изображений jpeg использовался фотосканер с разрешением 1 200 точек/дюйма и 16-битными оттенками серого. Время, необходимое для сканирования четырех 96-скважинных пластин с помощью фотосканера, составляет менее 10 минут.
    2. Выровняйте два последовательных сканирования(рисунок 2A)с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом49.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение генерирует разностное изображение для оценки изменений пикселей между двумя последовательными изображениями для интересуемойобласти (рисунок 2B)и относительной оценкой WormScan. Этот показатель WormScan эквивалентен изменениям локомоторного отклика на основе интенсивности света, создаваемого сканером при установке порога пикселей 5(рисунок 2C).
    3. Экспортируйте данные из WormScan в виде электронной таблицы. Сохраните электронную таблицу, содержащую данные, на локальном компьютере. Нормализуйте данные в процентах от контроля (POC) и сравните между биологическими экспериментами по репликации для различных мутантных или лечебных состояний. Выполните статистический анализ для сравнения мутантных и контрольных средств с помощью студенческогоt-теста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ локомоторной активности C. elegans в жидких средах может легко охватить интегрированный фенотип моделей червей митохондриальных заболеваний, которые не могут быть легко количественно оценены на твердых средах. ZebraLab был использован для количественной оценки локомоторной активности хорошо зарекомендовавшую себя штамма митохондриального комплекса I заболевания gas-1(fc21)относительно WTworms в жидких средах на личиночной стадии L4. Активность 5 червей в одной капле жидкости была зарегистрирована в течение 1 мин, в общей сложности 19 видео (технических реплик) записаны для каждого штамма, в результате чего в общей сложности анализ составил 95 червей на штамм. Было получено четыре эксперимента с биологическими репликациями на штамм. Активность червя отображается как изменение пикселей(рисунок 3A)и как процент управления (POC) при нормализации до N2 Bristol WT control(рисунок 3B). Черви gas-1(fc21)(62% ± 16% изменения пикселей, среднее ± SD, n = 19) имели значительное снижение на 38% (p < 0,001, t-тест)в их двигательной активности на стадии L4 по сравнению с червями WT (100% ± 11,35%, среднее ± SD, n = 95 червей на состояние в 19 технических репликациях более 4 биологических реплик).

Анализ WormScan также проводился для количественной оценки двигательной активности газов L4 стадии-1(fc21)и WT червей в жидких средах. Данные были собраны для трех экспериментов по биологической репликации, где каждая биологическая реплицированная пластина оценивалась двумя последовательными изображениями, отсканированные с использованием стандартного планшетного сканера. Червячная активность дифференциальных изображений сравнивалась с изменением пикселей и нормализовалась с одновременным контролем N2 Bristol WT. Аналогичным образом, как показал метод скрининга поведения рыбок данио, анализ на основе WormScan показал, что черви gas-1(fc21)(65,9 ± 6,1, среднее ± SD, n = 13 скважин) имели значительное снижение локомоторной активности на 34% (p < 0,001, t-тест)по сравнению с N2 бристольскими червями дикого типа (100% ± 4,8%, средняя ± SEM, n = 12 скважин)(рисунок 3C). Анализ с использованием WormScan на 1 день взрослых газов-1(fc21)червей (50,1% ± 10,7%, средняя ± SD, n = 7 скважин) продемонстрировал снижение двигательной активности на 49% (p < 0,001, t-тест)по сравнению с WT-червями (100% ± 16,2%, среднее ± SD, n = 6 скважин)(рисунок 3D).

Таблица 1: Сравнительный обзор экспериментальных анализов, доступных для оценки нервно-мышечной активности C. elegans. Представлен подробный обзор широкого спектра из 16 различных экспериментальных методов, которые могут быть использованы для количественной оценки нервно-мышечной активности червей по фенотипическим исходам метания, передвижения, глоточной накачки и / или хемотаксиса у C. elegans. Подробно описаны формат считывания, методология, пропускная способность эксперимента, требования к программному обеспечению и/или оборудованию, а также преимущества и ограничения каждого анализа. Также предоставляются ссылки и соответствующие веб-сайты для каждого анализа и программного средства. Пропускная способность каждого анализа описывается как низкая, средняя или высокая, исходя из экспериментальной сложности, использования одно- или многоядерных пластин и/или времени экспериментатора, необходимого для завершения экспериментальной установки и анализа данных. * Указывает, что методологии могут также использоваться для оценки локомоции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Figure 1
Рисунок 1:Анализ двигательной активности C. elegans с помощью программного обеспечения ZebraLab. (А,Б) Экспериментальный протокол для видеозаписи червей. Пять червей вводили на каплю (20 мкл) базального раствора S., причем четыре капли помещали на один стеклянный слайд под стереомикроскопом. Каждая капля 5 червей представляла собой технический эксперимент по репликации и записывалась в течение 1 мин в отдельном фильме с помощью камеры с заряженной связью (ПЗС). (C-F) Экспериментальные установки в ZebraLab адаптированы к оценке двигательной активности у C. elegans. (C) Выбор квантования с помощью файлов AVI для количественной оценки локомоторной активности червя каждого записанного видео. (D) Настройка параметров протокола, при этом в качестве продолжительности эксперимента выбран 1 мин. (E) Постройте область для выбора интересуемой области. Область была выбрана и построена вокруг 1 капли раствора, в которую были помещены 5 червей. (F)Обнаружение было определено на основе порогового значения серой шкалы для обнаружения всего тела каждого червя (красный). В разделе пороговых значений были выбраны значения всплеска и замораживания для анализа активности червя по мере изменения пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Анализ двигательной активности C. elegans с использованием методологии WormScan. (A) С помощью планшетного сканера Epson v800 было получено два последовательных сканирования 96-скважинной пластины с разрешением 1 200 точек / дюйма и 16-битных оттенков серого для получения изображений jpeg. (B) Эти два последовательных изображения 96-скважинной пластины были затем выровнены по эталонной области интереса (ROI) червей WT. (C) Анализ изображений основан на разнице в оценке изображения, рассчитанной для каждой рентабельности инвестиций с 15 червями / скважина для N2 Bristol. Разностное изображение было нормализовано и представлено в процентах от контрольного значения (POC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Сравнительный анализ двигательной активности программными анализами ZebraLab и WormScan у червей газовой(fc21)митохондриальной болезни относительно червей дикого типа N2 Bristol. (A,B) WT и gas-1(fc21) активность червей в жидких каплях (5 червей / капля) была записана на видео в течение 1 мин и количественно определена как(A)изменение пикселей или (B ) процент управления диким типом с помощью программного обеспечения ZebraLab. В целом, анализ активности червей на основе ZebraLab продемонстрировал значительное снижение на 38% у червей стадии газа-1(fc21)L4 по сравнению с контрольной средой дикого типа (*** p < 0,001). График отображает среднее ± SD всех данных, где каждая точка передает общую активность пяти червей на S. базальную каплю. Каждая капля представляет собой техническую реплику, в общей сложности четыре биологические реплики, изученные в каждом условии. В общей сложности было записано 19 видео (по одному видео для каждой капли 5 червей), в общей сложности 95 отдельных червей, изученных в каждом состоянии. Статистический анализ проводился с использованием студенческого t-тестав Prism -GraphPad v6. (C)WT и gas-1(fc21)черви на стадии L4 были проанализированы с помощью планшетного сканирования для получения двух последовательных изображений, которые были проанализированы в программном обеспечении WormScan для получения разностного изображения. Три эксперимента по биологическому репликации были проведены с 15 червями на скважину в 96 скважинах. Активность червей WT использовалась в качестве базового уровня для нормализации процента контроля (POC). активность газа-1(fc21)снизилась на 34% по сравнению с контролем дикого типа (*** p < 0,001). Гистограммы передают среднее и стандартное отклонение в трех биологических экспериментах по репликации. (D)N2 и газ-1(fc21)черви на взрослом этапе 1-го дня анализировали аналогично тому, как подробно описано для панели C. активность газа-1(fc21)в 1-й день у взрослых снижалась на 49,1% по сравнению с контрольными червями дикого типа (*** p < 0,001). Гистограммы передают среднее и стандартное отклонение пиксельных изменений в одной биологической реплике, сравнивая N2 (n = 6 скважин 15 червей / скважина) и газ-1(fc21) (n = 7 скважин из 15 червей / скважина). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь исследование обобщило подробную информацию и обоснования для изучения нервно-мышечной активности C. elegans на уровне различных исходов, включая разбиение червей, локомоцию, накачку глотки и хемотаксис. Сравнение 16 различных методологий анализа активности было проведено с точки зрения относительной пропускной способности, преимуществ и ограничений количественной активности нематод в популяциях одного червя или червей в разном возрасте и экспериментальной продолжительности. Среди них были выделены две новые адаптации и применения полуавтоматических анализов, чтобы продемонстрировать значительное снижение двигательной активности у личиночных червей на стадии развития личинок L4 и у молодых людей 1-го дня хорошо зарекомендовавшую себя митохондриального комплекса I болезни C. elegans штамма, газ-1(fc21)по сравнению с контролем WT.

В частности, нервно-мышечная функция C. elegans и двигательная активность широко изучались на твердых средах, поскольку движение червя WT очень регулярно в синусоидальных волновых паттернах. Аномалии их регулярного пути движения и скорости могут быть микроскопически обнаружены и вручную оценены экспериментальным наблюдателем в анализах, которые часто являются низкопроизводительными и утомительными. Для увеличения экспериментальной пропускной способности следует выбирать автоматизированные и высокопроизводительный методы. Нарушенная активность червей может поддается количественной оценке в жидких средах, где общая локомоторная активность червей в каплях на стеклянных слайдах или в многолуночных пластинах может быть записана и количественно определена полуавтоматическим или автоматизированным способом с помощью различных программных средств. Действительно, наши данные подчеркивают полезность объективного и эффективного измерения локомоторной активности нематод как с помощью нового приложения программного обеспечения ZebraLab для количественной оценки локомоторной активности в видео червей в каплях жидкости на стеклянных слайдах (подход со средней пропускной способностью скрининга), так и путем использования программного обеспечения WormScan для количественной оценки локомоторной активности червей в дифференциальных планшетных сканирующих изображениях червей в 96-скважинной пластинчатой жидкой среде подход54, 55,56 (высокопроизводительный подход к пропускной способности). Программный подход ZebraLab рассматривается как анализ средней пропускной способности, поскольку он требует, чтобы для каждого изучаемого состояния использовались отдельные пластины без разработанного в настоящее время протокола для форматов пластин с несколькими скважинами. Хотя использование программного подхода ZebraLab требует минимального времени при анализе активности C. elegans в нескольких условиях, экспериментальное время увеличивается при применении к нескольким условиям. Здесь экспериментальное время составляло примерно 2 ч для переноса червей в капли жидкости и записи видеозаписей их активности, рассматривая 18 технических реплик для каждого состояния. Время, затраченное на анализ этих видео с помощью программного обеспечения ZebraLab, составило примерно 1 час. Для сравнения, метод WormScan является высокопроизводимым, поскольку он включает в себя формат пластины с несколькими скважинами, который позволяет одновременно анализировать четыре 96-скважинные плиты менее чем за 10 минут, а установка 96-скважинной плиты с бизотером COPAS также составляет менее 10 минут.

Обе методологии показали аналогичное снижение активности у личинок L4 стадии газа-1(fc21)мутантных червей по сравнению с червями WT, тем самым подтверждая оба различных подхода для количественной оценки различий в поведении червей. Кроме того, анализ WormScan был использован для того, чтобы легко продемонстрировать, что прогрессирующее снижение двигательной активности животных происходило с возрастом у червей gas-1(fc21),что было очевидно на стадии взрослого человека на 1-й день.

Основные преимущества нашей адаптации программного обеспечения ZebraLab, которое было разработано для анализа плавания рыбок данио, к анализу активности C. elegans заключается в том, что объективно запечатлеть движение червей в видео экспериментально просто и недорого, а полуавтоматический количественный анализ в файлах фильмов, загруженных в программное обеспечение ZebraLab, требует всего нескольких секунд на техническую репликацию и устраняет предвзятость на основе исследователя, которая присутствует в методологиях ручного количественного определения. Кроме того, наличие этого программного инструмента в исследовательской лаборатории полезно для количественной оценки двигательной активности у двух видов животных, а именно рыбок данио и C. elegans. Недостатком является то, что это коммерческое программное обеспечение, которое требует покупки, и видео червей должны быть вручную загружены в программное обеспечение, хотя процесс загрузки прост, а время анализа программного обеспечения относительно быстрое. В целом, новое приложение, описанное здесь, об использовании программного обеспечения ZebraLab для количественной оценки двигательной активности C. elegans обладает прямым потенциалом для оценки влияния лекарств на поведение червей, хотя его пропускная способность остается низкой и средней, учитывая его требования к высокому разрешению, требующие, чтобы фильмы были сняты с червями, движущимися в каплях среды, размещенных на стеклянных слайдах.

Мы также адаптировали программное обеспечение WormScan для эффективной количественной оценки локомоторной способности червей в жидких средах в 96-скважинной пластине. Этот подход предлагает высокопроизводительный и недорогой экспериментальный метод, который использует стандартный планшетный сканер для объективной количественной оценки плодовитости и выживаемости животных и ранее использовался для высокопроизводительных экранов в C. elegans49. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он очень поддался высокопроизводительному скринингу, позволяя параллельно сравнивать большое количество состояний на любом этапе или в любом возрасте, с простотой использования, низкой стоимостью настройки и быстрым объективным анализом программным обеспечением WormScan, которое является бесплатным и общедоступным49. Недостатком WormScan является то, что он может только опрашивать изменения, которые происходят между последовательными сканированиями, которые в некоторых мутациях или условиях могут быть недостаточно чувствительными для обнаружения небольших степеней фенотипических изменений. Кроме того, поскольку методы ZebraLab и WormScan полагаются исключительно на изменения пикселей изображения для анализа активности животных, существенные различия в размерах червей, которые могут возникать между штаммами или в ответ на конкретную терапию с течением времени, возможно, потребуется рассмотреть и/или использовать в качестве фактора нормализации для обоих методов, чтобы более конкретно обеспечить оценку и сравнение влияния мутаций и/или лечения на двигательную активность животных.

В целом, широкий спектр экспериментальных методов может быть использован для оценки нервно-мышечной активности нематоды по интегрированным фенотипическим исходам треширования, локомоции, накачки глотки и / или хемотаксиса. Мы сравнили 16 из этих методов(таблица 1),подчеркнув их конкретные экспериментальные и аналитические требования, преимущества, ограничения и пропускную способность. Среди них мы предоставили подробные экспериментальные протоколы для двух новых приложений существующих программных средств, ZebraLab (подход со средней пропускной способностью) и WormScan (высокопроизводительный подход), которые особенно полезны для полуавтоматической, объективной и быстрой количественной оценки активности передвижения червей в жидких средах. Оба экспериментальных подхода выявили аналогично сниженную степень двигательной активности, имевшую место при митохондриальной болезни(gas-1(fc21))относительно штаммов WT C. elegans на стадии L4, с прогрессирующим снижением двигательной активности молодым взрослыми стадиями у червей gas-1(fc21). Эти данные демонстрируют обоснованность этих экспериментальных подходов, которые дают внутренне согласованные данные. Кроме того, этот набор методов является очень универсальным, позволяя использовать широкий спектр показателей двигательной активности червей в различных этиологиях заболеваний, стадиях и возрастах животных, а также в ответ на терапевтическое моделирование кандидатов или высокопроизводительный скрининг лекарств, которые полезны для доклинической оценки свинцовых мишеней для заболеваний человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S. и E.N.-O. не имеют соответствующей финансовой информации. M.J.F. является соучредителем MitoCUREia, Inc., членом научно-консультативного совета с долей участия в RiboNova, Inc. и членом научного совета в качестве оплачиваемого консультанта Khondrion и Larimar Therapeutics. M.J.F. ранее был или в настоящее время сотрудничает с несколькими компаниями, участвующими в разработке терапевтических доклинических и / или клинических стадий митохондриальных заболеваний в качестве платного консультанта (Astellas [ранее Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) и / или спонсируемого научного сотрудника (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics и Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Мы благодарны Энтони Рознеру, доктору философии, за его организационную поддержку в ранней подготовке этого проекта, и Эрин Хаус за вклад в анализ протоколов. Эта работа финансировалась Фондом исследований митохондриальных заболеваний Джульетты FBXL4, Исследовательским фондом Jaxson Flynt C12ORF65 и Национальными институтами здравоохранения (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 и T32-NS007413). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения спонсоров или Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Поведение Выпуск 170 Черви C. elegans,двигательная активность глоточная откачка хемотаксис трэшинг ZebraLab WormScan высокая пропускная способность скрининга газ-1(fc21)
Сравнительный анализ экспериментальных методов количественной оценки активности животных в моделях митохондриальной болезни <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter