Summary
Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for bruk av DNA-baserte spenningsprober for å avbilde reseptorkreftene som påføres av immunceller. Denne tilnærmingen kan kartlegge reseptorkrefter >4.7pN i sanntid og kan integrere krefter over tid.
Abstract
Mekaniske krefter overført ved krysset mellom to naboceller og ved krysset mellom celler og den ekstracellulære matrisen er kritiske for å regulere mange prosesser som spenner fra utvikling til immunologi. Derfor er det viktig å utvikle verktøyene for å studere disse kreftene på molekylær skala. Vår gruppe utviklet en pakke med molekylære spenningssensorer for å kvantifisere og visualisere kreftene som genereres av celler og overføres til bestemte ligander. Den mest følsomme klassen av molekylære spenningssensorer består av nukleinsyrestamsløyfehårnåler. Disse sensorene bruker fluorofor-slukkerpar for å rapportere om mekanisk forlengelse og utfoldelse av DNA-hårnåler under kraft. En utfordring med DNA-hårnålsspenningssensorer er at de er reversible med rask hårnålsfolding ved avslutning av spenningen, og dermed er forbigående krefter vanskelige å registrere. I denne artikkelen beskriver vi protokollene for å forberede DNA-spenningssensorer som kan "låses" og forhindres i å brettes på nytt for å muliggjøre "lagring" av mekanisk informasjon. Dette muliggjør opptak av svært forbigående piconewton-krefter, som deretter kan "slettes" ved tilsetning av komplementære nukleinsyrer som fjerner låsen. Denne evnen til å veksle mellom sanntids spenningskartlegging og mekanisk informasjonslagring avslører svake, kortvarige og mindre rikelig krefter, som ofte brukes av T-celler som en del av deres immunfunksjoner.
Introduction
Immunceller forsvarer seg mot patogener og kreftceller ved kontinuerlig å krype og skanne overflatene til målceller for antigener, og pigge overflaten 1,2. Antigengjenkjenning initieres ved binding mellom T-cellereseptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) komplekset uttrykt på overflaten av målceller. Fordi TCR-pMHC-gjenkjenning skjer i krysset mellom to mobilceller, har det lenge vært mistanke om å oppleve mekaniske krefter. Videre førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, noe som antyder at TCR-krefter bidrar til funksjonen 3,4. For å forstå når, hvor og hvordan mekaniske krefter bidrar til T-cellefunksjon, er det viktig å utvikle verktøy for å visualisere molekylære krefter som overføres av T-celler. Tradisjonelt brukes metoder som trekkraftmikroskopi (TFM) og mikropillararrays for å undersøke cellulære krefter 5,6. Imidlertid er kraftfølsomheten til TFM og mikropilarrayer på nanonewton (nN) -skalaen og er derfor ofte utilstrekkelig til å studere molekylære piconewton (pN) -krefter overført av cellereseptorer7. For å forbedre kraften og romlig oppløsning for deteksjon, var laboratoriet vårt banebrytende for utviklingen av molekylære spenningsprober, som opprinnelig ble syntetisert ved bruk av polyetylenglykol (PEG) polymerer7. Molekylære spenningsprober består av en utvidbar molekylær "fjær" (PEG, protein, DNA) flankert av en fluorofor og slukker og er forankret på en overflate. Krefter påført sondens endepunkt fører til dens forlengelse, separerer fluoroforen og slukkeren, og genererer dermed et sterkt fluorescenssignal (figur 1A) 8,9,10.
I løpet av det siste tiåret har vi utviklet et bibliotek med forskjellige klasser av molekylære spenningsprober med fjærelementer laget av nukleinsyrer11, proteiner10 og polymerer8. Blant disse gir de DNA-baserte spenningsprobene det høyeste signal-støyforholdet og den største kraftfølsomheten, som enkelt justeres fra noen få pN opp til ~20 pN11. Vi har brukt disse sanntids DNA-spenningsprobene til å studere molekylære krefter generert av mange forskjellige celletyper, inkludert fibroblaster, kreftceller, blodplater og immunceller11,12,13. Dette manuskriptet vil beskrive protokoller for å syntetisere og sette sammen DNA-spenningsprober på en overflate for å kartlegge molekylære reseptorkrefter med pN-kraftoppløsning ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Mens den nåværende prosedyren inkluderer kjemiske modifikasjoner av nukleinsyren for å introdusere fluorescerende reporter (figur 1B), er det viktig å merke seg at mange av modifikasjons- og rensetrinnene kan outsources til tilpassede DNA-syntesefirmaer. Derfor er DNA-spenningssondeteknologien lett og tilgjengelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologimiljøene.
Kort sagt, for å montere DNA-spenningssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene armen og en slukkeankerstreng på den andre armen og immobiliseres deretter på et glasssubstrat (figur 1C, sanntidsspenning). I fravær av mekanisk kraft er hårnålen lukket, og dermed slokkes fluorescensen. Men når den påførte mekaniske kraften er større enn F1/2 (kraften ved likevekt som fører til en 50% sannsynlighet for å utfolde seg), smelter hårnålen mekanisk, og et fluorescerende signal genereres.
Ved å bygge på sanntids DNA-spenningssensor beskriver vi også protokoller for å kartlegge akkumulerte krefter, noe som er spesielt nyttig for å studere interaksjoner mellom reseptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes at immunreseptorer ofte viser kortvarige bindinger 3,14. Akkumulerte krefter avbildes ved hjelp av en "låsende" streng som fortrinnsvis binder seg til åpne DNA-hårnåler og muliggjør lagring av fluorescenssignaler assosiert med mekaniske trekkhendelser (figur 1C, låst spenning). Låsestrengen er designet for å binde et kryptisk bindingssted som eksponeres ved mekanisk indusert smelting av hårnålen og låse hårnålen i åpen tilstand ved å blokkere hårnålsfolding, og dermed lagre spenningssignalet og generere et akkumulert spenningskart. Videre er låsestrengen designet med et åtte-nukleotidtåhold, som muliggjør en tåholdsmediert strengforskyvningsreaksjon med sitt fulle komplement, den "låsende" strengen. Med tillegg av opplåsingsstrengen fjernes den bundne låsestrengen av hårnålskonstruksjonen, sletter det lagrede spenningssignalet og tilbakestiller hårnålen tilbake til sanntidstilstanden.
Figur 1: Skjema for state-of-art molekylære spenningsprober. (A) Generell utforming av sanntids molekylær spenningssonde, (B) Tråder for DNA-basert spenningssondekonstruksjon, og (C) konstruerte DNA-baserte spenningsprober og deres veksling mellom sanntidstilstand og låst tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Hovedprotokollen består av fire hovedseksjoner - oligonukleotidpreparasjon, overflatebehandling, avbildning og dataanalyse. Denne protokollen har blitt vellykket demonstrert av laboratoriet vårt og andre i naive og aktiverte OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + -celler, samt hybridomer, og kan brukes til å forhøre forskjellige immuncellereseptorer, inkludert T-cellereseptor, programmert celledødsreseptor (PD1) og lymfocyttfunksjonsassosiert antigen 1 (LFA-1) krefter. OT-1 CD8+ naive T-celler brukes som eksempelcellelinje i denne artikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OT-1 transgene mus er plassert på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøkene ble godkjent og utført under protokollen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Oligonukleotid forberedelse
- Løs opp ligandstrengens DNA i vann (18,2 MΩ resistivitet, brukt gjennom hele protokollen). Vortex og spinn ned løsningen med en bordplate sentrifuge. Still inn vannvolumet slik at den endelige konsentrasjonen er 1 mM. Valider konsentrasjonen ved å bruke et nanodrop spektrofotometer for å måle absorbansen ved 260 nm og bestemme den endelige konsentrasjonen basert på utryddelseskoeffisienten til oligonukleotidet.
MERK: Ligandstrengen har en modifikasjon ved hver endestasjon, 5' amin og 3' biotin, for å konjugere med fluoroforen og presentere den biotinylerte liganden. Amingruppen i ligandstrengen må konjugeres med en fluorofor. Cy3B-fargestoff brukes til denne konjugeringen på grunn av sin høye lysstyrke og fotostabilitet, men det tilbys vanligvis ikke kommersielt og krever intern konjugering. Følgelig beskriver følgende avsnitt konjugeringen mellom aminer og NHS-esterfarger. For sluttbrukere som ikke har tilgang til fasiliteter eller ressurser for nukleinsyremodifisering, kan modifiserte nukleinsyrer i stedet kjøpes fra tilpassede DNA-synteseleverandører som tilbyr lyse og fotostabile fargestoffer, for eksempel Alexa- og Atto-familien av fargestoffer. - Forbered 10x PBS og 1 M NaHCO3 løsninger. Bland 10 μL av 1 mM aminligandstrengløsning (10 nmol) med 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 og 60 μLH2O. Løs opp 50 μg Cy3B NHS-ester i 10 μL DMSO umiddelbart før bruk og tilsett til blandingen for et totalt reaksjonsvolum på 100 μL. Tilsett Cy3B NHS-ester sist. La det reagere ved romtemperatur i 1 time eller 4 °C over natten.
- Forbered Atto647N låsestreng ved å bøye aminlåsestrengen med Atto647N NHS-ester. Forbered 10x PBS og 1 M NaHCO3 løsning. Bland 10 μL av 1 mM aminlåsestrengløsning (10 nmol) med 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 og 60 μLH2O. Løs opp 50 μg Atto647N NHS-ester i 10 μL DMSO umiddelbart før bruk og tilsett blandingen for et totalt reaksjonsvolum på 100 μL. Tilsett Atto647N NHS-ester sist. La det reagere ved romtemperatur i 1 time eller 4 °C over natten.
- Etter reaksjonene, fjern biprodukter, overflødig fargestoff og salter ved P2 avsaltingsgelfiltrering. Fortynn reaksjonsblandingen medH2Otil et totalt volum på 300 μL, som er egnet for det påfølgende HPLC-rensingstrinnet. Tilsett 650 μL hydrert P2 gel til en sentrifugalanordning og spinn ned ved 18.000 x g i 1 min. Fjern væsken i bunnen av enheten, tilsett reaksjonsblandingen til kolonnen som inneholder P2 gel, spinn ned ved 18.000 x g i 1 min og samle reaksjonsblandingen i bunnen av enheten.
MERK: P2 gel bør hydreres minst 4 timer før bruk med H2O. - Rens den avsaltede reaksjonsblandingen med HPLC ved bruk av en C18-kolonne betegnet for oligonukleotidrensing, med løsningsmiddel A: 0,1 M TEAA i H2O og B: ACN som mobilfase for en lineær gradienteluering 10-100 % B over 50 minutter ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min. Injiser den avsaltede reaksjonsblandingen i omvendt fase HPLC med en 500 μL injeksjonssløyfe for rensing. Samle produktet som har en absorbanstopp for DNA (260 nm) og en absorbanstopp for fluoroforen (560 nm for Cy3B og 647 nm for Atto647N) og tørk dem i en vakuumsentrifugalkonsentrator over natten (se figur 2A).
- Rekonstituer det tørkede oligofargeproduktet i 100 μL vann. Bestem konsentrasjonen av Cy3B-ligandstrengen og Atto647N låsestreng med nanodråpespektrofotometeret. Forsikre deg om at fargestoffmerkingsforholdet er nær 1: 1. Korriger for 260 nm absorbans av fargestoffet om nødvendig ved bestemmelse av oligonukleotidkonsentrasjonen.
- Valider det rensede produktet med MALDI-TOF-MS ved bruk av 3-HPA som substrat i 50% ACN / H2O med 0,1% TFA og 5 mg / ml ammoniumsitrat ved bruk av 0,5 μL av produktet ved 1-5 μM for MALDI-TOF-MS prøvepreparering. Et eksempel på massespektrum finnes i figur 2B.
- Løs hårnålsstrengen og slukkeankerstrengen i vann og sørg for at konsentrasjonen av stamløsningene er mellom 50 og 100 μM.
MERK: Hårnålsstrengen er umodifisert og kan tilpasses direkte syntetisert fra en leverandør. Ankerstrengen har en tiol-forankringsgruppe og en quencher BHQ2 og kan tilpasses direkte syntetisert fra en leverandør. - Aliquot alle oligonukleotidene. For kortvarig bruk og oppbevaring, oppbevar disse oligonukleotidene ved 4 °C. For langtidsoppbevaring, frys ned og oppbevares ved -20 °C. På dette tidspunktet er alle oligonukleotidene klare for DNA-spenningssondemonteringen.
MERK: Gjentatte fryse-tine-sykluser er ikke problematiske for oligonukleotider.
2. Overflatebehandling
MERK: Utarbeidelsen av DNA-hårnålsspenningssondesubstrater tar to dager. DNA-hårnålsspenningssonden vil bli funksjonalisert på glassdeksler.
- Dag 1
- Plasser 25 mm deksler på et polytetrafluoretylenstativ i et 50 ml beger. Hvert stativ har plass til opptil 8 deksler. Skyll dekslene ved å senke i vann tre ganger.
- Tilsett 40 ml av en 1: 1-forhold (v: v) løsning av etanol blandet med vann til begeret som inneholder stativet og dekkene, og forsegle begeret med en parafinfilm.
- Sonikere begeret i 15 minutter i en ultralydsrenser (driftsfrekvens 35 KHz) for å rengjøre dekslene. Etter sonikering, kast væsken og skyll begeret med stativet og dekslene i det med vann minst 6 ganger for å fjerne gjenværende organisk løsningsmiddel.
- Forbered fersk Piranha-løsning ved å blande svovelsyre og hydrogenperoksid i forholdet 3: 1. For å lage 40 ml Piranha-løsning, tilsett 30 ml svovelsyre til et rent 50 ml beger først og tilsett deretter sakte 10 ml H 2 O2. Piranha-løsningen vil raskt varme opp og boble ved tilsetning av H 2O2. Bland forsiktig pirajaen med enden av en glasspipette.
- Deretter overfører du stativet som holder dekslene til begeret som inneholder forsiktig blandet Piranha-løsning for etsing (figur 3A). La Piranha-oppløsningen hydroksylate og rengjør dekslene i 30 minutter ved romtemperatur. Etter Piranha-etsing, overfør stativet med stål eller polytetrafluoretylenpinsett til et rent 50 ml beger med vann og skyll igjen med vann minst 6 ganger.
FORSIKTIG: Store mengder organiske stoffer kan reagere kraftig med Piranha-oppløsning og kan forårsake eksplosjon. Vær forsiktig og arbeid alltid med Piranha-løsningen i en avtrekkshette. Sørg for å bruke labcoat, hansker og vernebriller. Oppbevar aldri fersk Piranha-oppløsning i en lukket beholder.
MERK: Forholdet mellom hydrogenperoksid og svovelsyre bør holdes under 1: 2 (v: v) og bør aldri overstige 1: 1. Når du senker stativet med deksler i Piranha-løsning, plasser dem i løsningen sakte og forsiktig. Ikke kast oppløsningen umiddelbart etter etsing, da den fortsatt er aktiv og varm. La det ligge i begeret over natten før du heller det i syreavfallsbeholderen. - Senk stativet som holder dekslene i et 50 ml beger med 40 ml etanol for å fjerne vann. Kast etanolen og gjenta 3 ganger for å sikre at vannet er fjernet.
- Senk deretter stativet i 3 % aminopropyltrietoksysilan (APTES) (v/v) i 40 ml etanol for å reagere med -OH på dekslene i 1 time ved romtemperatur (figur 3B).
MERK: Etanol kan erstattes av aceton. - Skyll overflater 6 ganger ved å senke dem i 40 ml etanol, tørk deretter i ovnen ved 80 °C i 20 minutter. Etter avkjøling, oppbevar de tørkede aminmodifiserte dekslene ved -20 °C for fremtidig bruk (opptil 6 måneder).
- Dekk den nederste innsiden av 10 cm diameter plast petriskåler med parafinfilm. Parafinfilmen forhindrer at dekslene glir inn i petriskålen og hjelper til med å holde løsningen for de neste trinnene i funksjonaliseringsoppholdet på dekslene. Legg de nedkjølte aminmodifiserte dekslene i petriskålene. Siden som skal funksjonaliseres, skal vende oppover.
- For å modifisere amingruppene på dekslene, tilsett 300 μL 0,5 % w/v liposyre PEG NHS (LA-PEG-SC) og 2,5 % w/v mPEG NHS (mPEG-SC) i 0,1 M NaHCO3 på hver dekkslipp og inkuber i 1 time ved romtemperatur (figur 3C). For hver 25 mm coverslip, veier 1,5 mg LA-PEG-SC og 7,5 mg mPEG-SC. Løs opp NHS-reagensene umiddelbart før tilsetning til overflatene, da de har kort halveringstid (~ 10 min) i vandig løsning ved romtemperatur. Etter reaksjonen, skyll overflater 3 ganger med vann.
MERK: NHS-reaksjonen kan utføres ved 4 ° C over natten. NHS-reagenser har lengre halveringstid før hydrolyse ved 4 °C, som er rundt 4-6 timer. Dette vil resultere i en tre-dagers overflateforberedelsesprosedyre. - Tilsett 100 μL 0,1 M NaHCO3 inneholdende 1 mg/ml sulfo-NHS-acetat til et sett med "sandwich" coverslips (to coverslips vendt mot hverandre med reaksjonsbuffer i mellom). La passivering skje i minst 30 minutter. For å lagre reagens kan dette trinnet gjøres med 50 μL 1 mg / ml sulfo-NHS-acetat. Skyll med vann tre ganger etter passivering.
- Tilsett 0,5 ml gull nanopartikler (AuNP, 8,8 nm, garvesyre, 0,05 mg / ml) til hvert deksel og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur (figur 3D). For å lagre reagenset kan dette trinnet gjøres ved å smøre to coverslips også. Pass på at ingen salter er tilstede i systemet fra tidligere trinn for å unngå aggregering av gull nanopartikler. Ikke la dekslene tørke etter dette trinnet.
- I mellomtiden konstruerer pre-hybridisere 4.7 pN hårnål, Cy3B ligandstreng og BHQ2 ankerstreng som danner DNA-spenningsprobene i forholdet 1.1: 1: 1 i 1 M NaCl ved 300 nM i et PCR-rør. Anneal trådene ved å varme opp oppløsningen til 95 °C i 5 minutter, avkjøl deretter gradvis ved å redusere temperaturen til 20 °C i løpet av 30 minutter i en termisk syklist.
- Skyll dekslene med vann tre ganger etter 30 min inkubasjon med gull nanopartikler. Legg til ekstra BHQ2 ankerstreng (fra 100 μM lager) til den glødet DNA-løsningen for å gjøre forholdet mellom BHQ2 ankerstreng og Cy3B ligandstreng 10: 1. På dette tidspunktet skal DNA-løsningen inneholde 300 nM spenningssondekonstruksjon og 2,7 μM BHQ2-streng. Tilsett 100 μL per to coverslips for å lage "sandwich" (figur 3E).
- Legg forsiktig en våt lab vev ball i petriskålen (vekk fra coverslips) og forsegle parabolen med parafinfilm for å forhindre at løsningen tørker opp. Dekk fatet med folie og rug ved 4 °C over natten.
- Dag 2
- Vask av overflødige sonder fra dekslene med 1x PBS. Sjekk for DNA-spenningssondens overflatekvalitet under et epifluorescerende mikroskop.
- Tilbered 40 μg/ml streptavidin i 1x PBS og inkuber på dekkslipp i 30 minutter ved romtemperatur (figur 3F). Vanligvis er 100 μL tilstrekkelig for en 25 mm deksel. Skyll med PBS 3 ganger etter inkubering for å vaske bort overflødig mengde streptapavidin.
- Klargjør 40 μg/ml biotinylert antistoff/ligand i 1x PBS. Tilsett 50-100 μL per sandwich og rug i 30 minutter ved romtemperatur (figur 3G). Skyll med PBS tre ganger etter inkubasjon for å vaske bort overflødig mengde biotinylert antistoff / ligand.
- Monter de rene bildekamrene med overflater nøye. Overflater kan lett sprekke når du strammer kamrene. Tilsett 0,5-1 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) til bildekamrene og hold dem klare for avbildning med celler (figur 3H).
3. Imaging cellereseptorkrefter
- Forbered immunceller av interesse for HBSS ved 1-2 x 106 celler / ml.
MERK: OT-1 CD8+ naive celler brukes som eksempel i denne artikkelen. Rens OT-1 CD8+ naive T-celler fra milten til ofrede mus ved hjelp av MACS-musens CD8+ T-celleisolasjonssett med en MACS-separator etter produsentens instruksjoner. Isoler og berik CD8+ T-cellene ved å fjerne eventuelle ikke-CD8+ T-celler som magnetisk nedbrytende antistoffcocktail er bundet til. Resuspender rensede OT-1 CD8+ naive T-celler i HBSS ved 2 x 106 celler/ml og hold på is før bruk. - Kontroller kvaliteten på DNA-hårnålsspenningssondens overflate under et fluorescensmikroskop (100x objektiv) for kvalitetskontroll før du legger til ligander eller platingceller. Avbilde og kvantifiser den gjennomsnittlige bakgrunnsintensiteten i Cy3B-kanalen til en DNA-hårnålsspenningssondeoverflate fra minst 5 forskjellige posisjoner og 3 replikater. Hold forholdene for bildeinnsamling konsistente, slik at denne verdien kan brukes som en pålitelig markør for overflatekvalitet og sondetetthet (figur 4C).
MERK: Kvantifiser antall DNA-tråder per gull nanopartikkel og antall gull nanopartikler per μm2 de første gangene av overflatebehandling i henhold til litteratur12, som kan brukes som en annen pålitelig markør for overflatekvalitet. - Plate ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 celler på hver DNA-spenningssonde funksjonalisert coverslip og la dem feste og spre seg i ~ 15 min ved romtemperatur.
- Når celler blir belagt på DNA-hårnålsspenningsprobene og begynner å spre seg, avbilde fluorescenssignalene som genereres i Cy3B-kanalen med 100x-målet (figur 3I).
- Etter at cellene begynner å produsere spenningssignal i sanntid på DNA-hårnålsspenningssondens overflate i Cy3B-kanalen, kan du ta bilder i både Cy3B- og Atto647N-kanaler (TIRF-mikroskopi gir bedre signal-støy-forhold enn epifluorescens). Deretter tilsettes Atto647N-streng til bildekamrene ved en endelig konsentrasjon på 200 nM for mekanisk selektiv hybridisering.
- Etter 10 minutters inkubering, fjern raskt og forsiktig bufferen som inneholder den fluorescerende Atto647N låsestrengen og erstatt med friske Hanks balanserte salter. Bilde i både Cy3B- og Atto647N-kanaler igjen og bestem Pearsons korrelasjonskoeffisient med Fiji-programvare15.
- På tidspunktet av interesse for undersøkelsen, introduser ikke-fluorescerende låsestreng til cellene i bildekammeret for å lagre spenningssignalet. Forbered låsetrådstokk (100 μM) og tilsett cellene ved en endelig konsentrasjon på 1 μM. Pipett forsiktig for å blande. Varigheten av låsingen kan variere, men 10 min er anbefalt tid.
- Skaff time-lapse-filmer eller endepunktsbilder i epifluorescens for både kvalitativ spenningskartlegging og kvantitativ analyse etter behov (figur 3J og figur 5).
MERK: Hvis spenningsmåling på flere tidspunkter er ønskelig, start sletting av lagrede spenningssignaler ved å legge til en opplåsingsstreng. For å unngå overflødig skylling brukes en høyere sluttkonsentrasjon av opplåsingsstreng ved 2 μM for å starte en tåholdsmediert trådforskyvningsreaksjon med låsestrengen i 3 minutter, som sletter de lagrede signalene (figur 3J). Skyll forsiktig de overskytende oligonukleotidene av med HBSS. DNA-hårnålsspenningssondens overflate og cellene er klare for en ny runde med spenningslagring og kartlegging. Opplåsing av spenningssignaler er ikke nødvendig hvis bare ett tidspunkt er av interesse for studien.
4. Dataanalyse
MERK: Bildeanalyse utføres ved hjelp av Fiji-programvare, og den kvantitative analysen utføres ved hjelp av analyseprogramvare.
- Korriger eventuell drift under bildeopptak med kommandoen Rett opp 3D-drift i Registrering under Pluginmoduler-menyen.
- Fjern kamerabakgrunnen til bildet med kommandoen Trekk fra under Prosess-menyen .
- Fastslå Pearsons korrelasjonskoeffisient med funksjonen Kolokalisering på Analyser-menyen.
- Gjennomsnitt og trekk fluorescensbakgrunnen produsert av de uåpnede sondene fra tre forskjellige lokale bakgrunnsregioner. Tegn ROI for celler på enten bakgrunnsfratrukne bilder eller RICM-bilder (refleksjon, interferens, kontrastmikroskopi) med Image J Freehand Selections-verktøyet . Mål alle målinger av interesse for avkastningen, for eksempel integrert fluorescensintensitet og spenningsbelegg ved hjelp av måleverktøyet under Analyser-menyen (figur 6).
- Eksporter målingene for kvantitativ analyse med analyseprogramvare.
- Plott dataene med hvilken som helst analyseprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi representative bilder av overflatekvalitetskontroll (figur 4). En overflate av høy kvalitet bør ha en ren bakgrunn i RICM-kanalen (figur 4B) og jevn fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samme bildebehandlingsutstyr og identiske fluorescensavbildningsoppkjøpsbetingelser, bør bakgrunnsfluorescensintensiteten være konsistent og reproduserbar hver gang når man utfører eksperimenter med DNA-prober. Vi anbefaler at du bruker den som en markør for overflatekvalitetskontrollen før hvert sett med individuelle eksperimenter.
I denne artikkelen viser vi noen representative data (figur 5) med OT-1-naive CD8+ -celler som modellcelletype, som spesifikt gjenkjenner kyllingens ovalbumin. CD3ε-antistoffet inngår som positiv kontroll for systemet, og det kognitive antigenet pMHC N4 (SIINFEKL) brukes som eksempel. Celler ble belagt på substrater som ble funksjonalisert med 4,7 pN DNA-hårnålsprober som presenterte enten antiCD3ε eller pMHC N4. Etter 30 minutter ble cellespredning i RICM og sanntidsspenningen i Cy3B-kanalen fanget, og låsestrengen ble introdusert ved en endelig konsentrasjon på 1 μM. Time-lapse av strekklåsing viste at både TCR-antiCD3ε og TCR-pMHC spenningssignaler ble forsterket på grunn av hårnålslåsing og signalakkumulering. Videre viste TCR-pMHC N4-interaksjon svakt kraftsignal i sanntid (0 min), sannsynligvis på grunn av dets korte bindingstid. Låsestrengen registrerte disse kortvarige mekaniske trekkhendelsene, noe som letter kvantitativ analyse. I tillegg avslørte låsing mønsteret av TCR-pMHC-kraften når den akkumuleres, noe som var ganske forskjellig fra antiCD3ε-kontrollen og lignet "bull's-eye" -mønsteret til immunsynapser. Kvantifiseringen av fluorescenssignalet er beskrevet i trinn 4.4. Vi bruker vanligvis spenningsbelegget (definert som prosentandelen av området som har spenningssignal over kontaktområdet) og integrert fluorescensintensitet av hver celle som en metrisk for å evaluere akkumulert spenning som er > 4,7 pN.
Figur 2: Eksempler på oligonukleotidpreparat. (A) HPLC-kromatogram av Cy3B ligandstrengrensing; (B) MALDI-TOF-MS-spektra av produktet; (C) Tabell over beregnet masse og funnet m / z topper av utgangsmaterialet og det merkede oligonukleotid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Funksjonalisering av DNA-spenningssondesubstratene og eksperimentprosedyrene. Trinn er beskrevet i den tilsvarende protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på DNA-spenningssondeoverflate med god kvalitet. (A) atomkraftmikroskopi (AFM) karakterisering av DNA-spenningssondens overflate; og råmikroskopibilder av en DNA-spenningsprobeoverflate i (B) RICM- og (C) Cy3B-kanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempel på råmikroskopibilder av et vellykket eksperiment. Bilder viser OT-1-naive CD8+ -celler som produserer TCR-krefter mot (A) antiCD3ε og (B) pMHC N4. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på databehandling og kvantitativ analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Eksempler på vellykkede og mislykkede overflater og spenningskartlegging . (A) Celler som ikke sprer seg sammenlignet med celler som sprer seg på pMHC N4-overflatene i RICM. (B) OT-1-celle som spredte seg, men ikke genererte noe spenningssignal på en antiCD3ε-overflate med lav DNA-spenningsprobetetthet. (C) Bilde som viser at den vellykkede overflaten er blekrosa, og den mislykkede overflaten er fargeløs. (D) Bilde i Cy3B-kanal som viser fluorescerende aggregater fra en gammel DNA-stamme. (E) Mønsteret i RICM-kanalen og Cy3B-kanalen som sannsynligvis skyldes enten utilstrekkelig vask eller utilsiktet overflatetørking mellom trinnene. (F) Bilder i RICM- og Cy3B-kanaler som viser effekten av å bruke Au NP av forskjellige størrelser. (G) RICM- og Cy3B-bilder av OT-1-celler som ikke utøvde spenningssignaler, men i stedet utarmet DNA. Skala bar = 5 μm. Merk at rådataene som vises her, ble samlet inn av forskjellige gruppemedlemmer med forskjellige bildeoppkjøpsinnstillinger fra 3 mikroskoper, og dermed hadde forskjellige fluorescensbakgrunnsnivåer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de detaljerte prosedyrene som er gitt her, kan man forberede DNA-hårnålsspenningssondesubstrater for å kartlegge og kvantifisere reseptorspenningen produsert av immunceller. Når celler blir belagt på DNA-hårnålsspenningssondesubstratet, lander, fester de seg og sprer seg når reseptorene sanser ligandene både kjemisk og mekanisk, hvorav sistnevnte oppdages av våre sonder. I noen tilfeller kan imidlertid celler mislykkes i å spre seg (Figur 7A) eller ikke produserer spenningssignal. Dette er ofte en konsekvens av overflatekjemiproblemer og krever feilsøking (Tabell 1). Lav ligandtetthet er et av de vanligste problemene som resulterer i svikt i cellespredning. Dette kan være et resultat av flere faktorer, for eksempel degradert ligand, degraderte DNA-tråder, hydrolyserte reagenser som APTES og / eller LA-PEG-NHS, aggregerte gullnanopartikler eller utilstrekkelig rengjøring av glassdeksel. Ved å sammenligne substratbakgrunnsfluorescensintensitet over vellykkede eksperimenter og mislykkede (Figur 7B), kan man raskt vurdere kilden til problemet. For eksempel indikerer overflater med sterkt fluorescenssignal fra bakgrunnsmålingene at immobiliseringen av DNA-prober var vellykket. Lav bakgrunnsintensitet antyder problemer i forberedelsestrinnene før tilsetning av streptatidin og biotinylert ligand. Hvis problemet skyldes liganden, kan kvaliteten kontrolleres ved å belegge den på et glassglass eller brønner i en 96-brønnsplate ved 10 μg / ml for å teste for celleadhesjon. Dette er en nyttig funksjonell test av ligandaktivitet for pMHC-ligander og anti-CD3-antistoffer. Ved å observere fargeendringen (blekrosa) på de funksjonaliserte dekksedlene etter Au NP-inkubasjonstrinnet, kan man vurdere om problemet skyldes DNA-nedbrytning eller trinnene forut for inkubasjon med DNA (Figur 7C). DNA-strengkvaliteten kan valideres med HPLC og MALDI-TOF-MS, der en enkelt DNA-prøve vil vise flere topper hvis den brytes ned. Kvaliteten på Au NP kan bekreftes ved å sammenligne UV-Vis-spektra og TEM-bilder med karakteriseringen fra produsenten. Hvis kvaliteten på liganden, DNA-trådene og Au NP er validert og disse reagensene ikke forårsaker overflateproblemet, anbefaler vi å erstatte reagenser inkludert APTES, LA-PEG-NHS, svovelsyre og H2O2 for fremtidig overflatebehandling i stedet for å bruke tid på å nøyaktig finne årsaken til overflatekjemiproblemet. Bortsett fra problemet med lav tetthet som vil forårsake en stor svikt i DNA-probesubstratet, er det noen få mindre problemer som kan påvirke datakvaliteten. Siden overflatebehandlingen har flere inkubasjonstrinn, bør buffere som brukes under overflatebehandling gjøres friske, filtreres og oppbevares ved 4 °C for oppbevaring for å unngå kontaminering. Hvis en overflate er forurenset, vil den være synlig i RICM-kanalen og kan resultere i en merkelig fluorescensbakgrunn. Bortsett fra forurensning kan det dannes aggregater i DNA-stamløsningen over tid, noe som kan resultere i lyse prikker i Cy3B-kanalen (Figur 7D). Vanligvis vil noen få aggregater ikke påvirke datakvaliteten; Men hvis en celle lander på regioner med slike feil, er dataanalysen mindre pålitelig. Av og til kan uregelmessige mønstre som påvirker spenningskartlegging observeres i både RICM- og Cy3B-kanalene, noe som kan komme fra utilstrekkelig vask etter APTES-trinnet, eller utilsiktet tørking av overflaten under trinnene etter at gullpartikler er funksjonalisert på overflaten (Figur 7E). Disse mønstrene kan påvirke spenningskartleggingen avhengig av hvor alvorlig den er. For å spare relativt verdifulle reagenser som antistoffer eller pMHC, anbefaler vi alltid å sjekke overflatekvaliteten (se 2.2.1 og 3.3) før funksjonalisering av DNA-hårnålsspenningsprober med antistoff/ligand. Selv om denne overflatebehandlingsprotokollen har vært robust og pålitelig i våre hender, merk at den ikke alltid tåler endringer på visse trinn veldig bra. For eksempel, når base- og plasmaetsing brukes i stedet for piranha-etsing, er det svært sannsynlig at sondetettheten minker, og flere overflatedefekter er tilstede. Endringer av Au NP-størrelse og kappereagenser vil sannsynligvis dramatisk påvirke overflatefunksjonaliseringsresultatene (Figur 7F). For eksempel har vi funnet ut at 5 og 10 nm Au NP ikke binder seg til liposyremodifiserte overflater veldig bra, noe som resulterer i minimal DNA etter overflatebehandling. Imidlertid kan 8, 8 nm og 13 nm Au NP binde seg til liposyreoverflatene ved en mye høy tetthet, som har blitt observert i RICM (ruhet) og Cy3B-kanal (fluorescensintensitet).
Når DNA-hårnålsspenningssondeoverflater av god kvalitet er utarbeidet, kan man utføre eksperimenter med celler av interesse og skaffe data med et fluorescensmikroskop. Sanntidsspenningen kan fanges opp med et vanlig fluorescensmikroskop utstyrt med et høyt NA-mål (numerisk blenderåpning) og EMCCD. Vær imidlertid oppmerksom på at vi har observert at primære T-celler av og til viser artefakter på DNA-spenningssondens overflater på grunn av den aktuelle musens forhold. Anekdotisk er slike gjenstander mer sannsynlig å skje med eldre mus. For eksempel har vi observert negativ uttømming av fluorescensen i stedet for påslåtte fluorescenssignaler (figur 7G). I dette tilfellet avslutter du eksperimentet og gjør om med en ny gruppe celler. Før du bruker ikke-fluorescerende låsetråd for kvantitativ analyse av reseptorkrefter, må lagring og sletting av spenningssignalet bekreftes med en fluorescerende Atto647N låsestreng. Etter første låsing i 10 minutter, bør Atto647N-signalet være sterkt samlokalisert med Cy3B-signal, da det reflekterer spenningshistorikk under denne inkubasjonen. Siden Cy3B-signalet ikke bare reflekterer spenningshistorikken, men også sanntidskreftene etter fjerning av låsestrengen, er det mulig at en liten delmengde av Cy3B-signalet ikke ledsages av Atto647N-signal (figur 3J). For en mer kvantitativ analyse av spenning anbefaler vi å bruke en ikke-fluorescerende låsetråd som vil eliminere den potensielle energioverføringen mellom Cy3B og Atto647N, samt unngå overflødig vask mellom bildeopptak. Merk at tilsetning av låsestreng uunngåelig vil føre til en liten fluorescensbakgrunnsøkning, da termodynamikken vil drive litt mindre hybridisering mellom hårnålen og låsestrengen, som kan trekkes fra før kvantifisering. Man kan kvantifisere den integrerte intensiteten til hver celle etter låseprosedyre for å studere kraften generert av en bestemt reseptor. I tillegg reflekterer kinetikken til låsing sannsynligvis 2D k på og kav en reseptor til liganden.
| Problem | Mulig årsak | Løsning |
| Overflater er ikke rosa etter AuNP-inkubasjon | Utilstrekkelig etsning | Inkluder et base-etsningstrinn etter piranha-etsning. Ets deksler i 0,5 M KOH i isbad i 1 time med sonikering. |
| APTES hydrolyseres | Bruk nye APTES | |
| NHS-reagenser hydrolyseres | Bruk nye PEG-NHS-reagenser | |
| PEG-NHS-reagenser hydrolyseres før de tilsettes overflater | Arbeid raskere | |
| Au NP har aggregert | Bruk nye Au NP | |
| Restvann på dekslene fortynnet Au NP | Pass på at det er ingen/lite vannrester før du tilsetter Au NP | |
| Celler sprer seg ikke på overflaten | Lav DNA-probetetthet | Hvis overflatene ikke er så rosa, feilsøk som beskrevet ovenfor. Hvis Au NP-funksjonaliseringen er normal, syntetiser og bruk nytt DNA |
| Lav ligandtetthet | Bruk nye streptavidin og ligandreagenser | |
| Celler sprer seg ikke på liganden | Sjekk cellespredning på en ligandbelagt overflate, hvis cellene ikke sprer seg fortsatt, inkluder adherende molekyler som beskrevet i ref.12. | |
| Celler sprer seg godt, men ingen spenningssignal eller bare svært svakt spenningssignal observeres selv med antistoffkontroll | Reseptor-ligand-interaksjonen har ikke kraftoverføring | NA |
| Kraften er kortvarig eller kraftsignalene er sparsomme | Bruk låsing av oligonukleotid | |
| Overflaten er ikke passivert godt | Øk sulfo-NHS-acetatet conc., opptil 10 mg / ml | |
| Det observeres ikke noe låsesignal i Atto647N | Oligonukleotid har blitt nedbrutt | Sjekk med MALDI-TOF-MS |
| Låsesignal er antilokalisert med sanntidssonde | Reseptorkraften er høyere enn arbeidsområdet for låsende nukleotid | Bruk 19 pN hårnålssonde i sanntid fra ref. 12 som beskrevet. |
Tabell 1: Feilsøking med det DNA-baserte spenningssondesystemet.
Anvendelsen av mekanisk informasjonslagring er spesielt nyttig for å kartlegge reseptorkrefter generert av immunceller, som ofte er forbigående og mindre rikelige. Som bestemt ved enkeltmolekylspektroskopimålinger, observeres toppbindingslevetiden ved bruk av ~ 10 pN kraft med en levetid som varierer fra mindre enn 100 millisekunder til flere sekunder lang. Slike kortvarige bindinger er vanskelige å fange med konvensjonell DNA-hårnålsspenningssondeavbildning15. En annen bruk av dette mekaniske lagringssystemet er når tettheten av reseptoren av interesse er relativt lav på celleoverflaten16, noe som resulterer i et sparsomt signal som ofte er vanskelig å skille fra bakgrunnen med konvensjonelle DNA-hårnålsspenningsprober. Slike reseptorkrefter med lav tetthet kan avsløres ved akkumulert spenningskartlegging med denne strategien. Merk at vi spesifikt begrenser anvendelsen av denne strategien på immunceller, da kreftene som er tilstede i immunceller er kjent for å være i det nedre regimet (TCR < 19 pN) sammenlignet med integriner i fibroblaster eller blodplater (opptil eller mer enn 56 pN) 12,13,15. Årsaken er at hybridiseringshastighetskonstanten khyb ikke er svekket når belastningen er mindre enn 20 pN i henhold til optiske pinsettmålinger, som ligger i området 106 M-1 S-1. Videre antas k hyb under krefter < 20 pN å være litt høyere enn ved khyb ved null kraft, da den svake kraften bidrar til å justere strengen for den komplementære strengen for å hybridisere med17. På den annen side forventes større krefter å hindre hybridiseringen, ettersom koff øker og skaper en barriere for hybridisering å skje18. For en lås som er 15-17 nukleotid lang, anslår vi at en kraft rundt 27,8 til 30,8 pN vil hindre hybridiseringen. Gitt disse begrensningene, foreslår vi å utelukkende anvende denne metoden i undersøkelser av immuncellereseptorkrefter. I tillegg vil tilstedeværelsen av låsestrengen sannsynligvis vippe energilandskapet for hårnålsutfolding, noe som kan redusere den effektive F1/2 litt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 og NSF CAREER 1350829. Vi takker NIH Tetramer Facility for pMHC-ligander. Denne studien ble delvis støttet av Emory Comprehensive Glycomics Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
- Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
- Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
- Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
- Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
- Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
- Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).
