Summary
Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att använda DNA-baserade spänningssonder för att avbilda receptorkrafterna som appliceras av immunceller. Detta tillvägagångssätt kan kartlägga receptorkrafter >4.7pN i realtid och kan integrera krafter över tid.
Abstract
Mekaniska krafter som överförs vid korsningen mellan två angränsande celler och vid korsningen mellan celler och den extracellulära matrisen är avgörande för att reglera många processer som sträcker sig från utveckling till immunologi. Därför är det viktigt att utveckla verktygen för att studera dessa krafter i molekylär skala. Vår grupp utvecklade en serie molekylära spänningssensorer för att kvantifiera och visualisera de krafter som genereras av celler och överförs till specifika ligander. Den känsligaste klassen av molekylära spänningssensorer består av nukleinsyrastamslinga hårnålar. Dessa sensorer använder fluorofor-släckarpar för att rapportera om den mekaniska förlängningen och utvecklingen av DNA-hårnålar som är i kraft. En utmaning med DNA-hårnålsspänningssensorer är att de är reversibla med snabb hårnålsvikning vid avslutad spänning och därmed är övergående krafter svåra att registrera. I den här artikeln beskriver vi protokollen för att förbereda DNA-spänningssensorer som kan "låsas" och förhindras från att vikas om för att möjliggöra "lagring" av mekanisk information. Detta möjliggör inspelning av mycket övergående piconewtonkrafter, som därefter kan "raderas" genom tillsats av komplementära nukleinsyror som tar bort låset. Denna förmåga att växla mellan spänningskartläggning i realtid och mekanisk informationslagring avslöjar svaga, kortlivade och mindre rikliga krafter, som vanligtvis används av T-celler som en del av deras immunfunktioner.
Introduction
Immunceller försvarar sig mot patogener och cancerceller genom att kontinuerligt krypa och skanna målcellernas ytor för antigener, studding deras yta 1,2. Antigenigenkänning initieras vid bindning mellan T-cellreceptorn (TCR) och det peptid-stora histokompatibilitetskomplexet MHC (pMHC) -komplexet uttryckt på ytan av målceller. Eftersom TCR-pMHC-igenkänning sker vid korsningen mellan två mobila celler har den länge misstänkts för att uppleva mekaniska krafter. Dessutom ledde detta till mekanosensormodellen för TCR-aktivering, vilket tyder på att TCR-krafter bidrar till dess funktion 3,4. För att förstå när, var och hur mekaniska krafter bidrar till T-cellernas funktion är det absolut nödvändigt att utveckla verktyg för att visualisera de molekylära krafter som överförs av T-celler. Traditionellt används metoder som dragkraftmikroskopi (TFM) och mikropelarrayer för att undersöka cellulära krafter 5,6. Emellertid är kraftkänsligheten hos TFM- och mikropelarrayer på nanonewton (nN) -skalan och är därför ofta otillräcklig för att studera molekylära piconewton (pN) -krafter som överförs av cellreceptorer7. För att förbättra kraften och den rumsliga upplösningen för detektion var vårt laboratorium banbrytande för utvecklingen av molekylära spänningsprober, som ursprungligen syntetiserades med användning av polyetylenglykol (PEG) polymerer7. Molekylära spänningsprober består av en utdragbar molekylär "fjäder" (PEG, protein, DNA) flankerad av en fluorofor och släckare och förankras på en yta. Krafter som appliceras på sondens ändpunkt leder till dess förlängning, separerar fluoroforen och släckaren och genererar därmed en stark fluorescenssignal (figur 1A)8,9,10.
Under det senaste decenniet har vi utvecklat ett bibliotek av olika klasser av molekylära spänningsprober med fjäderelement tillverkade av nukleinsyror11, proteiner10 och polymerer8. Bland dessa ger de DNA-baserade spänningsproberna det högsta signal-brusförhållandet och den största kraftkänsligheten, som enkelt ställs in från några pN upp till ~ 20 pN11. Vi har använt dessa DNA-spänningsprober i realtid för att studera de molekylära krafterna som genereras av många olika celltyper, inklusive fibroblaster, cancerceller, blodplättar och immunceller11,12,13. Detta manuskript kommer att beskriva protokoll för att syntetisera och montera DNA-spänningsprober på en yta för att kartlägga molekylära receptorkrafter med pN-kraftupplösning med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop. Medan det nuvarande förfarandet inkluderar kemiska modifieringar av nukleinsyran för att introducera den fluorescerande reportern (figur 1B), är det viktigt att notera att många av modifierings- och reningsstegen kan outsourcas till anpassade DNA-syntesföretag. Därför är DNA-spänningsprober teknik lätt och tillgänglig för de bredare cellbiologi- och mekanobiologiska samhällena.
Kortfattat, för att montera DNA-spänningssensorer, hybridiseras en DNA-hårnål till en fluorescerande ligandsträng på ena armen och en släckarankarsträng på den andra armen och immobiliseras sedan på ett glassubstrat (Figur 1C, realtidsspänning). I frånvaro av mekanisk kraft stängs hårnålen och fluorescensen släckes. Men när den applicerade mekaniska kraften är större än F1/2 (kraften vid jämvikt som leder till en 50% sannolikhet för utfällning) smälter hårnålen mekaniskt och en fluorescerande signal genereras.
Med utgångspunkt i DNA-spänningssensorn i realtid beskriver vi också protokoll för att kartlägga ackumulerade krafter, vilket är särskilt användbart för att studera interaktioner mellan receptorer på immunceller och deras naturliga ligand. Detta beror på att immunreceptorer ofta uppvisar kortlivade bindningar 3,14. Ackumulerade krafter avbildas med hjälp av en "låsande" sträng som företrädesvis binder till öppna DNA-hårnålar och möjliggör lagring av fluorescenssignaler associerade med mekaniska draghändelser (figur 1C, låst spänning). Låssträngen är utformad för att binda ett kryptiskt bindningsställe som exponeras vid mekaniskt inducerad smältning av hårnålen och låsa hårnålen i öppet tillstånd genom att blockera hårnålens omvikning, vilket lagrar spänningssignalen och genererar en ackumulerad spänningskarta. Dessutom är låssträngen utformad med en åtta-nukleotid-tåhållare, vilket möjliggör en tåhållmedierad strängförskjutningsreaktion med sitt fulla komplement, den "upplåsta" strängen. Med tillägget av upplåsningssträngen avlägsnas den bundna låssträngen från hårnålskonstruktionen, raderar den lagrade spänningssignalen och återställer hårnålen till realtidsläget.
Figur 1: Schema för de toppmoderna molekylära spänningsproberna . (A) Allmän design av molekylär spänningssond i realtid, (B) strängar för den DNA-baserade spänningssondkonstruktionen, och (C) konstruerade DNA-baserade spänningssonder och deras växling mellan realtidstillstånd och låst tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Huvudprotokollet består av fyra huvudsektioner - oligonukleotidberedning, ytbehandling, avbildning och dataanalys. Detta protokoll har framgångsrikt demonstrerats av vårt laboratorium och andra i naiva och aktiverade OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + -celler, såväl som hybridom, och kan tillämpas för att förhöra olika immuncellreceptorer inklusive T-cellreceptor, programmerad celldödsreceptor (PD1) och lymfocytfunktionsassocierad antigen 1 (LFA-1) krafter. OT-1 CD8 + naiva T-celler används som exempel cellinje i detta papper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OT-1 transgena möss är inrymda vid avdelningen för djurresurser vid Emory University. Alla experiment godkändes och utfördes enligt IACUC-protokollet (Institutional Animal Care and Use Committee).
1. Oligonukleotidpreparat
- Lös upp ligandsträngens DNA i vatten (18,2 MΩ resistivitet, används i hela protokollet). Vortex och snurra ner lösningen med en bordscentrifug. Ställ in vattenvolymen så att den slutliga koncentrationen är 1 mM. Validera koncentrationen med hjälp av en nanodropspektrofotometer för att mäta absorbansen vid 260 nm och bestämma den slutliga koncentrationen baserat på oligonukleotidens extinktionskoefficient.
OBS: Ligandsträngen har en modifiering vid varje ändstation, 5'amin och 3'biotin, för att konjugera med fluoroforen och presentera den biotinylerade liganden. Amingruppen i ligandsträngen måste konjugeras med en fluorofor. Cy3B-färgämne används för denna konjugering på grund av dess höga ljusstyrka och fotostabilitet, men det erbjuds vanligtvis inte kommersiellt och kräver intern konjugering. Följaktligen beskriver följande avsnitt konjugeringen mellan aminer och NHS-esterfärgämnen. För slutanvändare som inte har tillgång till anläggningar eller resurser för nukleinsyramodifiering kan modifierade nukleinsyror istället köpas från anpassade DNA-syntesleverantörer som erbjuder ljusa och fotostabila färgämnen, såsom Alexa och Atto-familjen av färgämnen. - Förbered 10x PBS och 1 M NaHCO3 lösningar. Blanda 10 μl av 1 mM aminligandsträngslösning (10 nmol) med 10 μl 10x PBS, 10 μl 1 MNaHCO3 och 60 μlH2O. Lös 50 μg Cy3B NHS-ester i 10 μl DMSO omedelbart före användning och tillsätt till blandningen för en total reaktionsvolym på 100 μl. Tillsätt Cy3B NHS-ester sist. Låt reagera vid rumstemperatur i 1 timme eller 4 °C över natten.
- Förbered Atto647N-låssträngen genom att konjugera aminlåssträngen med Atto647N NHS-ester. Förbered 10x PBS och 1 M NaHCO3-lösning . Blanda 10 μl av 1 mM aminlåssträngslösning (10 nmol) med 10 μl 10x PBS, 10 μl 1 MNaHCO3 och 60 μlH2O. Lös 50 μg Atto647N NHS-ester i 10 μl DMSO omedelbart före användning och tillsätt till blandningen för en total reaktionsvolym på 100 μl. Tillsätt Atto647N NHS-ester sist. Låt reagera vid rumstemperatur i 1 timme eller 4 °C över natten.
- Efter reaktionerna, avlägsna biprodukter, överskott av färgämne och salter genom P2-avsaltningsgelfiltrering. Späd reaktionsblandningen medH2Otill en total volym av 300 μl, vilket är lämpligt för det efterföljande HPLC-reningssteget. Tillsätt 650 μL hydratiserad P2-gel till en centrifugalanordning och snurra ner vid 18 000 x g i 1 minut. Ta bort vätskan längst ner på enheten, tillsätt reaktionsblandningen till kolonnen innehållande P2-gel, snurra ner vid 18 000 x g i 1 minut och samla reaktionsblandningen längst ner på enheten.
OBS: P2 gel bör hydreras minst 4 timmar före användning medH2O. - Rena den avsaltade reaktionsblandningen med HPLC med en C18-kolonn avsedd för oligonukleotidrening, med lösningsmedel A: 0,1 M TEAA iH2Ooch B: ACN som mobil fas för en linjär gradienteluering 10-100% B under 50 minuter vid en flödeshastighet på 0,5 ml/min. Injicera den avsaltade reaktionsblandningen i HPLC med omvänd fas med en 500 μl injektionsslinga för rening. Samla upp den produkt som har en absorbanstopp för DNA (260 nm) och en absorbanstopp för fluoroforen (560 nm för Cy3B och 647 nm för Atto647N) och torka dem i en vakuumcentrifugalkoncentrator över natten (se figur 2A).
- Bered den torkade oligofärgningsprodukten i 100 μl vatten. Bestäm koncentrationen av Cy3B-ligandsträngen och Atto647N-låssträngen med nanodropspektrofotometern. Se till att färgmärkningsförhållandet är nära 1: 1. Korrigera för färgämnets 260 nm absorbans om det behövs vid bestämning av oligonukleotidkoncentrationen.
- Validera den renade produkten med MALDI-TOF-MS med 3-HPA som substrat i 50 % ACN/H2Omed 0,1 % TFA och 5 mg/ml ammoniumcitrat med 0,5 μL av produkten vid 1–5 μM för provberedning med MALDI-TOF-MS. Ett exempel på massspektrum finns i figur 2B.
- Lös upp hårnålssträngen och släckarankarsträngen i vatten och se till att stamlösningens koncentration är mellan 50 och 100 μM.
OBS: Hårnålsträngen är oförändrad och kan skräddarsys direkt från en leverantör. Ankarsträngen har en tiolförankringsgrupp och en släckare BHQ2 och kan skräddarsys direkt från en leverantör. - Alikvot alla oligonukleotider. För kortvarig användning och förvaring, förvara dessa oligonukleotider vid 4 °C. För långvarig förvaring, frys och förvara dem vid -20 °C. Vid denna tidpunkt är alla oligonukleotider redo för DNA-spänningssondenheten.
OBS: Upprepade frys-tina cykler är inte problematiska för oligonukleotider.
2. Ytbehandling
OBS: Beredningen av DNA-hårnålsspänningssondsubstrat tar två dagar. DNA-hårnålsspänningssonden kommer att funktionaliseras på glasöverdrag.
- Dag 1
- Placera täckglasen på 25 mm på ett ställ av polytetrafluoretylen i en 50 ml bägare. Varje rack rymmer upp till 8 täckglas. Skölj täckglasen genom att sänka ner i vatten tre gånger.
- Tillsätt 40 ml av en 1:1-lösning (v:v) av etanol blandad med vatten till bägaren som innehåller stället och täckglasen och försegla bägaren med en paraffinfilm.
- Sonicate bägaren för 15 min i en ultraljud renare (arbetsfrekvens 35 KHz) för att rengöra täckglasen. Efter ultraljudsbehandling, kassera vätskan och skölj bägaren med racket och täckglasen i den med vatten minst 6 gånger för att avlägsna eventuellt kvarvarande organiskt lösningsmedel.
- Förbered färsk Piranha-lösning genom att blanda svavelsyra och väteperoxid i förhållandet 3: 1. För att göra 40 ml Piranha-lösning, tillsätt först 30 ml svavelsyra till en ren 50 ml bägare och tillsätt sedan långsamt 10 mlH2O2. Piranha-lösningen värms snabbt upp och bubblar vid tillsats avH2O2. Blanda försiktigt piranha med änden av en glaspipett.
- Överför sedan stället som håller täckglasen till bägaren som innehåller försiktigt blandad Piranha-lösning för etsning (figur 3A). Låt Piranha-lösningen hydroxylera och rengör täckglasen i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter Piranha etsning, överför stället med en pincett av stål eller polytetrafluoretylen till en ren 50 ml bägare med vatten och skölj igen med vatten minst 6 gånger.
VARNING: Stora mängder organiska ämnen kan reagera kraftigt med Piranha-lösningen och kan orsaka explosion. Var försiktig och arbeta alltid med Piranha-lösningen i ett dragskåp. Se till att bära en labcoat, handskar och skyddsglasögon. Förvara aldrig färsk Piranha-lösning i en förseglad behållare.
OBS: Förhållandet mellan väteperoxid och svavelsyra bör hållas under 1: 2 (v: v) och bör aldrig överstiga 1: 1. När du sänker ner racket med täckglas i Piranha-lösning, placera dem långsamt och försiktigt i lösningen. Kassera inte lösningen omedelbart efter etsning, eftersom den fortfarande är aktiv och varm. Lämna den i bägaren över natten innan du häller den i behållaren för surt avfall. - Sänk ner stället som håller täckglasen i en 50 ml bägare med 40 ml etanol för att avlägsna vatten. Kassera etanolen och upprepa 3 gånger för att säkerställa att vattnet har avlägsnats.
- Sänk sedan ned stället i 3 % aminopropyltrietoxisilan (APTES) (v/v) i 40 ml etanol för att reagera med -OH på täckglasen i 1 h vid rumstemperatur (figur 3B).
OBS: Etanol kan ersättas med aceton. - Skölj ytorna 6 gånger genom att sänka ner dem i 40 ml etanol och torka sedan i ugnen vid 80 °C i 20 minuter. Efter kylning förvaras de torkade aminmodifierade täckglasen vid -20 °C för framtida användning (upp till 6 månader).
- Täck undersidan av petriskålar av plast med en diameter på 10 cm med paraffinfilm. Paraffinfilmen förhindrar att täckglasen glider in i petriskålen och hjälper till att hålla lösningen för nästa steg av funktionalisering kvar på täckglasen. Lägg de nedkylda aminmodifierade täckglasen i petriskålarna. Den sida som ska funktionaliseras ska vara vänd uppåt.
- För att modifiera amingrupperna på täckglasen, tillsätt 300 μL 0,5% w/v liponsyra PEG NHS (LA-PEG-SC) och 2,5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) i 0,1 M NaHCO3 på varje täckglas och inkubera i 1 h vid rumstemperatur (figur 3C). För varje 25 mm täckglas, väg 1,5 mg LA-PEG-SC och 7,5 mg mPEG-SC. Lös upp NHS-reagenserna omedelbart innan de tillsätts på ytorna, eftersom de har en kort halveringstid (~ 10 min) i vattenlösning vid rumstemperatur. Skölj ytorna 3 gånger med vatten efter reaktionen.
OBS: NHS-reaktionen kan utföras vid 4 ° C över natten. NHS-reagens har längre halveringstid före hydrolys vid 4 °C, vilket är cirka 4-6 timmar. Detta kommer att resultera i en tre dagars ytförberedelseprocedur. - Tillsätt 100 μl 0,1 M NaHCO3 innehållande 1 mg/ml sulfo-NHS-acetat till en uppsättning "sandwich"-täckglas (två täckglas, vända mot varandra med reaktionsbuffert emellan). Låt passivering ske i minst 30 minuter. För att spara reagens kan detta steg göras med 50 μL 1 mg/ml sulfo-NHS-acetat. Skölj med vatten tre gånger efter passivering.
- Tillsätt 0,5 ml guldnanopartiklar (AuNP, 8,8 nm, garvsyra, 0,05 mg / ml) till varje täckglas och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (figur 3D). För att spara reagenset kan detta steg göras genom att smörja in två täckglas också. Se till att inga salter finns i systemet från tidigare steg för att undvika aggregering av guldnanopartiklar. Låt inte täckglasen torka efter detta steg.
- Under tiden prehybridiserar 4.7 pN hårnål, Cy3B-ligandsträng och BHQ2-ankarsträng som bildar DNA-spänningsproberna konstruerar i ett förhållande av 1.1: 1: 1 i 1 M NaCl vid 300 nM i ett PCR-rör. Glödgla trådarna genom att upphetta lösningen upp till 95 °C i 5 minuter och svalna sedan gradvis genom att sänka temperaturen till 20 °C under 30 minuter i en termisk cykler.
- Skölj täckglasen med vatten tre gånger efter 30 minuters inkubation med guldnanopartiklar. Tillsätt ytterligare BHQ2-ankarsträng (från 100 μM lager) till den glödgade DNA-lösningen för att göra förhållandet mellan BHQ2-ankarsträng och Cy3B-ligandsträng 10:1. Vid denna tidpunkt bör DNA-lösningen innehålla 300 nM spänningssondkonstruktion och 2,7 μM BHQ2-sträng. Tillsätt 100 μL per två täckglas för att göra "smörgåsen" (figur 3E).
- Lägg försiktigt en våt labvävnadsboll i petriskålen (bort från täckglas) och försegla skålen med paraffinfilm för att förhindra att lösningen torkar upp. Täck skålen med folie och inkubera vid 4 °C över natten.
- Dag 2
- Tvätta bort överflödiga sonder från täckglasen med 1x PBS. Kontrollera kvaliteten på DNA-spänningssondens yta under ett epifluorescerande mikroskop.
- Bered 40 μg/ml streptavidin i 1x PBS och inkubera på täckglas i 30 minuter vid rumstemperatur (figur 3F). Vanligtvis är 100 μL tillräckligt för ett 25 mm täckglas. Skölj med PBS 3 gånger efter inkubation för att tvätta bort överflödig mängd streptavidin.
- Bered 40 μg/ml biotinylerad antikropp/ligand i 1x PBS. Tillsätt 50–100 μl per smörgås och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (bild 3G). Skölj med PBS tre gånger efter inkubation för att tvätta bort den överflödiga mängden biotinylerad antikropp/ligand.
- Montera de rena bildkamrarna med ytor försiktigt. Ytor kan lätt knäckas vid åtdragning av kamrarna. Tillsätt 0,5-1 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till bildkamrarna och håll dem redo för avbildning med celler (figur 3H).
3. Avbildning av cellreceptorkrafter
- Förbered immunceller av intresse för HBSS vid 1-2 x 106 celler / ml.
OBS: OT-1 CD8 + naiva celler används som ett exempel i detta papper. Rena OT-1 CD8 + naiva T-celler a från mjälten hos offrade möss med MACS-musen CD8 + T-cellisoleringssats med en MACS-separator enligt tillverkarens instruktioner. Isolera och berika CD8 + T-cellerna genom att ta bort alla icke-CD8 + T-celler som magnetisk nedbrytande antikroppscocktail bunden till. Återsuspendera renade OT-1 CD8+ naiva T-celler i HBSS vid 2 x 106 celler/ml och håll isen före användning. - Kontrollera kvaliteten på DNA-hårnålsspänningssondytan under ett fluorescensmikroskop (100x objektiv) för kvalitetskontroll innan du lägger till ligander eller pläteringsceller. Avbilda och kvantifiera den genomsnittliga bakgrundsintensiteten i Cy3B-kanalen för en DNA-hårnålsspänningssondyta från minst 5 olika positioner och 3 replikat. Se till att bildtagningsförhållandena är konsekventa så att detta värde kan användas som en tillförlitlig markör för ytkvalitet och sonddensitet (figur 4C).
OBS: Kvantifiera antalet DNA-strängar per guldnanopartikel och antalet guldnanopartiklar per μm2 de första gångerna av ytbehandling enligt litteratur12, som kan användas som en annan pålitlig markör för ytkvalitet. - Platta ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 celler på varje DNA-spänningssond funktionaliserad täckslip och låt dem fästa och sprida i ~ 15 minuter vid rumstemperatur.
- När celler pläteras på DNA-hårnålsspänningsproberna och börjar spridas, avbilda fluorescenssignalerna som genereras i Cy3B-kanalen med 100x-målet (figur 3I).
- Efter att celler börjar producera spänningssignal i realtid på DNA-hårnålsspänningssondytan i Cy3B-kanalen, skaffa bilder i både Cy3B- och Atto647N-kanaler (TIRF-mikroskopi ger bättre signal-brusförhållande än epifluorescens). Tillsätt därefter Atto647N-sträng till bildkamrarna vid en slutlig koncentration av 200 nM för mekaniskt selektiv hybridisering.
- Efter 10 minuters inkubation, ta snabbt och försiktigt bort bufferten som innehåller den fluorescerande Atto647N-låssträngen och ersätt med färska Hanks balanserade salter. Bild i både Cy3B- och Atto647N-kanaler igen och bestäm Pearsons korrelationskoefficient med Fiji-programvara15.
- Vid tidpunkten för undersökningens intresse, inför icke-fluorescerande låssträng till cellerna i bildkammaren för att lagra spänningssignalen. Förbered låssträngen (100 μM) och tillsätt till cellerna i en slutlig koncentration på 1 μM. Pipettera försiktigt för att blanda. Låsningstiden kan variera men 10 minuter är den rekommenderade tiden.
- Hämta time-lapse-filmer eller slutpunktsbilder i epifluorescens för både kvalitativ spänningskartläggning och kvantitativ analys efter behov (figur 3J och figur 5).
OBS: Om spänningsmätning vid flera tidpunkter önskas, initiera radering av lagrade spänningssignaler genom tillägg av en upplåsningssträng. För att undvika överdriven sköljning används en högre slutlig koncentration av upplåsningssträngen vid 2 μM för att initiera en tåhållarmedierad strängförskjutningsreaktion med låssträngen i 3 minuter, vilket raderar de lagrade signalerna (figur 3J). Skölj försiktigt bort överskottet av oligonukleotider med HBSS. DNA-hårnålsspänningssondens yta och cellerna är redo för ytterligare en omgång spänningslagring och kartläggning. Upplåsning av spänningssignaler är inte nödvändigt om endast en tidpunkt är av intresse i studien.
4. Analys av data
OBS: Bildanalys utförs med hjälp av Fiji programvara, och den kvantitativa analysen utförs med hjälp av analysprogramvara.
- Korrigera eventuell drift under bildförvärv med kommandot Korrigera 3D-drift i Registrering under menyn Plugins .
- Ta bort kamerans bakgrund på bilden med kommandot Subtrahera under menyn Process .
- Bestäm Pearsons korrelationskoefficient med funktionen Samlokalisering under menyn Analysera .
- Medelvärde och subtrahera fluorescensbakgrunden som produceras av de oöppnade sonderna från tre olika lokala bakgrundsregioner. Rita ROI för celler på antingen bakgrundssubtraherade bilder eller RICM-bilder (reflektionsinterferenskontrastmikroskopi) med Image J Freehand Selections tool. Mät alla mått av intresse för ROI: erna, t.ex. integrerad fluorescensintensitet och spänningsbeläggning med hjälp av mätverktyget under menyn Analysera (figur 6).
- Exportera mätningarna för kvantitativ analys med analysprogram.
- Plotta data med valfri analysprogramvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi representativa bilder för ytkvalitetskontroll (figur 4). En yta av hög kvalitet bör ha en ren bakgrund i RICM-kanalen (figur 4B) och enhetlig fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samma bildutrustning och identiska fluorescensbildningsförhållanden bör bakgrundsfluorescensintensiteten vara konsekvent och reproducerbar varje gång vid experiment med DNA-sonder. Vi rekommenderar att du använder den som en markör för ytkvalitetskontrollen före varje uppsättning enskilda experiment.
I det här dokumentet visar vi några representativa data (figur 5) med OT-1 naiva CD8 + -celler som en modellcelltyp, som specifikt känner igen kycklingäggalbumin. CD3ε-antikroppen ingår som en positiv kontroll för systemet och det besläktade antigenet pMHC N4 (SIINFEKL) används som exempel. Celler pläterades på substrat som funktionaliserades med 4,7 pN DNA-hårnålssonder som presenterade antingen antiCD3ε eller pMHC N4. Efter 30 minuter fångades cellspridning i RICM och realtidsspänningen i Cy3B-kanalen och låssträngen infördes vid en slutlig koncentration av 1 μM. Tidsfördröjningen av spänningslåsning visade att både TCR-antiCD3ε och TCR-pMHC spänningssignaler förstärktes på grund av hårnålslåsning och signalackumulering. Dessutom visade TCR-pMHC N4-interaktionen svag kraftsignal i realtid (0 min), troligen på grund av dess korta bindningslivslängd. Låssträngen registrerade dessa kortlivade mekaniska draghändelser, vilket underlättar kvantitativ analys. Dessutom avslöjade låsning mönstret för TCR-pMHC-kraften när den ackumuleras, vilket var helt annorlunda än antiCD3ε-kontrollen och liknade "bull's-eye" -mönstret för immunsynapser. Kvantifieringen av fluorescenssignalen beskrivs i steg 4.4. Vi använder vanligtvis spänningsbeläggningen (definierad som procentandelen av området som har spänningssignal över kontaktytan) och integrerad fluorescensintensitet för varje cell som ett mått för att utvärdera ackumulerad spänning som är > 4,7 pN.
Figur 2: Exempel på oligonukleotidpreparat . a) HPLC-kromatogram för rening av Cy3B-ligandsträngar. b) Produktens MALDI-TOF-MS-spektra. (C) Tabell över den beräknade massan och påhittade m/z-toppar för utgångsmaterialet och den märkta oligonukleotiden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Funktionalisering av DNA-spänningssondsubstrat och experimentprocedurer. Steg beskrivs i motsvarande protokoll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på DNA-spänningssondyta med god kvalitet. (A) karakterisering av atomkraftsmikroskopi (AFM) av DNA-spänningssondytan; och råmikroskopibilder av en DNA-spänningssondyta i (B) RICM och (C) Cy3B-kanal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel på råmikroskopibilder av ett lyckat experiment. Bilder visar OT-1 naiva CD8 + celler som producerar TCR-krafter mot (A) antiCD3ε och (B) pMHC N4. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på databehandling och kvantitativ analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Exempel på lyckade och misslyckade ytor och spänningskartläggning . (A) Celler som inte sprider sig jämfört med celler som sprider sig på pMHC N4-ytorna i RICM. (B) OT-1-cell som spred sig men inte genererade någon spänningssignal på en antiCD3ε-yta med låg DNA-spänningssonddensitet. (C) Bild som visar att den framgångsrika ytan är blekrosa och den misslyckade ytan är färglös. (D) Bild i Cy3B-kanal som visar fluorescerande aggregat från ett gammalt DNA-lager. (E) Mönstret i RICM-kanalen och Cy3B-kanalen som sannolikt beror på antingen otillräcklig tvätt eller oavsiktlig yttorkning mellan stegen. (F) Bilder i RICM- och Cy3B-kanaler som visar effekten av att använda Au NP av olika storlekar. (G) RICM- och Cy3B-bilder av OT-1-celler som inte utövade spänningssignaler utan istället utarmat DNA. Skalstång = 5 μm. Observera att rådata som visas här samlades in av olika gruppmedlemmar med olika bildupptagningsinställningar från 3 mikroskop, vilket har olika fluorescensbakgrundsnivåer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de detaljerade procedurerna som tillhandahålls här kan man förbereda DNA-hårnålsspänningssondsubstrat för att kartlägga och kvantifiera receptorspänningen som produceras av immunceller. När celler pläteras på DNA-hårnålsspänningssondsubstratet landar, fäster och sprider de sig när receptorerna känner av liganderna både kemiskt och mekaniskt, varav den senare detekteras av våra sonder. I vissa fall kan celler dock misslyckas med att sprida sig (Figur 7A) eller misslyckas med att producera spänningssignal. Detta är ofta en följd av ytkemiska problem och kräver felsökning (Tabell 1). Låg liganddensitet är ett av de vanligaste problemen som resulterar i ett misslyckande med cellspridning. Detta kan vara ett resultat av flera faktorer, såsom nedbruten ligand, nedbrutna DNA-strängar, hydrolyserade reagens som APTES och / eller LA-PEG-NHS, aggregerade guldnanopartiklar eller otillräcklig rengöring av glasskydd. Genom att jämföra substratets bakgrundsfluorescensintensitet över framgångsrika experiment och misslyckade (Figur 7B) kan man snabbt bedöma källan till problemet. Till exempel indikerar ytor med stark fluorescenssignal från bakgrundsmätningarna att immobiliseringen av DNA-sonder var framgångsrik. Låg bakgrundsintensitet tyder på problem i beredningsstegen före tillsats av streptavidin och biotinylerad ligand. Om problemet orsakas av liganden kan dess kvalitet kontrolleras genom att belägga den på en glasskiva eller brunnar i en 96-brunnsplatta vid 10 μg / ml för att testa för celladhesion. Detta är ett användbart funktionellt test av ligandaktivitet för pMHC-ligander och anti-CD3-antikroppar. Genom att observera färgförändringen (blekrosa) hos de funktionaliserade täckglasen efter Au NP-inkubationssteget kan man bedöma om problemet orsakas av DNA-nedbrytning eller stegen före inkubation med DNA (Figur 7C). DNA-strängkvaliteten kan valideras med HPLC och MALDI-TOF-MS, där ett enda DNA-prov visar flera toppar om det bryts ned. Kvaliteten på Au NP kan bekräftas genom att jämföra UV-Vis-spektra och TEM-bilder med den karakterisering som tillhandahålls av tillverkaren. Om kvaliteten på liganden, DNA-strängarna och Au NP valideras och dessa reagens inte orsakar ytproblemet rekommenderar vi att du byter ut reagenser inklusive APTES, LA-PEG-NHS, svavelsyra och H2O2 för framtida ytbehandling istället för att spendera tid på att exakt lokalisera orsaken till ytkemiproblemet. Förutom problemet med låg densitet som kommer att orsaka ett stort fel i DNA-sondsubstratet, finns det några mindre problem som kan påverka datakvaliteten. Eftersom ytbehandlingen har flera inkubationssteg bör buffertar som används under ytbehandlingen göras färska, filtreras och förvaras vid 4 °C för lagring för att undvika kontaminering. Om en yta är förorenad kommer den att synas i RICM-kanalen och kan resultera i en konstig fluorescensbakgrund. Förutom kontaminering kan aggregat bildas i DNA-stamlösningen över tid, vilket kan resultera i ljusa prickar i Cy3B-kanalen (Figur 7D). Vanligtvis påverkar några aggregat inte datakvaliteten. Men om en cell landar på regioner med sådana defekter är dataanalys mindre tillförlitlig. Ibland kan oregelbundna mönster som påverkar spänningskartläggning observeras i både RICM- och Cy3B-kanalerna, vilket kan komma från otillräcklig tvätt efter APTES-steget eller oavsiktlig torkning av ytan under stegen efter att guldpartiklar har funktionaliserats på ytan (Figur 7E). Dessa mönster kan påverka spänningskartläggningen beroende på hur allvarlig den är. För att spara relativt värdefulla reagenser som antikroppar eller pMHC rekommenderar vi att du alltid kontrollerar ytkvaliteten (se 2.2.1 och 3.3) innan funktionalisering av DNA-hårnålsspänningsprober med antikropp/ligand. Även om detta ytbehandlingsprotokoll har varit robust och pålitligt i våra händer, notera att det inte alltid tolererar förändringar vid vissa steg särskilt bra. Till exempel, när bas- och plasmaetsning används istället för piranha-etsning, är det mycket troligt att sonddensiteten minskar och fler ytdefekter är närvarande. Förändringar av Au NP-storlek och kapslingsreagens kommer sannolikt att dramatiskt påverka ytfunktionaliseringsresultaten (Figur 7F). Till exempel har vi funnit att 5 och 10 nm Au NP inte binder till de liponsyramodifierade ytorna särskilt bra, vilket resulterar i minimalt DNA efter ytbehandlingen. 8,8 nm och 13 nm Au NP kan emellertid binda till liponsyraytorna vid en mycket hög densitet, vilket har observerats i RICM (grovhet) och Cy3B-kanal (fluorescensintensitet).
När DNA-hårnålsspänningssondytor av god kvalitet har förberetts kan man utföra experiment med intressanta celler och förvärva data med ett fluorescensmikroskop. Realtidsspänningen kan fångas med ett vanligt fluorescensmikroskop utrustat med ett högt NA-mål (numerisk bländare) och EMCCD. Observera dock att vi har observerat att primära T-celler ibland visar artefakter på DNA-spänningssondytorna på grund av den specifika musens förhållanden. Anekdotiskt är sådana artefakter mer benägna att hända med äldre möss. Till exempel har vi observerat negativ utarmning av fluorescenssignalerna istället för påslagen fluorescens (figur 7G). I det här fallet avslutar du experimentet och gör om med en ny grupp celler. Innan icke-fluorescerande låssträng används för kvantitativ analys av receptorkrafter måste lagring och radering av spänningssignaler bekräftas med en fluorescerande Atto647N-låssträng. Efter inledande låsning i 10 minuter bör Atto647N-signalen vara starkt samlokaliserad med Cy3B-signalen, eftersom den återspeglar spänningshistoriken under denna inkubation. Eftersom Cy3B-signalen inte bara reflekterar spänningshistoriken utan också realtidskrafter efter att låssträngen har tagits bort, är det möjligt att en liten delmängd av Cy3B-signalen inte åtföljs av Atto647N-signalen (figur 3J). För en mer kvantitativ analys av spänning rekommenderar vi att du använder en icke-fluorescerande låssträng som skulle eliminera den potentiella energiöverföringen mellan Cy3B och Atto647N, samt undvika överflödiga tvättar mellan bildförvärv. Observera att tillsatsen av låssträngen oundvikligen kommer att orsaka en liten fluorescensbakgrundsökning, eftersom termodynamiken kommer att driva en mindre hybridisering mellan hårnålen och låssträngen, som kan subtraheras före kvantifiering. Man kan kvantifiera den integrerade intensiteten hos varje cell efter låsningsproceduren för att studera kraften som genereras av en viss receptor. Dessutom återspeglar kinetiken för låsning sannolikt 2D k på och kav en receptor till dess ligand.
| Problem | Möjlig orsak | Lösning |
| Ytorna är inte rosa efter AuNP-inkubation | Otillräcklig etsning | Inkludera ett basetsningssteg efter piranha-etsning. Etsning täckglas i 0,5 M KOH i isbad i 1 h med ultraljudsbehandling. |
| APTES hydrolyseras | Använd nya APTES | |
| NHS-reagens hydrolyseras | Använd nya PEG-NHS-reagens | |
| PEG-NHS-reagens hydrolyseras innan de tillsätts till ytor | Arbeta snabbare | |
| Au NP har aggregerat | Använd nya Au NP | |
| Restvatten på täckglasen spädde Au NP | Se till att det inte finns några / lite vattenrester innan du lägger till Au NP | |
| Celler sprids inte på ytan | Låg DNA-sonddensitet | Om ytorna inte är lika rosa, felsök enligt beskrivningen ovan. Om Au NP-funktionaliseringen är normal, syntetisera och använd nytt DNA |
| Låg liganddensitet | Använd nya streptavidin- och ligandreagenser | |
| Celler sprids inte vidare på liganden | Kontrollera cellspridning på en ligandbelagd yta, om cellerna inte sprider sig stilla, inkludera vidhäftande molekyler som beskrivs i ref.12. | |
| Celler sprids bra men ingen spänningssignal eller endast mycket svag spänningssignal observeras även med antikroppskontroll | Receptor-ligandinteraktionen har ingen kraftöverföring | NA |
| Kraften är kortlivad eller kraftsignalerna är glesa | Använd låsoligonukleotid | |
| Ytan passiveras inte bra | Öka sulfo-NHS-acetatkonc., upp till 10 mg / ml | |
| Ingen låssignal observeras i Atto647N | Oligonukleotiden har försämrats | Kontrollera med MALDI-TOF-MS |
| Låssignalen är antilokaliserad med realtidssond | Receptorkraften är högre än arbetsområdet för låsning av nukleotid | Använd 19 pN realtidssond med hårnål från ref. 12 enligt beskrivningen. |
Tabell 1: Felsökning med det DNA-baserade spänningssondsystemet.
Tillämpningen av mekanisk informationslagring är särskilt användbar för att kartlägga receptorkrafter som genereras av immunceller, som ofta är övergående och mindre rikliga. Som bestäms genom enmolekylspektroskopimätningar observeras toppbindningslivslängden med applicering av ~ 10 pN kraft med en livslängd som sträcker sig från mindre än 100 millisekunder till flera sekunder lång. Sådana kortvariga bindningar är svåra att fånga med konventionell DNA-hårnålsspänningssondavbildning15. Ett annat användningsområde för detta mekaniska lagringssystem är när densiteten hos receptorn av intresse är relativt låg på cellytan16, vilket resulterar i en gles signal som ofta är svår att skilja från bakgrunden med konventionella DNA-hårnålsspänningsprober. Sådana lågdensitetsreceptorkrafter kan avslöjas genom ackumulerad spänningskartläggning med denna strategi. Observera att vi specifikt begränsar tillämpningen av denna strategi på immunceller, eftersom krafterna som finns i immunceller är kända för att vara i den lägre regimen (TCR < 19 pN) jämfört med integriner i fibroblaster eller blodplättar (upp till eller mer än 56 pN)12,13,15. Anledningen är att hybridiseringshastighetskonstanten khyb inte försämras när belastningen är mindre än 20 pN enligt optiska pincettmätningar, vilket ligger i intervallet 106 M-1 S-1. Dessutom förutspås k hyb under krafter < 20 pN vara något högre än vid khyb vid nollkraft, eftersom den svaga kraften hjälper till att rikta in strängen för den komplementära strängen att hybridisera med17. Å andra sidan förväntas större krafter hindra hybridiseringen, eftersom koff ökar och skapar en barriär för hybridisering att hända18. För ett lås som är 15-17 nukleotider långt uppskattar vi att en kraft runt 27,8 till 30,8 pN kommer att hindra hybridiseringen. Med tanke på dessa begränsningar föreslår vi att endast tillämpa denna metod i undersökningar av immuncellsreceptorkrafter. Dessutom kommer närvaron av låssträngen sannolikt att luta energilandskapet för hårnålsveckling, vilket kan minska den effektiva F1/2 något.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 och NSF CAREER 1350829. Vi tackar NIH Tetramer Facility för pMHC-ligander. Denna studie stöddes delvis av Emory Comprehensive Glycomics Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
- Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
- Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
- Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
- Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
- Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
- Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).
