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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62478
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1, 1,2,4,5,6
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 3MD program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Department of Pathology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Department of Urology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 6Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

Hier demonstrieren wir eine Methode, um flüssigen Scherstress auf Krebszellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen zu modellieren.

Abstract

Während der Metastasierung erhalten Krebszellen aus festem Gewebe, einschließlich Epithelien, Zugang zum lymphatischen und hämatogenen Kreislauf, wo sie aufgrund des hämodynamischen Flusses mechanischem Stress ausgesetzt sind. Eine dieser Belastungen, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) erfahren, ist der Flüssigkeitsscherstress (FSS). Während Krebszellen aufgrund des interstitiellen Flusses niedrige FSS-Spiegel im Tumor erfahren können, sind CTCs ohne extrazelluläre Matrixbindung viel höheren FSS-Spiegeln ausgesetzt. Physiologisch liegt FSS über 3-4 Größenordnungen, wobei niedrige Konzentrationen in Lymphgefäßen vorhanden sind (<1 Dyne / cm2) und die höchsten Werte kurz vorhanden sind, wenn Zellen durch das Herz und um Herzklappen gehen (>500 Dynen / cm2). Es gibt einige In-vitro-Modelle, die entwickelt wurden, um verschiedene Bereiche physiologischer Scherspannung über verschiedene Zeiträume zu modellieren. Dieser Artikel beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Folgen von kurzen (Millisekunden-) Pulsen von High-Level-FSS auf die Krebszellbiologie mit einem einfachen Spritzen- und Nadelsystem.

Introduction

Metastasierung oder die Ausbreitung von Krebs über die ursprüngliche Tumorstelle hinaus ist ein Hauptfaktor, der der Krebsmortalitätzugrunde 1. Während der Metastasierung nutzen Krebszellen das Kreislaufsystem als Autobahn, um sich an entfernte Stellen im ganzen Körper zu verbreiten2,3. Auf dem Weg zu diesen Stellen existieren zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in einer dynamischen flüssigen Mikroumgebung, die sich von der ihres ursprünglichen Primärtumors3,4,5 entiert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese flüssige Mikroumgebung eine von vielen Barrieren für Metastasierungen ist4. Es besteht weitgehende Übereinstimmung im Konzept der metastatischen Ineffizienz, d.h. dass die meisten CTCs, die in den Kreislauf gelangen, entweder zugrunde gehen oder keine produktiven metastatischen Kolonien bilden6,7,8. Warum Metastasen aus Sicht eines einzelnen CTC ineffizient sind, ist jedoch weniger sicher und bleibt ein aktives Untersuchungsgebiet. CTCs werden von der extrazellulären Matrix losgelöst, von löslichen Wachstums- und Überlebensfaktoren beraubt, die im Primärtumor vorhanden sein können, und dem Immunsystem und den hämodynamischen Kräften auf eine ganz andere Weise ausgesetzt als im Primärtumor4. Jeder dieser Faktoren kann zum schlechten Überleben von CTCs beitragen, aber ihre relativen Beiträge sind unklar. Dieser Beitrag befasst sich mit der Frage, wie hämodynamische Kräfte CTCs beeinflussen.

Die Untersuchung der Auswirkungen hämodynamischer Kräfte auf CTCs ist eine ziemliche Herausforderung. Derzeit gibt es keine entwickelten In-vitro-Systeme, die die gesamte raumzeitliche Dynamik (Herz zu Kapillaren) und rheologischen Eigenschaften des menschlichen Gefäßsystems replizieren können. Darüber hinaus ist nicht ganz klar, wie CTCs das Kreislaufsystem erleben. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass die meisten Krebszellen nicht kontinuierlich wie Blutzellen zirkulieren. Vielmehr werden die meisten CTCs aufgrund ihrer relativ großen Größe (10-20 μm Durchmesser) für variable Zeiträume (s bis Tage) in Kapillarbetten (6-8 μm Durchmesser) gefangen, wo sie sterben, extravasieren oder in das nächste Kapillarbett 8,9,10,11verschoben werden können . Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass die CTC-Größe in vivo heterogener sein kann und dass kleinere CTCs nachweisbar sind12. Daher können CTCs basierend auf Entfernung und Blutflussgeschwindigkeit nur für eine Frage von Sekunden zwischen diesen Einklemmungsperioden frei zirkulieren, obwohl eine quantitative Beschreibung dieses Verhaltens fehlt13.

Darüber hinaus können CTCs je nachdem, wo SIE in den Kreislauf gelangen, mehrere Kapillarbetten in der Lunge und anderen peripheren Stellen sowie durch das rechte und linke Herz passieren, bevor sie ihr endgültiges Ziel erreichen. Auf dem Weg sind CTCs verschiedenen hämodynamischen Belastungen ausgesetzt, einschließlich Flüssigkeitsscherspannung (FSS), Druckkräften während ihres Einklemmens in der Mikrozirkulation und möglicherweise Zugkräften unter Umständen, unter denen sie leukozytenartiges Rollen entlang der Blutgefäßwände aufweisen könnten14. Somit ist sowohl die Fähigkeit, die Zirkulation zu modellieren, als auch das Verständnis des zu modellierenden CTC-Verhaltens begrenzt. Aufgrund dieser Unsicherheit sollten alle Erkenntnisse aus In-vitro-Modellsystemen in einem experimentellen Wirbeltierorganismus und letztendlich bei Krebspatienten validiert werden.

Mit den oben genannten Vorbehalten zeigt dieses Papier ein relativ einfaches Modell, um FSS auf Zellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von FSS auf CTCs zu untersuchen, die erstmals 2012 beschriebenwurden 15. FSS resultiert aus der Reibung des Blutflusses gegen die Gefäßwand, die unter Bedingungen der laminaren Strömung in größeren Gefäßen einen parabolischen Geschwindigkeitsgradienten erzeugt. Zellen erfahren höhere FSS-Spiegel in der Nähe von Gefäßwänden und niedrigere Werte in der Nähe der Mitte des Blutgefäßes. Flüssigkeitsviskosität, Durchflussrate und Abmessungen der Leitung, durch die die Strömung erfolgt, beeinflussen FSS, wie in der Hagen-Poiseuille-Gleichung beschrieben. Dies gilt für Blutströme, die sich wie Newtonsche Flüssigkeiten verhalten, gilt jedoch nicht für die Mikrozirkulation. Physiologische FSS erstreckt sich über mehrere Größenordnungen mit den niedrigsten Werten in der Lymphe (<1 dyn/cm2) und den höchsten in Regionen um Herzklappen und atherosklerotische Plaques (>500 dyn/cm2)5. Die mittlere Wandscherspannung in den Arterien beträgt 10-70 dyn/cm2 und 1-6 dyn/cm2 in den Venen16,17.

Im Herzen können Zellen turbulenten Strömungen um Klappenblättchen ausgesetzt sein, wo sehr hohe, aber sehr kurze Dauer FSS auftreten kann18,19. Obwohl das Bioprozessfeld seit langem die Auswirkungen von FSS auf Säugetierzellen in Suspension untersucht, können diese Informationen für das Verständnis der Auswirkungen von FSS auf CTCs von begrenztem Wert sein, da sie sich im Allgemeinen auf viel niedrigere FSS-Spiegel konzentrieren, die über eine lange Dauer angewendet werden20. Wie unten beschrieben, kann man mit einer Spritze und einer Nadel relativ hohe (zehn bis tausend dyn/cm2)FSS für eine relativ kurze (Millisekunden) Dauer auf eine Zellsuspension auftragen. Seit der ersten Beschreibung dieses Modells15haben andere es verwendet, um die Auswirkungen von FSS auf Krebszellen21,22,23zu untersuchen. Mehrere "Impulse" von FSS können in kurzer Zeit auf Zellsuspensionen angewendet werden, um nachgelagerte experimentelle Analysen zu erleichtern. Zum Beispiel kann dieses Modell verwendet werden, um die Fähigkeit von Zellen zu messen, mechanischer Zerstörung durch FSS zu widerstehen, indem die Zelllebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Anzahl der angewendeten Impulse gemessen wird. Alternativ können die Auswirkungen der FSS-Exposition auf die Biologie von Krebszellen untersucht werden, indem Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen gesammelt werden. Wichtig ist, dass ein Teil der Zellsuspension als statische Kontrolle reserviert ist, um die Auswirkungen von FSS mit denen zu vergleichen, die mit Zellablösung und Zeit in Suspension verbunden sein könnten.

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Protocol

1. Zellvorbereitung

  1. Setzen Sie Zellen aus der Gewebekulturschale frei, wenn 70-90% konfluent sind, indem Sie die empfohlenen Richtlinien für die verwendete Zelllinie befolgen.
    1. Zum Beispiel das Wachstumsmedium für PC-3-Zellen absaugen und die 10 cm große Zellschale mit 5 ml kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
    2. Saugen Sie das PBS ab, bevor Sie 1 ml 0,25% Trypsin unter Verwendung des Herstellerprotokolls hinzufügen.
    3. Nachdem Sie die Ablösung der Zellen unter einem invertierten Mikroskop beobachtet haben, fügen Sie 5 ml DMEM: F12-Medium hinzu, das 10% fetales Rinderserum enthält, um das Trypsin zu hemmen.
  2. Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr.
  3. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl.
  4. Pelletzellen durch Zentrifugation (300 × g für 3 min), saugen den Überstand an und resuspendieren Zellen in serumfreiem Gewebekulturmedium auf 5 × 105 Zellen/ml.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Assay-Medium mindestens 1,17 mM Ca++ enthält, da extrazelluläres Ca++ für die zelluläre Resistenz gegen FSS15nachgewiesen wurde.

2. Belastungsbelastung durch Flüssigkeitsscherung

  1. Bevor Sie die Zellen FSS aussetzen, schneiden Sie ein rundes 14-ml-Polystyrolrohr an der 7-ml-Linie. Mischen Sie die Zellsuspension, legen Sie 5 ml der Suspension in das geschnittene Rohr und sammeln Sie statische Kontrollproben.
    HINWEIS: Das für die statische Probe erforderliche Volumen hängt vom verwendeten Lebensfähigkeitstest ab (siehe Schritt 3).
  2. Ziehen Sie die Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze und befestigen Sie eine 30 G 1/2"-Nadel. Entkappen Sie die Nadel, legen Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe, befestigen Sie die Spritze und stellen Sie die Durchflussrate ein, um das gewünschte FSS-Niveau zu erreichen.
    HINWEIS: Tabelle 1 zeigt die maximale Wandscherspannung für verschiedene Nadeln und Durchflussraten sowie den minimalen FSS-Gehalt in Abhängigkeit von der Zellgröße (10, 15 und 20 μm). Untersuchen Sie die Nadel vor dem Gebrauch, um sicherzustellen, dass sie nicht verbogen ist. Wenn Sie unsicher sind, ersetzen Sie die Nadel durch eine neue. Die Integrität der Nadel kann erhebliche Auswirkungen auf das Niveau des angewendeten FSS haben.
  3. Führen Sie die Spritzenpumpe aus und sammeln Sie die scherte Probe im geschnittenen Röhrchen in einem Winkel von etwa 45 °, um das Schäumen zu reduzieren. Sammeln Sie eine Probe, abhängig von der Art des Lebensfähigkeitstests oder den nachgelagerten Assay-Anforderungen.
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Spritze und die Nadel aus der Spritzenpumpe und entfernen Sie die Nadel mit einer Zange aus der Spritze, wobei Sie darauf achten, die Nadel nicht zu berühren.
      HINWEIS: Nicht abgeschränkte Nadeln können als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme austauschbar mit abgeschränkten Nadeln verwendet werden.
  4. Ziehen Sie die scherte Suspension zurück in die Spritze, befestigen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Zange und legen Sie sie wieder in die Spritzenpumpe.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4, bis die Zellsuspension der gewünschten Anzahl von FSS-Impulsen ausgesetzt wurde.
    HINWEIS: Um die Fähigkeit der Zellen zu beurteilen, der mechanischen Zerstörung durch FSS-Exposition zu widerstehen, wird die Zellsuspension typischerweise 10 FSS-Impulsen ausgesetzt. Es wurde jedoch gezeigt, dass Zellen nach 2 Impulsen24als Reaktion auf FSS biologische Anpassungen durchlaufen.

3. Messung der Lebensfähigkeit

HINWEIS: Die Lebensfähigkeit kann mit enzymatischen Assays (Luciferase, Resazurin und WST-1), der Zählung intakter Zellen, der Durchflusszytometrie oder durch klonogene Assays beurteilt werden.

  1. Für alle Messungen der Lebensfähigkeit, sammeln Sie eine Probe, bevor Sie Zellen FSS aussetzen.
    1. Für enzymatische Assays nehmen Sie doppelte 100 μL Aliquoten und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.
    2. Für die Durchflusszytometrie nehmen Sie ein 500 μL Aliquot und legen Es in ein 1,5 ml Röhrchen.
    3. Für den clonogenen Assay sammeln Sie ein Aliquot von 100 μL.
  2. Enzymatischer Assay
    1. Sammeln Sie 100 μL-Proben nach 1, 2, 4, 6, 8 und 10 Impulsen FSS-Exposition und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.
    2. Fügen Sie das gewünschte Substrat hinzu und befolgen Sie das Protokoll für den verwendeten Assay:
      1. Für Resazurin werden 20 μL einer 0,15 mg/ml Lösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 20 μL 0,15 mg/ml Resazurinlösung werden in Vertiefungen mit 100 μL Medium allein hinzugefügt. 2 h in einem 37 °C Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Messen Sie die Absorption mit einem Plattenleser, der Fluoreszenz ablesen kann (579 Anregung / 584 Emission).
      2. Für Luciferase-exprimierende Zellen 100 μL 15 mg/ml D-Luciferin zu 5 ml Medium hinzufügen. Fügen Sie 100 μL dieser Lösung zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält. Warten Sie 5 Minuten und lesen Sie dann die Platte mit einem Lesegerät, das mit Lumineszenz kompatibel ist.
      3. Für WST-1 fügen Sie 10 μL WST-1 zu jeder Vertiefung hinzu, einschließlich Vertiefungen, die nur Medium enthalten. 4 h inkubieren und dann die Absorption zwischen 420 und 480 nm mit einem Plattenleser ablesen.
    3. Vergleichen Sie das gemittelte Signal von jeder der FSS-exponierten Proben mit der gemittelten statischen Kontrollprobe, um den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu erhalten.
  3. Durchflusszytometrie24
    1. Sammeln Sie 500 μL-Proben und legen Sie sie nach 1, 2, 5 und 10 FSS-Impulsen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Zentrifugenproben (500 × g für 3 min) und entsorgen Sie die Überstände.
    3. Die Pellets mit 1 ml calcium- und magnesiumfreiem PBS resuspendieren und die Proben zentrifugieren (300 × g für 3 min).
    4. Suspendieren Sie die Pellets mit 500 μL fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumazid) mit Zählperlen und membrandurchlässigen oder Lebensfähigkeitsfarbstoffen wie Propidiiumiodid (1,75 μg/ml).
    5. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit, indem Sie das Verhältnis von lebensfähigen Zellen, normalisiert auf Zählperlen, in gescherten Proben mit dem der statischen Probe vergleichen.
  4. Clonogener Assay
    1. Nehmen Sie 100 μL der statischen Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine 1:10-Verdünnung herzustellen.
    2. Nehmen Sie 100 μL der 1:10 verdünnten Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine endgültige 1:100-Verdünnung zu erzielen.
    3. 100 μL der 1:100-Verdünnungsprobe werden in jede der 3 Vertiefungen einer 6-Well-Schale mit 2 ml Wachstumsmedium geben.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1-3.4.3 mit Proben, die 10 FSS-Impulsen ausgesetzt wurden.
    5. Lassen Sie die Zellen 7-10 Tage lang wachsen, ohne das Medium zu wechseln, und überprüfen Sie die Koloniebildung. Sobald sich Kolonien von ≥50 Zellen gebildet haben, saugen Sie das Wachstumsmedium an, spülen Sie jedes Gut mit 1 ml PBS, saugen Sie das PBS an und fixieren Sie es für 5 minuten mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol (EtOH). Wichtig ist, dass Sie sowohl gescherte als auch statische Proben gleichzeitig reparieren
    6. Nach dem Fixieren der Proben das EtOH absaugen und 1 bis 2 mL kristallviolette Lösung (0,1% kristallviolett in 90%H2O, 10% EtOH) für 5 min hinzufügen.
    7. Mit einem Überschuss an Wasser abspülen und den Teller trocknen lassen
    8. Zählen Sie die Kolonien (Cluster von ≥50 Zellen) sowohl für die statischen als auch für die gescherten Proben. Vergleichen Sie das Verhältnis der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der gescherten Probe mit der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der statischen Probe, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.

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Representative Results

Eine erhöhte Resistenz gegen FSS-induzierte mechanische Zerstörung hat sich zuvor als konservierter Phänotyp über mehrere Krebszelllinien und Krebszellen, die frisch aus Tumoren isoliert wurden, im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellkomparatorenerwiesen 15,24. Hier wurden zusätzliche Krebszelllinien aus einer Vielzahl von Gewebeursprüngen (Tabelle 2) getestet, um zu zeigen, dass die Mehrheit dieser Zellen nach 10 FSS-Pulsen bei 250 μL/s eine Lebensfähigkeit von 20% ≥ aufweisen. Die einzige Ausnahme sind MiaPaCa2-Zellen, die relativ empfindlich auf mechanische Zerstörung durch FSS reagierten (Lebensfähigkeit ≤ 10%). Um das FSS-Resistenzprofil einer Zelllinie adäquat zu beschreiben, werden n ≥ 3 biologische Replikate empfohlen.

Zum Vergleich: Alle untersuchten nicht transformierten Epithelzellen haben unter diesen Bedingungen eine Lebensfähigkeit < 10%15,24. Während also ein Bereich der FSS-Resistenz beobachtet wird, zeigt die Mehrheit der getesteten Krebszelllinien eine größere FSS-Resistenz als nicht transformierte Zellen. Krebszelllinien können sowohl aus primärem Tumorgewebe als auch aus Metastasen abgeleitet werden. Man könnte postulieren, dass Zellen, die aus Metastasen gewonnen werden, eine größere FSS-Resistenz aufweisen können, da dieser Phänotyp während der metastatischen Verbreitung ausgewählt wurde. Es wurde jedoch gezeigt, dass das FSS-Resistenzniveau nicht davon abhängt, ob Zellen von Primärtumoren oder Metastasen abgeleitet wurden15,24. Darüber hinaus korrelierten die FSS-Resistenzniveaus nicht mit dem metastasierten Potenzial in einer Reihe von menschlichen Prostatakrebszelllinien15.

Um dies weiter zu testen, wurden BALB/c-Brustepithelzellen mit variierendem metastasierendem Potential (4T1 = hochmetastasiert, 4T07 = schwaches bis mäßiges metastasierendes Potential, 67NR = kein bis niedriges metastasierendes Potential25,26)verwendet. Dieses Experiment zeigte, dass der FSS-Widerstand nicht mit dem metastasierten Potential korreliert (Abbildung 1). Darüber hinaus weisen sowohl 4T1- als auch 4T07-Zellen einen biphasischen Verlust der Zelllebensfähigkeit auf - einen größeren Verlust der Lebensfähigkeit in Pulsen 1-2 als in nachfolgenden Pulsen beobachtet. Dies ist typisch für die meisten Krebszelllinien, die von dieser Gruppe untersucht werden. Im Gegensatz dazu weist 67NR einen lineareren Verlust der Zelllebensfähigkeit als Funktion von FSS auf. Zusammen zeigen die Daten aus Tabelle 2 und Abbildung 1, dass der FSS-Widerstand eine Eigenschaft transformierter Zellen ist.

Figure 1
Abbildung 1: Flüssigkeitsscherstressresistenz syngener BALB/c-Brustepithelkrebszellen. Die Zellen wurden mit FSS (30 G Nadel, 10 pulses@250 ml/s) exponiert und die Lebensfähigkeit wurde mittels Resazurin-Umwandlung (n = 4/Zelllinie) gemessen. Während die FSS-Exposition die Anzahl der lebensfähigen Zellen reduzierte (p < 0,0001, 2-Wege-ANOVA) und jede Zelllinie unterschiedliche Widerstandsprofile aufwies (p = 0,0446, 2-Wege-ANOVA), gab es nach 10 Pulsen FSS-Exposition keinen signifikanten Unterschied zwischen den Zelllinien (p = 0,2833, 2-Wege-ANOVA). Abkürzungen: FSS = Fluidscherspannung; ANOVA = Varianzanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Scherung (τ): Wand (maximal) Minimum
Zelldurchmesser: Nicht/A 10 μm 15 μm 20 μm
Nadelmessgerät: 30 27 25 30 27 25 30 27 25 30 27 25
Durchfluss (μL/s) 20 507 220 116 32 10 4 48 16 7 64 21 9
50 1267 550 290 80 26 11 120 39 17 159 52 22
100 2534 1100 580 159 52 22 239 79 33 319 105 45
150 3801 1650 869 239 79 33 359 118 50 478 157 67
200 5068 2200 1159 319 105 45 478 157 67 637 210 89
250 6335 2750 1449 398 131 56 598 196 84 797 262 111

Tabelle 1: Maximale Scherspannung (τWand) Die Tabelle listet die maximalen Wand-FSS-Werte in Dyn/cm2 für 30 G-, 27 G- und 25 G-Nadeln bei den Durchflussraten von 20, 50, 100, 150, 200 und 250 μL/s auf. Die Scherspannungen wurden mit der Poiseuille-Gleichung ( Equation 1 ) berechnet, die für den Innendurchmesser jedes Nadelmessgeräts verfügbar ist, sowie die Annahme, dass μ = 0,01 dyn·s/cm2. Minimale FSS-Werte für jede Größe wurden Equation 2 berechnet, wobei r der Radius der Zelle und R der Radius der Nadel ist. Abkürzung: FSS = Fluidscherspannung; τ = Scherung; τWand = maximale Scherung; μ = Viskosität; Q = Volumenstrom.

Zelllinie Gewebequelle Spezies Mittlere Lebensfähigkeit (%) nach 10 Impulsen
TRAMPC1 Prostata Maus 40
4T01 Brust Maus 32
4T7 Brust Maus 43
67NR Brust Maus 46
66CL4 Brust Maus 28
RT4 Blase Mensch 62
W17-266-4 Melanom Mensch 46
HS852 Melanom Mensch 41
HS695 Melanom Mensch 41
A2058 Melanom Mensch 37
A375 Melanom Mensch 37
DREHZAHL-7951 Melanom Mensch 35
SKMEL2 Melanom Mensch 29
A101D Melanom Mensch 28
MiaPaCa Bauchspeicheldrüsen Mensch 7

Tabelle 2: Flüssigkeitsscherstressresistenz verschiedener Krebszelllinien. Jede Krebszelllinie wurde einer Flüssigkeitsscherspannung aus dem Spritzen- und Nadelmodell (30 G-Nadel, 10 pulses@250 ml / s) (n ≥ 3 / Zelllinie) ausgesetzt, und die Lebensfähigkeit wurde entweder durch Luciferase-Aktivität oder Resazurin-Umwandlung gemessen.

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Discussion

Dieses Papier demonstriert die Anwendung von FSS auf Krebszellen in Suspension mit einer Spritze und einer Nadel. Mit diesem Modell wurde gezeigt, dass Krebszellen resistenter gegen kurze Pulse von High-Level-FSS im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellensind 15,22,24. Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber FSS unter Verwendung dieses Modells zu einem schnellen Anstieg der Zellsteifigkeit, Aktivierung von RhoA und erhöhter kortikaler F-Aktin- und Myosin-II-basierter Kontraktilität24,27. Eine schnelle Mechano-Anpassung (die Fähigkeit von CTCs, je nach den Umständen mehr oder weniger steif zu werden) kann die mechanische Zerstörung von CTCs verhindern und andere Aspekte der metastasierten Besiedlung erleichtern24,28. Tatsächlich wurden die mit diesem In-vitro-Modell gewonnenen Ergebnisse mit experimentellen CTCs in Tiermodellen bestätigt24. Diese schnelle Mechano-Anpassung erklärt wahrscheinlich den in diesem Modell typischerweise beobachteten biphasischen Verlust der Zelllebensfähigkeit (Abbildung 1), d.h. FSS-naive Zellen sind anfälliger für Zerstörung als Zellen, die auch nur einem einzigen FSS-Puls ausgesetzt waren. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass FSS eine schnelle Zellversteifung in Krebszellen induziert, die sie vor nachfolgenden FSS-Impulsen schützt.

Obwohl die RhoA-Actomyosin-Achse ein wichtiger Treiber des FSS-Widerstands15,21,24ist, sind wahrscheinlich andere Mechanismen beteiligt29. Ein weiterer Beweis dafür, dass die Zellsteifigkeit eine Schlüsseldeterminante der FSS-Resistenz ist, ist, dass die Störung von Lamin A, das die strukturelle Integrität des Kerns - der steifsten Komponente der Zelle - steuert, die FSS-Resistenz in Krebszellen mit diesem Modell22reduziert. Mit diesem Modell untersuchen wir die Mechanismen der FSS-Resistenz in Krebszellen weiter. Hier wurde dieses Modell verwendet, um die Fähigkeit verschiedener Krebszelllinien zu messen, mechanischer Zerstörung zu widerstehen, indem Zellen kurzen Pulsen mit hohem FSS-Spiegel ausgesetzt werden. Obwohl dies ein relativ kostengünstiges, einfaches Modell ist, das im Labor entwickelt werden kann, wobei das teuerste Element die Spritzenpumpe ist, muss darauf geachtet werden, das Protokoll treu zu befolgen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Mehrere Impulse von FSS können in sehr kurzer Zeit auf Zellen angewendet werden, <10min. Die gesamte verstrichene Zeit für das Experiment hängt vom Suspensionsvolumen, der Durchflussrate, der Pulszahl und der Geschicklichkeit des Benutzers ab, der die Suspension zwischen den Impulsen überträgt. Mit Erfahrung kann eine 5 mL Suspension, die FSS mit einer 30 G Nadel für 10 pulses@250 μL/s ausgesetzt ist, in ~10 min verarbeitet werden. Bei den meisten Zelllinien gibt es einen minimalen Verlust an Lebensfähigkeit, da sie für diese Zeit in Suspension gehalten werden.

Da die Exposition gegenüber FSS relativ schnell auftritt, wird FSS typischerweise auf Zellsuspensionen in serumfreiem Medium aufgetragen, um das Aufschäumen der Proben zu reduzieren. Der Unterschied in der Viskosität zwischen 0-10% fetalem Rinderserum ist in diesem Assay vernachlässigbar. Es ist jedoch wichtig, physiologische Kalziumspiegel in dem Medium sicherzustellen, in dem die Zellen geschert werden. Darüber hinaus wurde in Bezug auf die Methoden zur Zelldissoziation vor der FSS-Exposition kein Unterschied in der FSS-Resistenz in PC-3-Zellsuspensionen nachgewiesen, die durch Trypsinisierung oder Behandlung mit nicht-enzymatischen Dissoziationsmitteln hergestelltwurden 15. Die Zellkonzentration kann je nach nach nachgeschalteten Anwendungsanforderungen größer oder kleiner als 5 ×10 5 Zellen/ml sein. Die Reaktion von PC-3-Prostatakrebszellen ist in einem Bereich von 5 × 104 bis 5 × 105,15ähnlich. Die Auswirkungen der Zellkonzentration auf die Lebensfähigkeit nach FSS-Exposition sollten jedoch empirisch bestimmt werden.

Für die meisten Anwendungen, die mit kultivierten Zellen ins Auge gefasst werden, sollte die Zelldichte die Viskosität und damit die Menge an FSS nicht signifikant beeinflussen. Variablen, wie z. B. die Zeit, für die die Zellen vor der FSS-Exposition in Suspension gehalten werden, sollten über experimentelle Replikate hinweg konstant gehalten werden. Wie oben erwähnt, ist auch die Integrität der Nadel von entscheidender Bedeutung. Im Laufe der Zeit wurden bei Nadeln Variationen in Bezug auf diesen Assay festgestellt. Hypodermische Nadeln wurden für den klinischen Einsatz entwickelt, nicht für die hier verwendeten Durchflussraten. In seltenen Fällen kann die Nabe der Nadel teilweise verschlossen werden, was bei nachfolgenden Impulsen den Durchgang der Suspension durch die Nadel und schließlich den Rückfluss um den Spritzenkolben verdeckt. Darüber hinaus ist es sehr wichtig zu verstehen, dass tote / sterbende Zellen außergewöhnlich empfindlich auf FSS reagieren, wie zuvorgezeigt 24. Wenn also eine bestimmte Zelllinie ein hohes Maß an sterbenden Zellen aufweist, entweder als Routinemerkmal oder als experimentelle Manipulationen (z. B. medikamentöse Behandlungen), führt dies zu einem sehr starken Verlust der Zelllebensfähigkeit, der im Vergleich zur statischen Kontrolle möglicherweise nicht vollständig normalisiert wird.

Die Anwendung von FSS kann mit anderen Assays wie Immunfluoreszenz, Pulldown-Assays und Western Blotting gepaart werden, um die Wirkung von FSS auf die Krebszellbiologie zu untersuchen 24. Prinzipiell könnte dieses Modell auch verwendet werden, um die Auswirkungen von FSS mit hoher Und kurzer Dauer auf andere Zelltypen einschließlich Blutzellen zu untersuchen. Normale rote Blutkörperchen und Leukozyten sind viel resistenter gegen FSS, das auf diese Weise angewendet wird, als sogar Krebszellen, was physiologisch15 naheliegt. Tatsächlich wird der FSS-Gehalt, der mit einer 30 G 1/2 "-Nadel bei einer Durchflussrate von 250 ml / s angewendet wird, den Bereich ein, der für die Störung der roten Zellmembran erforderlich ist (basierend auf der Millisekundenanwendung von Kraft)30,31. Eine Einschränkung dieses Modells oder einer Einschränkung, bei der Flüssigkeit durch eine Leitung geführt wird, besteht darin, dass das genaue Niveau von FSS, das Zellen im Bereich von der maximalen Wandscherspannung und dem Minimum in der Mitte der Leitung erfahren, nicht bekannt ist. Daher erfahren bei jedem Puls nicht alle Zellen das gleiche FSS-Niveau, und bei wiederholten Impulsen wird erwartet, dass einzelne Zellen bei jedem Puls innerhalb des angegebenen Bereichs unterschiedliche FSS-Werte erfahren.

Die hydrodynamische Fokussierung unter den in diesem Modell verwendeten Bedingungen führt jedoch dazu, dass zellen zum Zentrum der Strömung, weg von der Wand, und damit zu einer niedrigeren FSS-Exposition gerichtet werden32. Andere Modelle, wie Kegel- und Plattenviskosimeter oder Couette-Kammern, eignen sich besser für die Anwendung von FSS bei konstanten Konzentrationen auf eine Zellsuspension. Wie bereits erwähnt, bleibt es schwierig, die FSS-Exposition von CTCs in vitro zu modellieren. Dieses Modell ist am besten geeignet, um die Auswirkungen einer hohen, aber kurzen FSS-Exposition zu testen, wie sie beim Durchqueren des Herzens auftreten kann. Der Fluss durch Arterien und Venen führt zu einer längeren Exposition gegenüber niedrigeren FSS-Werten. Wie bereits erwähnt, ist jedoch unklar, wie lange CTCs im kontinuierlichen Fluss im Kreislauf verbleiben, und die meisten experimentellen Beweise bis heute stimmen mit kurzen Perioden (Sekunden) des freien Flusses überein, die durch längere Perioden der Einklemmung in der Mikrozirkulation unterbrochen werden.

Modelle, die Krebszellen in Suspension für längere Zeiträume (Minuten bis Tage) niedrigeren FSS-Konzentrationen (0,5-60 Dyn/cm2)aussetzen, umfassen Kegel- und Plattenviskosimeter, Couette-Kammern, kontinuierliche Durchflussschleifen, Spritzen mit einer Röhrchenverlängerung und mikrofluidische Geräte33,34,35,36,37. Diese wurden auch verwendet, um Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie FSS CTCs beeinflussen könnte, und haben zu der Feststellung geführt, dass die Exposition gegenüber FSS oxidativen Stress, Zellproliferation und -invasion sowie stammzellähnliche Eigenschaften in verschiedenen Krebszellenlinien erhöht. Es wird interessant sein, die ergebnisse dieser Modelle mit dem hier beschriebenen zu vergleichen. Zum Beispiel fanden Xin et al. unter Verwendung eines kontinuierlichen Flussschleifenmodells heraus, dass die ROCK-Actomyosin-Achse einen Verlust der Zelllebensfähigkeit in Krebszelllinien förderte, die FSS (20 dyn / cm2)für 2-12h ausgesetzt waren, im krassen Gegensatz zu den oben beschriebenen Daten38. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass der biologische Kontext für alle diese In-vitro-Modelle von Bedeutung ist, was die Notwendigkeit verstärkt, Erkenntnisse über CTCs in In-vivo-Modelle und letztendlich in Krebspatienten zu übersetzen.

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Disclosures

MDH ist Mitbegründer, Präsident und Aktionär von SynderBio, Inc. DLM ist Berater für SynderBio, Inc.

Acknowledgments

Die Entwicklung des hier gezeigten Modells wurde durch den DOD-Zuschuss W81XWH-12-1-0163, den NIH-Zuschüssen R21 CA179981 und R21 CA196202 sowie den Sato Metastasis Research Fund unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Gibco 25200-056
14 mL round bottom tubes Falcon - Corning 352059
30 G 1/2" Needle BD 305106
5 mL syringe BD 309646
96-well black bottom plate Costar - Corning 3915
Bioluminescence detector AMI AMI HTX
BSA, Fraction V Sigma 10735086001
Cell Titer Blue Promega G8081
crystal violet Sigma C0775
D-luciferin GoldBio D-LUCK
DMEM Gibco 11965-092
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Gibco 10010023
Plate Reader BioTek Synergy HT
Sodium Azide (NaN3) Sigma S2002
Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3005

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References

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Krebsforschung Ausgabe 170
Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel
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Moose, D. L., Williams-Perez, S.,… More

Moose, D. L., Williams-Perez, S., Cafun, R., Krog, B. L., Henry, M. D. Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle. J. Vis. Exp. (170), e62478, doi:10.3791/62478 (2021).

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