Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

דוגמנות ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור באמצעות מזרק ומחט

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62478
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1, 1,2,4,5,6
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 3MD program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Department of Pathology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Department of Urology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 6Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

כאן אנו מדגימים שיטה להחיל מתח גיסת נוזלים על תאים סרטניים בהשעיה כדי לדגמן את ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור.

Abstract

במהלך גרורות, תאים סרטניים מרקמות מוצקות, כולל אפיתליה, מקבלים גישה למחזור הלימפה וההמטוגני שם הם חשופים ללחץ מכני עקב זרימה המודינמית. אחד הלחצים הללו כי תאים סרטניים במחזור (CTCs) ניסיון הוא מתח גיסת נוזלים (FSS). בעוד תאים סרטניים עלולים לחוות רמות נמוכות של FSS בתוך הגידול עקב זרימה ביניים, CTCs נחשפים, ללא התקשרות מטריצה חוץ תאית, לרמות הרבה יותר גבוהות של FSS. מבחינה פיזיולוגית, FSS נע על פני 3-4 סדרי גודל, עם רמות נמוכות הקיימות בלימפטיקה (<1 דיין / ס"מ2) והרמות הגבוהות ביותר המוצגות בקצרה כאשר תאים עוברים דרך הלב וסביב שסתומי הלב (>500 dynes / cm2). ישנם כמה מודלים במבחנה שנועדו לדגמן טווחים שונים של לחץ גיזמה פיזיולוגית על פני מסגרות זמן שונות. מאמר זה מתאר מודל לחקור את ההשלכות של פולסים קצרים (אלפיות השנייה) של FSS ברמה גבוהה על ביולוגיה של תאים סרטניים באמצעות מזרק פשוט ומערכת מחט.

Introduction

גרורות, או התפשטות הסרטן מעבר לאתר הגידול הראשוני, הוא גורם מרכזי בבסיס התמותה מסרטן1. במהלך גרורות, תאים סרטניים לנצל את מערכת הדם ככביש כדי להפיץ לאתרים רחוקים בכל הגוף2,3. בעוד בדרך לאתרים אלה, תאים סרטניים במחזור (CTCs) קיימים בתוך microenvironment נוזל דינמי שלא כמו זה של הגידול העיקרי המקורי שלהם3,4,5. הוצע כי מיקרו-סביבה נוזלית זו היא אחד מחסומים רבים לגרורות4. יש הסכמה רחבה במושג של חוסר יעילות גרורתית, כלומר, שרוב CTCs הנכנסים למחזור או לגווע או לא ליצור מושבות גרורתיותפרודוקטיביות 6,7,8. עם זאת, מדוע גרורות אינו יעיל מנקודת המבט של CTC בודדים הוא פחות בטוח ונשאר תחום פעיל של חקירה. CTCs מנותקים מטריצה חוץ תאית, משוללים גורמי גדילה הישרדות מסיסים שעשויים להיות נוכחים בגידול העיקרי, ונחשפו למערכת החיסון ולכוחות המודינמיים באופן שונה בהרבה מאשר בגידול הראשי4. כל אחד מהגורמים הללו עשוי לתרום להישרדותם הלקויה של CTCs, אך תרומתם היחסית אינה ברורה. מאמר זה עוסק בשאלה כיצד כוחות המונמיים משפיעים על CTCs.

לימוד ההשפעות של כוחות המודינמיים על CTCs הוא די מאתגר. נכון לעכשיו, אין מערכות במבחנה מהונדסות שיכולות לשכפל את כל הדינמיקה spatiotemporal (לב נימים) ואת המאפיינים הרולוגיים של מערכת כלי הדם האנושית. יתר על כן, האופן שבו CTCs לחוות את מערכת הדם אינו ברור לחלוטין. ראיות ניסיוניות מצביעות על כך שרוב התאים הסרטניים אינם מסתובבים ברציפות כמו תאי דם. במקום זאת, בשל גודלם הגדול יחסית (קוטר 10-20 מיקרומטר), רוב CTCs להיות לכודים במיטות נימיות (6-8 מיקרומטר קוטר) עבור אורכים משתנים של זמן (s עד ימים) שבו הם עלולים למות, extravasate, או להיות עקורים למיטה נימי הבא8,9,10,11. עם זאת, יש כמה ראיות כי גודל CTC עשוי להיות הטרוגניים יותר ויו, וכי CTCs קטנים יותר ניתנים לזיהוי12. לכן, בהתבסס על מרחק ומהירות זרימת הדם, CTCs עשויים להסתובב בחופשיות רק למשך שניות בין תקופות אלה של מלכוד, אם כי תיאור כמותי של התנהגות זו חסר13.

יתר על כן, בהתאם למקום שבו CTCs להיכנס למחזור הדם, הם עשויים לעבור דרך מיטות נימים מרובים בריאה ואתרים היקפיים אחרים ודרך הלב הימני והשמאלי לפני שהגיע ליעד הסופי שלהם. לאורך הדרך, CTCs חשופים ללחצים המודינמיים שונים כולל לחץ גיסת נוזלים (FSS), כוחות דחיסה במהלך ההשתלטות שלהם במיקרו-סירקולציה, ופוטנציאל, כוחות המתיחה בנסיבות שבהן הם עשויים להפגין לויקוציטים דמויי גלגול לאורך קירות כלי הדם14. לכן, הן את היכולת לדגמן את זרימת הדם ואת ההבנה של התנהגות CTC להיות מודל מוגבל. בגלל אי הוודאות הזו, כל ממצא ממערכות מודל במבחנה צריך להיות מאומת באורגניזם בעל חוליות ניסיוני ובסופו של דבר, בחולי סרטן.

עם האזהרות הנ"ל, מאמר זה מדגים מודל פשוט יחסית להחיל FSS על תאים בהשעיה כדי לחקור את ההשפעות של FSS על CTCs שתואר לראשונה בשנת 201215. FSS נובע חיכוך של זרימת הדם על קיר כלי הדם, אשר מייצר שיפוע מהירות פרבולית בתנאים של זרימת למינאר בכלי גדול יותר. תאים חווים רמות גבוהות יותר של FSS ליד קירות כלי דם ורמות נמוכות יותר ליד מרכז כלי הדם. צמיגות נוזלים, קצב זרימה וממדים של הצינור שדרכו מתרחשת הזרימה משפיעים על FSS, כפי שתואר על ידי משוואת האגן-פויזאויל. זה חל על זרמי דם מתנהג כמו נוזלים ניוטוניים, אבל לא מחזיק עבור microcirculation. FSS פיזיולוגי נע על פני מספר סדרי גודל עם הרמות הנמוכות ביותר בלימפטיקה (<1דיין/ ס"מ 2 ) ואת הגבוה ביותר באזורים סביב שסתומי לב ולוחות טרשת עורקים (>500 דיין / ס"מ2)5. לחץ גיסת קיר ממוצע בעורקים הוא 10-70 צביעה / ס"מ2 ו 1-6 גוסן / ס"מ2 בוורידים16,17.

בלב, תאים עשויים להיות חשופים לזרימות סוערות סביב עלוני שסתום שבהם ברמה גבוהה מאוד, אבל FSS לטווח קצר מאוד עשוי להיות מנוסה18,19. למרות שתחום עיבוד ביולוגי חקר זה מכבר את ההשפעות של FSS על תאי יונקים בהשעיה, מידע זה עשוי להיות בעל ערך מוגבל להבנת ההשפעות של FSS על CTCs כפי שהוא מתמקד בדרך כלל ברמות נמוכות בהרבה של FSS מיושם על משך זמן ארוך20. כפי שתואר להלן, באמצעות מזרק ומחט, ניתן להחיל גבוה יחסית(עשרותעד אלפי דיסים / ס"מ 2 ) FSS למשך קצר יחסית (אלפיות שניה) להשעיית תא. מאז התיאור הראשוני של מודלזה 15, אחרים השתמשו בו כדי לחקור את ההשפעות של FSS על תאים סרטניים21,22,23. "פולסים" מרובים של FSS ניתן להחיל על השעיות תאים בפרק זמן קצר כדי להקל על ניתוחים ניסיוניים במורד הזרם. לדוגמה, מודל זה יכול לשמש כדי למדוד את היכולת של תאים להתנגד הרס מכני על ידי FSS על ידי מדידת הכדאיות התא כפונקציה של מספר הפולסים מוחל. לחלופין, ניתן לחקור את ההשפעות של חשיפה ל- FSS על הביולוגיה של תאים סרטניים על ידי איסוף תאים למגוון ניתוחים במורד הזרם. חשוב לציין, חלק מההשעיה של התא שמור כפקד סטטי כדי להשוות את ההשפעות של FSS מאלה שעשויות להיות משויכות לניתוק תאים וזמן המוחזק בהשעיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. לשחרר תאים מצלחת תרבית רקמות כאשר 70-90% מפגש על ידי ביצוע ההנחיות המומלצות עבור קו התא בשימוש.
    1. לדוגמה, לשאוף את מדיום הצמיחה עבור תאי PC-3, ולשטוף את צלחת 10 ס"מ של תאים עם 5 מ"ל של סידן ומגנזיום ללא מגנזיום תמיסת מלח ללא פוספט (PBS).
    2. שאף את ה- PBS לפני הוספת 1 מ"ל של טריפסין של 0.25% באמצעות פרוטוקול היצרן.
    3. לאחר התבוננות בניתוק התאים תחת מיקרוסקופ הפוך, הוסף 5 מ"ל של DMEM:F12 בינוני המכיל סרום בקר עוברי 10% כדי לעכב את טריפסין.
  2. מניחים את התלוי של התא לתוך צינור חרוטי.
  3. קבע את ריכוז התא ואת מספר התא הכולל.
  4. תאי גלולה לפי צנטריפוגה (300 × גרם למשך 3 דקות), שואפים את supernatant, ותאים resuspend בתרבית רקמות ללא סרום בינוני עד 5 × 105 תאים / מ"ל.
    הערה: זה קריטי כי מדיום לבדיקה מכיל לפחות 1.17 mM Ca++ כמו Ca++ חוץ תאי הוכח להיות נדרש עבור התנגדות סלולרית FSS15.

2. חשיפה ללחץ גזל

  1. לפני חשיפת תאים ל- FSS, לחתוך צינור פוליסטירן 14 מ"ל עגול בקו 7 מ"ל. מערבבים את ההשעיה של התא, מניחים 5 מ"ל של המתלה לתוך הצינור החתוך, ולאסוף דגימות שליטה סטטית.
    הערה: אמצעי האחסון הדרוש לאיסוף עבור המדגם הסטטי תלוי במבחן הכדאיות המשמש (ראה שלב 3).
  2. צייר את השעיית התא למזרק 5 מ"ל, ולחבר מחט 30 G 1/2 ". לפרוק את המחט, למקם את המזרק על משאבת מזרק, לאבטח את המזרק, ולהגדיר את קצב הזרימה כדי להשיג את הרמה הרצויה של FSS.
    הערה: טבלה 1 מציגה את הלחץ המרבי של הטיית הקיר עבור מחטים וקצבי זרימה שונים, כמו גם את הרמה המינימלית של FSS בהתאם לגודל התא (10, 15 ו -20 מיקרומטר). בדוק את המחט לפני השימוש כדי להבטיח כי הוא לא כפוף; אם לא בטוח, להחליף את המחט עם אחד חדש. שלמות המחט יכולה להיות השפעה משמעותית על רמת FSS מיושם.
  3. הפעל את משאבת המזרק, ולאסוף את המדגם גיה בצינור לחתוך בזווית של 45 ° כ כדי להפחית קצף. לאסוף מדגם בהתאם לסוג של קיימא assay או במורד הזרם assay הצרכים.
    1. הסר בזהירות את המזרק והמחט ממשאבת המזרק, והשתמש בצבת כדי להסיר את המחט מהמזרק, תוך הקפדה לא לגעת במחט.
      הערה: ניתן להשתמש במחטים שאינן משופעות לסירוגין עם מחטים משופעות כאמצעי בטיחות נוסף.
  4. משכו את ההשעיה הנמרצת בחזרה למזרק, חיברו מחדש בזהירות את המחט באמצעות צבת, והחזירו אותה למשאבת המזרק.
  5. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 עד להשעיית התא נחשף למספר הפולסים הרצוי של FSS.
    הערה: כדי להעריך את היכולת של תאים להתנגד הרס מכני מחשיפה FSS ההשעיה התא בדרך כלל נתון 10 פולסים של FSS. עם זאת, הוכח כי תאים מתחילים לעבור התאמות ביולוגיות בתגובה FSS לאחר 2 פולסים24.

3. מדידת כדאיות

הערה: הכדאיות ניתן להעריך באמצעות בדיקות אנזימטיות (לוציפראז, resazurin, ו WST-1), ספירת תאים שלמים, ציטומטריית זרימה, או על ידי בדיקות קלונוגניות.

  1. עבור כל מדדי הכדאיות, לאסוף מדגם לפני חשיפת תאים FSS.
    1. לבדיקות אנזימטיות, יש לקחת 100 עליקוטים כפולים של μL ולהכניס אותם לצלחת של 96 בארות.
    2. עבור ציטומטריית זרימה, לקחת aliquot אחד 500 μL ולהניח אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    3. לבדיקה קלוגוגנית, לאסוף aliquot 100 μL.
  2. אסיימטי
    1. לאסוף 100 דגימות μL לאחר 1, 2, 4, 6, 8, ו 10 פולסים של חשיפה FSS למקם אותם בצלחת 96-well.
    2. הוסף את המצע הרצוי, ופעל לפי הפרוטוקול עבור ההסתה שבה נעשה שימוש:
      1. עבור resazurin, להוסיף 20 μL של פתרון 0.15 מ"ג / מ"ל לכל באר. הוסף 20 μL של 0.15 מ"ג / מ"ל resazurin פתרון לבארות המכילות 100 μL של בינוני לבד. דגירה במשך 2 שעות באינקובטור תרבית רקמות 37 °C.C. מדוד את הספיגה באמצעות קורא לוחות המסוגל לקרוא פלואורסצנטיות (579 עירור / 584 פליטה).
      2. עבור תאים מבטאים לוציפראז, להוסיף 100 μL של 15 מ"ג / מ"ל D-לוציפרין ל 5 מ"ל של בינוני. הוסף 100 μL של פתרון זה לכל תאים המכילים היטב. המתן 5 דקות ולאחר מכן קרא את הצלחת באמצעות קורא התואם לאור.
      3. עבור WST-1, הוסף 10 μL של WST-1 לכל באר, כולל בארות המכילות בינוני בלבד. דגירה במשך 4 שעות, ולאחר מכן לקרוא את הספיגה בין 420 ל 480 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
    3. השווה את האות הממוצע מכל אחת מהדגימות שנחשפו ל- FSS לדגימת הבקרה הסטטית הממוצעת כדי להשיג את אחוז התאים הנים.
  3. ציטומטרייתזרימה 24
    1. לאסוף 500 דגימות μL ולהניח אותם לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל לאחר 1, 2, 5, ו 10 פולסים של FSS.
    2. דגימות צנטריפוגות (500 × גרם למשך 3 דקות), ומשליכים את דגימות העל.
    3. יש להזרים את הכדורים עם 1 מ"ל של PBS נטול סידן ומגנזיום, ולצבוע את הדגימות (300 × גרם למשך 3 דקות).
    4. השהה את הכדורים עם 500 μL של חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (PBS עם אלבומין סרום בקר 0.5% ו 0.1% נתרן אזיד) עם ספירת חרוזים וצבעים בלתי חדירים או קיימא כגון פרופיליום יודיד (1.75 מיקרוגרם / מ"ל).
    5. לקבוע את הכדאיות על ידי השוואת היחס של תאים קיימא, מנורמל לספור חרוזים, בדגימות גיזום לזה של המדגם הסטטי.
  4. צ'ק קלונוגני
    1. קח 100 μL של המדגם הסטטי, ולהוסיף 900 μL של בינוני צמיחה כדי להפוך דילול 1:10.
    2. קח 100 μL של המדגם מדולל 1:10, ולהוסיף 900 μL של בינוני צמיחה כדי להפוך את דילול הסופי 1:100.
    3. הוסף 100 μL של מדגם דילול 1:100 לתוך כל אחת מ 3 בארות של צלחת 6-well המכיל 2 מ"ל של מדיום צמיחה.
    4. חזור על שלבים 3.4.1-3.4.3 עם דגימות שהיו כפופות ל -10 פולסים של FSS.
    5. תן לתאים לגדול במשך 7-10 ימים מבלי לשנות את המדיום, ולבדוק היווצרות המושבה. לאחר מושבות של ≥50 תאים נוצרו, לשאוף את מדיום הצמיחה, לשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של PBS, לשאוף PBS, ולתקן במשך 5 דקות באמצעות 1 מ"ל של קר כקרח 70% אתנול (EtOH). חשוב לציין, לתקן הן דגימות גיהה וסטטי באותו זמן
    6. לאחר תיקון הדגימות, לשאוף EtOH, ולהוסיף 1 עד 2 מ"ל של פתרון סגול קריסטל (0.1% סגול קריסטל ב 90% H2O, 10% EtOH) במשך 5 דקות.
    7. לשטוף עם עודף מים, ולתת את הצלחת יבשה
    8. ספירת המושבות (אשכולות של ≥50 תאים) עבור הדגימות הסטטיות והן עבור הדגימות הגוזבות. השווה את היחס בין המספר הממוצע של מושבות מהדגימה הנמרצת למספר הממוצע של מושבות מהדגימה הסטטית כדי לקבוע את הכדאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עמידות מוגברת להרס מכני שנגרם על ידי FSS הוכח בעבר פנוטיפ שמור על פני קווי תאים סרטניים מרובים ותאים סרטניים מבודדים טריים מגידולים ביחס משווים תאי אפיתל שלא השתנו15,24. כאן, שורות תאים סרטניים נוספים ממגוון מקורות רקמות (טבלה 2) נבדקו כדי להוכיח כי רוב התאים האלה מציגים כדאיות ≥ 20% לאחר 10 פולסים של FSS ב 250 μL/s. היוצא מן הכלל היחיד הוא תאי MiaPaCa2, שהיו רגישים יחסית להרס מכני של FSS (הכדאיות ≤ 10%). כדי לתאר כראוי את פרופיל ההתנגדות FSS של קו תא, n ≥ 3 שכפולים ביולוגיים מומלצים.

לשם השוואה, כל תאי האפיתל שלא השתנו שנבדקו הם בעלי כדאיות < 10% בתנאים אלה15,24. לכן, בעוד שיש טווח בהתנגדות FSS נצפתה, רוב קווי התא הסרטני שנבדקו מציגים עמידות FSS גדולה יותר מאשר תאים שאינם שעברו טרנספורמציה. קווי תאים סרטניים יכולים להיגזר הן מרקמות הגידול העיקריות והן גרורות. אפשר להסיק כי תאים נגזר גרורות עשויים להפגין התנגדות FSS גדולה יותר כמו פנוטיפ זה אולי נבחר במהלך הפצה גרורתית. עם זאת, רמת ההתנגדות FSS הוכח לא תלוי אם תאים נגזרו גידולים ראשוניים או גרורות15,24. יתר על כן, רמות ההתנגדות FSS לא לתאם עם פוטנציאל גרורתי בסדרה של תאים סרטן הערמונית האנושית15.

כדי לבדוק זאת עוד יותר, תאי אפיתל mammary BALB/c עם פוטנציאל גרורתי משתנה (4T1 = גרורתי מאוד, 4T07 = פוטנציאל גרורתי חלש עד בינוני, 67NR = לא עד פוטנציאל גרורתי נמוך25,26) שימשו. ניסוי זה גילה כי התנגדות FSS אינה מתואמת עם פוטנציאל גרורתי (איור 1). יתר על כן, הן תאי 4T1 והן 4T07 מציגים אובדן biphasic של הכדאיות התא - אובדן גדול יותר של הכדאיות בפולסים 1-2 ממה שנצפה בפולסים הבאים. זה אופייני לרוב קווי התאים הסרטניים שנחקרו על ידי קבוצה זו. לעומת זאת, 67NR מציג אובדן ליניארי יותר של כדאיות התא כפונקציה של FSS. באופן קולקטיבי, הנתונים מטבלה 2 ואיור 1 ממחישים שהתנגדות FSS היא מאפיין של תאים שעברו טרנספורמציה.

Figure 1
איור 1: עמידות ללחץ גזירה נוזלית של תאי סרטן אפיתל מסוג BALB/c סינגניים. תאים נחשפו FSS (מחט 30 G, 10 pulses@250 mL/s), ואת הכדאיות נמדדה באמצעות המרת resazurin (n = 4 / קו תא). בעוד שחשיפה ל- FSS הפחיתה את מספר התאים בני קיימא (p < 0.0001, ANOVA דו-כיווני), וכל קו תא הציג פרופילי התנגדות שונים (p = 0.0446, ANOVA דו-כיווני), לא היה הבדל משמעותי בין קווי התא לאחר 10 פעימות של חשיפה ל- FSS (p = 0.2833, ANOVA דו כיווני). קיצורים: FSS = מתח גיסת נוזל; ANOVA = ניתוח של שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

גיהר (τ): קיר (מקסימום) מינימום
קוטר תא: N/A 10 מיקרומטר 15 מיקרומטר 20 מיקרומטר
מד מחט: 30 27 25 30 27 25 30 27 25 30 27 25
קצב זרימה (μL/s) 20 507 220 116 32 10 4 48 16 7 64 21 9
50 1267 550 290 80 26 11 120 39 17 159 52 22
100 2534 1100 580 159 52 22 239 79 33 319 105 45
150 3801 1650 869 239 79 33 359 118 50 478 157 67
200 5068 2200 1159 319 105 45 478 157 67 637 210 89
250 6335 2750 1449 398 131 56 598 196 84 797 262 111

טבלה 1: רמות מקסימום לחץ גיסת (קיר τ). הטבלה מפרטת את רמות ה- FSS המרביות בקיר ב dyn/cm2 עבור 30 G, 27 G ו- 25 G מחטים בקצבי הזרימה של 20, 50, 100, 150, 200 ו- 250 מיקרול/s. רמות הלחץ של הגיה חושבו באמצעות משוואת Poiseuille , Equation 1 מידע זמין לקוטר הפנימי של כל מד מחט, כמו גם את ההנחה כי μ = 0.01 dyn·s / cm2. רמות FSS מינימליות עבור כל גודל חושבו באמצעות Equation 2 הרדיוס של התא, ו- R הוא הרדיוס של המחט. קיצור: FSS = מתח גיסת נוזלים; τ = גיסת; τקיר = גיסת מקסימום; μ = צמיגות; Q = קצב זרימה נפחי.

שורת תא מקור רקמות מינים כדאיות ממוצעת (%) לאחר 10 פעימות
TRAMPC1 ערמונית עכבר 40
4T01 חזה עכבר 32
4T7 חזה עכבר 43
67NR חזה עכבר 46
66CL4 חזה עכבר 28
RT4 שלפוחית השתן אנוש 62
W17-266-4 מלנומה אנוש 46
HS852 מלנומה אנוש 41
HS695 מלנומה אנוש 41
A2058 מלנומה אנוש 37
A375 מלנומה אנוש 37
RPMI-7951 מלנומה אנוש 35
סמל 2 מלנומה אנוש 29
A101D מלנומה אנוש 28
מיאפקה הלבלב אנוש 7

טבלה 2: עמידות ללחץ גזירה נוזלית של קווי תאים סרטניים שונים. כל קו תאים סרטניים נחשף ללחץ גזוז נוזלים ממודל המזרק והמחט (30 G מחט, 10 pulses@250 mL/s) (n ≥ קו 3/תא), והערך נמדד על ידי פעילות לוציפראז או המרת resazurin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מדגים את היישום של FSS לתאים סרטניים בהשעיה באמצעות מזרק ומחט. באמצעות מודל זה, תאים סרטניים הוכחו עמידים יותר לפולסים קצרים של FSS ברמה גבוהה ביחס לתאי אפיתל שאינם שעברו טרנספורמציה15,22,24. יתר על כן, חשיפה FSS באמצעות מודל זה גורמת לעלייה מהירה נוקשות התא, הפעלה של RhoA, ו- F-actin קליפת המוח מוגברת וכווץ מבוסס מיוסין II24,27. הסתגלות מהירה של מכניקה (היכולת של CTCs להיות פחות או יותר נוקשה בהתאם לנסיבות) עשויה למנוע הרס מכני של CTCs ולאפשר היבטים אחרים של קולוניזציה גרורתית24,28. ואכן, ממצאים שנעשו באמצעות מודל זה במבחנה אושרו באמצעות CTCs ניסיוני במודלים בעלי חיים24. הסתגלות מהירה זו של המהנו מסבירה ככל הנראה את האובדן הדו-פאזי של הכדאיות התאית שבדרך כלל נצפתה במודל זה (איור 1),כלומר, תאים נאיביים של FSS רגישים יותר להרס מאשר תאים שנחשפו אפילו לפעימה אחת של FSS. יחד, זה מצביע על כך FSS תותך התקשות תאים מהירה בתאים סרטניים המגן עליהם מפני פולסים הבאים של FSS.

למרות ציר RhoA-actomyosin הוא מניע חשוב של התנגדות FSS15,21,24, סביר להניח שיש מנגנונים אחרים המעורבים29. עדות נוספת לכך שנוקשות התא היא גורם מכריע של התנגדות FSS היא כי הפרעה של למין A, השולט בשלמות המבנית של הגרעין - הרכיב הנוקשה ביותר של התא, מפחית את ההתנגדות FSS בתאים סרטניים באמצעות מודלזה 22. אנו משתמשים במודל זה כדי לחקור את המנגנונים של התנגדות FSS בתאים סרטניים עוד יותר. כאן, מודל זה שימש למדידת היכולת של קווי תאים סרטניים שונים להתנגד להרס מכני על ידי חשיפת תאים לפולסים קצרים של רמות גבוהות של FSS. למרות שמדובר במודל זול יחסית ופשוט לפתח במעבדה, כאשר האלמנט היקר ביותר הוא משאבת המזרק, יש להקפיד לעקוב אחר הפרוטוקול בנאמנות כדי להשיג תוצאות לשחזור. פולסים מרובים של FSS ניתן להחיל על תאים בזמן קצר מאוד, <10 דקות. הזמן הכולל שחלף לניסוי תלוי בנפח המתלים, קצב הזרימה, מספר הדופק והמיומנות של המשתמש המעביר את ההשעיה בין פולסים. עם ניסיון, השעיה 5 מ"ל חשוף FSS עם מחט 30 G עבור 10 pulses@250 μL / s ניתן לעבד ~ 10 דקות. עבור רוב קווי התא, יש אובדן מינימלי של הכדאיות עקב מוחזק בהשעיה למשך זמן זה.

מכיוון שהחשיפה ל- FSS מתרחשת במהירות יחסית, FSS מוחל בדרך כלל על השעיות תאים במדיום ללא סרום כדי להפחית קצף של הדגימות. ההבדל בצמיגות בין סרום בקר עוברי 0-10% הוא זניח בבחינה זו. עם זאת, זה קריטי כדי להבטיח רמות פיזיולוגיות של סידן במדיום שבו התאים גיזום. יתר על כן, לגבי השיטות לניתוק תאים לפני חשיפה ל- FSS, לא זוהה הבדל בהתנגדות FSS בהשעיות תאי PC-3 שהוכנו על ידי טריפסיניזציה או טיפול עם סוכני דיסוציאציה לא אנזימטיים15. ריכוז התא יכול להיות גדול או פחות מ 5 × 105 תאים / מ"ל בהתאם לצרכי יישום במורד הזרם. התגובה של תאי סרטן הערמונית PC-3 דומה בטווח שבין 5 × 104 עד 5 × 105,15. עם זאת, ההשפעות של ריכוז התא על הכדאיות לאחר חשיפה FSS צריך להיקבע אמפירית.

עבור רוב היישומים החזוי עם תאים בתרבית, צפיפות התא לא צריכה להשפיע באופן משמעותי על צמיגות ולכן, כמות FSS מוחל. משתנים, כגון הזמן שבו התאים מוחזקים בהשעיה לפני חשיפה ל- FSS, צריכים להיות מוחזקים קבועים על פני שכפולים ניסיוניים. כפי שהוזכר לעיל, שלמות המחט היא גם קריטית. וריאציות הרבה נרשמו במחטים ביחס לבחינה זו לאורך זמן. מחטים תת עוריות תוכננו לשימוש קליני, לא לשיעורי הזרימה המועסקים כאן. במקרים נדירים, הרכזת של המחט ניתן לאסם חלקית, אשר במהלך פולסים הבאים, חוסם את המעבר של השעיה דרך המחט ובסופו של דבר, זרימה אחורית סביב בוכנה מזרק. יתר על כן, חשוב מאוד להבין כי תאים מתים / גוססים רגישים במיוחד FSS, כפי שמוצג קודם לכן24. לכן, אם לקו תאים מסוים יש רמה גבוהה של תאים גוססים, או כמניפולציות אופייניות שגרתיות או ניסיוניות (למשל, טיפולים תרופתיים), זה יגרום לאובדן תלול מאוד של הכדאיות התאית שאולי לא מנורמלת לחלוטין בהשוואה לשליטה הסטטית.

היישום של FSS יכול להיות מזווג עם התקפות אחרות, כגון אימונופלואורסצנטיות, הבדיקות הנמשכות, וחולחול מערבי, כדי לחקור את ההשפעה של FSS על ביולוגיה של תאים סרטניים 24. באופן עקרוני, מודל זה עשוי לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של FSS ברמה גבוהה, משך קצר על סוגי תאים אחרים כולל תאי דם. תאי דם אדומים רגילים לויקוציטים עמידים הרבה יותר ל- FSS המיושם בדרך זו מאשר אפילו תאים סרטניים, אשר עומד לחשובפיזיולוגית 15. למעשה, רמת FSS מוחל, באמצעות מחט 30 G 1/2 " בקצב זרימה של 250 מ"ל / s, סוגריים את הטווח הנדרש עבור ההפרעה של קרום התא האדום (מבוסס על יישום אלפית השנייה של כוח)30,31. מגבלה אחת של מודל זה, או כל זה שכרוך בהעברת נוזל דרך צינור, היא כי הרמה המדויקת של FSS כי תאים חווים בתוך הטווח מן הלחץ גיסת הקיר המרבי המינימום במרכז הצינור אינו ידוע. לכן, בכל פעימה, כל התאים אינם חווים את אותה רמה של FSS, ועל פולסים חוזרים ונשנים, תאים בודדים צפויים לחוות רמות שונות של FSS בכל פעימה בטווח שצוין.

עם זאת, התמקדות הידרודינמית בתנאים המועסקים במודל זה גורמת לתאים להיות מופנים למרכז הזרימה, הרחק מהקיר, ובכך לכיוון חשיפה נמוכה יותר של FSS32. דגמים אחרים, כגון קונוס וצמיגי צלחת או תאי Couette, מתאימים יותר ליישום FSS ברמות קבועות להשעיית תא. כאמור, זה נשאר מאתגר מודל FSS חשיפה של CTCs במבחנה. מודל זה מתאים ביותר כדי לבדוק את ההשפעות של חשיפה גבוהה, אך קצרה, FSS כפי שעלול לקרות חוצה את הלב. זרימה דרך עורקים ורידים גורמת לחשיפה ארוכה יותר לרמות נמוכות יותר של FSS. עם זאת, כאמור, כמה זמן CTCs להישאר בזרימה רציפה במחזור אינו ברור, ורוב הראיות הניסיוניות עד כה עולה בקנה אחד עם תקופות קצרות (שניות) של זרימה חופשית מנוקד על ידי תקופות ארוכות יותר של מלכוד במיקרו-סירקולציה.

מודלים החושפים תאים סרטניים בהשעיה לרמות נמוכות יותר של FSS (0.5-60 דיסום / ס"מ2) למשך זמן ארוך יותר (דקות עד ימים) כוללים קונוס וצמיגי צלחת, תאי Couette, לולאות זרימה רציפה, מזרק עם הרחבת צינור, והתקנים מיקרופלואידיים33,34,35,36,37. אלה שימשו גם כדי לקבל תובנות כיצד FSS עשוי להשפיע על CTCs והובילו לגלות כי חשיפה FSS מגביר מתח חמצוני, התפשטות תאים וחדירה, ומאפיינים דמויי תאי גזע בקווי תאים סרטניים שונים. יהיה מעניין להשוות בין תוצאות הנגזרות מאותם מודלים עם זו המתוארת כאן. לדוגמה, באמצעות מודל לולאת זרימה רציפה, Xin et al. מצא כי ציר ROCK-actomyosin קידם אובדן הכדאיות התא בקווי תאים סרטניים שנחשפו FSS (20 דיין / ס"מ2) עבור 2-12 שעות בניגוד מוחלט לנתונים המתוארים לעיל38. לכן, הקשר ביולוגי עשוי מאוד להיות חשוב עבור כל אלה מודלים במבחנה, חיזוק הצורך לתרגם ממצאים על CTCs לתוך מודלים vivo ובסופו של דבר, חולי סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MDH הוא מייסד שותף, נשיא ובעל מניות של SynderBio, Inc. DLM הוא יועץ עבור SynderBio, Inc.

Acknowledgments

פיתוח המודל שהודגם כאן נתמך על ידי מענק DOD W81XWH-12-1-0163, NIH מעניק R21 CA179981 ו- R21 CA196202, וקרן המחקר של סאטו גרורות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Gibco 25200-056
14 mL round bottom tubes Falcon - Corning 352059
30 G 1/2" Needle BD 305106
5 mL syringe BD 309646
96-well black bottom plate Costar - Corning 3915
Bioluminescence detector AMI AMI HTX
BSA, Fraction V Sigma 10735086001
Cell Titer Blue Promega G8081
crystal violet Sigma C0775
D-luciferin GoldBio D-LUCK
DMEM Gibco 11965-092
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Gibco 10010023
Plate Reader BioTek Synergy HT
Sodium Azide (NaN3) Sigma S2002
Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
  4. Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
  5. Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
  6. Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
  7. Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
  8. Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
  9. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  10. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
  11. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  12. Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
  13. Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
  16. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  17. Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
  18. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
  19. Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).
  20. Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
  21. Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
  22. Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
  23. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
  24. Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
  25. Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
  26. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
  27. Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
  28. Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
  29. O'Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
  30. Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
  31. Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
  32. Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
  33. Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
  34. Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
  35. Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
  36. Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
  37. Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
  38. Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 170
דוגמנות ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור באמצעות מזרק ומחט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moose, D. L., Williams-Perez, S.,… More

Moose, D. L., Williams-Perez, S., Cafun, R., Krog, B. L., Henry, M. D. Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle. J. Vis. Exp. (170), e62478, doi:10.3791/62478 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter