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Cancer Research

एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी पर Hemodynamic तनाव के प्रभाव मॉडलिंग

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62478
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1, 1,2,4,5,6
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 3MD program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Department of Pathology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Department of Urology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 6Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

यहां हम ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी पर हीमोडायनामिक तनाव के प्रभाव को मॉडल करने के लिए निलंबन में कैंसर कोशिकाओं को तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

मेटास्टेसिस के दौरान, एपिथेलिया सहित ठोस ऊतकों से कैंसर कोशिकाएं, लिम्फेटिक और हेमेटोजेनस परिसंचरण तक पहुंच प्राप्त करती हैं जहां वे हीमोडायनामिक प्रवाह के कारण यांत्रिक तनाव के संपर्क में आते हैं। इन तनावों में से एक है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) अनुभव तरल पदार्थ कतरनी तनाव (FSS) है । जबकि कैंसर कोशिकाओं को इंटरस्टिशियल प्रवाह के कारण ट्यूमर के भीतर एफएसएस के निम्न स्तर का अनुभव हो सकता है, सीटीसी को एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स अटैचमेंट के बिना, एफएसएस के बहुत अधिक स्तर तक उजागर किया जाता है। शारीरिक रूप से, FSS परिमाण के 3-4 आदेश से अधिक पर्वतमाला, कम स्तर के साथ लिम्फाटिक्स में मौजूद (<1 dyne/सेमी2)और उच्चतम स्तर संक्षेप में मौजूद के रूप में कोशिकाओं को दिल के माध्यम से और दिल वाल्व के आसपास से गुजरती है (>५०० dynes/सेमी2)। विभिन्न समय सीमाओं पर शारीरिक कतरनी तनाव की विभिन्न श्रेणियों के मॉडल के लिए डिज़ाइन किए गए कुछ इन विट्रो मॉडल हैं। यह पेपर एक सरल सिरिंज और सुई प्रणाली का उपयोग करके कैंसर सेल जीव विज्ञान पर उच्च स्तरीय एफएसएस की संक्षिप्त (मिलीसेकंड) दालों के परिणामों की जांच करने के लिए एक मॉडल का वर्णन करता है।

Introduction

मेटास्टेसिस, या प्रारंभिक ट्यूमर साइट से परे कैंसर का प्रसार, कैंसर मृत्यु दर1अंतर्निहित एक प्रमुख कारक है। मेटास्टेसिस के दौरान, कैंसर कोशिकाएं पूरे शरीर में दूर के स्थलों तक प्रसारित करने के लिए एक राजमार्ग के रूप में संचार प्रणाली का उपयोग करती हैं2,3. इन साइटों के रास्ते में, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) उनके मूल प्राथमिकट्यूमर3,4,5के विपरीत एक गतिशील द्रव माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर मौजूद हैं। यह प्रस्ताव किया गया है कि यह तरल माइक्रोएनवायरमेंट मेटास्टेसिस4के कई अवरोधों में से एक है । मेटास्टैटिक अक्षमता की अवधारणा में व्यापक सहमति है, यानी कि अधिकांश सीटीसी परिसंचरण में प्रवेश करते हैं या तो नष्ट हो जाते हैं या उत्पादक मेटास्टैटिक उपनिवेश नहीं बनाते हैं6,7,8। हालांकि, क्यों मेटास्टेसिस एक व्यक्ति सीटीसी के नजरिए से अक्षम है कम निश्चित है और जांच का एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है । सीटीसी को बाहृशियल मैट्रिक्स से अलग किया जाता है, जो घुलनशील विकास और जीवित रहने के कारकों से वंचित होते हैं जो प्राथमिक ट्यूमर में मौजूद हो सकते हैं, और प्राथमिक ट्यूमर4की तुलना में प्रतिरक्षा प्रणाली और हेमोडायनामिक बलों के संपर्क में हैं। इन कारकों में से प्रत्येक CTCs के गरीब अस्तित्व के लिए योगदान कर सकते हैं, लेकिन उनके सापेक्ष योगदान अस्पष्ट हैं । यह पत्र इस प्रश्न का समाधान करता है कि हीमोडायनामिक बल सीटीसी को कैसे प्रभावित करते हैं ।

सीटीसी पर हीमोडायनामिक बलों के प्रभावों का अध्ययन करना काफी चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान में, विट्रो सिस्टम में कोई इंजीनियर नहीं है जो पूरे स्थानिक तंत्र गतिशीलता (केशिकाओं के लिए दिल) और मानव संवहनी प्रणाली के रियोलॉजिकल गुणों को दोहरा सकता है। इसके अलावा, सीटीसी संचार प्रणाली का अनुभव कैसे करते हैं, यह पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है। प्रायोगिक साक्ष्य इंगित करता है कि अधिकांश कैंसर कोशिकाएं रक्त कोशिकाओं की तरह लगातार प्रसारित नहीं होती हैं। बल्कि, उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार (व्यास में 10-20 माइक्रोन) के कारण, अधिकांश सीटीसी समय की चर लंबाई (एस टू डेज) के लिए केशिका बिस्तरों (व्यास में 6-8 माइक्रोन) में फंस जाते हैं, जहां वे मर सकते हैं, अतिरिक्त हो सकते हैं, या अगलेकेशिका बिस्तर8, 9,10,11में विस्थापित हो सकते हैं। हालांकि, कुछ सबूत हैं कि सीटीसी का आकार वीवो में अधिक विषम हो सकता है, और छोटे सीटीसी12का पता लगाने योग्य हैं। इसलिए, दूरी और रक्त प्रवाह वेग के आधार पर, सीटीसी केवल फंसाने की इन अवधियों के बीच सेकंड के एक मामले के लिए स्वतंत्र रूप से प्रसारित कर सकते हैं, हालांकि इस व्यवहार का मात्रात्मक विवरण13की कमी है ।

इसके अलावा, जहां CTCs परिसंचरण में प्रवेश के आधार पर, वे फेफड़ों और अंय परिधीय साइटों में कई केशिका बिस्तरों के माध्यम से और दोनों सही और बाएं दिल के माध्यम से अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने से पहले पारित कर सकते हैं । रास्ते में, सीटीसी को तरल कतरनी तनाव (एफएसएस), माइक्रोसर्कुलेशन में फंसाने के दौरान संपीड़न बलों सहित विभिन्न हेमोडायनामिक तनावों से अवगत कराया जाता है, और संभावित रूप से, उन परिस्थितियों में कर्षण बल जहां वे रक्त वाहिका दीवारों के साथ ल्यूकोसाइट जैसे रोलिंग का प्रदर्शन कर सकते हैं14। इस प्रकार, दोनों परिसंचरण मॉडल और सीटीसी व्यवहार की समझ को मॉडल करने के लिए सीमित है । इस अनिश्चितता के कारण, इन विट्रो मॉडल सिस्टम से किसी भी निष्कर्ष को एक प्रयोगात्मक कशेरुकी जीव में और अंततः कैंसर रोगियों में मान्य किया जाना चाहिए ।

उपरोक्त चेतावनी के साथ, यह पेपर 201215में वर्णित सीटीसी पर एफएसएस के प्रभावों की जांच करने के लिए निलंबन में कोशिकाओं पर एफएसएस लागू करने के लिए अपेक्षाकृत सरल मॉडल प्रदर्शित करता है। एफएसएस के परिणामस्वरूप पोत की दीवार के खिलाफ रक्त प्रवाह के घर्षण से होता है, जो बड़े जहाजों में लैमिनार प्रवाह की स्थितियों के तहत पैराबोलिक वेग ढाल पैदा करता है। कोशिकाओं को पोत की दीवारों के पास एफएसएस के उच्च स्तर और रक्त वाहिका के केंद्र के पास निचले स्तर का अनुभव होता है। द्रव चिपचिपाहट, प्रवाह दर, और नाली के आयाम जिसके माध्यम से प्रवाह होता है FSS को प्रभावित करता है, जैसा कि हेगन-Poiseuille समीकरण द्वारा वर्णित है। यह न्यूटोनियन तरल पदार्थ के रूप में व्यवहार करने वाले रक्त प्रवाह पर लागू होता है, लेकिन माइक्रोसर्कुलेशन के लिए पकड़ नहीं करता है। शारीरिक एफएसएस परिमाण के कई आदेशों से अधिक होता है जिसमें लिम्फाटिक्स (<1 डाइन/सेमी2)में निम्नतम स्तर होते हैं और हृदय वाल्व और एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े (>500 डायन/सेमी2) 5के आसपास के क्षेत्रों में उच्चतमहोताहै । धमनियों में मतलब दीवार कतरनी तनाव 10-70 dyn/cm2 और 1-6 dyn/सेमी2 नसों में16,17है ।

दिल में, कोशिकाओं को वाल्व पत्रक के आसपास अशांत प्रवाह के संपर्क में किया जा सकता है जहां बहुत उच्च स्तर, लेकिन बहुत कम अवधि के FSS18, 19अनुभव किया जा सकता है । हालांकि बायोप्रोसेसिंग फील्ड ने लंबे समय से निलंबन में स्तनधारी कोशिकाओं पर एफएसएस के प्रभावों का अध्ययन किया है, यह जानकारी सीटीसी पर एफएसएस के प्रभावों को समझने के लिए सीमित मूल्य की हो सकती है क्योंकि यह आम तौर पर लंबी अवधि20पर लागू एफएसएस के बहुत निचले स्तरों पर केंद्रित है। जैसा कि नीचे वर्णित है, एक सिरिंज और सुई का उपयोग करके, कोई भी कोशिका निलंबन के लिए अपेक्षाकृत कम (मिलीसेकंड) अवधि के लिए अपेक्षाकृत उच्च (दसियों से हजारों dyn/cm2)एफएसएस लागू कर सकता है। चूंकि इस मॉडल15के आरंभिक विवरण के बाद से अन्य लोगों ने कैंसर कोशिकाओं पर एफएसएस के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इसे21,22 , 23के रूपमेंनियोजितकिया है . एफएसएस की कई "दालें" डाउनस्ट्रीम प्रायोगिक विश्लेषणों को सुविधाजनक बनाने के लिए थोड़े समय में सेल निलंबन पर लागू की जा सकती हैं। उदाहरण के लिए, इस मॉडल का उपयोग लागू दालों की संख्या के एक समारोह के रूप में कोशिका व्यवहार्यता को मापने के द्वारा FSS द्वारा यांत्रिक विनाश का विरोध करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को मापने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कैंसर कोशिकाओं के जीव विज्ञान पर FSS जोखिम के प्रभाव को विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करके खोजा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, सेल निलंबन का हिस्सा एक स्थिर नियंत्रण के रूप में आरक्षित है उन है कि सेल टुकड़ी और निलंबन में आयोजित समय के साथ जुड़ा हो सकता है से FSS के प्रभाव की तुलना ।

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Protocol

1. सेल की तैयारी

  1. ऊतक संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को रिहा जब 70-90% उपयोग में सेल लाइन के लिए अनुशंसित दिशा निर्देशों का पालन करके ढुलमुल ।
    1. उदाहरण के लिए, पीसी-3 कोशिकाओं के लिए विकास माध्यम को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं के 10 सेमी डिश को कैल्शियम के 5 एमएल और मैग्नीशियम-मुक्त फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोएं।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके 0.25% ट्राइपसिन के 1 एमसीएल जोड़ने से पहले पीबीएस को एस्पिरेट करें।
    3. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की टुकड़ी का अवलोकन करने के बाद, डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें: ट्राइप्सिन को बाधित करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त F12 माध्यम।
  2. सेल सस्पेंशन को शंकु नली में रखें।
  3. सेल एकाग्रता और कुल सेल संख्या निर्धारित करें।
  4. अपकेंद्रित्र द्वारा पैलेट कोशिकाएं (3 मिनट के लिए 300 × ग्राम), सुपरनैंट को एस्पिरेट करें, और सीरम-मुक्त ऊतक संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल तक पुनर्निर् फिर से रखना।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि परख माध्यम में कम से कम 1.17 mM Ca++ शामिल है क्योंकि एक्सपेरिमेंटल सीए++ को एफएसएस15के सेलुलर प्रतिरोध के लिए आवश्यक होने का प्रदर्शन किया गया है।

2. तरल पदार्थ कतरनी तनाव जोखिम

  1. एफएसएस के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से पहले, 7 एमएल लाइन पर एक गोल-नीचे 14 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब काटें। सेल निलंबन मिलाएं, निलंबन के 5 एमएल को कट ट्यूब में रखें, और स्थिर नियंत्रण नमूने एकत्र करें।
    नोट: स्थिर नमूने के लिए इकट्ठा करने के लिए आवश्यक मात्रा उपयोग की गई व्यवहार्यता परख पर निर्भर करती है (चरण 3 देखें)।
  2. सेल निलंबन को 5 एमएल सिरिंज में खींचें, और 30 जी 1/2 "सुई संलग्न करें। सुई को अनकैप करें, सिरिंज को सिरिंज पंप पर रखें, सिरिंज को सुरक्षित करें, और एफएसएस के वांछित स्तर को प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें।
    नोट: तालिका 1 विभिन्न सुइयों और प्रवाह दरों के लिए अधिकतम दीवार कतरनी तनाव दिखाता है, साथ ही सेल आकार (10, 15, और 20 माइक्रोन) के आधार पर एफएसएस का न्यूनतम स्तर भी दिखाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले सुई का निरीक्षण करें कि यह तुला नहीं है; यदि अनिश्चित है, तो सुई को एक नए से बदलें। सुई अखंडता लागू FSS के स्तर पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।
  3. सिरिंज पंप चलाएं, और फोमिंग को कम करने के लिए लगभग 45 डिग्री कोण पर कट ट्यूब में कतरनी नमूना एकत्र करें। व्यवहार्यता परख या डाउनस्ट्रीम परख की जरूरतों के प्रकार के आधार पर एक नमूना एकत्र करें।
    1. सिरिंज पंप से सिरिंज और सुई को सावधानी से हटा दें, और सिरिंज से सुई को हटाने के लिए चिमटा का उपयोग करें, सुई को छूने का ध्यान न रखें।
      नोट: एक अतिरिक्त सुरक्षा उपाय के रूप में गैर-बेवेल्ड सुइयों का उपयोग एक अतिरिक्त सुई के साथ किया जा सकता है।
  4. कतरनी निलंबन को सिरिंज में वापस खींचें, ध्यान से चिमटा का उपयोग करके सुई को फिर से संलग्न करें, और इसे सिरिंज पंप में वापस रखें।
  5. जब तक सेल निलंबन एफएसएस की दालों की वांछित संख्या के संपर्क में नहीं आ जाता तब तक चरण 2.3 और 2.4 दोहराएं।
    नोट: FSS एक्सपोजर से यांत्रिक विनाश का विरोध करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए सेल निलंबन आमतौर पर एफएसएस की 10 दालों के अधीन होता है। हालांकि, यह प्रदर्शित किया गया है कि कोशिकाओं को 2 दालों24के बाद FSS के जवाब में जैविक रूपांतरों से गुजरना शुरू करते हैं ।

3. व्यवहार्यता माप

नोट: व्यवहार्यता एंजाइमैदार परख (लूसिफ़ेरेस, रेसाज़ुरिन, और WST-1) का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, बरकरार कोशिकाओं की गिनती, प्रवाह साइटोमेट्री, या क्लोनोजेनिक परख द्वारा।

  1. व्यवहार्यता के सभी उपायों के लिए, FSS के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से पहले एक नमूना इकट्ठा ।
    1. एंजाइमेटिक परख के लिए, डुप्लिकेट 100 माइक्रोल एलिकॉट लें और उन्हें 96-वेल प्लेट में रखें।
    2. फ्लो साइटोमेट्री के लिए, एक 500 माइक्रोन एलिकोट लें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
    3. क्लोनोजेनिक परख के लिए, एक 100 μL aliquot इकट्ठा करें।
  2. एंजाइमेटिक परख
    1. 1, 2, 4, 6, 8, और FSS जोखिम के 10 दालों के बाद 100 μL नमूने ले लीजिए और उन्हें एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में जगह है।
    2. वांछित सब्सट्रेट जोड़ें, और उपयोग की गई परख के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. resazurin के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से एक 0.15 मिलीग्राम/ अकेले मध्यम के 100 माइक्रोन युक्त कुओं के लिए 0.15 मिलीग्राम/एमएल resazurin समाधान के 20 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट। फ्लोरेसेंस (579 उत्तेजन/
      2. लूसिफ़ेरेस-व्यक्त कोशिकाओं के लिए, मध्यम के 5 एमएल में 15 मिलीग्राम/एमएल डी-लूसिफ़ेरिन के 100 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं के लिए उस समाधान के 100 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए रुको, और फिर एक चमक के साथ संगत पाठक का उपयोग कर थाली पढ़ें ।
      3. WST-1 के लिए, प्रत्येक कुएं में WST-1 के 10 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें केवल मध्यम युक्त कुएं शामिल हैं। 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट, और फिर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 420 और 480 एनएम के बीच अवशोषण पढ़ें।
    3. व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए औसत स्थिर नियंत्रण नमूने के लिए FSS-उजागर नमूनों में से प्रत्येक से औसत संकेत की तुलना करें ।
  3. फ्लो साइटोमेट्री24
    1. 500 माइक्रोन नमूने ले लीजिए और उन्हें 1,2, 5, और FSS की 10 दालों के बाद 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
    2. सेंट्रलाइज नमूने (3 मिनट के लिए 500 × जी), और सुपरनेटेंट्स को त्यागें।
    3. कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ छर्रों को फिर से खर्च करें, और नमूनों को अपकेंद्रित्र करें (300 × ग्राम 3 मिनट के लिए)।
    4. फ्लोरिडियम आयोडाइड (1.75 माइक्रोन/एमएलए) जैसे मोतियों और झिल्ली-अभेद्य या व्यवहार्यता रंगों की गिनती के साथ फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) बफर (पीबीएस के साथ 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और 0.1% सोडियम एजाइड) के 500 माइक्रोल के साथ छर्रों को निलंबित करें।
    5. व्यवहार्य कोशिकाओं के अनुपात की तुलना करके व्यवहार्यता निर्धारित करें, मोतियों की गिनती के लिए सामान्यीकृत, कतरनी नमूनों में स्थिर नमूने के लिए।
  4. क्लोनोजेनिक परख
    1. स्थिर नमूने के 100 माइक्रोन लें, और 1:10 कमजोर पड़ने के लिए विकास माध्यम के 900 माइक्रोन जोड़ें।
    2. 1:10 पतला नमूने के 100 माइक्रोन लें, और अंतिम 1:100 कमजोर पड़ने के लिए विकास माध्यम के 900 माइक्रोन जोड़ें।
    3. विकास माध्यम के 2 एमएल युक्त 6-अच्छी डिश के 3 कुओं में से प्रत्येक में 1:100 कमजोर पड़ने के नमूने के 100 μL जोड़ें।
    4. एफएसएस की 10 दालों के अधीन किए गए नमूनों के साथ 3.4.1-3.4.3 कदम दोहराएं।
    5. माध्यम को बदले बिना कोशिकाओं को 7-10 दिनों तक बढ़ने दें, और कॉलोनी गठन की जांच करें। एक बार ≥50 कोशिकाओं की उपनिवेशों का गठन हो जाने के बाद, विकास माध्यम को बढ़ा दें, प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुल्ला करें, पीबीएस को एस्पिरेट करें, और 1 मिलील बर्फ-ठंडे 70% इथेनॉल (एटोह) का उपयोग करके 5 मिनट के लिए ठीक करें। महत्वपूर्ण बात, एक ही समय में दोनों कतरनी और स्थिर नमूनों को ठीक
    6. नमूनों को ठीक करने के बाद, एटोह को एस्पिरेट करें, और 5 मिनट के लिए क्रिस्टल वायलेट समाधान (90% एच 2 ओ, 10% एटोह में 0.1% क्रिस्टल वायलेट) के 1 से2एमएल जोड़ें।
    7. पानी की अधिकता के साथ कुल्ला, और थाली सूख जाने
    8. स्थिर और कतरनी नमूनों दोनों के लिए कालोनियों (≥50 कोशिकाओं के समूह) की गणना करें। कतरनी नमूने से कॉलोनाइजरों की औसत संख्या के अनुपात की तुलना व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए स्थिर नमूने से कालोनियों की औसत संख्या से करें।

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Representative Results

FSS-प्रेरित यांत्रिक विनाश के लिए ऊंचा प्रतिरोध पहले कई कैंसर सेल लाइनों और कैंसर कोशिकाओं को ताजा ट्यूमर से गैर-परिवर्तित एपीथेलियल सेल तुलनात्मक15,24के सापेक्ष अलग में एक संरक्षित फेनोटाइप दिखाया गया है । यहां, ऊतक मूल(तालिका 2)की एक किस्म से अतिरिक्त कैंसर सेल लाइनों को प्रदर्शित करने के लिए परीक्षण किया गया है कि इन कोशिकाओं के बहुमत 250 μL/s पर FSS की 10 दालों के बाद 20% के ≥ व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं । एक अपवाद MiaPaCa2 कोशिकाएं हैं, जो एफएसएस (व्यवहार्यता ≤ 10%) से यांत्रिक विनाश के प्रति अपेक्षाकृत संवेदनशील थे। सेल लाइन के एफएसएस प्रतिरोध प्रोफ़ाइल का पर्याप्त रूप से वर्णन करने के लिए, एन ≥ 3 जैविक प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है।

तुलना के माध्यम से, जांच की गई सभी गैर-परिवर्तित एपिथेलियल कोशिकाओं में इन शर्तों के तहत 10% < व्यवहार्यताहै 15,24। इस प्रकार, जबकि एफएसएस प्रतिरोध में एक सीमा देखी गई है, कैंसर सेल लाइनों के अधिकांश गैर-परिवर्तित कोशिकाओं की तुलना में अधिक एफएस प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। कैंसर सेल लाइनों दोनों प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों और मेटास्टेसिस से प्राप्त किया जा सकता है। कोई भी यह बता सकता है कि मेटास्टेस से प्राप्त कोशिकाएं अधिक एफएसएस प्रतिरोध प्रदर्शित कर सकती हैं क्योंकि मेटास्टैटिक प्रसार के दौरान इस फेनोटाइप का चयन किया गया हो सकता है। हालांकि , एफएसएस प्रतिरोध स्तर को इस बात पर निर्भर नहीं दिखाया गया कि कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेस15,24से प्राप्त की गई थीं या नहीं । इसके अलावा, एफएसएस प्रतिरोध का स्तर मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों15की एक श्रृंखला में मेटास्टैटिक क्षमता से सहसंबंधित नहीं था।

इसका आगे परीक्षण करने के लिए, अलग-अलग मेटास्टैटिक क्षमता (4T1 = अत्यधिक मेटास्टैटिक, 4T07 = कमजोर से मध्यम मेटास्टैटिक क्षमता, 67NR = नहीं कम मेटास्टैटिक क्षमता25,26)के साथ बाल्ब/सी स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। इस प्रयोग से पता चला कि एफएसएस प्रतिरोध मेटास्टैटिक क्षमता(चित्र 1)से सहसंबद्ध नहीं है। इसके अलावा, 4T1 और 4T07 दोनों कोशिकाएं कोशिका व्यवहार्यता का एक द्विचरणीय हानि दर्शाती हैं- दालों में व्यवहार्यता का अधिक नुकसान 1-2 बाद की दालों में मनाया गया। यह इस समूह द्वारा जांच की गई अधिकांश कैंसर सेल लाइनों की खासियत है। इसके विपरीत, 67NR एफएसएस के एक समारोह के रूप में सेल व्यवहार्यता का अधिक रैखिक नुकसान दर्शाता है। सामूहिक रूप से, तालिका 2 और चित्रा 1 के आंकड़े प्रदर्शित करते हैं कि एफएसएस प्रतिरोध परिवर्तित कोशिकाओं की संपत्ति है।

Figure 1
चित्रा 1:सिंजेनिक BALB/c स्तन एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं के तरल कतरनी तनाव प्रतिरोध । कोशिकाओं को FSS (30 जी सुई, 10 pulses@250 एमएल/एस) के संपर्क में थे, और व्यवहार्यता resazurin रूपांतरण (एन = 4/सेल लाइन) का उपयोग कर मापा गया था । जबकि FSS जोखिम व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या कम (पी < ०.०००१, 2 तरह ANOVA), और प्रत्येक सेल लाइन अलग प्रतिरोध प्रोफाइल प्रदर्शित (पी = ०.०४४६, 2 तरह ANOVA), वहां एफएस जोखिम के 10 दालों के बाद सेल लाइनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर था (पी = ०.२८३३, 2-तरह ANOVA) । संक्षिप्त नाम: FSS = तरल पदार्थ कतरनी तनाव; ANOVA = विचरण का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कतरनी (1): दीवार (अधिकतम) कम से कम
सेल व्यास: N/A 10 माइक्रोन 15 माइक्रोन 20 माइक्रोन
सुई गेज: 30 27 25 30 27 25 30 27 25 30 27 25
प्रवाह दर (μL/s) 20 507 220 116 32 10 4 48 16 7 64 21 9
50 1267 550 290 80 26 11 120 39 17 159 52 22
100 2534 1100 580 159 52 22 239 79 33 319 105 45
150 3801 1650 869 239 79 33 359 118 50 478 157 67
200 5068 2200 1159 319 105 45 478 157 67 637 210 89
250 6335 2750 1449 398 131 56 598 196 84 797 262 111

तालिका 1: अधिकतम कतरनी तनाव (दीवार)का स्तर। तालिका में 30 जी, 27 जी और25 जी सुइयों के लिए डाइन/सेमी 2 में अधिकतम दीवार एफएसएस स्तरों को 20, 50, 100, 150, 200 और 250 माइक्रोएल/एस की प्रवाह दरों पर सूचीबद्ध किया गया है। कतरनी तनाव के स्तर की गणना Poiseuille समीकरण Equation 1 (), प्रत्येक सुई गेज के भीतरी व्यास के लिए उपलब्ध जानकारी का उपयोग कररहे थे, साथ ही साथ धारणा है कि μ = 0.01 dyn·s/ प्रत्येक आकार के लिए न्यूनतम एफएसएस स्तरों की गणना की गई थी Equation 2 जिसमें आर सेल का त्रिज्या है, और आर सुई का त्रिज्या है। संक्षिप्त नाम: FSS = तरल पदार्थ कतरनी तनाव; = कतरनी; 1दीवार = अधिकतम कतरनी; μ = चिपचिपाहट; प्रश्न = वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर।

सेल लाइन ऊतक स्रोत प्रजातियां 10 दालों के बाद मतलब व्यवहार्यता (%)
TRAMPC1 प्रोस्टेट चूहा 40
4T01 स्तन चूहा 32
4T7 स्तन चूहा 43
67एनआर स्तन चूहा 46
66CL4 स्तन चूहा 28
आरटी4 मूत्राशय मानवीय 62
W17-266-4 मिलैनोमा मानवीय 46
एचएस852 मिलैनोमा मानवीय 41
HS695 मिलैनोमा मानवीय 41
A2058 मिलैनोमा मानवीय 37
A375 मिलैनोमा मानवीय 37
आरपीएमआई-7951 मिलैनोमा मानवीय 35
SKMEL2 मिलैनोमा मानवीय 29
A101D मिलैनोमा मानवीय 28
मियापाका अग्नाशय मानवीय 7

तालिका 2: विभिन्न कैंसर सेल लाइनों के तरल कतरनी तनाव प्रतिरोध। प्रत्येक कैंसर सेल लाइन सिरिंज और सुई मॉडल (30 जी सुई, 10 pulses@250 एमएल/एस) (n ≥ 3/सेल लाइन) से तरल पदार्थ कतरनी तनाव को उजागर किया गया था, और व्यवहार्यता या तो लूसिफ़ेरेस गतिविधि या resazurin रूपांतरण द्वारा मापा गया था ।

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Discussion

यह कागज एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर निलंबन में कैंसर कोशिकाओं के लिए FSS के आवेदन को दर्शाता है । इस मॉडल का उपयोग करते हुए, कैंसर कोशिकाओं को उच्च स्तरीय एफएसएस की संक्षिप्त दालों के लिए अधिक प्रतिरोधी दिखाया गया है, जो गैर-परिवर्तित एपिथेलियल कोशिकाओं15,22, 24के सापेक्ष है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग करके एफएसएस के संपर्क में आने से सेल कठोरता में तेजी से वृद्धि होती है, RhoA की सक्रियता, और कॉर्टिकल एफ-ऐक्टिन और मायोसिन II-आधारित संकुचन24,27में वृद्धि होती है। रैपिड मेचानो-अनुकूलन (परिस्थितियों के आधार पर सीटीसी की क्षमता कमोबेश कठोर हो जाती है) सीटीसी के यांत्रिक विनाश को रोक सकती है और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण24, 28के अन्य पहलुओं को सुविधाजनक बना सकती है। दरअसल, इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके किए गए निष्कर्षों की पुष्टि पशु मॉडल24में प्रायोगिक सीटीसी का उपयोग करके की गई है । यह तेजी से mechano-अनुकूलन की संभावना कोशिका व्यवहार्यता के द्वि-phasic नुकसान आम तौर पर इस मॉडल में मनाया बताते है(चित्रा 1), यानी,FSS-भोली कोशिकाओं को कोशिकाओं है कि FSS के एक पल्स के संपर्क में आ गया है की तुलना में विनाश के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । एक साथ लिया, यह इंगित करता है कि FSS कैंसर कोशिकाओं में तेजी से सेल कठोरता है कि उन्हें FSS के बाद दालों से बचाता है लाती है।

यद्यपि रोआ-एक्टोमायोसिन धुरी एफएसएस प्रतिरोध15 , 21,24का एक महत्वपूर्ण चालक है, लेकिनइसमें 29अन्य तंत्र शामिल हैं। इसके अलावा सबूत है कि सेल कठोरता FSS प्रतिरोध का एक प्रमुख निर्धारक है कि लेमिन ए का व्यवधान है, जो नाभिक की संरचनात्मक अखंडता को नियंत्रित करता है-कोशिका का सबसे कठोर घटक, इस मॉडल22का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं में एफएसएस प्रतिरोध को कम करता है। हम इस मॉडल का उपयोग कैंसर कोशिकाओं में FSS प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए आगे कर रहे हैं । यहां, इस मॉडल का उपयोग विभिन्न कैंसर सेल लाइनों की क्षमता को मापने के लिए किया गया है ताकि कोशिकाओं को एफएसएस के उच्च स्तर की संक्षिप्त दालों को उजागर करके यांत्रिक विनाश का विरोध किया जा सके। हालांकि यह प्रयोगशाला में विकसित करने के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ती, सरल मॉडल है, सबसे महंगा तत्व सिरिंज पंप होने के साथ, प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए ईमानदारी से प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। FSS की कई दालों को बहुत कम समय में कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है, <10min । प्रयोग के लिए कुल बीता समय निलंबन की मात्रा, प्रवाह दर, पल्स संख्या, और दालों के बीच निलंबन स्थानांतरित करने वाले उपयोगकर्ता की निपुणता पर निर्भर करता है। अनुभव के साथ, 10 pulses@250 μL/s के लिए 30 जी सुई के साथ FSS के संपर्क में एक 5 एमएल निलंबन ~ 10 मिनट में संसाधित किया जा सकता है । अधिकांश सेल लाइनों के लिए, इस समय की लंबाई के लिए निलंबन में आयोजित होने के कारण व्यवहार्यता का न्यूनतम नुकसान होता है।

क्योंकि FSS के लिए जोखिम अपेक्षाकृत जल्दी होता है, FSS आम तौर पर सीरम मुक्त माध्यम में सेल निलंबन के लिए लागू करने के लिए नमूनों के झाग को कम किया जाता है । इस परख में 0-10% भ्रूण गोजातीय सीरम के बीच चिपचिपाहट में अंतर नगण्य है। हालांकि, जिस माध्यम में कोशिकाओं को कतरनी होती है, उसमें कैल्शियम का शारीरिक स्तर सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एफएसएस एक्सपोजर से पहले सेल वियोजन के तरीकों के संबंध में, गैर-एंजाइमेटिक वियोजन एजेंटों15के साथ ट्राइसाइनाइजेशन या उपचार द्वारा तैयार पीसी-3 सेल निलंबन में एफएसएस प्रतिरोध में कोई अंतर नहीं पाया गया था। कोशिका एकाग्रता डाउनस्ट्रीम आवेदन आवश्यकताओं के आधार पर 5 ×10 5 कोशिकाओं/एमएल से अधिक या कम हो सकती है। पीसी-3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया 5 × 104 से 5 × 105,15तक की सीमा में समान है। हालांकि, FSS जोखिम के बाद व्यवहार्यता पर सेल एकाग्रता के प्रभाव अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

सुसंस्कृत कोशिकाओं के अनुरूप अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, सेल घनत्व चिपचिपाहट को काफी प्रभावित नहीं करना चाहिए और इसलिए, एफएसएस की मात्रा लागू होती है। चर, जैसे कि एफएसएस एक्सपोजर से पहले कोशिकाओं को निलंबन में आयोजित किया जाता है, को प्रयोगात्मक प्रतिकृति में निरंतर आयोजित किया जाना चाहिए। जैसा कि ऊपर बताया गया है, सुई अखंडता भी महत्वपूर्ण है। समय के साथ इस परख के संबंध में सुइयों में बहुत विविधताओं को नोट किया गया है। हाइपोडर्मिक सुई नैदानिक उपयोग के लिए डिजाइन किए गए थे, यहां नियोजित प्रवाह दरों के लिए नहीं। दुर्लभ अवसरों पर, सुई के हब को आंशिक रूप से ऑक्सीलेड किया जा सकता है, जो बाद की दालों के दौरान, सुई के माध्यम से निलंबन के पारित होने को रोकता है और अंततः, सिरिंज प्लंजर के चारों ओर बैकफ्लो। इसके अलावा, यह समझना बहुत महत्वपूर्ण है कि मृत/मरने वाली कोशिकाएं एफएसएस के प्रति असाधारण रूप से संवेदनशील हैं, जैसा कि पहले24दिखाया गया था । इसलिए, यदि किसी विशेष सेल लाइन में मरने वाली कोशिकाओं का उच्च स्तर होता है, या तो एक नियमित विशेषता या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ (जैसे, दवा उपचार) के रूप में, इससे कोशिका व्यवहार्यता का बहुत भारी नुकसान होगा जिसे स्थिर नियंत्रण की तुलना में पूरी तरह से सामान्य नहीं किया जा सकता है।

कैंसर सेल बायोलॉजी 24पर एफएसएस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एफएसएस के आवेदन को अन्य परखों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस, पुलडाउन परख, और पश्चिमी ब्लॉटिंग। सिद्धांत रूप में, इस मॉडल का उपयोग रक्त कोशिकाओं सहित अन्य कोशिका प्रकारों पर उच्च स्तरीय, अल्पकालिक एफएसएस के प्रभावों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। सामान्य लाल रक्त कोशिकाएं और ल्यूकोसाइट्स भी कैंसर कोशिकाओं की तुलना में इस तरह से लागू एफएसएस के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं, जो शारीरिक रूप से15कारण हैं। वास्तव में, एफएसएस का स्तर लागू होता है, 250 एमएल/एस की प्रवाह दर पर 30 जी 1/2 "सुई का उपयोग करके, लाल कोशिका झिल्ली (बल के मिलीसेकंड आवेदन के आधार पर)30, 31के व्यवधान के लिए आवश्यक सीमा कोष्ठक करता है। इस मॉडल की एक सीमा, या किसी भी है कि एक नाली के माध्यम से तरल पदार्थ गुजर शामिल है, यह है कि FSS के सटीक स्तर है कि कोशिकाओं को अधिकतम दीवार कतरनी तनाव से सीमा के भीतर अनुभव और नाली के केंद्र में ंयूनतम ज्ञात नहीं है । इस प्रकार, प्रत्येक पल्स पर, सभी कोशिकाओं को एफएसएस के समान स्तर का अनुभव नहीं होता है, और बार-बार दालों पर, व्यक्तिगत कोशिकाओं को निर्दिष्ट सीमा के भीतर प्रत्येक पल्स पर एफएसएस के विभिन्न स्तरों का अनुभव करने की उम्मीद होगी।

हालांकि, हाइड्रोडायनामिक इस मॉडल में नियोजित शर्तों के तहत ध्यान केंद्रित करने के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को दीवार से दूर प्रवाह के केंद्र की ओर निर्देशित किया जा रहा है, और इस प्रकार कम एफएसएस एक्सपोजर32की ओर। अन्य मॉडल, जैसे शंकु और प्लेट विस्कोमीटर या कूएट कक्ष, सेल निलंबन के लिए निरंतर स्तर पर एफएसएस के आवेदन के लिए बेहतर अनुकूल हैं। जैसा कि ऊपर बताया गया है, विट्रो मेंसीटीसी के एफएसएस एक्सपोजर को मॉडल करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यह मॉडल उच्च के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए सबसे उपयुक्त है, लेकिन संक्षिप्त, FSS के संपर्क में है जैसा कि दिल को पार करना हो सकता है। धमनियों और नसों के माध्यम से प्रवाह FSS के निचले स्तर के लिए लंबे समय तक जोखिम में परिणाम है । हालांकि, जैसा कि उल्लेख किया गया है, सीटीसी संचलन में निरंतर प्रवाह में कितनी देर तक रहते हैं, अस्पष्ट है, और आज तक का अधिकांश प्रायोगिक साक्ष्य माइक्रोसर्कुलेशन में फंसाने की लंबी अवधि तक विरामित मुक्त प्रवाह की छोटी अवधि (सेकंड) के अनुरूप है।

एफएसएस (0.5-60 डाइन/सेमी2)के निचले स्तरों के निलंबन में कैंसर कोशिकाओं को बेनकाब करने वाले मॉडलों में लंबी अवधि (मिनट-टू डेज) के लिए शंकु और प्लेट विस्कोमीटर, कूएट चैम्बर्स, निरंतर प्रवाह छोरों, ट्यूब एक्सटेंशन के साथ सिरिंज, और माइक्रोफ्लुइडिकिक डिवाइस33,34,35,36,37शामिल हैं। इनका उपयोग इस बात के लिए भी किया गया है कि एफएसएस सीटीसी को कैसे प्रभावित कर सकता है और यह पता लगाने के लिए कि एफएसएस के संपर्क में आने से ऑक्सीडेटिव तनाव, सेल प्रसार और आक्रमण बढ़ता है, और विभिन्न कैंसर सेल लाइनों में स्टेम सेल जैसी विशेषताएं होती हैं। यहां वर्णित एक के साथ उन मॉडलों से प्राप्त परिणामों की तुलना करना दिलचस्प होगा। उदाहरण के लिए, एक सतत प्रवाह लूप मॉडल का उपयोग करते हुए, Xin एट अल. ने पाया कि रॉक-actomyosin धुरी ने38से ऊपर वर्णित आंकड़ों के विपरीत 2-12h के लिए 2-12h के लिए एफएसएस (20 dyn/सेमी2) के संपर्क में आने वाले कैंसर सेल लाइनों में सेल व्यवहार्यता के नुकसान को बढ़ावा दिया। इस प्रकार, जैविक संदर्भ इन सभी इन विट्रो मॉडलों के लिए मायने रखने की संभावना है, जो वीवो मॉडल और अंततः कैंसर रोगियों में सीटीसी के बारे में निष्कर्षों का अनुवाद करने की आवश्यकता को मजबूत करते हैं।

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Disclosures

एमडीएच सिंडरबायो के सह-संस्थापक, अध्यक्ष और शेयरधारक हैं, इंक डीएलएम सिंडरबायो, इंक के लिए एक सलाहकार है।

Acknowledgments

यहां प्रदर्शित मॉडल के विकास को डीओडी ग्रांट W81XWH-12-1-0163, एनआईएच अनुदान R21 CA179981 और R21 CA196202, और सातो मेटास्टेसिस रिसर्च फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Gibco 25200-056
14 mL round bottom tubes Falcon - Corning 352059
30 G 1/2" Needle BD 305106
5 mL syringe BD 309646
96-well black bottom plate Costar - Corning 3915
Bioluminescence detector AMI AMI HTX
BSA, Fraction V Sigma 10735086001
Cell Titer Blue Promega G8081
crystal violet Sigma C0775
D-luciferin GoldBio D-LUCK
DMEM Gibco 11965-092
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Gibco 10010023
Plate Reader BioTek Synergy HT
Sodium Azide (NaN3) Sigma S2002
Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3005

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 170
एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी पर Hemodynamic तनाव के प्रभाव मॉडलिंग
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Moose, D. L., Williams-Perez, S.,… More

Moose, D. L., Williams-Perez, S., Cafun, R., Krog, B. L., Henry, M. D. Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle. J. Vis. Exp. (170), e62478, doi:10.3791/62478 (2021).

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