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Biology

मनका लोडिंग प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड अनुयायी मानव कोशिकाओं में

Published: June 1, 2021 doi: 10.3791/62559
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University, 2World Research Hub Initiative, Institute of Innovative Research, Tokyo Institute of Technology

Summary

मनका लोडिंग प्रोटीन, प्लाज्मिड, और कणों को अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं में पेश करती है। यह सेल लोडिंग तकनीक सस्ती, तेजी से है, और सेल स्वास्थ्य को काफी हद तक प्रभावित नहीं करती है। यह लाइव-सेल इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त है।

Abstract

कई लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग कोशिकाओं के भीतर लेबल या कार्य करने के लिए बहिर्जात कणों (जैसे, पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, मोती) का उपयोग करते हैं। हालांकि, इसकी झिल्ली के पार एक सेल में प्रोटीन शुरू करना मुश्किल है। वर्तमान तरीकों का सीमित चयन कम दक्षता के साथ संघर्ष करता है, महंगे और तकनीकी रूप से मांग करने वाले उपकरणों, या संकीर्ण मापदंडों के भीतर कार्यों की आवश्यकता होती है। यहां, हम जीवित मानव कोशिकाओं में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन लोड करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तकनीक का वर्णन करते हैं। मनका लोडिंग कोशिका झिल्ली में एक अस्थायी यांत्रिक व्यवधान लाती है, जिससे मैक्रोमॉलिक्यूल्स अनुयायी, जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। प्रति प्रयोग 0.01 अमरीकी डॉलर से कम पर, मनका लोडिंग सबसे कम महंगी सेल लोडिंग विधि उपलब्ध है। इसके अलावा, मनका लोडिंग कोशिकाओं को काफी तनाव नहीं देती है या उनकी व्यवहार्यता या प्रसार को प्रभावित नहीं करती है। यह पांडुलिपि मनका लोडिंग प्रक्रिया, अनुकूलन, विविधताओं और तकनीकी सीमाओं के चरणों का वर्णन करती है। यह पद्धति विशेष रूप से लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन अन्य अनुप्रयोगों के लिए एक व्यावहारिक समाधान प्रदान करती है जिसमें प्रोटीन, मोती, आरएनए, या प्लाज्मिड की शुरुआत की आवश्यकता होती है, जो जीवित, अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं में होता है।

Introduction

स्तनधारी कोशिकाओं में मैक्रोमॉलिक्यूल्स लोड करने से कार्यप्रणाली की आवश्यकता होती है जो उन्हें कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली को पार करने की अनुमति देती है1। कई तरीके ट्रांसफैक्शन के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मिड पेश कर सकते हैं, जिसमें लिपोसोमल ट्रांसफैक्शन2 और डायथाइलमिनोएथिल-डेक्सट्रान ट्रांसफैक्शन3शामिल हैं। हालांकि, कोशिकाओं में प्रोटीन या झिल्ली-अभेद्य कणों को लोड करने के तरीके अधिक सीमित हैं।

कई तकनीकों ने विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करके इस कठिन बाधा को दरकिनार कर दिया है। सबसे पहले, माइक्रोइंजेक्शन एक माइक्रोस्कोप4के तहत जीवित कोशिकाओं में एक माइक्रोपिपेट के माध्यम से कणों को बचाता है । यकीनन सबसे नियंत्रित और कम आक्रामक विधि, यह तकनीक अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है क्योंकि कोशिकाओं को एक-एक करके लोड किया जाना चाहिए। इसके अलावा, माइक्रोइंजेक्शन के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और तकनीकी रूप से मांग की जाती है।

दूसरा, इलेक्ट्रोपॉनेशन वोल्टेज-प्रेरित झिल्ली व्यवधान5,6,7के माध्यम से कोशिकाओं में प्रोटीन को इलेक्ट्रो-इंजेक्ट करने का एकतरीकाहै। हालांकि, इस विधि को फिर से विशेष, महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है, और सदमे सेल तनाव और मृत्यु दर का कारण बन सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपाउशन से पहले ट्रिप्सिनाइज्ड किया जाना चाहिए और बाद में उन्हें रिफ्लेम किया जाना चाहिए, जिस समय सीमा को सीमित किया जाना चाहिए जिस पर कोशिकाओं की इलेक्ट्रोपॉशन के बाद जांच की जा सकती है ।

तीसरा, कोशिका झिल्ली को अस्थायी, प्रतिवर्ती पारमेबिलाइजेशन8,9के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। स्ट्रेप्टोलिसिन-ओ लोडिंग कोशिका झिल्ली में एक एंडोटॉक्सिन सम्मिलित करता है, जो अस्थायी छिद्र बनाता है, जिससे प्रोटीन और डीएनए प्लाज्मिड सहित एक्सोजेनस झिल्ली-अभेद्य कणों को कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है10। 2 घंटे की वसूली के बाद, लगभग आधी कोशिकाएं इन छिद्रों की मरम्मत करती हैं और समाधान से कणों को आंतरिक रूप से रोकती हैं। हालांकि, इस तकनीक के लिए एक लंबे समय की वसूली समय की आवश्यकता होती है और सेल प्रकारों के साथ असंगत है जो एंडोटॉक्सिन को बर्दाश्त नहीं कर सकता है।

चौथा, यांत्रिक व्यवधान कोशिका झिल्ली11के भौतिक क्षोभ के माध्यम से कोशिकाओं में कणों लोड । यह कई तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें12, 13कोशिकाओं के ऊपर खरोंच, स्क्रैपिंग और रोलिंग मोती शामिल हैं। 1987 की शुरुआत में, मोतियों का उपयोग यांत्रिक रूप से14कोशिकाओं में प्रोटीन लोड करने के लिए किया गया है। हाल ही में, मनका लोडिंग तकनीक को प्रोटीन से परे अनुकूलित और अनुकूलित किया गया है ताकि प्लाज्मिड और आरएनए की लोडिंग को शामिल किया जा सके, जैसा कि यहां वर्णित है।

मनका लोडिंग प्रोटीन और प्लाज्मिड को अनुयायी मानव कोशिकाओं में लोड करने के लिए एक आसान, सस्ती और तेज विधि है। कांच के मोती संक्षेप में कोशिकाओं के ऊपर लुढ़का रहे हैं, अस्थाई रूप से उनके सेलुलर झिल्ली में खलल न डालें । यह समाधान में कणों को प्रवेश करने की अनुमति देता है। चूंकि मनका लोडिंग में कम दक्षता होती है, इसलिए यह एकल-अणु या एकल-कोशिका माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है। मनका लोडिंग खंडित एंटीबॉडी (फैब),15, 16शुद्ध प्रोटीन जैसे एससीएफवी,17 इंट्राबॉडी, 18,19,या एमआरएनए कोट प्रोटीन, जैसे, एमएस2 कोट प्रोटीन (एमसीपी)20, 21सहित विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पेश करसकतेहैं। प्लास्मिड एक्सप्रेशन वैक्टर को प्रोटीन समाधान और मनका-लोडेड में एक साथ 22 ,23,24,25भी जोड़ा जा सकता है।

प्रोटीन और प्लाज्मिड से परे, 250 एनएम पॉलीस्टीरिन मोतियों के रूप में बड़े अणुओं को मनका लोडिंग (व्यक्तिगत संचार) के माध्यम से कोशिकाओं में पेश किया गया है। मनका लोडिंग अविश्वसनीय रूप से सस्ती है, सामग्री में प्रति प्रयोग 0.01 अमरीकी डालर से कम लागत और कोई अतिरिक्त महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है। प्रति प्रयोग उपयोग की जाने वाली जांच की मात्रा को कम करके लागत को और कम किया जाता है क्योंकि केवल एक इमेजिंग कक्ष के केंद्रीय 14 मिमी व्यास माइक्रोवेल में कोशिकाएं भरी हुई हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीमित लोडिंग क्षेत्र का मतलब है कि मनका लोडिंग थोक-सेल लोडिंग के लिए आदर्श नहीं है।

यह पांडुलिपि मनका लोडिंग प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जिसमें मनका लोडिंग उपकरण का निर्माण करना और एक प्रयोग करना शामिल है। यह दर्शाता है कि प्रोटीन, आरएनए और डीएनए को विभिन्न कोशिका प्रकारों में लोड किया जा सकता है और दो अलग-अलग, साथ ही मनका-लोडेड प्रोटीन में अत्यधिक सहसंबद्ध सेलुलर सांद्रता और अपेक्षाकृत कम विचरण होता है। इसके अलावा चर्चा की सेल प्रकार और प्रोटीन, प्लाज्मिड, या आरएनए की लोडिंग के आधार पर प्रोटोकॉल में बदलाव कर रहे हैं । यद्यपि मोती कोशिका झिल्ली को छिद्रित और बाधित करने के लिए सोचा जाता है, जब उचित रूप से प्रदर्शन किया जाता है, तो मनका लोडिंग प्रक्रिया इमेजिंग कक्ष के नीचे से केवल थोड़ी संख्या में कोशिकाओं को उखाड़ फेंकती है। एक छोटी वसूली अवधि के बाद, कोशिकाओं को बढ़ने और विभाजित करने के लिए जारी है । यह पद्धति लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए आदर्श है, जिसमें एकल-अणु प्रोटीन और आरएनए ट्रैकिंग, ट्रांसलेशनल संशोधन का पता लगाने, गतिशील सेलुलर तंत्र का अवलोकन, या15, 16,22,26,27शामिलहैं।

Protocol

1. क्लंपिंग से बचने और कोशिकाओं के ऊपर फैलने को सुनिश्चित करने के लिए साफ, बंध्याकरण और सूखे ग्लास मोती।

  1. सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) में कांच के मोतियों की लगभग 5 मिलील की नसबंदी करें। मोतियों को 50 एमएल शंकु नली में माप लें। 2 एम नाओएच के 25 एमएल जोड़ें और 2 घंटे के लिए एक शेखर या रोटेटर का उपयोग करके धीरे-धीरे मिलाएं।
  2. नाओएच को डिकेंट करें, जितना संभव हो उतने मोतियों को बनाए रखें। यदि मोती निलंबन में हैं, तो मोतियों की ट्यूब को संक्षेप में एक अपकेंद्रित्र (~ 1000 × जी,कमरे के तापमान पर 1 मिनट) में स्पिन करें।
  3. पीएच तटस्थ होने तक सेल कल्चर-ग्रेड पानी के साथ मोतियों को अच्छी तरह से धोएं (तटस्थ पीएच की पुष्टि करने के लिए एल्यूएंट पर पीएच टेस्ट स्ट्रिप का उपयोग करें)। पहले की तरह हर बार धोने के पानी को डिकेंट करें।
  4. मोतियों को 100% इथेनॉल 2-3x से अच्छी तरह धोएं। इथेनॉल हर बार, पहले की तरह।
  5. मोतियों को सुखा लें। एक बाँझ कंटेनर (जैसे 10 सेमी पेट्री डिश) के अंदर एक पतली परत बनाने के लिए मोतियों को छिड़कें। कंटेनर को खुला छोड़ते हुए, मोतियों को रात भर जैवसेफ्टी कैबिनेट में सूखने दें। सुनिश्चित करें कि मोती कंटेनर को टैप करके या धीरे-धीरे हिलाकर पूरी तरह से सूखे हैं और यह जांचते हैं कि मोतियों में कोई झुरमुट या फ्लैकिंग के साथ रेतीली बनावट है।
  6. यूवी-15 मिनट के लिए सूखे मोतियों को स्टरलाइज करें।

2. मनका लोडर उपकरण इकट्ठा करें।

  1. जाल के एक पैच जकड़ना (पॉलीप्रोपाइलीन या समकक्ष सामग्री, 105 माइक्रोन उद्घाटन मोती के माध्यम से पारित करने की अनुमति देने के लिए) या तो टेप के साथ मोती होल्डिंग चैंबर के पूरे उद्घाटन को कवर करने के लिए या एक धातु पुन: प्रयोज्य इमेजिंग चैंबर(चित्रा 1A)के पुरुष और महिला सिरों के बीच जाल क्लैंपिंग।
  2. यूवी-15 मिनट के लिए उपकरण की नसबंदी करें। उपकरण के लिए मोती जोड़ें और मोमी फिल्म के साथ कसकर इसे सील।
    नोट: यह आवश्यक है कि मोती इस कदम पर पूरी तरह से साफ और सूखे हैं। वे ढीले हो जाना चाहिए और कोई झुरमुट के साथ रेतीले दिखना चाहिए। यदि वे ऐसा नहीं दिखाई देते हैं, तो फिर से धोएं और मोतियों को पूरी तरह से सुखा लें।
  3. उपकरण को सिलिका जेल या अन्य डेसिकेंट माध्यम द्वारा एक सीलबंद, सूखे कंटेनर में स्टोर करें। यदि मोती नम हो जाते हैं, जो मनका झुरमुट से स्पष्ट हो जाएगा, अच्छी तरह से सूखी और मनका लोडर नसबंदी और ताजा मोतियों के साथ बदलें ।
    नोट: इन सभी सावधानियों पर या मनका लोडर के भीतर मोती के आसपास बढ़ने से किसी भी मोल्ड या बैक्टीरिया को रोकने जाएगा । मनका लोडर उपकरण अलग-अलग तरीकों से बनाया जा सकता है। चर्चा में विवरण देखें।

3. अनुयायी कोशिकाओं के ग्लास-बॉटम कक्ष तैयार करें।

  1. बीज अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं को 35 मिमी ग्लास-बॉटम कक्ष पर। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को मनका लोडिंग के समय लगभग 80% ढुलमुल हैं। (विभिन्न सेल प्रकारों और विभिन्न सेल प्रकारों में मनका लोडिंग की प्रभावशीलता पर नोट्स के बारे में अधिक जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
    नोट: कोशिकाओं को कक्ष के केंद्र में केवल माइक्रोवेल में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है ताकि यह संरक्षित किया जा सके कि कितनी कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है।
  2. कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे पूरी तरह से ग्लास के पालन न हों।
    नोट: यह आवश्यक है कि सेल घनत्व काफी अधिक है और कोशिकाओं को सुरक्षित रूप से ग्लास का पालन किया जाता है। यदि इन आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर रहे हैं, कोशिकाओं की संभावना मनका लोडिंग के दौरान छील जाएगा । सेल सीडिंग और मनका लोडिंग के बीच की समयसीमा को उचित सेल आसंजन और उदारता सुनिश्चित करने के लिए लंबा किया जा सकता है।

4. मनका लोडिंग सेल

नोट: यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) से संक्षेप में धोएं और फिर इष्टतम माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।

  1. वांछित प्लाज्मिड, प्रोटीन, और/या कणों युक्त 3-8 माइक्रोन का समाधान बनाएं। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर प्रत्येक प्रकार के प्लाज्मिड और प्रोटीन के ~ 0.5 माइक्रोग्राम (0.01 एनएमओएल) के ~ 1 माइक्रोग्राम (0.1-1 पीएमओएल) का उपयोग करें। प्रोटीन के लिए लो-रिटेंशन ट्यूब का इस्तेमाल करें ताकि वे ट्यूब की दीवारों पर पीछे न रह जाएं। समाधान को पीबीएस के साथ न्यूनतम 3 माइक्रोल तक लाएं, और कोशिकाओं के पूरे क्षेत्र को लोड करने के लिए कोट करने के लिए समाधान की मात्रा को समायोजित करें (यानी, चैंबर का माइक्रोवेल, चित्रा 1 बी)।
  2. ऊपर और नीचे और/या ट्यूब को फ्लिकिंग करके समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं। संक्षेप में एक टेबलटॉप माइक्रोफ्यूज में ट्यूब के नीचे समाधान स्पिन करें।
  3. मनका लोडिंग समाधान और कोशिकाओं के कक्ष को ऊतक संस्कृति हुड में स्थानांतरित करें। बाँझ तकनीक का उपयोग कर ऊतक संस्कृति हुड में शेष चरणों का प्रदर्शन करें।
  4. माध्यम को कोशिकाओं से निकालें और अस्थायी रूप से इसे बाँझ ट्यूब में स्टोर करें। धीरे-धीरे कक्ष के किनारों के चारों ओर से सभी माध्यमों को हटा दें, और कक्ष को लगभग 45 डिग्री कोण पर झुकाएं और केंद्र माइक्रोवेल में मीडिया की शेष बूंद को हटा दें। मध्यम हटाने के दौरान, पिपेट टिप को ग्लास को छूने से बचना सुनिश्चित करें, जिसके परिणामस्वरूप सेल छीलने और नुकसान हो सकता है। अगले चरण में जल्दी से आगे बढ़ें ताकि कोशिकाएं लंबे समय तक सूखी न हों।
  5. धीरे-धीरे चैंबर के केंद्र में ग्लास माइक्रोवेल पर मनका लोडिंग समाधान को पिपेट करें। वैकल्पिक: कक्ष को पूरी तरह से सूखने की अनुमति दिए बिना ~ 30 एस के लिए कोमल कमाल के साथ इनक्यूबेट।
  6. धीरे से कोशिकाओं के शीर्ष पर कांच के मोतियों की एक मोनोलेयर तितर-बितर, अधिमानतः एक मनका लोडिंग उपकरण(चित्रा 1A)का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि मोती कांच के नीचे माइक्रोवेल में कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करें।
  7. दो उंगलियों के साथ चैंबर चुटकी, यह ~ 2 इंच उठाने और इसे मजबूती से नीचे लाने के द्वारा हुड सतह के खिलाफ नल । उस ऊंचाई से पकवान छोड़ने के लिए लगभग बराबर बल का प्रयोग करें। कुल ~ 10 नलों के लिए दोहराएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नल कोशिकाओं को काफी हद तक छील नहीं करते हैं। टैपिंग को सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यदि कोशिकाएं खराब होती हैं, तो कठिन टैप करें; हालांकि, अगर कई कोशिकाएं छीलती हैं, तो अधिक हल्के से टैप करें।
  8. धीरे-धीरे कक्ष के प्लास्टिक की ओर धीरे-धीरे पाइपिंग करके कक्ष में मध्यम वापस जोड़ें। कोशिकाओं को परेशान किए बिना किसी भी अस्थायी मोतियों को आकांक्षी करने की कोशिश करें। इस कदम पर अधिक पूर्व गरम मीडिया जोड़ें अगर बहुत ज्यादा हटा दिया गया था । इनक्यूबेटर में 0.5-2 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  9. यूवी-डिसेटिंग परिस्थितियों में भंडारण के लिए लौटने से पहले 15 मिनट के लिए मनका लोडर नसबंदी ।
  10. निर्माता के अनुशंसित प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं में डाई (जैसे, डीएपीआई या हेलोटैग लिगांड दाग, यदि प्रयोग द्वारा आवश्यक हो) जोड़ें।
  11. मोतियों और समाधान में अतिरिक्त लोडिंग घटकों को हटाने के लिए इमेजिंग से पहले माध्यम के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं। उन्हें छीलने से रखने के लिए कोशिकाओं पर सीधे पाइपिंग से बचें।

5. मनका भरी हुई कोशिकाओं इमेजिंग

  1. कोशिकाओं को तुरंत या प्रयोग के लिए आवश्यक होने पर छवि करें। फ्लोरेसेंस (लेजर या मोनोक्रोमेटिक प्रकाश स्रोत) पर कब्जा करने में सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजन तरंगदैर्ध्य चुने हुए फ्लोरोफोर या डाई (उदाहरण के लिए, हरे फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) के लिए 488 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश के लिए उपयुक्त हैं।
    नोट: मनका-भरी हुई प्रोटीन एक बार कोशिकाओं को बरामद किया है छवि हो सकता है (जैसे ही 30 मिनट के बाद यहां वर्णित सेल लाइनों के लिए लोड हो रहा है) । प्लाज्मिड अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति वेक्टर तत्वों(चित्रा 1C,और चर्चा में आगे स्पष्टीकरण) के आधार पर ≥2 एच लेता है। मनका-भरी हुई कोशिकाओं की इमेजिंग लोडेड जांच से जुड़े उपयुक्त फ्लोरोसेंट स्रोतों से लैस किसी भी माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है, फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करने में सक्षम कैमरा, जैसे इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) या वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (एसएमओएस) कैमरा, और तापमान, आर्द्रता और कार्बन डाइऑक्साइड को नियंत्रित करने के लिए एक इनक्यूबेटर। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक गाइड के लिए, 27 को देखें।

Representative Results

मनका लोडिंग का सबसे आम अनुप्रयोग अनुयायी मानव कोशिकाओं में एक या अधिक प्रकार के प्रोटीन को पेश करना है। इसे समझाने के लिए, कोशिकाओं को Cy3-और Alexa488-conjugated फैब प्रोटीन के समाधान के साथ मनका-भरी हुई थी । हालांकि माइक्रोवेल में हर कोशिका मनका-भरी हुई नहीं थी, लेकिन जिन कोशिकाओं को लगभग हमेशा लोड किया गया था उनमें Cy3-और Alexa488-लेबल प्रोटीन एक साथ(चित्रा 2A)दोनों थे। एक पूर्व अनुमान के अनुसार, जब 4 माइक्रोलीटर में पतला फैब का 0.5 माइक्रोग्राम मनका-लोडेड29है, जैसा कि चित्र 2 एमें है, तो प्रत्येक कोशिका लगभग 106 फैब अणुओं से भरी हुई है।

प्लाज्मिड डीएनए एन्कोडिंग जीएफपी (प्लाज्मिड डीएनए का 1 माइक्रोन, 557 एनजी/माइक्रोन समाधान का 1.8 माइक्रोन) और Cy3-लेबल फैब के 0.5 माइक्रोग्राम को भी मनका लोडिंग के माध्यम से कोशिकाओं में पेश किया गया था और बाद में व्यक्त और कल्पना(चित्रा 2B)। जीएफपी फ्लोरेसेंस ने संकेत दिया कि जीएफपी-एन्कोडिंग प्लाज्मिड को न केवल कोशिकाओं में लोड किया गया था बल्कि व्यक्त भी किया गया था । इस प्रकार, एक ही सेल में, मनका लोडिंग एक प्रोटीन जांच (जैसे, Cy3-लेबल फैब) और रिपोर्टर प्लाज्मिड (जैसे, जीएफपी) शुरू कर सकता है,जैसा कि पहले22, 23,24इस प्रयोगशाला में किया जाता था। हमने निर्धारित किया है कि कोशिकाओं के ४०% मनका-फैब प्रोटीन के साथ भरी हुई थी और मनका से भरी कोशिकाओं के 21% सह भरी हुई प्लाज्मिड व्यक्त की, के रूप में प्रतिनिधि क्षेत्रों में दिखाया गया है-चित्रा 2Bमें देखने के । आमतौर पर, प्रत्येक कक्ष प्लाज्मिड के 1-2 माइक्रोग्राम से भरा हुआ है, जो लगभग लिपोफेक्शन के समान राशि है।

मनका से भरी कोशिकाएं प्लाज्मिड्स(चित्रा 2C,D)के व्यापक रूप से अलग-अलग स्तरों को व्यक्त करती हैं। विशेष रूप से इस उपाय करने के लिए, हमने प्रोटीन और प्लाज्मिड तीव्रता डेटा के वितरण की तुलना करने के लिए फिशर रेशियो परीक्षण का उपयोग किया। परिणामों से पता चला है कि हालांकि प्रोटीन 1 और 2 में समान तीव्रता वितरण (पी = ~ 1) था, प्रत्येक प्रोटीन में प्लाज्मिड (पी = 3.2e-6 और1.8e-5) की तुलना में काफी छोटा वितरण था। यद्यपि यह प्रति कोशिका कितने प्लाज्मिड लोड किए जाते हैं, परिवर्तनशीलता के कारण हो सकता है, प्लास्मिड अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक कई चरणों से परिवर्तनशीलता का अधिक स्रोत उत्पन्न हो सकता है जो कोशिकाओं के बीच बहुत भिन्न होने की संभावना है, जिसमें सेल न्यूक्लियस, ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद में आयात किया जा रहा है। इसके विपरीत, मनका-लोडेड प्रोटीन के स्तर में मामूली सेल-टू-सेल विचरण था, और दो एक साथ लोड किए गए प्रोटीन का स्तर एक दूसरे के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध था(चित्रा 2डी,ई)।

प्लाज्मिड अभिव्यक्ति को 2-4 घंटे पोस्ट मनका लोडिंग के रूप में देखा जा सकता है लेकिन बाद में इष्टतम प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्राप्त होने पर निर्भर करता है। हम 2-24 घंटे पोस्ट मनका लोडिंग फैले एक विशिष्ट प्लाज्मिड के लिए अभिव्यक्ति की सबसे अच्छी खिड़की निर्धारित करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। यह एक कक्ष में लंबी समय सीमा इमेजिंग के साथ या मनका लोडिंग और चौंका देने वाला कई कक्षों द्वारा किया जा सकता है। मनका भरी हुई कोशिकाओं को पालन रहते है और काफी स्वस्थ बढ़ने और विभाजित कर रहे हैं । मनका-भरी हुई मानव U2OS कोशिकाओं को सीधे पहले, सीधे बाद, और मनका लोडिंग के बाद 24 घंटे इमेज किए गए थे। उचित मनका लोडिंग कोशिकाओं या उनके आकृति विज्ञान की संख्या पर लगभग कोई ध्यान देने योग्य प्रभाव पड़ा, जैसा कि चित्र 3 ए (बाएं, मध्य) में दिखाया गया है।

इसके विपरीत, बहुत अधिक मोतियों और अत्यधिक दोहन बल के साथ खराब मनका लोडिंग को चित्र 3 बीमें चित्रित किया गया है। इससे बहुत सेल हानि हुई (कोशिकाओं के बिना कवरग्लास के बड़े पैच और अलग, फ्लोटिंग, आउट-ऑफ-फोकस कोशिकाएं), खराब सेल आकृतिविज्ञान (कोशिकाएं गोल और खराब पालन दिखाई देती हैं), और मोतियों के समूह मोतियों को लोड करने के बाद कवरग्लास पर शेष होते हैं। हालांकि कोशिकाओं को मनका लोडिंग के दौरान यांत्रिक क्षति से गुजरना करने के लिए सोचा जाता है, कोशिकाओं में वृद्धि हुई और ठीक से मनका से भरी हुई कक्ष में प्रसारित, के रूप में कोशिकाओं की वृद्धि की संख्या का सबूत 24 घंटे मनका लोडिंग के बाद(चित्रा 3A,सही)। सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव का आकलन विभिन्न प्रकार के परखों के माध्यम से किया जा सकता है, जैसे कि 3-(4,5-डाइमेथिल्थियाजोल-2-आईएल) - 2,5-डिफेनिल्टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख, मणिका-लोडेड की तुलना नकली-लोड कोशिकाओं30से करने के लिए। इसके अलावा, यह और पिछला काम दिखाता है कि मनका-लोडेड कोशिकाएं सेल डिवीजन(चित्रा 3 सी और पूरक वीडियो 1)से गुजरती हैं, और माइटोसिस का समय मनका लोडिंग31से प्रभावित नहीं होता है, जो मनका लोड करने के बाद निरंतर सेल स्वास्थ्य के लिए आगे सबूत के रूप में कार्य करता है।

मनका लोडिंग एक बहुमुखी तकनीक है, जो कई अनुयायी कोशिका रेखाओं और विभिन्न मैक्रोमॉलिक्यूल्स को समायोजित करती है। यहां, इस किस्म को फैब(चित्रा 4A,बी)के साथ RPE1 और HeLa सेल लाइनों लोड करके प्रदर्शित किया गया है । तालिका 1 इस प्रयोगशाला में और उससे आगे विभिन्न सेल लाइनों में मनका लोडिंग के आगे उदाहरण प्रदान करता है, और अन्य प्रयोगशालाओं से मनका लोडिंग प्रोटोकॉल के बीच कुछ सूक्ष्म अंतर बताते हैं। ध्यान दें, लोडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास मोतियों का व्यास प्रयोगशालाओं के बीच बहुत भिन्न होता है, हालांकि सबसे कुशल लोडिंग कई सेल लाइनों14में छोटे, 75 माइक्रोन व्यास मोतियों के लिए पाया गया था। इसके अलावा, इस प्रयोगशाला मनका लोडिंग आरएनए के रूप में अच्छी तरह से शुरू कर दिया है (डेटा नहीं दिखाया) । चित्रा 4C एक प्रतिनिधि U2OS सेल मनका प्रदर्शित करता है-एक Cy5-RNA 9mer और Cy3-DNA 28mer एक साथ के साथ भरी हुई ।

Figure 1
चित्रा 1:मनका लोडिंग उपकरण, तकनीक और टाइमलाइन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। मनका लोडिंग प्रोटीन एकाग्रता में कम परिवर्तनशीलता का परिचय देती है लेकिन प्लाज्मिड अभिव्यक्ति में उच्च परिवर्तनशीलता। (क)कोशिकाओं को मोदक समाधान लोडिंग के 4 माइक्रोन में एलेक्सा 488-संयुग्मित एंटी-एच3के27 एसिटिल फैब (ग्रीन) और Cy3-संयुग्मित एंटी-आरएनएपीआई-सेरीन 5-फॉस्फोरिलेटेड फैब (लाल) में से प्रत्येक के 0.5 माइक्रोग्राम के साथ लोड किया गया था। कोशिकाओं को DAPI-दाग (नीला) और फिर तुरंत लाइव-इमेज्ड किया गया था। स्केल बार = 20 माइक्रोन.(बी)कोशिकाओं को फैब प्रोटीन के 0.5 माइक्रोग्राम (Cy3-conjugated एंटी-आरएनएपीआई-सेरीन 5-फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन, लाल) और 1 माइक्रोग्राम ऑफ प्लाज्मिड एन्कोडिंग सुपरफोल्डर जीएफपी-एच2बी (ग्रीन) के साथ 4 माइक्रोनल मोदक समाधान लोडिंग में लोड किया गया था। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं DAPI दाग (नीला) और चित्रित रहते थे । स्केल बार = 30 माइक्रोन(सी-ई)प्रोटीन 1 (JF646-HaloLigand-लेबल हेलोटैग-एमसीपी), प्रोटीन 2 (Cy3-conjugated विरोधी झंडा फैब), और एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP (λN-EGFP-LacZ) कोशिकाओं में एक साथ लोड किया गया । प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल में कुल तीव्रता प्रत्येक कोशिका के साइटोप्लाज्म में 1.3 x 1.3 माइक्रोन पैच में मापी गई थी। N = 25 कोशिकाओं। (ग)मनका-भरी हुई प्लाज्मिड, λN-ईजीएफपी-लैक्ज़ को व्यक्त करने वाली प्रतिनिधि कोशिकाएं । सभी कोशिकाओं के लिए एक ही इमेजिंग स्थितियों और तीव्रता का उपयोग किया गया था। धब्बे व्यक्त प्रोटीन के समुच्चय हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन.(घ)चार्ट प्रत्येक कोशिका की कुल तीव्रता को दिखाता है या तो प्रोटीन 1, प्रोटीन 2, या ईजीएफपी प्लाज्मिड से व्यक्त किया जाता है। प्रत्येक चैनल को मीडियन में सामान्यीकृत किया गया था। बोनफेरोनी-सही पी मूल्यों की गणना फिशर रेशियो परीक्षण द्वारा यह निर्धारित करने के लिए की गई थी कि प्रोटीन या प्लाज्मिड तीव्रता डेटा के वितरण में एक ही परिवर्तनशीलता है या नहीं। प्रत्येक बिंदु एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है। (ई)या तो प्रोटीन, प्रोटीन 1 और प्लाज्मिड, या प्रोटीन 2 और प्लाज्मिड दोनों के लिए कुल तीव्रता एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची जाती है । गणना आर2 मान प्रदर्शित कर रहे हैं। प्रत्येक बिंदु एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; A.U. = मनमाने ढंग से इकाइयां; एमसीपी = MS2 कोट प्रोटीन; आरएनएपीआई = आरएनए पॉलीमरेज II। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:मनका-भरी हुई कोशिकाएं अनुयायी रहती हैं और बढ़ने और विभाजित करने के लिए पर्याप्त स्वस्थ होती हैं। (ए)यू2ओएस कोशिकाओं को मनका लोडिंग समाधान के 4 माइक्रोन में Cy3-conjugated एंटी-फ्लैग फैब के 0.5 माइक्रोन के साथ लोड किया गया था। कोशिकाओं को सीधे पहले, सीधे मनका लोडिंग के बाद, और मनका लोडिंग के बाद 24 घंटे इमेज किए गए थे। नारंगी तीर उन क्षेत्रों की पहचान करते हैं जहां कोशिकाएं मनका लोडिंग के दौरान खुली होती हैं। स्केल बार = 2 मिमी.(बी)U2OS कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि मनका-से घटकों के साथ भरी हुई(ए)लेकिन कठोर दोहन और बहुत सारे मोतियों के साथ । लाल तीर अतिरिक्त कांच के मोतियों की पहचान करता है। स्केल बार = 2 मिमी(C)U2OS कोशिकाओं को 14.4 केबीपी प्लाज्मिड स्मफ्लैग-केडीएम5बी-15xBoxB-24xMs2 के 1.5 माइक्रोग्राम के साथ लोड किया गया था, Cy3 के 0.5 माइक्रोन-कंजूस एंटी-फ्लैग फैब (ग्रीन), 130 एनजी हेलोटैग-एमसीपी (मैजेंटा) में 8 माइक्रोन ऑफेडिंग समाधान। इमेजिंग से पहले सीधे, हेलोटैग को JF646-HaloLigand के साथ दाग दिया गया था। रिपोर्टर प्लाज्मिड से लिखित mRNA के MS2 स्टेम-लूप एमसीपी (मैजेंटा स्पॉट) द्वारा लेबल किए गए हैं, और फ्लैग-टैग किए गए अनुवादित रिपोर्टर प्रोटीन को एंटी-फ्लैग फैब (एमआरएनए के लिए ग्रीन कोलोकैलाइजेशन) द्वारा लेबल किया गया है। परिपक्व फैब-लेबल प्रोटीन नाभिक के लिए स्थानीयकरण करता है। मनका लोडिंग के बाद इस सेल को 4-15 घंटे इमेज किया गया था। पीले तीर कोशिका विभाजन के बाद कोशिका नाभिक से पहले और नाभिक की पहचान करते हैं। स्केल बार = 5 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: MCP = MS2 कोट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:मनका लोडिंग प्रोटोकॉल के सेल प्रकार लोडिंग सामग्री में भिन्नता। (A-B) आरपीई1(ए)और हेला(बी)कोशिकाओं को लोडिंग समाधान के 4 माइक्रोन में परमाणु फैब प्रोटीन (एंटी-आरएनएपीआई-सेरीन 5-फॉस्फोरिलेशन) के 1.5 माइक्रोग्राम के साथ मनका-लोड किया गया था। प्रत्येक कोशिका के नाभिक (एनयूसी) और साइटोप्लाज्म (साइटो) चिह्नित किए जाते हैं। कोशिकाओं को मनका-भरी हुई होने के बाद 6 घंटे की छवि दी गई थी। स्केल बार = 5 माइक्रोन.(C)मानव U2OS कोशिकाओं को मनका-दोनों Cy5-RNA 9mer (मजेंटा) और Cy3-DNA 28mer (ग्रीन) ओलिगोस, प्रत्येक के 10 picomoles, bead loading समाधान के 4 μL में के साथ भरी हुई थे । कोशिकाओं को मनका-भरी होने के बाद 4 घंटे की छवि दी गई थी। सभी कोशिका नाभिक को एक धराशायी रेखा द्वारा हाइलाइट किया जाता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। संक्षिप्त: आरएनएपीआई = आरएनए पॉलीमरेज II। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल लाइन सेल प्रकार मनका लोडिंग प्रभावशीलता नोट्स/रेफरेंस
स्टेम सेल (मानव) भ्रूणीय स्टेम सेल कठिन * कई कोशिकाओं को मनका लोडिंग के दौरान छील अगर जिलेटिन लेपित प्लेटों पर चढ़ाया
हेक 293 मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाएं कठिन * मनका लोडिंग से पहले इमेजिंग चैंबर सतह के लिए एक जेल मैट्रिक्स नीचे रखना की जरूरत है। पहली बार में मनका लोड होने पर धीरे-धीरे टैप करें।
न्यूरॉन्स (चूहा) प्राथमिक भ्रूण न्यूरॉन्स (ई-18), अलग बहुत अक्षम * इस मानक मनका लोडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूरॉन्स का कुशल मनका लोडिंग नहीं देखा गया था। यह न्यूरॉन्स की गैर-अनुयायी प्रकृति या तंत्रिका प्रक्रियाओं को परिणामी क्षति के कारण हो सकता है।
एमडीकेके (कैनाइन) मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी कोशिकाएं मैकनील और वार्डर (1987)देखें 14 * कम दक्षता वाला मनका लोडिंग14
U2OS (मानव) ऑस्टियोसारकोमा मानक मनका लोडिंग प्रोटोकॉल
हेला (मानव) सर्वाइकल कैंसर मानक मनका लोडिंग प्रोटोकॉल
RPE1 (मानव) एपिथेलियल कोशिकाओं को hTERT के साथ अमर मानक मनका लोडिंग प्रोटोकॉल
एचएफएफ (मानव) प्राथमिक चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट देखें Besteiro एट अल . (२००९)31  *31 टैप करने के बजाय झुकाव का संशोधित प्रोटोकॉल
BALB/c 3T3, NIH 3T3, और स्विस 3T3 (माउस) भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट गिलमोर और रोमर (१९९६)३२,इमर्सन एट अल ( २०१४)३३ और मैकनील और वार्डर (१९८७)14 देखें * 425-600 माइक्रोन ग्लास मोती की रिपोर्ट32
* प्रयुक्त 200-300 माइक्रोन ग्लास मोती33
* 75 माइक्रोन ग्लास मोतियों ने 400 माइक्रोन14 की तुलना में बेहतर परिणाम दिए
डीएम (भारतीय मुंतजाक) त्वचा फाइब्रोब्लास्ट देखें मैंडर्स, किमुरा, और कुक (१९९९)३४
चो (हम्सटर) एपिथेलियल जैसी अंडाशय कोशिकाएं मेमदुला और बेलमोंट (2003)35 देखें * प्रयुक्त 425-600 माइक्रोन ग्लास मोती35
बीएई (गोजातीय) गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएईसी-11) मैकनील और वार्डर (1987)देखें 14 * 75 माइक्रोन ग्लास मोतियों ने 400 माइक्रोन14 की तुलना में बेहतर परिणाम दिए
पीटीके-2 (पोटोमस ट्राइडाकलीलिस) एपिथेलियल किडनी कोशिकाएं मैकनील और वार्डर (1987)देखें 14 * 75 माइक्रोन ग्लास मोतियों ने 400 माइक्रोन14 की तुलना में बेहतर परिणाम दिए
HUVEC (मानव) गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाएं गिलमोर और रोमर (1996)32 देखें * प्रयुक्त 425-600 माइक्रोन ग्लास मोती32
J774 और J774.2 (माउस) मोनोसाइट मैक्रोफेज कोशिकाएं बेकर एट अल देखें । (२००५)३६ और मैकनील और वार्डर (१९८७)14 * कोमल आंदोलन (दोहन के बजाय) और 425-600 माइक्रोन ग्लास मोती36
एमएस-5 (माउस) बोन मैरो स्ट्रोमल कोशिकाएं देखें मोलनार एट अल. (२००३)३७
WPE1-NB11 (मानव) प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाएं गिलमोर और रोमर (1996)32 देखें और * प्रयुक्त 425-600 माइक्रोन ग्लास मोती32
इमर्सन एट अल . (२०१४)३३ * प्रयुक्त 200-300 माइक्रोन ग्लास मोती33

तालिका 1: विभिन्न सेल लाइनों में मनका लोडिंग। सेल लाइनों के लिए जो अभी तक इस प्रयोगशाला में मनका-लोड नहीं किया गया है, प्रोटोकॉल में भिन्नता पर संदर्भ और नोट प्रदान किए जाते हैं।

पूरक वीडियो 1: कोशिका विभाजन के दौर से गुजर एक मनका-भरी हुई सेल का उदाहरण। U2OS कोशिकाओं को 14.4 केबीपी प्लाज्मिड स्मफ्लैग-केडीएम5बी-15xBoxB-24xMS2, Cy3-conjugated एंटी-फ्लैग फैब (ग्रीन), 130 एनजी हेलोटैग-एमसीपी (मैगेंटा) के 1.5 माइक्रोग्राम के साथ लोड किया गया था। इमेजिंग से पहले सीधे, हेलोटैग को JF646-HaloLigand के साथ दाग दिया गया था। रिपोर्टर प्लाज्मिड से लिखित mRNA के MS2 स्टेम-लूप एमसीपी (मैजेंटा स्पॉट) द्वारा लेबल किए गए हैं, और फ्लैग-टैग किए गए अनुवादित रिपोर्टर प्रोटीन को एंटी-फ्लैग फैब (एमआरएनए के लिए ग्रीन कोलोकैलाइजेशन) के माध्यम से लेबल किया गया है। परिपक्व फैब-लेबल प्रोटीन नाभिक के लिए स्थानीयकरण करता है। मनका लोडिंग के बाद इस सेल को 4-15 घंटे इमेज किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: MCP = MS2 कोट प्रोटीन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित मनका लोडिंग तकनीक मैक्रोमॉलिक्यूल्स और अन्य कणों को अनुयायी कोशिकाओं में पेश करने के लिए एक लागत प्रभावी और समय-कुशल विधि है। इस बहुमुखी प्रक्रिया में प्रोटीन(चित्रा 2A)15,16, 26,27,प्रोटीन और प्लाज्मिड्स (चित्र 2बी, सी)22,25,आरएनए(चित्रा 4 सी),100 और 250 एनएम पॉलीस्टीरिन मोती (व्यक्तिगत पत्राचार),सिंथेटिक रंग39 या क्वांटम34, 40का संयोजन लोड किया जा सकताहै। . मनका लोडिंग में अन्य प्रकार के झिल्ली-अभेद्य कणों को भी लोड करने की क्षमता हो सकती है। इसका सबसे अधिक बार उपयोग किया जाने वाला एप्लिकेशन एंटीओजेनस एपिटोप्स को लक्षित करने के लिए एंटीबॉडी या फैब्स लोड करने के लिए है, जैसे कि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम), लाइव कोशिकाओं में। पीटीएम जैसे लक्ष्य अक्सर स्थापित पीटीएम-विशिष्ट, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच41, 42के बिना जीवित कोशिकाओं में लेबल करना मुश्किलहोताहै। इसके विपरीत, मनका लोडिंग एक साथ कई readouts की निगरानी के लिए एक ही सेल में एक साथ जांच, संवाददाताओं, या अन्य आणविक उपकरणों के कई प्रकार शुरू कर सकते हैं। हम आशा करते हैं कि मनका लोडिंग विभिन्न प्रकार के मैक्रोमॉलिक्यूल्स या कणों को लोड करने के लिए एक उपयोगी तकनीक होगी।

मनका लोडिंग का एक प्रमुख लाभ कम लागत है: प्रत्येक प्रयोग की लागत 0.01 अमरीकी डॉलर से कम है। एक मनका लोडर उपकरण आसानी से कुल ~ $ 150 में लागत वाली सस्ती सामग्रियों का उपयोग करके बनाया जा सकता है, जो किसी भी अन्य सेल-लोडिंग विधि की तुलना में काफी कम महंगा है। एक मनका लोडर उपकरण की लागत को एक प्लास्टिक के साथ पुन: प्रयोज्य धातु कक्ष की जगह से $ 10 के तहत कम किया जा सकता है। इसके लिए, या तो 35 मिमी कक्ष में एक छेद ड्रिल करें या 35 मिमी ग्लास-बॉटम कक्ष से ग्लास को हटा दें, फिर टेप के साथ जगह में जाल को सुरक्षित रूप से जकड़ें। एक उपकरण के बदले में, मनका लोडिंग भी एक व्यापक बोर १० μL पिपेट टिप का उपयोग कर के लिए स्कूप और कोशिकाओं पर मोती छिड़क प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि इस बदलाव यह मुश्किल कोशिकाओं पर मोतियों की एक मोनोलेयर छिड़क (चरण ४.६) बनाता है ।

मनका लोडिंग का एक और लाभ यह है कि कोशिकाएं सामान्य समग्र आकृति विज्ञान को बनाए रख सकती हैं, तेजी से ठीक हो सकती हैं, और कम से कम U2OS, RPE1 और HeLa कोशिकाओं के लिए यहां अध्ययन की गई और अन्य सेल लाइनों के लिए कहीं और अध्ययन किया जासकता है (चित्र 3; चित्रा 4ए,बी; पूरक वीडियो 1; और तालिका 1)31. मनका लोडिंग के दौरान, कोशिकाओं को शारीरिक तनाव से गुजरना पड़ता है और कभी-कभी उखाड़ फेंकना और छीलना (~ 5% कोशिकाएं इष्टतम परिस्थितियों में छीलती हैं, लेकिन अधिक सेल हानि हो सकती है यदि मोतियों की लोडिंग बहुत जबरदस्ती की जाती है या बहुत सारे ग्लास मोती कोशिकाओं के ऊपर लोड किए जाते हैं, जैसा कि चित्र 3 बीमें दर्शाया गया है)। हालांकि, कवरस्लिप से जुड़ी रहने वाली मनका-लोडेड कोशिकाएं आमतौर पर स्वस्थ दिखाई देती हैं और मनका लोडिंग(चित्र 3 ए)के बाद 30 मिनट के रूप में इमेज की जा सकती हैं। हम आम तौर पर कोशिकाओं को 30-मिनट की वसूली अवधि की अनुमति देते हैं, लेकिन आशा करते हैं कि इमेजिंग जितनी जल्दी पोस्ट-मनका लोडिंग संभव है।

इस तकनीक की एक बड़ी खामी यह है कि कोशिकाओं को लोडिंग के दौरान मामूली शारीरिक तनाव को सहन करने में सक्षम होने की जरूरत है और कवरस्लिप के लिए सुरक्षित रूप से पालन करते रहते हैं। खराब/गैर-अनुयायी कोशिका रेखाएं या कोटेड प्लेटों (जैसे, एचईके और स्टेम सेल) पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं अक्सर मनका लोडिंग के दौरान कोमल दोहन पर अलग होती हैं । इसके अलावा, अनुभव से पता चला है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स मनका लोडिंग के लिए बहुत संवेदनशील हैं।

मनका लोडिंग एकल कोशिका या एकल अणु प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है। हमारे अनुभव में, मनका लोडिंग में लगभग 20-40% प्रोटीन लोडिंग दक्षता है, और ~ 20% मनका-लोडेड कोशिकाओं ने भी सह-लोडेड प्लाज्मिड(चित्रा 2 ए,बी)व्यक्त किया है। इस प्रकार, मनका लोडिंग प्लाज्मिड प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कम कुशल हो सकता है क्योंकि प्लाज्मिड को न केवल कोशिकाओं में प्रवेश करना चाहिए बल्कि व्यक्त किया जाना चाहिए (जिसमें अन्य बातों के अलावा, परमाणु आयात, प्रतिलेखन और अनुवाद शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक अभिव्यक्ति दक्षता को कम कर सकता है)। मनका-भरी हुई प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की कम दक्षता को वैकल्पिक ट्रांसफैक्शन प्रोटोकॉल, जैसे लिपोफेक्शन का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, मनका लोड करने से पहले प्रोटीन लोड करना या16,27की जांच करता है। इसके अतिरिक्त, मनका लोडिंग से पहले 30 मिनट के लिए इष्टतम मीडिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग प्लास्मिड अभिव्यक्ति की सहायता कर सकता है। कम प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के कारण, मनका लोडिंग का उपयोग अक्सर इस प्रयोगशाला में लिपोफेक्शन-आधारित ट्रांसफैक्शन के विकल्प के रूप में नहीं किया जाता है। एकमात्र अपवाद यह है कि जब फैब जैसे शुद्ध प्रोटीन को सह-लोड किया जाना है, जिस स्थिति में एक ही समय में प्रोटीन और प्लाज्मिड को मनका-लोड करना काफी सुविधाजनक है। इसके अलावा, उन कोशिकाओं के लिए जो अनुत्तरदायी या लिपिशोधन के लिए असहिष्णु हैं, मनका लोडिंग एक वैकल्पिक, हालांकि कम दक्षता, क्षणिक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए विधि प्रदान कर सकती है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल को बेहतर बनाने और विकसित करने में मदद करने वाली असंख्य बातचीत के लिए स्टैसेविच लैब के सदस्यों के आभारी हैं। विशेष रूप से, डॉ लिंडा Forero और डॉ फिल फॉक्स मनका लोडिंग विभिन्न सेल प्रकार पर सलाह के लिए। हम अपने ग्लास मनका लोडिंग प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए डॉ योको हयाशी-ताकानाका, डॉ युको सातो और डॉ हिरोशी किमुरा को ईमानदारी से धन्यवाद देना चाहते हैं । हम डॉ अशोक प्रसाद और डॉ डिएगो क्राफ के बहुत आभारी हैं कि वे कोशिकाओं में अकार्बनिक कणों को पेश करने के लिए अपने मनका लोडिंग प्रोटोकॉल को उदारतापूर्वक साझा करते हैं । हम डॉ ट्रैइज सैंडर्स, क्रेग मार्शल, और डॉ थॉमस सैंटएंजेलो के लिए आभारी हैं उदारता से अपने लेबल आरएनए अभिकर्ण साझा करने के लिए । ए एलके, एमएनएस, सीएसी, जीजी और टीजेएस को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R35GM119728 और नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ) कैरियर ग्रांट एमसीबी-1845761, दोनों टीजेएस के लिए समर्थित थे। सीएसी को एनएसएफ एनआरटी अवार्ड डीजेई-1450032 का भी समर्थन मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm cell culture dishes VWR 82050-916 Use to culture cells
35 mm cell culture dishes Falcon 353001 Use to construct bead loader
Attofluor Cell Chamber Thermo Fisher Scientific A7816 Use to construct the custom bead loader
DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960069 Use in general cell culture
Drierite Indicating Absorbents Thermo Fisher Scientific 07-578-3B Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets
Fetal Bovine Serum Atlas Biologics F-0050-A Use in general cell culture and as a supplement before bead loading
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* Millipore Sigma G4649 Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Seed cells onto these chambers for imaging
L-Glutamine-200 mM Thermo Fisher Scientific 25030081 Use to make DMEM + media
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step)
Parafilm VWR 52858-032 waxy film used to construct bead loader
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 Use to make DMEM + media
Phenol-free DMEM Thermo Fisher Scientific 31053036 Use on cells before imaging
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9625 Working stock of sterile 1X PBS
Sodium Hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific S318-500 Use 2 M solution to wash glass beads
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening Spectrum Labs 148496 Use to construct bead loader
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300062 Use in general cell culture

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जीव विज्ञान अंक 172
मनका लोडिंग प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड अनुयायी मानव कोशिकाओं में
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Cialek, C. A., Galindo, G., Koch, A. L., Saxton, M. N., Stasevich, T. J. Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells. J. Vis. Exp. (172), e62559, doi:10.3791/62559 (2021).

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