Summary
Бисерная нагрузка вводит белки, плазмиды и частицы в адгезивные клетки млекопитающих. Этот метод клеточной загрузки является недорогим, быстрым и существенно не влияет на здоровье клеток. Он лучше всего подходит для визуализации живых клеток.
Abstract
Многие эксперименты по визуализации живых клеток используют экзогенные частицы (например, пептиды, антитела, шарики) для маркировки или функционирования в клетках. Однако введение белков в клетку через ее мембрану затруднено. Ограниченный выбор современных методов борется с низкой эффективностью, требует дорогостоящего и технически сложного оборудования или функционирует в узких параметрах. Здесь мы описываем относительно простую и экономически эффективную технику загрузки ДНК, РНК и белков в живые клетки человека. Нагрузка на шарики вызывает временное механическое разрушение клеточной мембраны, позволяя макромолекулям проникать в адгезивные, живые клетки млекопитающих. При цене менее 0,01 доллара США за эксперимент загрузка шариков является наименее дорогим доступным методом загрузки ячеек. Кроме того, нагрузка на шарики существенно не напрягает клетки и не влияет на их жизнеспособность или пролиферацию. В этой рукописи описываются этапы процедуры загрузки бусин, адаптации, вариации и технические ограничения. Эта методология особенно подходит для визуализации живых клеток, но обеспечивает практическое решение для других применений, требующих введения белков, бусин, РНК или плазмид в живые, адгезивные клетки млекопитающих.
Introduction
Загрузка макромолекул в клетки млекопитающих требует методологии, которая позволяет им пересекать плазматическую мембрану клетки1. Несколько способов могут вводить плазмиды в клетки млекопитающих посредством трансфекции, включая липосомальную трансфекцию2 и диэтиламиноэтил-декстрановую трансфекцию3. Однако способы загрузки белков или мембранно-непроницаемых частиц в клетки более ограничены.
Несколько методов обошли это трудное препятствие, используя различные стратегии. Во-первых, микроинъекция доставляет частицы через микропипетку в живые клетки под микроскопом4. Хотя, возможно, это самый контролируемый и наименее инвазивный метод, этот метод имеет относительно низкую пропускную способность, потому что клетки должны быть загружены одна за одной. Кроме того, микроинъекция требует специализированного оборудования и является технически сложной.
Во-вторых, электропорация — это способ электроинъендуции белков в клетки посредством вызванного напряжением мембранного разрушения5,6,7. Однако этот метод опять же требует специализированного, дорогостоящего оборудования, а шок может вызвать клеточный стресс и смертность. Кроме того, клетки должны быть трипсинизированы перед электропорацией и впоследствии повторно покрыты, ограничивая временные рамки, в которые клетки могут быть исследованы после электропорации.
В-третьих, клеточные мембраны могут быть химически модифицированы для временной, обратимой пермеабилизации8,9. Загрузка стрептолизин-О вводит эндотоксин в клеточные мембраны, который образует временные поры, позволяя экзогенным мембранно-непроницаемым частицам, включая белки и плазмиды ДНК, проникать в клетки10. После 2-х ч восстановления около половины клеток восстанавливают эти поры и останавливают интернализацию частиц из раствора. Однако этот метод требует длительного времени восстановления и несовместим с типами клеток, которые не переносят эндотоксины.
В-четвертых, механическое разрушение нагружает частицы в клетки посредством физического возмущения клеточной мембраны11. Это может быть сделано несколькими способами, включая царапины, соскобливание и прокатку бусин поверх ячеек12,13. Еще в 1987 году шарики использовались для механической загрузки белков в клетки14. Совсем недавно метод загрузки шариков был оптимизирован и адаптирован за пределами белков, чтобы включить нагрузку плазмид и РНК, как описано здесь.
Загрузка бусин — это простой, недорогой и быстрый метод загрузки белка и плазмид в адгезивные клетки человека. Стеклянные шарики ненадолго закатывают поверх клеток, временно нарушая их клеточную мембрану. Это позволяет частицам в растворе проникать. Поскольку нагрузка на шарики имеет низкую эффективность, она лучше всего подходит для экспериментов с одномолекулярной или одноклеточной микроскопией. Нагрузка на шарики может вводить широкий спектр белков, включая фрагментированные антитела (Fab),15,16 очищенных белков, таких как scFvs,17 внутрител,18,19или белки оболочки мРНК, например, белок оболочки MS2 (MCP)20,21. Векторы экспрессии плазмид также могут быть добавлены к белковым раствору и нагружены бусинами одновременно22,23,24,25.
Помимо белков и плазмид, молекулы размером до 250 нм полистирольных шариков были введены в клетки посредством загрузки шариков (личное общение). Загрузка бусин невероятно недорогая, стоит менее 0,01 доллара США за эксперимент в материалах и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования. Стоимость еще больше снижается за счет минимизации количества зондов, используемых в эксперименте, поскольку загружаются только ячейки в центральной микроявли диаметром 14 мм камеры визуализации. Следует отметить, что ограниченная площадь загрузки означает, что загрузка шариков не идеальна для загрузки навалочных ячеек.
В этой рукописи представлен процесс загрузки бусин, в том числе то, как построить аппарат для загрузки бусин и провести эксперимент. Он показывает, что белки, РНК и ДНК могут быть загружены в различные типы клеток и что два разных, одновременно загруженных шариками белка имеют высококоррелированные клеточные концентрации и относительно низкую дисперсию. Также обсуждаются вариации в протоколе, основанные на типе клетки и загрузке белка, плазмиды или РНК. Хотя считается, что бусины перфорируют и разрушают клеточную мембрану, при надлежащем выполнении процесс загрузки шариков вытесняет только небольшое количество клеток из нижней части камеры визуализации. После короткого восстановительного периода клетки продолжают расти и делиться. Эта методология идеально подходит для экспериментов по микроскопии живых клеток, включая отслеживание одномолекулярных белков и РНК, обнаружение постпереводной модификации, наблюдение динамических клеточных механизмов или мониторинг субклеточной локализации15,16,22,26,27.
Protocol
1. Очистите, стерилизуйте и высушите стеклянные шарики, чтобы избежать скопления и обеспечить равномерное распределение поверх ячеек.
- Стерилизуйте примерно 5 мл стеклянных шариков гидроксидом натрия (NaOH). Измерьте шарики в конической трубке 50 мл. Добавьте 25 мл 2 М NaOH и осторожно перемешайте с помощью шейкера или ротатора в течение 2 ч.
- Декант NaOH, сохранив как можно больше бусин. Если бусины находятся во суспензии, на короткое время покрутите трубку бусин в центрифуге (1 мин при ~1000 × г,комнатная температура).
- Тщательно вымойте шарики водой для клеточных культур до тех пор, пока рН не станет нейтральным (используйте тест-полоску pH на элюенте для подтверждения нейтрального рН). Декантную промывную воду каждый раз, как и раньше.
- Тщательно вымойте бусины 100% этанолом 2-3 раза. Декантация этанола каждый раз, как и раньше.
- Высушите бусины. Посыпьте бусины, чтобы сформировать тонкий слой внутри стерильного контейнера (например, чашки Петри 10 см). Оставив контейнер открытым, дайте бусинам высохнуть на воздухе в шкафу для биобезопасности на ночь. Убедитесь, что бусины полностью высохли, постукивая или осторожно встряхивая контейнер и проверяя, что бусины имеют песчаную текстуру без слипания или шелушения.
- УФ-стерилизуют сухие шарики в течение 15 мин.
2. Соберите аппарат погрузчика бусин.
- Закрепите участок сетки (полипропилен или эквивалентный материал, отверстия 105 мкм, чтобы шарики могли пройти через них), чтобы покрыть все отверстие камеры для крепления бусин либо лентой, либо зажимающей сетку между мужским и женским концами металлической многоразовой камеры визуализации(рисунок 1A).
- УФ-стерилизуют аппарат в течение 15 мин. Добавьте бусины к аппарату и плотно запечатайте его восковой пленкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы бусины были полностью чистыми и сухими на этом этапе. Они должны быть рыхлыми и выглядеть песчаными без комков. Если они не появляются, повторно вымойте и полностью высушите бусины. - Храните аппарат в герметичном сухом контейнере, высушиваемом силикагелем или другой адсорбцируем. Если бусины станут влажными, что будет видно при слипание бисера, тщательно высушите и стерилизуйте бусину и замените ее свежим бисером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти меры предосторожности предотвратят рост плесени или бактерий на бусинах или вокруг них в загрузчике бусин. Аппарат погрузчика бисера может быть изготовлен по-разному. Подробности см. в обсуждении.
3. Подготовьте камеры со стеклянным дном из адгезивных ячеек.
- Посеять клетки млекопитающих в камеру со стеклянным дном толщиной 35 мм. Убедитесь, что ячейки примерно на 80% сливаются во время загрузки шарика. (См. Таблицу 1 для получения дополнительной информации о различных типах клеток и заметок об эффективности загрузки шариков в различных типах клеток.)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть посеяны только в микрояди в центре камеры, чтобы сохранить количество используемых клеток. - Инкубировать клетки в нормальных условиях до тех пор, пока они полностью не прилиптут к стеклу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы плотность клеток была достаточно высокой и чтобы ячейки надежно прилипли к стеклу. Если эти требования не будут выполнены, ячейки, скорее всего, отклеятся во время загрузки бусин. Временная шкала между посевом клеток и загрузкой шариков может быть удлинена для обеспечения надлежащей адгезии и слияния клеток.
4. Шариковые загрузочные ячейки
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости кратковременно промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), а затем добавить 2 мл оптимальной среды. Инкубировать не менее 30 мин.
- Делают раствор из 3-8 мкл, содержащий нужные плазмиды, белок и/или частицы. Используйте ~ 1 мкг (0,1-1 пмоль) каждого типа плазмиды и ~ 0,5 мкг (0,01 нмоль) белка, в зависимости от экспериментальных требований. Используйте трубку с низким удержанием для белков, чтобы они не остались на стенках трубки. Доведите раствор до минимума 3 мкл с PBS и отрегулируйте объем раствора, чтобы покрыть всю площадь загружаемых ячеек (т. Е. Микровелл камеры, рисунок 1B).
- Тщательно перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз и/или щелкая трубкой. Кратковременно раскрутите раствор до дна трубки в настольном микрофуге.
- Перенесите бусинный загрузочный раствор и камеру клеток в тканевую культурную вытяжку. Выполните остальные шаги в тканевом культуре капюшона с использованием стерильной техники.
- Извлеките среду из клеток и временно храните ее в стерильной трубке. Осторожно аспирируйте всю среду по краям камеры, наклоните камеру примерно под углом 45° и удалите оставшуюся каплю среды в центральном микроумести. Во время удаления среды убедитесь, что кончик пипетки не касается стекла, что может привести к отслаиванию и потере клеток. Быстро переходите к следующему шагу, чтобы клетки не высыхли долго.
- Аккуратно пипетку выгружаем бусину раствором на стеклянный микрояг в центре камеры. Дополнительно: Инкубировать с мягким раскачивающимся в течение ~ 30 с, не давая камере полностью высохнуть.
- Аккуратно рассеивают монослой из стеклянных шариков поверх ячеек, предпочтительно с помощью аппарата для загрузки шариков(фиг.1А). Убедитесь, что шарики полностью покрывают ячейки в микроямне со стеклянным дном.
- Зажав камеру двумя пальцами, прижмите ее к поверхности капота, подняв ее ~ на 2 дюйма и плотно опустить. Используйте силу, примерно эквивалентную падению тарелки с этой высоты. Повторите в общей сложности ~10 касаний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что краны не очищают клетки по существу. Касание может быть оптимизировано для типа ячейки. Если ячейки плохо нагружаются, нажмите сильнее; однако, если много клеток отслаивается, постучите более легко. - Осторожно добавьте среду обратно в камеру, медленно пипетируя на пластиковую сторону камеры. Попробуйте аспирировать любые плавающие бусины, не нарушая клетки. Добавьте больше предварительно нагретых носителей на этом шаге, если было удалено слишком много. Инкубируют клетки в течение 0,5-2 ч в инкубаторе.
- УФ-стерилизуйте шариковый погрузчик в течение 15 мин, прежде чем вернуть его на хранение в условиях высыхания.
- Добавьте краситель (например, краситель DAPI или лиганд HaloTag, если это требуется экспериментом) в клетки в соответствии с рекомендуемым производителем протоколом.
- Промыть ячейки 3x средой перед визуализацией, чтобы удалить шарики и избыточные нагрузочные компоненты в растворе. Избегайте пипетки непосредственно на клетки, чтобы они не шелушилась.
5. Визуализация камер с бусинной нагрузкой
- Визуацируйте клетки сразу или по мере необходимости эксперимента. Используйте микроскоп, способный улавливать флуоресценцию (лазеры или монохроматический источник света). Убедитесь, что длины волн возбуждения соответствуют выбранному флуорофору или красителю (например, 488 нм длины волны для зеленого флуоресцентного белка (GFP)).
ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, нагруженные бисером, могут быть визуальзированы после восстановления клеток (уже через 30 минут после загрузки клеточных линий, описанных здесь). Экспрессия плазмиды занимает ≥2 ч в зависимости от векторных элементов выражения(рисунок 1Си дальнейшее объяснение в обсуждении). Визуализация камер с шариковой нагрузкой может быть выполнена на любом микроскопе, оснащенном соответствующими флуоресцентными источниками, связанными с нагруженными зондами, камерой, способной захватывать флуоресцентные изображения, такой как электронно-умножающее устройство с зарядовой связью (EMCCD) или научная комплементарная металлооксидная полупроводниковая (sCMOS) камера, а также инкубатор для контроля температуры, влажности и углекислого газа. Руководство по флуоресцентной микроскопии см. в 27.
Representative Results
Наиболее распространенным применением бисероплетения является введение одного или нескольких типов белка в адгезивные клетки человека. Чтобы проиллюстрировать это, клетки были загружены раствором Cy3- и Alexa488-конъюгированного белка Fab. Хотя не каждая клетка в микроявке была загружена бусинами, клетки, которые были загружены, почти всегда имели белки, меченые Cy3 и Alexa488 вместе(рисунок 2A). Согласно более ранней оценке, когда 0,5 микрограмма Fab, разбавленного в 4 микролитрах, нагружают бусинами29,как на рисунке 2A,каждая клетка загружается примерно 106 молекулами Fab.
Плазмидная ДНК, кодируя GFP (1 мкг плазмидной ДНК, 1,8 мкл раствора 557 нг/мкл) и 0,5 мкг Меченого Cy3 Fab, также вводили в клетки посредством бусинной нагрузки и впоследствии экспрессировали и визуализировали(Рисунок 2B). Флуоресценция GFP показала, что плазмида, кодировка GFP, не только загружается в клетки, но и экспрессируется. Таким образом, в одну и ту же клетку, шариковую нагрузку могут вводить белковый зонд (например, Cy3-меченый Fab) и репортерную плазмиду (например, GFP), как это выполнялось в этой лабораторииранее 22,23,24. Мы определили, что 40% клеток были загружены белком Fab, а 21% клеток с бусинчатой нагрузкой экспрессировали конагруженную плазмиду, как показано на репрезентативных полях зрения на рисунке 2B. Как правило, каждая камера загружена 1-2 мкг плазмиды, примерно такое же количество, как и липофекция.
Клетки с шариковой нагрузкой экспрессируют широко варьирующиеся уровни плазмид(рисунок 2C,D). Чтобы конкретно измерить это, мы использовали тест Fisher Ratio для сравнения распределения данных об интенсивности белка и плазмиды. Результаты показали, что, хотя белки 1 и 2 имели сходные распределения интенсивности (p = ~1), каждый белок имел значительно меньшее распределение, чем плазмида (p = 3,2e-6 и 1,8e-5). Хотя это может быть связано с изменчивостью того, сколько плазмид загружено на клетку, больший источник изменчивости может возникнуть из-за многих этапов, необходимых для экспрессии плазмид, которые, вероятно, будут сильно различаться между клетками, включая импорт в ядро клетки, транскрипцию и трансляцию. Напротив, уровни белков, нагруженных бисером, имели небольшую дисперсию между клетками, а уровни двух одновременно загруженных белков были сильно коррелированы друг с другом(рисунок 2D,E).
Экспрессия плазмид может наблюдаться уже через 2-4 ч после загрузки шарика, но может произойти позже в зависимости от того, когда получена оптимальная экспрессия плазмиды. Мы рекомендуем выполнить курс времени, чтобы определить наилучшее окно выражения для конкретной плазмиды, охватывающей 2-24 ч после загрузки шарика. Это может быть сделано в одной камере с длинными временными рамками визуализации или путем загрузки шариков и ошеломляющих нескольких камер. Клетки, нагруженные бисером, остаются адгезивными и достаточно здоровыми, чтобы расти и делиться. Нагруженные бусинами человеческие клетки U2OS были сфотированы непосредственно до, непосредственно после и через 24 часа после загрузки бусин. Правильная нагрузка на бусины почти не оказала заметного влияния на количество клеток или их морфологию, как показано на рисунке 3А (слева, посередине).
Напротив, плохая загрузка бусин со слишком большим количеством бусин и чрезмерной силой постукивания изображена на рисунке 3B. Это вызвало большую потерю клеток (большие участки покровного стекла без клеток и отделившённые, плавающие, расфокусированные клетки), плохую морфологию клеток (клетки, кажущиеся округлыми и плохо приклеенными) и скопления бусин, оставшихся на покрытом стекле после загрузки бисера. Хотя считается, что клетки подвергаются механическому повреждению во время загрузки шариков, клетки росли и размножались в правильно загруженной камере, о чем свидетельствует увеличение числа ячеек через 24 ч после загрузки шарика(рисунок 3A,справа). Влияние на жизнеспособность клеток может быть оценено с помощью различных анализов, таких как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), для сравнения шариковых клеток с имитацией нагруженных клеток30. Кроме того, эта и предыдущая работы показывают, что клетки, нагруженные шариками, подвергаются делению клеток(рисунок 3C и дополнительное видео 1),и на сроки митоза не влияет нагрузка на шарики31,что служит дополнительным доказательством устойчивого здоровья клеток после загрузки шариков.
Загрузка бусин является универсальной техникой, вмещающей в себя несколько адгезивных клеточных линий и различные макромолекулы. Здесь эта разновидность была продемонстрирована путем загрузки клеточных линий RPE1 и HeLa с Помощью Fab(рисунок 4A,B). В таблице 1 приведены дополнительные примеры загрузки бусин в различных клеточных линиях, в этой лаборатории и за ее пределами, и указаны некоторые нюансы различий между протоколами загрузки бусин из других лабораторий. Следует отметить, что диаметр стеклянных шариков, используемых для загрузки, сильно варьируется между лабораториями, хотя наиболее эффективная загрузка была найдена для небольших бусин диаметром 75 мкм в нескольких клеточных линиях14. Кроме того, эта лаборатория также начала загрузку РНК (данные не показаны). На рисунке 4C показана репрезентативная клетка U2OS, нагруженная Cy5-РНК 9mer и Cy3-ДНК 28mer вместе.
Рисунок 1:Устройство загрузки бусин, техника и временная шкала Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Нагрузка на шарики приводит к низкой изменчивости концентрации белка, но высокой изменчивости в экспрессии плазмид. (A)Ячейки были нагружены шариками по 0,5 мкг каждого из Alexa488-конъюгированных анти-H3K27 ацетиловых Fab (зеленый) и Cy3-конъюгированных анти-RNAPII-серин 5-фосфорилированных Fab (красный) в 4 мкл бусинчатого нагрузочного раствора. Клетки были окрашены DAPI (синий), а затем немедленно визуализировались вживую. Шкала батончиков = 20 мкм.(B)Клетки были загружены бисером 0,5 мкг белка Fab (Cy3-конъюгированный анти-RNAPII-серин 5-фосфорилированный белок, красный) и 1 мкг плазмиды, кодирующей суперпапку GFP-H2B (зеленый) в 4 мкл бусинчатого нагрузочного раствора. Через 24 ч клетки окрашивались в DAPI (синий цвет) и визуализировывались живыми. Шкала батончиков = 30 мкм.(C-E)Белок 1 (JF646-HaloLigand-меченый HaloTag-MCP), белок 2 (Cy3-конъюгированный анти-FLAG Fab) и плазмида, кодировка EGFP (λN-EGFP-LacZ), были загружены шариками вместе в клетки. Общая интенсивность в каждом флуоресцентном канале измеряли в пластыре 1,3 х 1,3 мкм в цитоплазме каждой клетки. N = 25 клеток. (C) Репрезентативные клетки, экспрессивающие плазмиду, нагруженную шариками, λN-EGFP-LacZ. Одинаковые условия и интенсивность визуализации использовались для всех клеток. Пятна представляют собой агрегаты экспрессированного белка. Шкала баров = 10 мкм. (D) Диаграмма показывает общую интенсивность каждой клетки белка 1, белка 2 или EGFP, экспрессируемого из плазмиды. Каждый канал был нормализован до медианы. Значения P с коррекцией Бонферрони были рассчитаны с помощью теста Fisher Ratio, чтобы определить, имеет ли распределение данных об интенсивности белка или плазмиды одинаковую изменчивость. Каждая точка представляет ячейку. (E)Общие интенсивности обоих белков, белка 1 и плазмиды, или белка 2 и плазмиды, строятся друг против друга. Отображаются вычисляемые значенияR2. Каждая точка представляет ячейку. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок; A.U. = произвольные единицы; MCP = белок оболочки MS2; RNAPII = РНК-полимераза II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Ячейки сбисероплетениями остаются адгезивными и достаточно здоровыми для роста и деления. (A)Ячейки U2OS были загружены бисером 0,5 мкг Cy3-конъюгированного анти-FLAG Fab в 4 мкл бусинного нагрузочного раствора. Ячейки были изображены непосредственно перед загрузкой бусин и через 24 часа после загрузки бисера. Оранжевые стрелки определяют области, где клетки отслаиваются во время загрузки бусин. Шкала стержней = 2 мм. (B) Репрезентативное изображение ячеек U2OS, загруженных компонентами из(A),но с резким постукиванием и слишком большим количеством бусин. Красная стрелка обозначает дополнительные стеклянные бусины. Масштабная планка = 2 мм.(C)ячейки U2OS были загружены 1,5 мкг плазмиды 14,4 кбит/с smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 мкг Cy3-сопряженного анти-FLAG Fab (зеленый), 130 нг HaloTag-MCP (пурпурный) в 8 мкл бусинчатого загрузочного раствора. Непосредственно перед визуализацией HaloTag был окрашен JF646-HaloLigand. Стволовые петли MS2 мРНК, транскрибируемые из репортерной плазмиды, помечены MCP (пурпурными пятнами), а помеченный FLAG переведенный репортерный белок помечен анти-FLAG Fab (зеленая колокализация в мРНК). Зрелый fab-меченый белок локализуется в ядре. Эта ячейка была сфотирована через 4-15 ч после загрузки бусины. Желтые стрелки идентифицируют ядро клетки до и ядра после деления клетки. Шкала стержней = 5 мкм. Аббревиатура: MCP = MS2 белок оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Вариации типа ячейки загрузочного материала протокола загрузки шарика. (А-Б) Клетки RPE1(A)и HeLa(B)нагружали шариками 1,5 мкг ядерного белка Fab (анти-RNAPII-Серин 5-фосфорилирование) в 4 мкл нагрузочного раствора. Отмечены ядро (nuc) каждой клетки и цитоплазма (cyto). Клетки были сфотированы через 6 ч после загрузки бисером. Шкала стержней = 5 мкм.(C)Человеческие клетки U2OS были загружены бусинами как Cy5-РНК 9mer (пурпурный), так и Cy3-ДНК 28мер (зеленый) олиго, по 10 пикомолей каждого, в 4 мкл раствора для загрузки бусин. Ячейки были сфотированы через 4 ч после загрузки бусинами. Все ядра клеток выделены пунктирной линией. Шкала стержней = 5 мкм. Сокращения: RNAPII = РНК-полимераза II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Клеточная линия | Тип ячейки | Эффективность загрузки бусин | Примечания/справка |
| Стволовые клетки (человеческие) | Эмбриональные стволовые клетки | Трудный | * Многие клетки отслаиваются во время загрузки шарика, если они покрыты желатиновым покрытием пластинами |
| ХЕК 293 | Эмбриональные клетки почек человека | Трудный | * Необходимо уложить гелевую матрицу на поверхность камеры визуализации перед загрузкой шарика. Осторожно нажимайте при загрузке бусины. |
| Нейроны (крысы) | Первичные эмбриональные нейроны (e-18), диссоциированные | Очень неэффективно | * Эффективная загрузка нейронов бусинами не наблюдалась с использованием этого стандартного протокола загрузки бусин. Это может быть связано с неприлипчивой природой нейронов или с последующим повреждением нейронных процессов. |
| MDCK (сока) | Клетки почек собачки Мадина-Дарби | См. Макнил и Уордер (1987)14 | * Низкоэффективная загрузка бусин14 |
| U2OS (человек) | Остеосаркома | Стандартный протокол загрузки шариков | |
| Хела (человек) | Рак шейки матки | Стандартный протокол загрузки шариков | |
| RPE1 (человек) | Эпителиальные клетки, увековеченные hTERT | Стандартный протокол загрузки шариков | |
| HFF (человек) | Первичные фибробласты кскини | См. Besteiro et al. (2009)31 | * Изменен протокол наклона вместо нажатия31 |
| BALB/c 3T3, NIH 3T3 и Swiss 3T3 (мышь) | Эмбриональные фибробласты | Гилмор и Ромер (1996)32,Эмерсон и др. (2014)33 и Макнил и Уордер (1987)14 | * 425–600 мкм стеклянных шариков сообщилио 32 |
| *Использованные стеклянные бусины 200–300 мкм33 | |||
| * Стеклянные бусины 75 мкм дали лучшие результаты, чем 400 мкм14 | |||
| DM (индийский мунтжак) | Фибробласты кожи | См. Мандерс, Кимура и Кук (1999)34 | |
| ЧО (хомяк) | Эпителиоподобные клетки яичники | См. Мемедула и Бельмонт (2003)35 | *Б/у 425–600 мкм стеклянные шарики35 |
| BAE (бык) | Эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого голова (BAEC-11) | См. Макнил и Уордер (1987)14 | * Стеклянные бусины 75 мкм дали лучшие результаты, чем 400 мкм14 |
| ПтК-2 (Потомус тридаклилис) | Эпителиальные клетки почек | См. Макнил и Уордер (1987)14 | * Стеклянные бусины 75 мкм дали лучшие результаты, чем 400 мкм14 |
| ХУВЕК (человек) | Эндотелиальные клетки пупочных вен | Гилмор и Ромер (1996)32 | *Использованные стеклянные бусины 425–600 мкм32 |
| J774 и J774.2 (мышь) | клетки моноцитарных макрофагов | Becker et al. (2005)36 и McNeil and Warder (1987)14 | * Мягкое перемешивание (вместо постукивания) и стеклянные шарики 425–600 мкм36 |
| MS-5 (мышь) | стромальные клетки костного мозга | Molenaar et al. (2003)37 | |
| WPE1-NB11 (человек) | эпителиальные клетки простаты | Гилмор и Ромер (1996)32 и | *Использованные стеклянные бусины 425–600 мкм32 |
| Эмерсон и др. (2014)33 | *Использованные стеклянные бусины 200–300 мкм33 |
Таблица 1: Загрузка бусин в различных клеточных линиях. Для клеточных линий, которые еще не были загружены шариками в этой лаборатории, приводятся ссылки и примечания об изменениях в протоколе.
Дополнительное видео 1: Пример ячейки, нагруженной шариками, подвергающейся делению клеток. Ячейки U2OS были загружены 1,5 мкг плазмиды 14,4 кбит/с smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 мкг Cy3-конъюгированного анти-FLAG Fab (зеленый), 130 нг HaloTag-MCP (пурпурный) в 8 мкл бусинчатого нагрузочного раствора. Непосредственно перед визуализацией HaloTag был окрашен JF646-HaloLigand. Стволовые петли MS2 мРНК, транскрибируемой из репортерной плазмиды, помечены MCP (пурпурными пятнами), а помеченный FLAG транслированный репортерный белок маркируется через anti-FLAG Fab (зеленая колокализация в мРНК). Зрелый fab-меченый белок локализуется в ядре. Эта ячейка была сфотирована через 4-15 ч после загрузки бусины. Шкала шкалы = 10 мкм. Аббревиатура: MCP = MS2 белок оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Описанная здесь техника загрузки шариков является экономически эффективным и эффективным по времени методом введения макромолекул и других частиц в адгезивные ячейки. Этот универсальный процесс может загружать белок(Рисунок 2А)15,16,26,27,комбинацию белка и плазмид(Рисунок 2B,C)22,25,РНК(Рисунок 4C),100 и 250 нм полистирольных шариков (личное соответствие), синтетические красители39 или квантовыеточки 34,40 . Нагрузка на шарики может иметь возможность загружать и другие типы мембранопроницаемых частиц. Его наиболее часто используемое применение заключается в загрузке антител или Fabs для нацеливания на эндогенные эпитопы, такие как постпереходные модификации (PTM), в живые клетки. Мишени, такие как PTM, часто трудно маркировать в живых клетках без установленных PTM-специфических, генетически закодированных зондов41,42. Напротив, загрузка шариков может вводить несколько типов зондов, репортеров или других молекулярных инструментов вместе в одну ячейку для мониторинга нескольких считывания одновременно. Мы ожидаем, что загрузка шариков будет полезным методом для загрузки различных макромолекул или частиц.
Основным преимуществом загрузки бисером является низкая стоимость: каждый эксперимент стоит менее 0,01 USD. Аппарат-погрузчик для бисера может быть легко изготовлен с использованием недорогих материалов общей стоимостью ~ 150 долларов США, что значительно дешевле, чем любой другой метод загрузки ячеек. Стоимость аппарата погрузчика для бисера может быть дополнительно снижена до менее чем 10 долларов США путем замены многоразовой металлической камеры на пластиковую. Для этого либо просверлите отверстие в камере 35 мм, либо извлеките стекло из камеры со стеклянным дном 35 мм, затем надежно закрепите сетку на месте скотчем. Вместо устройства загрузка бусин может быть выполнена даже с использованием широкопроходимого наконечника пипетки объемом 1000 мкл для зачерпывания и посыпания бусин на ячейки, хотя это изменение затрудняет посыпку монослоя бусин на ячейки (этап 4.6).
Еще одно преимущество бусиновой нагрузки заключается в том, что клетки могут сохранять нормальную общую морфологию, быстро восстанавливаться и продолжать расти и делиться, по крайней мере, для клеток U2OS, RPE1 и HeLa, изученных здесь, и для других клеточных линий, изученных в других местах(рисунок 3; Рисунок 4А,В; Дополнительное видео 1; и таблица 1)31. Во время загрузки бусин клетки подвергаются физическому стрессу, а иногда смещаются и отслаиваются (~ 5% клеток шелушения при оптимальных условиях, но большая потеря клеток может произойти, если нагрузка на бусин выполняется слишком сильно или слишком много стеклянных шариков загружается поверх ячеек, как показано на рисунке 3B). Тем не менее, ячейки, нагруженные бисером, которые остаются прикрепленными к крышке, обычно выглядят здоровыми и могут быть изображены уже через 30 минут после загрузки бусин(рисунок 3A). Как правило, мы допускаем 30-минутный период восстановления клеток, но ожидаем, что визуализация возможна раньше после загрузки шариков.
Основным недостатком этого метода является то, что клетки должны быть способны выдерживать незначительные физические нагрузки во время нагрузки и надежно прилипать к крышке. Плохо адгезивные клеточные линии или клетки, выращенные на пластинах с покрытием (например, HEK и стволовые клетки), часто отсоединяются при мягком постукивании во время загрузки шарика. Кроме того, опыт показал, что первичные нейроны слишком чувствительны к загрузке бусин.
Загрузка шариков лучше всего подходит для одноклеточных или одномолекулярных экспериментов. По нашему опыту, нагрузка на шарики имеет примерно 20-40% эффективности загрузки белка, и ~ 20% клеток, нагруженных бисером, также экспрессируют совместно загруженную плазмиду(Рисунок 2A,B). Таким образом, плазмиды, нагрузляемые шариками, могут быть менее эффективными для экспрессии белка, чем очищенные белки, загружающие шарики, потому что плазмиды должны не только проникать в клетки, но и экспрессиваться (что включает, среди прочего, ядерный импорт, транскрипцию и трансляцию, каждый из которых может снизить эффективность экспрессии). Низкая эффективность экспрессии плазмид с бисероплетением может быть обойдена с помощью альтернативных протоколов трансфекции, таких как липофекция, перед загрузкой бисера белков или зондов16,27. Кроме того, инкубирование клеток в оптимальной среде в течение 30 мин до загрузки шарика может способствовать экспрессии плазмиды. Из-за низкой экспрессии плазмидная нагрузка на шарики не часто использовалась в качестве альтернативы трансфекции на основе липофекции в этой лаборатории. Единственное исключение — когда очищенный белок, такой как Fab, должен быть совместно загружен, и в этом случае довольно удобно загружать белок и плазмиду одновременно. Более того, для клеток, которые не реагируют или не переносимы на липофекцию, нагрузка на шарики может обеспечить альтернативный, хотя и малоэффективный, метод экспрессии переходных плазмид.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарны сотрудникам лаборатории Стасевича за бесчисленные беседы, которые помогли усовершенствовать и развить этот протокол. В частности, д-р Линда Фореро и д-р Фил Фокс за советом по загрузке бисером различных типов клеток. Мы хотели бы искренне поблагодарить д-ра Йоко Хаяси-Таканаку, д-ра Юко Сато и д-ра Хироси Кимуру за то, что они поделились своим протоколом загрузки стеклянных бусин. Мы очень благодарны доктору Ашоку Прасаду и доктору Диего Крапфу за то, что они щедро поделились своими протоколами загрузки бусин для введения неорганических частиц в клетки. Мы благодарны доктору Трэвису Сандерсу, Крейгу Маршаллу и доктору Томасу Сантанджело за то, что они щедро поделились своим меченым РНК-реагентом. ALK, MNS, CAC, GG и TJS были поддержаны грантом Национального института здравоохранения (NIH) R35GM119728 и грантом КАРЬЕРЫ Национального научного фонда (NSF) MCB-1845761, оба для TJS. CAC также был поддержан наградой NSF NRT DGE-1450032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
| 35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
| Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
| Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
| Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
| L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
| Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
| Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
| Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |
References
- Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
- Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
- Potter, H.
- Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
- Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
- Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
- McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
- Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
- Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
- Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
- Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
- Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
- Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
- Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
- Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
- Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
- JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
- Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
- Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
- Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
- Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
- Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
- Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
- Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
- Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
- Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
- Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).
