Summary
Perlebelastning introducerer proteiner, plasmider og partikler i klæbende pattedyrceller. Denne cellebelastningsteknik er billig, hurtig og påvirker ikke cellesundheden væsentligt. Det er bedst egnet til live-celle billeddannelse.
Abstract
Mange live-celle imaging eksperimenter bruger udefrakommende partikler (f.eks peptider, antistoffer, perler) til at mærke eller fungere i celler. Det er imidlertid vanskeligt at introducere proteiner i en celle på tværs af membranen. Det begrænsede udvalg af nuværende metoder kæmper med lav effektivitet, kræver dyrt og teknisk krævende udstyr eller funktioner inden for snævre parametre. Her beskriver vi en relativt enkel og omkostningseffektiv teknik til at indlæse DNA, RNA og proteiner i levende menneskelige celler. Perlebelastning fremkalder en midlertidig mekanisk forstyrrelse af cellemembranen, så makromolekyler kan komme ind i klæbende, levende pattedyrceller. På mindre end 0,01 USD per eksperiment, perle lastning er den billigste celleindlæsning metode til rådighed. Desuden stresser perlebelastning ikke i væsentlig grad celler eller påvirker deres levedygtighed eller spredning. Dette manuskript beskriver trinene i perleindlæsningsproceduren, tilpasninger, variationer og tekniske begrænsninger. Denne metode er specielt velegnet til levende cellebilleddannelse, men giver en praktisk løsning til andre applikationer, der kræver indførelse af proteiner, perler, RNA eller plasmider i levende, klæbende pattedyrceller.
Introduction
Indlæsning af makromolekyler i pattedyrsceller kræver en metode, der gør det muligt for dem at krydse cellens plasmamembran1. Flere metoder kan indføre plasmider i pattedyrsceller gennem transfection, herunder fedtsomale transfection2 og diethylaminoethyl-dextran transfection3. Metoder til indlæsning af proteiner eller membran-uigennemtrængelige partikler i celler er dog mere begrænsede.
Flere teknikker har omgået denne vanskelige hurdle ved hjælp af forskellige strategier. For det første leverer mikroinjektion partikler gennem en mikropipette i levende celler under et mikroskop4. Mens velsagtens den mest kontrollerede og mindst invasive metode, denne teknik er relativt lav-throughput, fordi celler skal indlæses en efter en. Desuden kræver mikroinjection specialiseret udstyr og er teknisk krævende.
For det andet er elektroporation en måde at elektroinje proteiner i celler via spændingsinduceret membranforstyrrelse5,6,7. Men denne metode kræver igen specialiseret, dyrt udstyr, og chokket kan forårsage cellestress og dødelighed. Desuden skal cellerne trypsiniseres før elektroporering og efterfølgende omlægges, hvilket begrænser den tidsramme, hvor celler kan undersøges efter elektroporation.
For det tredje kan cellemembraner kemisk modificeres til midlertidig, reversibel permeabilisering8,9. Streptolysin-O-belastning indsætter en endotoksin i cellemembraner, som danner midlertidige porer, hvilket gør det muligt for udefrakommende membran-uigennemtrængelige partikler, herunder proteiner og DNA-plasmider, at komme ind i cellerne10. Efter en 2 timers genopretning reparerer omkring halvdelen af cellerne disse porer og stopper internalisering af partikler fra opløsningen. Denne teknik kræver dog lang restitutionstid og er uforenelig med celletyper, der ikke kan tolerere endotoksiner.
For det fjerde indlæser mekaniske forstyrrelser partikler i celler gennem fysisk forstyrrelse af cellemembranen11. Dette kan gøres på flere måder, herunder ridser, skrabning og rullende perler oven på cellerne12,13. Så tidligt som i 1987, perler er blevet brugt til at indlæse proteiner i celler mekanisk14. For nylig er perlebelastningsteknikken blevet optimeret og tilpasset ud over proteiner til at omfatte lastning af plasmid og RNA, som beskrevet her.
Perlebelastning er en nem, billig og hurtig metode til at indlæse protein og plasmid i klæbende menneskelige celler. Glasperler rulles kortvarigt oven på celler, der midlertidigt forstyrrer deres cellulære membran. Dette gør det muligt for partikler i opløsning at komme ind. Da perlebelastning har lav effektivitet, er den bedst egnet til enkeltmolekyle- eller enkeltcellede mikroskopiforsøg. Perlebelastning kan introducere en bred vifte af proteiner, herunder fragmenterede antistoffer (Fab),15,16 rensede proteiner som scFvs,17 intrabodies,18,19eller mRNA-pelsproteiner, f.eks. MS2-frakkeprotein (MCP)20,21. Plasmid-udtryksvektorer kan også tilsættes proteinopløsningen og perleindlæses samtidigt22,23,24,25.
Ud over proteiner og plasmider er molekyler så store som 250 nm polystyrenperler blevet introduceret i celler via perlebelastning (personlig kommunikation). Perlebelastning er utroligt billig, koster mindre end 0,01 USD pr. eksperiment i materialer og kræver ikke yderligere dyrt udstyr. Omkostningerne reduceres yderligere ved at minimere mængden af sonder, der anvendes pr. eksperiment, fordi kun cellerne i den centrale mikrowell med en billedbehandlingskammers centrale mikrorum med en diameter er indlæst. Det skal bemærkes, at det begrænsede lasteområde betyder, at perlebelastning ikke er ideel til bulkcellebelastning.
Dette manuskript præsenterer perlebelastningsprocessen, herunder hvordan man konstruerer perleindlæsningsapparatet og udfører et eksperiment. Det viser, at proteiner, RNA, og DNA kan indlæses i forskellige celletyper, og at to forskellige, samtidig perle-loaded proteiner har meget korrelerede cellulære koncentrationer og relativt lav varians. Også diskuteret er variationer i protokollen baseret på celletype og belastning af protein, plasmid, eller RNA. Selvom perler menes at perforere og forstyrre cellemembranen, fjerner perlebelastningsprocessen kun et lille antal celler fra bunden af billedkammeret, når den udføres korrekt. Efter en kort restitutionsperiode fortsætter cellerne med at vokse og opdele. Denne metode er ideel til live-celle mikroskopi eksperimenter, herunder enkelt-molekyle protein og RNA tracking, post-translationel modifikation detektion, observation af dynamiske cellulære mekanismer, eller subcellulære lokalisering overvågning15,16,22,26,27.
Protocol
1. Rengør, steriliser og tørre glasperler for at undgå klumpning og sørg for jævn spredning på toppen af cellerne.
- Steriliser ca. 5 ml glasperler i natriumhydroxid (NaOH). Mål perlerne i et 50 mL konisk rør. Tilsæt 25 mL på 2 M NaOH og bland forsigtigt ved hjælp af en shaker eller rotator i 2 timer.
- Dekanter NaOH, bevarer så mange perler som muligt. Hvis perlerne er i suspension, spinde ned røret af perler kort i en centrifuge (1 min ved ~ 1000 × g, stuetemperatur).
- Vask perlerne grundigt med cellekultur-grade vand, indtil pH er neutral (brug en pH-test strimmel på eluent at bekræfte en neutral pH). Dekanter vaskevandet hver gang, som før.
- Vask perlerne grundigt med 100% ethanol 2-3x. Dekanter ethanol hver gang, som før.
- Tør perlerne. Drys perlerne til at danne et tyndt lag inde i en steril beholder (såsom en 10 cm petriskål). Lad beholderen stå åben, lad perlerne lufttørre i et biosikkerhedskab natten over. Sørg for, at perlerne er helt tørre ved at trykke eller forsigtigt ryste beholderen og kontrollere, at perlerne har en sandet tekstur uden klumpning eller afskalning.
- UV-sterilisere de tørre perler i 15 min.
2. Saml perlelæsserapparatet.
- Fastgør et stykke net (polypropylen eller tilsvarende materiale, 105 μm åbninger, så perlerne kan passere igennem) for at dække hele åbningen af perlerne, der holder kammer med enten tape eller fastspænding af masken mellem han- og hunenderne i et metalgenbrugbart billedkammer (figur 1A).
- UV-sterilisere apparatet i 15 min. Tilsæt perlerne til apparatet og forsegle det tæt med voksagtig film.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at perlerne er helt rene og tørre på dette trin. De skal være løse og se sandede uden klumper ud. Hvis de ikke ser ud til det, skal du vaske og tørre perlerne helt. - Apparatet opbevares i en forseglet, tør beholder, der udtørres med silicagel eller andet tørremiddel. Hvis perlerne bliver fugtige, hvilket vil være tydeligt ved perleklumpning, grundigt tørt og sterilisere perlelæsseren og erstatte med friske perler.
BEMÆRK: Alle disse forholdsregler vil forhindre skimmel eller bakterier i at vokse på eller omkring perlerne i perlelæsseren. Perlelæsserapparatet kan laves på forskellige måder. Se detaljerne i diskussionen.
3. Forbered glasbundede kamre af klæbende celler.
- Frø klæbende pattedyrceller på et 35 mm glasbundet kammer. Sørg for, at cellerne er ca. 80% sammenflyttede på tidspunktet for perlebelastning. (Se tabel 1 for at få flere oplysninger om forskellige celletyper og noter om effektiviteten af perlebelastning i forskellige celletyper).
BEMÆRK: Celler kan kun sås i mikrobomen i midten af kammeret for at bevare, hvor mange celler der bruges. - Inkuber cellerne under normale forhold, indtil de er helt klæbende til glasset.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at celletætheden er høj nok, og at cellerne er forsvarligt klæbet til glasset. Hvis disse krav ikke er opfyldt, vil cellerne sandsynligvis skrælle af under perlebelastning. Tidslinjen mellem cellesåning og perlebelastning kan forlænges for at sikre korrekt vedhæftning og sammenløb.
4. Perle indlæser celler
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal cellerne vaskes kortvarigt med fosfatbufferet saltvand (PBS) og derefter tilsættes 2 gtL af det optimale medium. Inkuber i mindst 30 min.
- Der fremstilles en opløsning på 3-8 μL, der indeholder de ønskede plasmider, protein og/eller partikler. Brug ~1 μg (0,1-1 pmol) af hver type plasmid og ~0,5 μg (0,01 nmol) protein, afhængigt af forsøgskravene. Brug et rør med lav retention til proteiner, så de ikke efterlades på rørvæggene. Opløsningen bringes op på mindst 3 μL med PBS, og juster opløsningsvolumenet, så hele det celleområde, der skal lastes (dvs. kammerets mikrorum, figur 1B),belægges ).
- Bland opløsningen grundigt ved at pipetter op og ned og/eller svirpe røret. Drej kortvarigt opløsningen ned til bunden af røret i en bordplade mikrofuge.
- Overfør perlebelastningsopløsningen og cellernes kammer til en vævskulturhætte. Udfør de resterende trin i vævskulturhætten ved hjælp af steril teknik.
- Fjern mediet fra cellerne og opbevar det midlertidigt i et sterilt rør. Sy forsigtigt alle medier fra omkring kanterne af kammeret, og vippe kammeret i ca en 45 ° vinkel og fjerne den resterende dråbe af medier i midten mikrowell. Under medium fjernelse skal du sørge for at undgå at lade pipettespidsen røre glasset, hvilket kan resultere i celleskalning og tab. Flyt hurtigt til næste trin, så cellerne ikke er tørre for længe.
- Rør forsigtigt perlens lastningsopløsning på glasmikrowellen i midten af kammeret. Valgfrit: Inkuber med blid vuggende for ~ 30 s uden at lade kammeret tørre helt op.
- Spred forsigtigt en monolag af glasperler oven på cellerne, helst ved hjælp af et perlebelastningsapparat (Figur 1A). Sørg for, at perlerne dækker cellerne i glasbundens mikrorum helt.
- Klem kammeret med to fingre, tryk det mod hættens overflade ved at løfte det ~ 2 inches og bringe det ned fast. Brug en kraft, der omtrent svarer til at tabe fadet fra den højde. Gentag for i alt ~ 10 vandhaner.
BEMÆRK: Sørg for, at vandhanerne ikke skræller cellerne væsentligt. Trykning kan optimeres til celletypen. Hvis cellerne indlæses dårligt, skal du trykke hårdere; Men hvis mange celler skaller af, skal du trykke mere let. - Tilsæt forsigtigt medium tilbage i kammeret ved at pipetter langsomt på plastsiden af kammeret. Prøv at aspirere nogen flydende perler uden at forstyrre cellerne. Tilføj flere forvarmede medier på dette trin, hvis for meget blev fjernet. Inkuber cellerne i 0,5-2 timer i inkubatoren.
- UV-sterilisere perlelæsseren i 15 minutter, før den tages på lager under udtørrende forhold.
- Tilsæt farvestof (f.eks. DAPI eller HaloTag ligand plet, hvis det kræves af eksperimentet) til cellerne i henhold til producentens anbefalede protokol.
- Vask cellerne 3x med medium før billeddannelse for at fjerne perlerne og overskydende belastningskomponenter i opløsning. Undgå at pipettere direkte på cellerne for at forhindre dem i at skrælle.
5. Imaging de perle-loaded celler
- Billede cellerne med det samme, eller når det kræves af eksperimentet. Brug et mikroskop, der er i stand til at opfange fluorescens (lasere eller monokromatisk lyskilde). Sørg for, at excitationsbølgelængderne er egnede til det valgte fluorophore eller farvestof (f.eks. 488 nm bølgelængdelys til grønt fluorescensprotein (GFP)).
BEMÆRK: Perle-loaded proteiner kan afbildes, når cellerne er kommet sig (så snart 30 min post loading for de cellelinjer, der er beskrevet her). Plasmidudtrykket tager ≥2 timer afhængigt af udtryksvektorelementer (Figur 1Cog yderligere forklaring i diskussionen). Billeddannelse af perle-loaded celler kan udføres på ethvert mikroskop udstyret med passende fluorescerende kilder forbundet med lastede sonder, et kamera i stand til at indfange fluorescens billeder, såsom en elektron-multiplicere opladning-koblet enhed (EMCCD) eller videnskabelige komplementære metal-oxid halvleder (SCMOS) kamera, og en inkubator til at kontrollere temperatur, fugtighed og kuldioxid. For en guide til fluorescensmikroskopi henvises til 27.
Representative Results
Den mest almindelige anvendelse af perlebelastning er at introducere en eller flere typer protein i klæbende menneskelige celler. For at illustrere dette blev cellerne perle-fyldt med en opløsning af et Cy3- og Alexa488-konjugeret Fab-protein. Selv om ikke alle celler i mikrowell var perle-loaded, de celler, der blev indlæst næsten altid havde både Cy3- og Alexa488-mærket proteiner sammen (Figur 2A). Ifølge et tidligere skøn, når 0,5 mikrogram Fab fortyndet i 4 mikroliter er perle-loaded29, som i figur 2A, hver celle er fyldt med omkring 106 Fab molekyler.
Plasmid DNA-kodning GFP (1 μg plasmid DNA, 1,8 μL af en 557 ng/μL opløsning) og 0,5 μg Cy3-mærket Fab blev også indført i celler via perlebelastning og efterfølgende udtrykt og visualiseret (Figur 2B). GFP-fluorescensen indikerede, at GFP-kodningsplasmiden ikke kun blev indlæst i celler, men også udtrykt. Således kan perlebelastning i samme celle introducere en proteinsonde (f.eks. Cy3-mærket Fab) og reporter plasmid (f.eks. GFP), som udført i dette laboratorium tidligere22,23,24. Vi fastslog, at 40% af cellerne var perle-fyldt med Fab protein og 21% af perle-loaded celler udtrykte co-loaded plasmid, som vist i de repræsentative synsfelter i figur 2B. Typisk er hvert kammer fyldt med 1-2 μg plasmid, omtrent samme mængde som fedtsugning.
Perleinstallerede celler udtrykker meget forskellige niveauer af plasmider (Figur 2C, D). For specifikt at måle dette brugte vi Fisher Ratio-testen til at sammenligne fordelingen af protein- og plasmidintensitetsdata. Resultaterne viste, at selv om proteiner 1 og 2 havde lignende intensitetsfordelinger (p = ~ 1), havde hvert protein en betydeligt mindre fordeling end plasmiden (p = 3,2e-6 og 1,8e-5). Selv om dette kan skyldes variation i, hvor mange plasmider der indlæses pr. celle, kan den større kilde til variabilitet opstå fra de mange trin, der kræves for plasmidudtryk, der sandsynligvis vil variere meget mellem celler, herunder importeres til cellekernen, transskription og oversættelse. I modsætning hertil havde niveauet af perlebelastede proteiner en lille celle-til-celle-varians, og niveauet af to samtidig belastede proteiner var stærkt korreleret med hinanden (Figur 2D, E).
Plasmid udtryk kan ses så tidligt som 2-4 timer post perle lastning, men kan forekomme senere afhængigt af, hvornår optimal plasmid udtryk er opnået. Vi anbefaler at udføre et tidskursus for at bestemme det bedste udtryksvindue for en bestemt plasmid, der spænder over 2-24 timers postperlebelastning. Dette kan gøres i et kammer med lang tidsramme billeddannelse eller ved perle lastning og svimlende flere kamre. Perle-loaded celler forbliver klæbende og er sunde nok til at vokse og opdele. Perle-loaded menneskelige U2OS celler blev afbildet direkte før, umiddelbart efter, og 24 timer efter perle lastning. Korrekt perlebelastning havde næsten ingen mærkbar effekt på antallet af celler eller deres morfologi, som vist i figur 3A (venstre, midten).
I modsætning hertil er dårlig perlebelastning med for mange perler og overdreven tappekraft afbildet i figur 3B. Dette forårsagede meget celletab (store pletter af coverglass uden celler og løsrevne, flydende, out-of-focus celler), dårlig cellemorfologi (celler vises afrundet og dårligt klæbet), og klynger af perler tilbage på dækglasset efter perlebelastning. Selvom celler menes at gennemgå mekanisk skade under perlebelastning, voksede og spredte cellerne sig i det korrekt perlebelastede kammer, som det fremgår af det øgede antal celler 24 timer efter perlebelastning (Figur 3A, til højre). Effekten på celle levedygtighed kan vurderes gennem en række analyser, såsom en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, at sammenligne perle-loaded til mock-loaded celler30. Endvidere viser dette og tidligere arbejde, at de perlebelastede celler gennemgår celledeling (Figur 3C og supplerende video 1), og tidspunktet for mitose påvirkes ikke af perlebelastning31, hvilket tjener som yderligere bevis for vedvarende cellesundhed efter perlebelastning.
Perlebelastning er en alsidig teknik, der imødekommer flere klæbende cellelinjer og forskellige makromolekyler. Her er denne sort blevet demonstreret ved at indlæse RPE1 og HeLa cellelinjer med Fab (Figur 4A,B). Tabel 1 giver yderligere eksempler på perlebelastning i forskellige cellelinjer, i dette laboratorium og videre, og påpeger nogle af de nuancerede forskelle mellem perlebelastningsprotokoller fra andre laboratorier. Bemærk, at diameteren af glasperler, der anvendes til lastning varierer meget mellem laboratorier, selv om den mest effektive belastning blev fundet for små, 75 μm diameter perler i flere cellelinjer14. Desuden er dette laboratorium også begyndt at indlæse RNA (data, der ikke er vist). Figur 4C viser en repræsentativ U2OS celle perle-lastet med en Cy5-RNA 9mer og Cy3-DNA 28mer sammen.
Figur 1: Perleindlæsningsapparat, teknik og tidslinje Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Perlebelastning introducerer lav variation i proteinkoncentrationen, men høj variation i plasmidudtryk. (A) Cellerne var perle-lastet med 0,5 μg af hver af Alexa488-konjugeret anti-H3K27 acetyl Fab (grøn) og Cy3-konjugeret anti-RNAPII-Serine 5-fosforyleret Fab (rød) i 4 μL perle lastning løsning. Celler var DAPI-farvede (blå) og derefter live-afbilledet straks. Skalastænger = 20 μm. (B) Cellerne var perlebelastede med 0,5 μg Fab-protein (Cy3-konjugeret anti-RNAPII-Serin 5-fosforyleret protein, rødt) og 1 μg plasmidkodning superfolder GFP-H2B (grøn) i 4 μL perlebelastningsopløsning. Efter 24 timer blev cellerne DAPI-farvede (blå) og afbildet live. Skalastænger = 30 μm. (C-E) Protein 1 (JF646-HaloLigand-mærket HaloTag-MCP), protein 2 (Cy3-konjugeret anti-FLAG Fab) og en plasmid kodning EGFP (λN-EGFP-LacZ) blev perle-læsset sammen i celler. Den samlede intensitet i hver fluorescerende kanal blev målt i en 1,3 x 1,3 μm patch i cytoplasma af hver celle. N = 25 celler. (C) Repræsentative celler, der udtrykker den perlebelastede plasmid, λN-EGFP-LacZ. De samme billeddannelsesforhold og intensiteter blev brugt til alle celler. Pletter er aggregater af det udtrykte protein. Skalabarer = 10 μm. (D) Diagrammet viser hver celles samlede intensitet af enten protein 1, protein 2 eller EGFP udtrykt fra plasmiden. Hver kanal blev normaliseret til medianen. Bonferroni-korrigerede P-værdier blev beregnet ved Fisher Ratio-testen for at afgøre, om fordelingen af protein- eller plasmidintensitetsdata har samme variation. Hvert punkt repræsenterer en celle. (E) De samlede intensiteter for enten både proteiner, protein 1 og plasmid, eller protein 2 og plasmid, er plottet mod hinanden. Beregnede R2-værdier vises. Hvert punkt repræsenterer en celle. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; A.U. = vilkårlige enheder; MCP = MS2 pelsprotein; RNAPII = RNA polymerase II. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Perlebelastede celler forbliver klæbende og er sunde nok til at vokse og opdele. (A) U2OS-celler var perlebelastede med 0,5 μg Cy3-konjugeret anti-FLAG Fab i 4 μL perlebelastningsopløsning. Cellerne blev afbildet direkte før, umiddelbart efter perlebelastning, og 24 timer efter perlebelastning. Orange pile identificerer områder, hvor celler skrællet af under perlebelastning. Skalastænger = 2 mm. (B) Repræsentativt billede af U2OS-celler perle-fyldt med komponenter fra (A), men med hård aflytning og for mange perler. Den røde pil identificerer ekstra glasperler. Skalastang = 2 mm. (C) U2OS-celler blev lastet med 1,5 μg af de 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg cy3-konjugeret anti-FLAG Fab (grøn), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL perlebelastningsopløsning. Umiddelbart før billeddannelse blev HaloTag plettet med JF646-HaloLigand. MS2 stilk-sløjfer af mRNA transskriberet fra reporter plasmid er mærket af MCP (magenta pletter), og FLAG-tagged oversat reporter protein er mærket af anti-FLAG Fab (grøn colocalization til mRNA). Ældre Fab-mærket protein lokaliserer til kernen. Denne celle blev afbildet 4-15 timer efter perle lastning. Gule pile identificerer cellekernen før og kernerne efter celledeling. Skalastænger = 5 μm. Forkortelse: MCP = MS2 coat protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Variationer i celletypeindlæsningsmateriale i perleindlæsningsprotokollen. (A-B) RPE1 (A) og HeLa (B)celler var perlebelastede med 1,5 μg af et nukleart Fab-protein (anti-RNAPII-Serin 5-fosforylering) i 4 μL lastopløsning. Hver celles kerne (nuc) og cytoplasma (cyto) er markeret. Celler blev afbildet 6 timer efter at være blevet perle-indlæst. Skalastænger = 5 μm. (C) Humane U2OS-celler var perlebelastede med både Cy5-RNA 9mer (magenta) og Cy3-DNA 28mer (grøn) oligo, 10 picomoler af hver, i 4 μL perlebelastningsopløsning. Celler blev afbildet 4 timer efter at være blevet perle-indlæst. Alle cellekerner fremhæves af en stiplet linje. Skalastænger = 5 μm. Forkortelser: RNAPII = RNA polymerase II. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Cellelinje | Celletype | Effektiviteten af indlæsning af perle | Bemærkninger/reference |
| Stamceller (menneskelige) | Embryonale stamceller | Vanskelig | * Mange celler skræl off under perle lastning, hvis belagt på gelatine-belagt plader |
| HEK 293 | Menneskelige embryonale nyreceller | Vanskelig | * Behov for at fastsætte en gel matrix til billedbehandling kammer overflade før perle lastning. Tryk forsigtigt, når perlen læsses i starten. |
| Neuroner (rotte) | Primære embryonale neuroner (e-18), dissocierede | Meget ineffektiv | * Effektiv perle belastning af neuroner blev ikke observeret ved hjælp af denne standard perle lastning protokol. Dette kan skyldes neuroners ikke-klæbende karakter eller følgeskader på neurale processer. |
| MDCK (hunde) | Madin-Darby hunde nyreceller | Se McNeil og Warder (1987)14 | *Laveffektiv perle lastning14 |
| U2OS (menneske) | Osteosarkom | Standardprotokol til indlæsning af perle | |
| HeLa (menneske) | Livmoderhalskræft | Standardprotokol til indlæsning af perle | |
| RPE1 (menneske) | Epitelceller udødeliggjort med hTERT | Standardprotokol til indlæsning af perle | |
| BFF (menneske) | Primære forhudsfibroblaster | Se Besteiro et al. (2009)31 | *Ændret protokol med vippe i stedet for at trykke på31 |
| BALB/c 3T3, NIH 3T3 og schweizisk 3T3 (mus) | Embryonale fibroblaster | Se Gilmore og Romer (1996)32, Emerson et al. (2014)33 og McNeil and Warder (1987)14 | *425-600 μm glasperler rapporteret32 |
| *Brugte 200-300 μm glasperler33 | |||
| *75 μm glasperler gav bedre resultater end 400 μm14 | |||
| DM (indisk muntjac) | Hud fibroblaster | Se Manders, Kimura og Cook (1999)34 | |
| CHO (hamster) | Epitellignende æggestoksceller | Se Memedula og Belmont (2003)35 | *Brugte 425-600 μm glasperler35 |
| BAE (kvæg) | Kvæg aorta endotelceller (BAEC-11) | Se McNeil og Warder (1987)14 | *75 μm glasperler gav bedre resultater end 400 μm14 |
| PtK-2 (Potomus tridaclylis) | Epitel nyreceller | Se McNeil og Warder (1987)14 | *75 μm glasperler gav bedre resultater end 400 μm14 |
| HUVEC (menneske) | Navlestrengsn endotelceller | Se Gilmore og Romer (1996)32 | *Brugte 425-600 μm glasperler32 |
| J774 og J774.2 (mus) | monocyt makrofagceller | Se Becker et al. (2005)36 og McNeil and Warder (1987)14 | * Blid agitation (i stedet for at trykke) og 425-600 μm glasperler36 |
| MS-5 (mus) | knoglemarv stromale celler | Se Molenaar et al. (2003)37 | |
| WPE1-NB11 (menneske) | prostata epitelceller | Se Gilmore og Romer (1996)32 og | *Brugte 425-600 μm glasperler32 |
| Emerson et al. (2014)33 | *Brugte 200-300 μm glasperler33 |
Tabel 1: Perlebelastning i forskellige cellelinjer. For de cellelinjer, der endnu ikke er bead-indlæst i dette laboratorium, leveres referencer og noter om variationer i protokollen.
Supplerende video 1: Eksempel på en perle-indlæst celle under celledeling. U2OS-celler blev lastet med 1,5 μg af de 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugeret anti-FLAG Fab (grøn), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL perlebelastningsopløsning. Umiddelbart før billeddannelse blev HaloTag plettet med JF646-HaloLigand. MS2 stilk-sløjfer af mRNA transskriberet fra reporter plasmid er mærket af MCP (magenta pletter), og FLAG-tagged oversat reporter protein er mærket via anti-FLAG Fab (grøn colocalization til mRNA). Ældre Fab-mærket protein lokaliserer til kernen. Denne celle blev afbildet 4-15 timer efter perle lastning. Skalalinje = 10 μm. Forkortelse: MCP = MS2 coat protein. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Perlebelastningsteknikken, der er beskrevet her, er en omkostningseffektiv og tidseffektiv metode til at introducere makromolekyler og andre partikler i klæbende celler. Denne alsidige proces kan indlæse protein (Figur 2A)15,16,26,27, en kombination af protein og plasmider ( Figur2B,C)22,25, RNA ( Figur4C), 100 og 250 nm polystyrenperler (personlig korrespondance), syntetiske farvestoffer39 eller kvanteprikker34,40 . Perlebelastning kan også have mulighed for at indlæse andre typer membranindtrængelige partikler. Dens hyppigst anvendte anvendelse er til lastning antistoffer eller Fabs at målrette endogene epitoper, såsom post-translationelle ændringer (PTMs), i levende celler. Mål, såsom PTM'er, er ofte vanskelige at mærke i levende celler uden etablerede PTM-specifikke, genetisk kodede sonder41,42. I modsætning hertil kan perlebelastning introducere flere typer sonder, journalister eller andre molekylære værktøjer sammen i den samme celle til overvågning af flere udlæsninger samtidigt. Vi forventer, at perlebelastning vil være en nyttig teknik til lastning af en række makromolekyler eller partikler.
En stor fordel ved perlebelastning er de lave omkostninger: Hvert eksperiment koster mindre end 0,01 USD. En perle loader apparat kan gøres nemt ved hjælp af billige materialer koster i alt ~ $ 150, hvilket er betydeligt billigere end nogen anden celle-loading metode. Omkostningerne ved en perle læsseapparat kan yderligere reduceres til under $ 10 ved at erstatte genanvendelige metalkammer med en plastik en. Til dette skal du enten bore et hul i et 35 mm kammer eller fjerne glasset fra et 35 mm glasbundet kammer og derefter fastgøre masken sikkert med tape. I stedet for et apparat kan perlebelastning endda udføres ved hjælp af en bred boring 1000 μL pipettespids til at scoop og drysse perler på celler, selvom denne variation gør det vanskeligt at drysse en monolag af perler på celler (trin 4.6).
En anden fordel ved perlebelastning er, at cellerne kan bevare normal samlet morfologi, genoprette hurtigt og fortsætte med at vokse og opdele, i det mindste for U2OS-, RPE1- og HeLa-cellerne, der studeres her og for de andre cellelinjer, der studeres andre steder (figur 3; Figur 4A, B; Supplerende video 1; og tabel 1)31. Under perlebelastning gennemgår cellerne fysisk stress og løsner undertiden og skræller (~ 5% af cellerne skræl under optimale forhold, men større celletab kan ske, hvis perlebelastning udføres for kraftigt, eller for mange glasperler indlæses oven på cellerne, som afbildet i figur 3B). Perleinstallerede celler, der forbliver fastgjort til dækslerne, ser dog normalt sunde ud og kan afbildes så snart som 30 min efter perlebelastning (Figur 3A). Vi tillader generelt celler en 30-minutters restitutionsperiode, men forventer, at billeddannelse før post-perlebelastning er mulig.
En stor ulempe ved denne teknik er, at cellerne skal være i stand til at modstå mindre fysisk stress under belastning og forblive sikkert klæbende til coverlip. Dårligt/ikke-klæbende cellelinjer eller celler, der dyrkes på coatede plader (f.eks. HEK og stamceller), løsnes ofte ved blid aflytning under perlebelastning. Desuden har erfaringen vist, at primære neuroner er for følsomme til perlebelastning.
Perlebelastning er bedst egnet til enkeltcellede eller enkeltmolekyleforsøg. Det er vores erfaring, perle lastning har en ca 20-40% protein lastning effektivitet, og ~ 20% af perle-loaded celler også udtrykt en co-loaded plasmid (Figur 2A,B). Perlebelastningsplasmider kan således være mindre effektive til proteinudtryk end perlebelastning af rensede proteiner, fordi plasmider ikke kun skal komme ind i celler, men også udtrykkes (hvilket blandt andet involverer nuklear import, transskription og oversættelse, som hver især kan sænke udtrykseffektiviteten). Den lave effektivitet af perle-loaded plasmid udtryk kan omgås ved hjælp af alternative transfection protokoller, såsom fedtsugning, før perle lastning proteiner eller sonder16,27. Derudover kan inkubation af celler i optimale medier i 30 minutter før perlebelastning hjælpe plasmidudtryk. På grund af lav plasmid udtryk, perle lastning har ikke ofte været brugt som et alternativ til lipofection-baseret transfection i dette laboratorium. Den eneste undtagelse er, når et renset protein, såsom Fab, skal co-loaded, i hvilket tilfælde det er ganske bekvemt at perle-belastning protein og plasmid på samme tid. Desuden kan perlebelastning for celler, der ikke reagerer eller er intolerante over for fedtsugning, give en alternativ, om end laveffektiv, metode til forbigående plasmidudtryk.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for medlemmerne af Stasevich laboratoriet for utallige samtaler, der hjalp med at forbedre og udvikle denne protokol. Specifikt, Dr. Linda Forero og Dr. Phil Fox for rådgivning om perle lastning forskellige celletyper. Vi vil gerne oprigtigt takke Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato og Dr. Hiroshi Kimura for at dele deres glas perle lastning protokol. Vi er meget taknemmelige for Dr. Ashok Prasad og Dr. Diego Krapf for generøst at dele deres perle lastning protokoller for at indføre uorganiske partikler i celler. Vi er taknemmelige for Dr. Travis Sanders, Craig Marshall, og Dr. Thomas Santangelo for generøst at dele deres mærket RNA reagens. ALK, MNS, CAC, GG og TJS blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R35GM119728 og National Science Foundation (NSF) CAREER tilskud MCB-1845761, begge til TJS. CAC blev også støttet af NSF NRT-prisen DGE-1450032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
| 35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
| Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
| Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
| Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
| L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
| Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
| Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
| Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |
References
- Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
- Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
- Potter, H.
- Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
- Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
- Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
- McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
- Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
- Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
- Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
- Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
- Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
- Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
- Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
- Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
- Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
- JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
- Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
- Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
- Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
- Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
- Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
- Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
- Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
- Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
- Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
- Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).
