Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62618
Automatic Translation
1
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

تفصل مقالة هذه الطريقة الخطوات الرئيسية في قياس تسرب H + عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي باستخدام تقنية المشبك التصحيحي ، وهو نهج جديد لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا.

Abstract

يعد تكوين الحرارة في الميتوكوندريا (المعروف أيضا باسم فك ارتباط الميتوكوندريا) أحد أكثر الأهداف الواعدة لزيادة إنفاق الطاقة لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. الأنسجة الحرارية مثل الدهون البنية والبيج تطور الميتوكوندريا عالية التخصص لإنتاج الحرارة. الميتوكوندريا من الأنسجة الأخرى ، التي تنتج في المقام الأول ATP ، تحول أيضا ما يصل إلى 25 ٪ من إجمالي إنتاج طاقة الميتوكوندريا إلى حرارة ، وبالتالي ، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على فسيولوجيا الجسم كله. لا يعد توليد الحرارة للميتوكوندريا ضروريا للحفاظ على درجة حرارة الجسم فحسب ، بل يمنع أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ويقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لحماية الخلايا من التلف التأكسدي. نظرا لأن توليد الحرارة في الميتوكوندريا هو منظم رئيسي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، فإن الفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيساعد في تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا. الأهم من ذلك ، أن الآليات الجزيئية الدقيقة التي تتحكم في التنشيط الحاد للتوليد الحراري في الميتوكوندريا غير محددة بشكل جيد. ويرجع هذا النقص في المعلومات إلى حد كبير إلى ندرة طرق القياس المباشر للبروتينات غير المقترنة. وقد مكن التطور الأخير لمنهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا، لأول مرة، من إجراء دراسة مباشرة للظاهرة في أصل توليد الحرارة للميتوكوندريا، وتسرب H+ من خلال IMM، وأول توصيف فيزيائي حيوي لناقلات الميتوكوندريا المسؤولة عنها، والبروتين غير المقترن 1 (UCP1)، المحدد للدهون البنية والبيج، وناقل ADP/ATP (AAC) لجميع الأنسجة الأخرى. سيوفر هذا النهج الفريد رؤى جديدة حول الآليات التي تتحكم في تسرب H + وتوليد الحرارة الميتوكوندريا وكيف يمكن استهدافها لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. تصف هذه الورقة منهجية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا لدراسة قدرتها الحرارية عن طريق قياس تيارات H+ مباشرة من خلال IMM.

Introduction

تشتهر الميتوكوندريا بكونها قوة الخلية. في الواقع ، هم المصدر الرئيسي للطاقة الكيميائية ، ATP. ما هو أقل شهرة هو أن الميتوكوندريا تولد الحرارة أيضا. في الواقع ، كل ميتوكوندريون يولد باستمرار نوعين من الطاقات (ATP والحرارة) والتوازن الدقيق بين شكلي الطاقة يحدد توازن الخلايا الأيضية (الشكل 1). كيف توزع الميتوكوندريا الطاقة بين ATP والحرارة هو بالتأكيد السؤال الأكثر جوهرية في مجال الطاقة الحيوية ، على الرغم من أنه لا يزال غير معروف إلى حد كبير. نحن نعلم أن زيادة إنتاج حرارة الميتوكوندريا (تسمى توليد الحرارة الميتوكوندريا) ، وبالتالي تقليل إنتاج ATP يزيد من إنفاق الطاقة وهذه واحدة من أفضل الطرق لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي1.

ينشأ توليد الحرارة للميتوكوندريا من تسرب H+ عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) ، مما يؤدي إلى فصل أكسدة الركيزة وتخليق ATP مع ما يترتب على ذلك من إنتاج للحرارة ، ومن هنا جاء اسم "فك ارتباط الميتوكوندريا"1 (الشكل 1). يعتمد تسرب H+ هذا على ناقلات الميتوكوندريا التي تسمى البروتينات غير المقترنة (UCPs). كان UCP1 أول UCP يتم تحديده. يتم التعبير عنه فقط في الأنسجة الحرارية والدهون البنية والدهون البيج التي تتخصص فيها الميتوكوندريا لإنتاج الحرارة2،3،4. ظلت هوية UCP في الأنسجة غير الدهنية مثل العضلات الهيكلية والقلب والكبد مثيرة للجدل. يمكن أن تحتوي الميتوكوندريا في هذه الأنسجة على حوالي 25٪ من إجمالي طاقة الميتوكوندريا المحولة إلى حرارة ، مما قد يؤثر بشكل كبير على فسيولوجيا الجسم كله1. إلى جانب الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية ، يمنع توليد الحرارة الميتوكوندريا أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي عن طريق تقليل السعرات الحرارية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بواسطة الميتوكوندريا لحماية الخلايا من الضرر التأكسدي1. وبالتالي ، فإن التوليد الحراري للميتوكوندريا يشارك في الشيخوخة الطبيعية ، والاضطرابات التنكسية المرتبطة بالعمر ، وغيرها من الحالات التي تنطوي على الإجهاد التأكسدي ، مثل نقص التروية - التروية. لذلك ، فإن توليد الحرارة الميتوكوندريا هو منظم قوي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيعزز تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا.

كان التنفس الميتوكوندريا أول تقنية تكشف عن الدور الحاسم للتوليد الحراري للميتوكوندريا في التمثيل الغذائي الخلوي ولا تزال الأكثر شعبية في المجتمع1. تعتمد هذه التقنية على قياس استهلاك الأكسجين بواسطة سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) التي تزداد عند تنشيط تسرب الميتوكوندريا H+. هذه التقنية ، على الرغم من أنها مفيدة ، لا يمكنها دراسة تسرب الميتوكوندريا H + مباشرة عبر IMM1 ، مما يجعل التحديد الدقيق وتوصيف البروتينات المسؤولة عنه أمرا صعبا ، خاصة في الأنسجة غير الدهنية التي يكون فيها إنتاج الحرارة ثانويا مقارنة بإنتاج ATP. في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير تقنية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا ، أول دراسة مباشرة لتسرب H + عبر IMM بأكمله في الأنسجة المختلفة 5,6,7.

تم إنشاء مشبك رقعة الميتوكوندريا لكامل IMM لأول مرة بطريقة قابلة للتكرار بواسطة Kirichok et al.8. ووصفوا أول قياس مباشر لتيارات الميتوكوندريا يونيبورتر الكالسيوم (MCU) في عام 2004 باستخدام mitoplasts من خطوط خلايا COS-78. في وقت لاحق ، أظهر مختبر Kirichok تيارات الكالسيوم من IMMs من أنسجة الفأر 9 وذبابة الفاكهة 9. تستخدم مختبرات أخرى الآن هذه التقنية بشكل روتيني لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية ل MCU10،11،12،13،14. من الممكن أيضا إجراء تحليل كامل لمشبك التصحيح IMM لتوصيل البوتاسيوم والكلوريد وقد تم ذكره في العديد من الأوراق البحثية ولكنه لم يكن بعد الموضوع الرئيسي لمنشور 6,7,9. تم الإبلاغ عن أول قياس لتيارات H + عبر IMM في عام 2012 من الميتوكوندريا6 ذات الدهون البنية للفئران ، ومن الميتوكوندريا الدهنية البيج للفئران في عام 20177. ويرجع هذا التيار إلى البروتين المحدد غير المقترن للأنسجة الحرارية ، UCP1 6,7. وصف العمل الأخير المنشور في عام 2019 AAC بأنه البروتين الرئيسي المسؤول عن تسرب الميتوكوندريا H + في الأنسجة غير الدهنية مثل القلب والعضلات الهيكلية5.

يسمح هذا النهج الفريد الآن بإجراء تحليل وظيفي مباشر عالي الدقة لقنوات أيون الميتوكوندريا والناقلات المسؤولة عن توليد الحرارة في الميتوكوندريا. لتسهيل توسيع الطريقة واستكمال الدراسات الأخرى مثل تنفس الميتوكوندريا ، يتم وصف بروتوكول مفصل أدناه لقياس تيارات H + التي تحملها UCP1 و AAC. يتم وصف ثلاث خطوات مهمة: 1) عزل الميتوكوندريا عن الدهون البنية للفأر لتحليل تيار H+ المعتمد على UCP1 والعزلة الميتوكوندريا من القلب لتحليل تيار H+ المعتمد على AAC ، 2) إعداد mitoplasts باستخدام مطبعة فرنسية للتمزق الميكانيكي لغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) ، 3) تسجيلات المشبك التصحيحي لتيارات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC المعتمدة على H + عبر IMM بأكمله.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تتوافق جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات التي تم تنفيذها مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (IACUC).

ملاحظة: يعتمد إجراء عزل الميتوكوندريا على الطرد المركزي التفاضلي ويختلف قليلا من نسيج إلى آخر. على سبيل المثال ، نظرا لأن الأنسجة الدهنية البنية غنية للغاية بالدهون ، فإنها تتطلب خطوة إضافية لفصل حطام الخلايا والعضيات عن مرحلة الدهون قبل حصاد الميتوكوندريا. لتجنب الارتباك ، يتم تفصيل إجراءي عزل الميتوكوندريا (أحدهما من الدهون البنية والآخر من القلب) أدناه.

1. عزل الميتوكوندريا عن الدهون البنية بين الكتف (المعدلة من Bertholet et al. 2020)15

  1. القتل الرحيم C57BL/6 الفأر الذكر باستخدام اختناق CO2 وخلع عنق الرحم اللاحق ، على النحو الموصى به من قبل فريق الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية ولجنة IACUC.
  2. بعد وضع الفأر مع بطنه المواجه للطاولة ، رش الكحول لتنظيف الشعر وتبليله (تم تعديله من Mann et al.، 2014)16.
  3. قم بعمل شق 2 سم في الجزء العلوي من الظهر بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط.
  4. استخراج الدهون البنية بين الكتف من الماوس التي تتوافق مع عضو ثنائي الفصوص مع شكل فراشة16.
  5. انقل الدهون البنية إلى طبق بتري 35 مم مملوء ب 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) الموضوع مسبقا على الثلج.
  6. نظف الدهون البنية من الدهون البيضاء تحت منظار.
  7. انقل الدهون البنية إلى كوب سعة 10 مل مع 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) لتقطيعها إلى قطع رقيقة. نقل إلى مجانس الزجاج المبرد بالجليد 10 مل (مدقة المواد البلاستيكية البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE).
  8. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة / دقيقة.
  9. جهاز طرد مركزي متجانس عند 8500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل. تخلص من المادة الفائقة التي تحتوي على مرحلة الدهون.
  10. أعد تعليق الكريات في 5 مل من العازل العازل للعزل البارد (الجدول 1) وقم بتجانس التعليق على الجليد مرة ثانية بست ضربات بطيئة بسرعة 275 دورة / دقيقة.
  11. انقل المتجانس في أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل وقم بطرده مركزيا عند 700 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكسير جميع النوى والخلايا غير المنكسرة.
  12. اجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة 15 مل وضعه على الجليد.
  13. قم بطرد مركزي للجهاز الفائق عند 8500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.
  14. أعد تعليق الكريات التي تحتوي على الميتوكوندريا في 3.8 مل من المخزن المؤقت للمانيتول مفرط التوتر (الجدول 2) واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.

2. عزل الميتوكوندريا عن قلب الفأر (معدل من Garg et al. 2019)17

  1. القتل الرحيم C57BL/6 الفأر الذكر باستخدام اختناق CO2 وخلع عنق الرحم اللاحق ، على النحو الموصى به من قبل فريق الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية ولجنة IACUC.
  2. بعد وضع الماوس على ظهره ، رش الكحول لتنظيف الشعر وترطيبه. ثم ، قم بعمل شق 2 سم على الصدر بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط.
  3. تشريح القلب من صدر الحيوان وشطفه لإزالة كل الدم في كوب 10 مل مع 5 مل من محلول العزل البارد (الجدول 1).
  4. بمجرد تطهير القلب من آثار الدم ، انقله إلى كوب آخر سعة 10 مل يحتوي على 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) لتقطيعه إلى قطع رقيقة. ثم ، انقل إلى مجانس زجاجي 10 مل مبرد بالجليد (مدقة PTFE).
  5. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة / دقيقة.
  6. انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل وقم بطرده مركزيا عند 700 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى نوى الكريات والخلايا غير المنكسرة.
  7. اجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة 15 مل وضعه على الجليد.
  8. قم بطرد مركزي للجهاز الفائق عند 8500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.
  9. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 3.8 مل من المخزن المؤقت للمانيتول مفرط التوتر البارد (الجدول 2) واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.

3. إعداد mitoplasts مع الصحافة الفرنسية للتمزق الميكانيكي من OMM.

ملاحظة: يسمح الإجراء الصحفي الفرنسي بتحرير IMM من OMM مع الحفاظ على سلامته ، بما في ذلك المصفوفة و crista (الشكل 2)18. يتم احتضان الميتوكوندريا مسبقا في مخزن مؤقت مفرط التوتر (الجدول 2) وتخضع لضغط أقل أثناء إجراء الصحافة الفرنسية لتجنب أي تمدد جذري ل IMM عند تمزق OMM.

  1. املأ تعليق الميتوكوندريا-فرط التوتر-مانيتول في خلية ضغط صغيرة مبردة (قطر المكبس 3/8 بوصة) من الصحافة الفرنسية (الشكل 3A).
  2. حدد الوضع المتوسط للضغط الفرنسي وضغط التعليق من خلال خلية الضغط الصغيرة عند 110 على قرص المعصرة الفرنسية للميتوكوندريا الدهنية البنية وعند 140 للميتوكوندريا القلبية (~ 2000 رطل لكل بوصة مربعة).  تأكد من أن التعليق يخرج من خلية الضغط الصغيرة بمعدل حوالي 1 قطرة / ثانية.
  3. اجمع القطرات في أنبوب مخروطي مبرد بالجليد سعة 15 مل.
  4. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 10500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. أعد تعليق حبيبات mitoplasts في 0.5-2 مل من المخزن المؤقت Hypertonic-KCl البارد (الجدول 3) وقم بتخزين التعليق على الجليد.
    ملاحظة: الدهون البنية و mitoplasts القلب جاهزة لتسجيل المشبك التصحيح ويجب أن تظل قابلة للاستخدام لمدة 3-6 ساعات تقريبا.

4. التسجيلات الكهروفسيولوجية لتسرب H + من خلال UCP1 و AAC 5,7,15

ملاحظة: استخدم الإعداد الكهروفسيولوجي التالي (الشكل 3B): المجهر المقلوب مع تباين التداخل التفاضلي (DIC) ، وهدف الغمر المائي 60x ، وطاولة عزل الاهتزاز وقفص Faraday ، ومضخم صوت قياسي يدعم التسجيلات منخفضة الضوضاء ، وجهاز رقمنة قياسي يستخدم للإعداد الكهروفسيولوجي ، pClamp 10 ، ومناور دقيق ، وقطب مرجعي للحمام (3 M KCl-agar جسر ملحي مدرج داخل حامل microelectrode يحتوي على حبيبات كلوريد الفضة / الفضة مصبوبة في جسم الحامل (الموصوف في Liu et al. 2021)19 ، غرفة التروية ذات قاع الغطاء الزجاجي 0.13 مم ، متصلة بنظام تروية تغذيه الجاذبية.

  1. اسحب خيوط زجاج البورسليكات في يوم التسجيل باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. قم بتعيين برنامج على المجتذب المستخدم لتوليد الماصات بدرجة عالية من الاستنساخ20.
    ملاحظة: يتطلب تصميم هذا البرنامج عدة محاولات للحصول على ماصات محسنة لمشبك تصحيح IMM. تحتوي الماصة القياسية على أطراف دقيقة ذات شكل مخروطي تدريجي.
  2. أدخل خيطا زجاجيا واحدا داخل المجتذب واسحبه للحصول على ماصتين متطابقتين تقريبا من خيوط البورسليكات الواحدة.
  3. اضبط البرنامج عندما تصبح الماصات غير متناسقة بين دورات السحب بسبب شيخوخة خيوط صندوق التسخين الخاصة بالمسحوب.
  4. ضع الماصة داخل ملمع الماصة وضع الطرف بالقرب من الخيوط تحت تكبير 100x لتلميعها.
  5. اضغط على دواسة القدم عدة مرات لتسخين الخيوط دون انسداد أو إتلاف منحنى الطرف.
  6. البولندية حتى يتم الحصول على الماصات ذات المقاومة بين 25 و 35 MΩ عند ملئها بمحلول ماصة قائم على TMA (TMA لهيدروكسيد رباعي ميثيل الأمونيوم ، الجدول 4).
  7. أغطية ما قبل الحضانة (قطرها 5 مم ، سمك 0.1 مم) مع 0.1٪ جيلاتين لتقليل التصاق mitoplast وشطفها بمحلول حمام KCl (الجدول 5) قبل إيداع تعليق mitoplast.
  8. تحضير تخفيف الخام عن طريق خلط ~ 35 ميكرولتر من تعليق mitoplast المركز مع 500 ميكرولتر من محلول حمام KCl (الجدول 5) ووضعه على أغطية وضعت سابقا في بئر من لوحة 4 آبار.
  9. احتضن على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة للميتوبلاستيدات إلى الرواسب على الغطاء.
  10. املأ غرفة الحمام بالكامل ب ~ 50 ميكرولتر من محلول حمام KCl (الجدول 5).
  11. انقل غطاء مع mitoplasts داخل الغرفة باستخدام ملاقط تشريح مجهري رقيقة مع طرف عازم.
  12. رتب الغطاء في الجزء السفلي من الغرفة. لا تقم بتحريك الغرفة للحفاظ على استقرار mitoplasts على الغطاء.
  13. اختر mitoplast غير لاصق فردي على شكل 8 عن طريق مسح الغطاء تحت المجهر بهدف 60x.
  14. قم بتحميل الماصة بمحلول الماصة (~ 50 ميكرولتر) وضعها في حامل الماصة.
  15. أحضر الماصة إلى محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق واقترب منه فوق mitoplast المحدد مباشرة للاقتراب من IMM. يعطي برنامج مكبر الصوت مقاومة الماصة بمجرد وجودها في محلول الحمام. امسك إمكانات الغشاء عند 0 mV وقم بتطبيق نبضات 10 mV باستخدام أمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت.
  16. تطبيق ضغط سلبي طفيف لإنشاء جيجاسيال بسرعة مع IMM (الشكل 2B).
  17. ارفع الماصة مع تثبيت mitoplast لإبعادها عن الغطاء لتجنب كسر الختم بسبب انحراف الماصة أثناء التجربة.
  18. قم بتعويض عابرات السعة الضالة بأمر "اختبار الغشاء" في برنامج مكبر الصوت قبل اختبار تكوين mitoplast الكامل للحصول على قياس السعة الصحيح (Cm) لغشاء mitoplast بعد الاقتحام.
  19. قم بتطبيق نبضات الجهد قصيرة المدة (5-15 مللي ثانية) (250-600 مللي فولت) مع برنامج مكبر الصوت لتمزيق رقعة الغشاء تحت الماصة الزجاجية وتحقيق تكوين mitoplast الكامل (الشكل 2C). ينعكس الاقتحام الناجح من خلال عودة ظهور العابرين للسعة.
  20. بعد الاقتحام ، قم بتركيب السعة العابرة مع خيار اختبار الغشاء لبرنامج مكبر الصوت لتقييم سعة الغشاء (التي تعكس حجم mitoplast) ومقاومة الوصول Ra (مما يعكس جودة تكوين mitoplast الكامل). بعد الاقتحام ، يجب أن يكون Ra بين 40 و 80 MΩ. عادة ما يكون لل Mitoplasts (2-6 ميكرومتر في الحجم) المستخدمة في تجارب مشبك التصحيح سعات غشائية من 0.5-1.1 pF.
  21. مباشرة بعد الاقتحام ، استبدل محلول حمام KCl (الجدول 5) بمحلول حمام HEPES (الجدول 6) عن طريق بدء التروية.
  22. قم بتطبيق بروتوكول منحدر 850 مللي ثانية مصمم باستخدام برنامج مكبر الصوت ، من -160 mV إلى +100 mV مع فاصل زمني 5 s ، مع الاحتفاظ ب mitoplast عند 0 mV. يعمل هذا البروتوكول مع دراسات UCP1 6,7,15 و AAC 5 (الشكل 4 والشكل 5).
    ملاحظة: يوصى بأن تحصل قياسات التيار H+ المعتمدة على UCP1 و AAC على جميع البيانات الكهروفسيولوجية عند 10 كيلو هرتز وأن ترشح عند 1 كيلو هرتز باستخدام برامج كافية تقود مكبر الصوت والرقمنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قدم تطوير منهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا أول دراسة مباشرة لتسرب H + من خلال IMM وناقلات الميتوكوندريا ، UCP1 و AAC ، المسؤولة عن ذلك. يمكن أن يوفر التحليل الكهروفسيولوجي لتسريبات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC نظرة أولى على القدرة الحرارية للميتوكوندريا. يصف قسم النتائج الإجراءات القياسية لقياس تسرب H+ عبر UCP1 و AAC.

قياس التيار H+ المعتمد على UCP1 (الشكل 4)6,7,15
يؤدي تطبيق بروتوكول منحدر الجهد إلى تيار H+ كبير السعة عبر IMM للدهون البنية دون إضافة الأحماض الدهنية الخارجية (FA) ، والمنشطات المطلوبة من UCPs (الشكل 4A). هذه هي سمة محددة من الدهون البنية والبيج IMM بسبب الإنتاج المحلي من FA من خلال نشاط الفوسفوليباز المرتبط بالغشاء. عندما يتطور تيار H+ استجابة لبروتوكول المنحدر ، من المهم الانتظار حتى تستقر السعة الحالية. يتطلب التحديد الكمي لسعة تيار H+ عبر UCP1 تحديد خط الأساس المقابل لتيار UCP1 صفري. بمجرد الوصول إلى استقرار السعة الحالية H + ، يوصى باستخدام إما مثبط UCP1 Guanosine diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي - 1 mM ، الشكل 4A) أو مخلب FA (0.5٪ ألبومين مصل البقري الخالي من FA ، غير معروض) أو 10 mM Methyl Beta Cyclodextrin (MβCD) لاستخراج غشاء FA الداخلي ، الشكل 4B ، أثر أسود). التيار المتبقي هو التيار الذي سيتم من خلاله تحديد سعة تيارات UCP1. للمساعدة في مقارنة سعات تيارات UCP1 في mitoplasts مختلفة ، يتم حساب كثافة التيار (pA / pF) لكل mitoplast عن طريق تطبيع تيارات UCP1 مع سعة mitoplast (Cm) 5,7. يمكن إعادة تنشيط التيار عن طريق إضافة FA طويل السلسلة الخارجية باستخدام حمض الأراكيدونيك (AA) أو حمض الأوليك (OA) (1-2 ميكرومتر). نظرا لأن كلا من IMMs الدهنية البنية والبيج تمتلك نشاط PLA2 ، يتم تجديد FAs الغشائية الداخلية جزئيا في غضون بضع دقائق من غسل MβCD / الألبومين من الحمام ، مما يؤدي إلى إعادة تنشيط تيار H + عبر UCP1 6,7. كما هو متوقع ، يختفي هذا التيار تماما في IMM من UCP1-/- الفئران (الشكل 4A)6,7.

هناك طريقة أكثر دقة لمقارنة كثافة ونشاط UCP1 من mitoplasts مختلفة من نفس الأنسجة أو من mitoplasts من أنسجة مختلفة (الدهون البنية والبيج) هي التحكم في تركيز FA على سطح IMM 6,7. في الواقع ، يمكن أن تختلف السعة الحالية H + بين mitoplasts بسبب كمية البروتين UCP1 لكل IMM ولكن أيضا بسبب إنتاج FA الداخلي. وبالتالي ، يوصى باستخراج FA الداخلي من IMM وإعادة تنشيط تيار H+ المعتمد على UCP1 عن طريق إضافة FA خارجي المنشأ بتركيز معروف. للقيام بذلك ، يجب أولا استخراج FAs الذاتية المنشأ من IMM عن طريق دمج محلول حمام HEPES (الجدول 6) الذي يحتوي على 10 mM MβCD. بعد ذلك ، للسماح بإعادة تنشيط تيار H + عبر UCP1 بتركيز دقيق فقط من FAs الخارجية ، سيتم تشغيل هذا الأخير على خلفية HEPES / MβCD لاستخراج FAs المنتجة من IMM باستمرار.

دراسة المنافسة بين نيوكليوتيد البيورين و FA للارتباط ب UCP1 ممكنة أيضا باستخدام تقنية المشبك التصحيحي 6,7,15. يمكن مقارنة تثبيط UCP1 بواسطة نيوكليوتيدات البيورين (على سبيل المثال ، Mg2 + ATP الحرة) بتركيزين مختلفين من FA (من الناحية المثالية 10 أضعاف). لهذا الغرض ، تتم إزالة الغشاء الداخلي FA أولا عن طريق تطبيق 10 mM MβCD (الشكل 4B ، التتبع الأسود). تطبيق FAs الخارجية (على سبيل المثال ، هنا ، يتم عرض 0.5 mM FAs فقط) المطبقة على خلفية 10 mM MβCD يسمح بالتحكم الدقيق في تركيز FAs المنشطة لأن FAs المنتجة محليا يتم استخراجها على الفور من الغشاء. في هذه الحالة ، تكون FAs الخارجية مسؤولة في المقام الأول عن تطوير تيار H +. تتم إضافة تركيزات مختلفة من ATP لاحقا إلى محلول OA / MβCD لتقييم IC50ATP لكل تركيز FA تم اختباره وبالتالي تحديد ما إذا كان FA يتنافس مع نيوكليوتيدات البيورين للارتباط ب UCP1.

قياس التيار H+ المعتمد على AAC (الشكل 5)5
على عكس الدهون البنية ، فإن IMM للأنسجة غير الدهنية مثل العضلات الهيكلية والقلب لا يطور H+ قابلا للقياس مباشرة بعد الاقتحام (الشكل 5 ، الآثار السوداء). للحث على تيار H+ قابل للقياس من خلال AAC ، من الضروري تطبيق محلول حمام HEPES (الجدول 6) الذي يحتوي على 1-2 ميكرومتر من FA الخارجي (AA ، الشكل 5A ، التتبع الأحمر). قد يشير هذا إلى أن IMM للأنسجة غير الدهنية لا يحتوي على آلية إنتاج FA في IMM كما هو موجود في IMM للدهون البنية والبيج.

يتوافق خط الأساس (أو التيار الصفري) لتحديد كمية سعة تيار H+ عبر AAC مع محلول حمام HEPES (الجدول 6) الذي تم تطبيقه على سطح IMM قبل إضافة FA. للتأكد من أن تيار H+ المقاس تحمله AAC ، من المهم تطبيق مثبطات محددة من AAC تضاف إلى FA ، 1 ميكرومتر من carboxyatractyloside (CATR ، الشكل 5A) أو 4 ميكرومتر من حمض bonkgrekic (BKA ، غير معروض) 5 ، والتي تمنع بالكامل تقريبا تيار H +. يختفي هذا التيار تماما في IMM من الفئران AAC1-/- (الشكل 5A) ، AAC1 هو الشكل المتماثل السائد في القلب5.

تحليل المشبك التصحيحي للتفاعل بين تسرب H+ المعتمد على FA والنيوكليوتيدات ممكن أيضا باستخدام AAC5. ومع ذلك ، هناك فرق مهم بين AAC و UCP1: AAC لا يحمل H + فحسب ، بل تتمثل وظيفته الرئيسية في نقل نيوكليوتيدات الأدينين ADP و ATP21. لدراسة كيفية تأثير تبادل نيوكليوتيدات الأدينين على تسرب H+ المعتمد على FA ، تتم إضافة 1 mM Mg2 + ADP الخالي من ADP إلى محلول الماصة. بعد ذلك ، يتم تشغيل FA لتنشيط تيار H + عبر AAC. ADP فقط في محلول الماصة لا يتداخل مع تيار H + 5. بمجرد الوصول إلى سعة تيار H+ مستقرة ، يتم تشغيل ADP في وقت واحد مع FA. فقط عندما يكون ADP موجودا على جانبي الغشاء لتوليد تبادل نيوكليوتيدات نشط عبر AAC ، يكون هناك تثبيط ثابت ولكنه غير كامل أبدا لتسرب H + المحقق (الشكل 5B). وقد يشير ذلك إلى أن وسيلتي النقل التابعتين ل AAC (تبادل FA-H+ الحالي وADP/ATP) تتنافسان ومن المرجح أن يحدثا عبر نفس مسار النقل. تم اختيار التبادل المتجانس ADP / ADP لتجنب التيار الإضافي المرتبط بالتبادل الفسيولوجي ADP / ATPheteroexchange 5.

Figure 1
الشكل 1: توزيع طاقة الميتوكوندريا بين الحرارة وإنتاج ATP. آليات الميتوكوندريا ATP وإنتاج الحرارة. تحتوي الميتوكوندريا على غشاءين [OMM (أرجواني) و IMM (برتقالي)] ، يحتويان على آلات ATP وإنتاج الحرارة. يولد ETC تدرج كهروكيميائي من H + عبر IMM ، والذي يستخدمه ATP synthase (AS) لإنتاج ATP ويستخدمه UCPs لتوليد الحرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تقنية المشبك اللاصق للميتوكوندريا (معدلة من Bertholet et al. 2020)15. (أ) يتم عزل الميتوكوندريا من تحلل الأنسجة عن طريق الطرد المركزي (OMM باللون الأرجواني و IMM باللون البرتقالي). (ب) الصحافة الفرنسية ذات الضغط المنخفض تمزق OMM لإطلاق IMM الذي يعطي mitoplast. تمثل اللوحة اليسرى mitoplast ، والتي تفترض شكلا على شكل 8 مع بقايا OMM متصلة ب IMM. يتم الاقتراب من ماصة زجاجية إلى IMM لتشكيل ختم gigaohm (التكوين المرفق mitoplast). تظهر صورة فوتوغرافية للتكوين المرفق ب mitoplast في اللوحة اليمنى. (C) يتم الحصول على تكوين IMM الكامل (الرسم البياني في اللوحة اليسرى) بعد كسر رقعة الغشاء تحت الماصة بواسطة عدة نبضات جهد (200-500 mV). تظهر صورة فوتوغرافية لتكوين IMM بالكامل في اللوحة اليمنى. التيارات الداخلية (I ، أحمر) سالبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الصحافة الفرنسية والإعداد الكهروفسيولوجي. (أ) صورة للصحافة الفرنسية ، مما يساعد على تمزيق OMM لإطلاق IMM. (ب) صورة لقفص فاراداي ، مجهر مقلوب مع تباين تداخل تفاضلي (DIC) ، هدف غمر مائي 60x ، طاولة عزل اهتزاز ، ومناور دقيقة. لا يظهر مكبر الصوت القياسي وجهاز التحويل الرقمي القياسي وكمبيوتر الكمبيوتر الشخصي في الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تيار H+ عبر UCP1 في الدهون البنية. (A) تيار H+ المعتمد على UCP1 التمثيلي المسجل من ميتوبلاست الدهون البنية المعزولة من WT (اللوحة العلوية) والفئران UCP1−/− (اللوحة السفلية). تتوافق آثار تيار التحكم H+ الموضحة باللون الأسود مع سعة التيار المستقرة بعد كسر IMM. ثم يضاف الناتج المحلي الإجمالي 1 mM إلى محلول الحمام (البرتقالي). يظهر بروتوكول منحدر الجهد فوق آثار WT. يتم عرض الرقم الهيدروجيني لمحاليل الحمام والماصة في مخطط ماصة-ميتوبلاست. (ب) تثبيط UCP1 بواسطة نيوكليوتيدات البيورين في الدهون البنية. آثار تيار H+ المعتمدة على UCP1 في تركيزات مختلفة من ATP على الوجه الخلوي ل IMM للدهون البنية للفئران عند الحياد الحراري. تم تنشيط تيار H+ المعتمد على UCP1 باستخدام حمض الأوليك 0.5 mM (OA) الممزوج ب 10 mM MβCD.يشار إلى بروتوكول الجهد في الأعلى. في اللوحة السفلية ، يتم تمثيل نفس التتبع ولكن لا يتم تطبيعه باستخدام سعة غشاء mitoplast. كان للميتوبلاست الدهني البني في هذا الشكل سعة غشاء تبلغ 0.624 pF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تيار H+ المعتمد على FA عبر AAC في mitoplast. (أ) تيار H+ المعتمد على AAC عند تطبيقه 2 ميكرومتر AA في محلول الحمام (اللوحة العلوية ، البرتقالية) في mitoplasts قلب WT ومثبط بواسطة 1 ميكرومتر CATR (أرجواني). التتبع التمثيلي المسجل في AAC1−/− mitoplast القلب موجودة في اللوحة السفلية. التحكم الحالي باللون الأسود. يظهر بروتوكول منحدر الجهد فوق آثار WT. يتم عرض الرقم الهيدروجيني لمحاليل الحمام والماصة في مخطط ماصة-ميتوبلاست. (ب) في حين أن محلول الماصة يحتوي على 1 مللي متر معزز ، فإن تيار H+ المعتمد على AAC يتم تحريضه بواسطة 2 ميكرومتر AA (برتقالي) ويتم تثبيطه بإضافة 1 mM ADP إلى الحمام (الأرجواني). يظهر بروتوكول منحدر الجهد فوق التتبع. يتم عرض الرقم الهيدروجيني لمحاليل الحمام والماصة في مخطط ماصة-ميتوبلاست. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الكاشف التركيز النهائي
سكروز 250 مللي متر
هيبس 10 مللي متر
EGTA 1 مللي متر
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.2 مع TrisBase

الجدول 1: عازل عزل الميتوكوندريا (التوتر ~ 300 مليمول لكل كيلوغرام)

الكاشف التركيز النهائي
سكروز 140 مللي متر
د-مانيتول 440 مللي متر
هيبس 10 مللي متر
EGTA 1 مللي متر
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.2 مع TrisBase

الجدول 2: المخزن المؤقت للمانيتول مفرط التوتر

الكاشف التركيز النهائي
كيه سي ال 750 مللي متر
هيبس 20 مللي متر
EGTA 1 مللي متر
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.2 مع TrisBase

الجدول 3: المخزن المؤقت HYPERTONNIC-KCl

الكاشف التركيز النهائي
التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي 130 مللي متر
هيبس 100 مللي متر
EGTA 1 مللي متر
MgCl2 لتسجيلات UCP1 2 مللي متر
أو
TrisCl لتسجيلات AAC
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.0 أو 7.5 مع حمض الجلوكونيك D

الجدول 4: محلول ماصة قائم على TMA (التوتر ~ 360 مليمول لكل كجم)

الكاشف التركيز النهائي
كيه سي ال 150 مللي متر
هيبس 10 مللي متر
EGTA 1 مللي متر
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.0 مع TrisBase

الجدول 5: محلول حمام KCl (التوتر ~ 300 مليمول لكل كجم)

الكاشف التركيز النهائي
سكروز 100 مللي متر لتسجيلات UCP1
أو
150 mM لتسجيلات AAC
هيبس 150 مللي متر لتسجيلات UCP1
أو
100 مللي متر لتسجيلات AAC
1 ملليمتر EGTA
درجة الحموضة المعدلة إلى 7.0 مع TrisBase

الجدول 6: محلول حمام HEPES (التوتر ~ 300 مليمول لكل كجم)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تهدف مقالة هذه الطريقة إلى تقديم تقنية المشبك التصحيحي التي تم تطبيقها مؤخرا على الميتوكوندريا ، وهو نهج جديد لدراسة تسرب H + مباشرة من خلال IMM المسؤول عن توليد الحرارة الميتوكوندريا5،6،7،15. لا تقتصر هذه التقنية على الأنسجة ويمكن استخدامها أيضا لتحليل تسرب H + والموصلات الأخرى ل IMM في نماذج بشرية وخلوية قياسية مختلفة مثل HAP1 و COS7 و C2C12 و MEF. ومع ذلك، يتطلب كل عزل للميتوكوندريا بعض التعديلات الخاصة بكل خلية أو نوع من الأنسجة.

يتم تلخيص الخطوات الرئيسية في القياس المباشر لتيارات H + من خلال IMM للدهون البنية 5,6 والقلب5 هنا لتوضيح الآليات المسؤولة عن توليد الحرارة الميتوكوندريا في الأنسجة الحرارية وغير الدهنية المتخصصة. في الواقع ، يسمح تطوير هذه التقنية لأول مرة بإجراء تحليل وظيفي عالي الدقة للمركزين الرئيسيين UCPs (UCP1 و AAC) في بيئة الغشاء الأصلية الخاصة بهم مع التحكم الدقيق في الظروف التجريبية الحرجة مثل: 1) درجة الحموضة في محاليل الماصة والحمام ، 2) التحكم في إمكانات الغشاء عبر IMM ، و 3) التركيب الدقيق للحلول لاستبعاد أي أيونات ومستقلبات قابلة للنفاذ إلى IMM بخلاف H +. تمت صياغة الماصة القائمة على TMA (الجدول 4) وحلول حمام HEPES (الجدول 6) لتسجيل تيارات H + وتحتوي فقط على الأملاح التي تنفصل إلى أنيونات كبيرة وكتيونات غير منفذة عادة ل IMM. في حين يمكن تغيير محلول الحمام باستخدام نظام التروية ، مما يسمح بتطبيق علاجات مختلفة على الجانب الخلوي من الغشاء ، لا يمكن تغيير تكوين محلول intrapipette. هذا يحد من فهم الآليات التنظيمية التي تحدث على جانب المصفوفة. في الواقع ، يجب أن تكون المركبات موجودة داخل محلول intrapipette في وقت ملء الماصة. لذلك ، يمكن دراسة تسرب H + بمعزل عن التيارات الأخرى. كانت الدراسات الدوائية واستخدام الفئران KO ضرورية لتوصيف وتحديد البروتينات المسؤولة عن تيار H + من خلال IMM للأنسجة المختلفة5،6،7. أثبتت هذه النتائج أن UCP1 هو UCP الرئيسي للدهون البنية والبيج ، و AAC في الأنسجة غير الدهنية. لا يمكننا أن نستبعد تماما إمكانية وجود تيارات H+ أخرى لا تتوسط فيها UCP1 و AAC. ومع ذلك ، إذا كانت هناك تيارات H + أخرى ، فإن سعتها كانت تتجاوز دقة إعدادنا الكهروفسيولوجي. نحن لا نقيس ضخ H+ من ETC في ظل الظروف الموضحة في هذه الورقة. بمجرد وصولنا إلى تكوين IMM بالكامل ، يتم غسل مصفوفة الميتوكوندريا عن طريق تروية محلول داخل الماصة. لم تعد المساحة بين الأغشية موجودة منذ خطوة كسر OMM مع الصحافة الفرنسية. لم تتم إضافة ركائز من مجمعات الجهاز التنفسي الضرورية لضخ H + من خلال ETC. لذلك من غير المرجح أن تطور ضخ H+ نشط في ظل الظروف الكهروفسيولوجية المفصلة هنا.

لا يتم وصف تسجيلات قناة واحدة للتصحيحات المستثناة في هذه المقالة. على الرغم من أن التيارات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC عبر IMM قوية بسبب كثافتها العالية من البروتين ، إلا أنه لا يمكن حل فتحات القناة الواحدة لأن سعة التيارات الوحدوية UCP1 و AAC ربما تكون صغيرة جدا.

على النقيض من الدراسات الكيميائية الحيوية ، لا تحتاج عزلة الميتوكوندريا الموصوفة في هذه المقالة إلى مستوى عال من نقاء الميتوكوندريا. في الواقع ، يتم مسح مستحضر الميتوكوندريا الذي يتكون من العديد من mitoplasts الفردية وحطام الخلايا تحت المجهر للعثور على mitoplast واحد على شكل 8 إلى التصحيح. يرجع الشكل 8 الأشكال من mitoplast إلى إطلاق IMM من خلال ثقب في OMM الناجم عن إجراء الصحافة الفرنسية (الشكل 2). الفص الأقل كثافة يتوافق مع IMM15,17. يمكن تحديد التحضير المناسب عن طريق mitoplasts تتحرك بحرية والتي يمكن تمييزها بسهولة عن الحطام الخلوي. ومع ذلك ، من المهم تقليل عدد الحطام لتجنب تلوث IMM ، والذي يمكن أن يؤثر على جودة ختم الماصة الزجاجية بالغشاء. تتيح خطوة المسح الضوئي هذه تحت المجهر اختيار mitoplast مع سلامة IMM عالية معترف بها بواسطة فص أقل كثافة من الفص المحدد بواسطة OMM وبالتالي تزيد من فرص الاقتحام الناجح.

وفرت هذه التقنية لأول مرة القياس المباشر لتيارات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC داخل غشائها الأصلي. ومع ذلك ، لم تعد سلامة الميتوكوندريا وتقسيمها موجودين بسبب تمزق OMM وربما cristae. لذلك من الضروري استكمال تحليل المشبك بالتصحيح بالطرق الكلاسيكية الأخرى مثل التنفس الميتوكوندريا لتأكيد الدور الفسيولوجي للبروتينات المميزة حديثا في الميتوكوندريا السليمة.

توفر تقنية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا إمكانيات جديدة لفهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن تسرب الميتوكوندريا H+ وتوليد الحرارة بشكل أفضل. جنبا إلى جنب مع التقنيات الخلوية والجزيئية الحديثة ، سيوفر هذا النهج المبتكر رؤى جديدة حول الآليات التي تتحكم في القدرة الحرارية للميتوكوندريا وكيف يمكن استهدافها لمكافحة الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

أشكر الدكتور يوري كيريشوك على العلم العظيم الذي كنت جزءا منه في مختبره وأعضاء مختبر كيريشوك على المناقشات المفيدة. كما أشكر الدكتور دوغلاس سي والاس على توفير الفئران AAC1 بالضربة القاضية. التمويل: تم دعم A.M.B من قبل جائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34630062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 Olympus UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries Sutter Instruments BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer Molecular Devices
Faraday cage Homemade
French Press Glen Mills 5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope Olympus IX71 or IX73
Micro Forge (Narishige) MF-830
Micromanupulator MPC-385 Sutter Instruments FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge World Precision Instruments MEH3F4515
Micropipette Puller (Sutter Instruments) P97
Mini Cell for French Press Glen Mills 5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM Cole Parmer EW-50705-50
Objective 100X magnification Nikon  lens MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10 Molecular Devices
Perfusion chamber Warner Instruments RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml Wheaton 358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD Thermo Scientific 75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness Warner Instruments 640700
Vibration isolation table Newport VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid Sigma Aldrich G1951
D-mannitol  Sigma Aldrich M4125
EGTA  Sigma Aldrich 3777
HEPES  Sigma Aldrich H7523
KCl  Sigma Aldrich 60128
MgCl2  Sigma Aldrich 63068
sucrose  Sigma Aldrich S7903
TMA  Sigma Aldrich 331635
TrisBase  Sigma Aldrich T1503
TrisCl  Sigma Aldrich T3253

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
  5. Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
  6. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  7. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
  8. Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
  9. Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
  10. Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
  11. Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
  12. Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
  13. Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
  14. Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
  15. Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
  16. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
  17. Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
  18. Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
  19. Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
  20. Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
  21. Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).

Tags

علم الأحياء ، العدد 171 ،
استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertholet, A. M. The Use of the… More

Bertholet, A. M. The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria. J. Vis. Exp. (171), e62618, doi:10.3791/62618 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter