Summary
この方法の記事では、ミトコンドリアの熱生成能力を研究するための新しいアプローチであるパッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るH+ リークを測定する主な手順を詳述します。
Abstract
ミトコンドリア熱発生(ミトコンドリアアンカップリングとしても知られている)は、メタボリックシンドロームと戦うためのエネルギー消費を増加させるための最も有望な標的の1つである。茶色脂肪やベージュ脂肪などの熱発生組織は、熱産生のために高度に専門化されたミトコンドリアを発達させる。主にATPを産生する他の組織のミトコンドリアも、ミトコンドリア全体のエネルギー産生の最大25%を熱に変換し、したがって、全身の生理機能に大きな影響を与える可能性があります。ミトコンドリア熱発生は、体温を維持するために不可欠であるだけでなく、食事誘発性肥満を予防し、活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する。ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の重要な調節因子であるため、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発に役立つであろう。重要なことに、ミトコンドリアにおける熱発生の急性活性化を制御する正確な分子機構は、あまり定義されていない。この情報の欠如は、主に、結合解除タンパク質を直接測定する方法が不足しているためです。ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の最近の開発により、ミトコンドリア熱発生の起源における現象、IMMを介したH+ リークの直接研究が初めて可能になり、それを担うミトコンドリアトランスポーター、褐色およびベージュ色の脂肪に特異的な脱共役タンパク質1(UCP1)、および他のすべての組織に対するADP / ATPトランスポーター(AAC)の最初の生物物理学的特徴付けが可能になった。このユニークなアプローチは、H+ リークとミトコンドリア熱発生を制御するメカニズムと、メタボリックシンドロームと戦うためにそれらをどのように標的にすることができるかについての新しい洞察を提供します。この論文では、IMMを通るH+ 電流を直接測定することによってミトコンドリアの熱発生能力を研究するためにミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論について説明します。
Introduction
ミトコンドリアは細胞の原動力として有名です。実際、それらは化学エネルギーの主要な供給源であるATPです。あまり知られていないのは、ミトコンドリアも熱を発生するということです。実際、すべてのミトコンドリアは常に2種類のエネルギー(ATPと熱)を生成し、2つのエネルギー形態の微妙なバランスが代謝細胞の恒常性を定義します(図1)。ミトコンドリアがATPと熱の間でどのようにエネルギーを分配するかは、生体エネルギー学の分野では確かに最も基本的な問題ですが、まだほとんど知られていません。ミトコンドリア熱産生(ミトコンドリア熱発生と呼ばれる)を増加させ、その結果ATP産生を減少させるとエネルギー消費が増加することが知られており、これはメタボリックシンドローム1と戦うための最良の方法の1つです。
ミトコンドリア熱発生は、ミトコンドリア内膜(IMM)を横切るH+リークに由来し、基質酸化の脱結合とATP合成、その結果生じる熱の生成につながるため、「ミトコンドリアアンカップリング」1という名前が付けられています(図1)。このH+リークは、アンカップリングタンパク質(UCP)と呼ばれるミトコンドリアトランスポーターに依存します。UCP1 は最初に同定された UCP でした。それは、ミトコンドリアが熱産生に特化している熱発生組織、褐色脂肪、およびベージュ脂肪でのみ発現される2,3,4。骨格筋、心臓、肝臓などの非脂肪組織におけるUCPの同一性は、依然として議論の余地がある。これらの組織におけるミトコンドリアは、全ミトコンドリアエネルギーの約25%を熱に変換することができ、これは全身の生理機能に大きな影響を与える可能性がある1。深部体温を維持することに加えて、ミトコンドリア熱発生はまた、カロリーを減らすことによって食事誘発性肥満を防ぎます。さらに、ミトコンドリアによる活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する1。したがって、ミトコンドリア熱発生は、正常な老化、加齢性変性障害、および虚血再灌流などの酸化ストレスを伴う他の状態に関与する。したがって、ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の強力な調節因子であり、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発を促進するであろう。
ミトコンドリア呼吸は、細胞代謝におけるミトコンドリア熱発生の重要な役割を明らかにした最初の技術であり、コミュニティ1で依然として最も人気があります。この技術は、ミトコンドリアH+リークが活性化されると増加するミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)による酸素消費量の測定に基づいています。この技術は、道具的ではあるが、IMM 1を横切るミトコンドリアH+リークを直接研究することはできないため、特にATP産生と比較して熱産生が二次的である非脂肪組織において、IMM1の原因となるタンパク質の正確な同定および特性評価を困難にする。最近、ミトコンドリアに適用されるパッチクランプ技術の開発は、様々な組織におけるIMM全体にわたるH+リークの最初の直接研究を提供しました5、6、7。
IMM全体のミトコンドリアパッチクランプは、Kirichokらによって再現可能な方法で最初に確立された8。彼らは、2004年にCOS-7細胞株8からのミトプラストを用いてミトコンドリアカルシウムユニポーター(MCU)電流の最初の直接測定を説明した。その後、Kirichok研究室は、マウス9およびショウジョウバエ組織9のIMMからのカルシウム電流を示した。他の研究室は現在、MCU10、11、12、13、14の生物物理学的特性を研究するためにこの技術を日常的に使用しています。カリウムと塩化物のコンダクタンスのIMMパッチクランプ分析も可能であり、いくつかの論文で言及されていますが、まだ出版物6、7、9の主な主題ではありません。IMMを横切るH+電流の最初の測定は、2012年にマウスの褐色脂肪ミトコンドリア6から、そして2017年にマウスベージュ脂肪ミトコンドリアから報告されました7。この電流は、熱発生組織の特異的な脱共役タンパク質、UCP1 6,7によるものである。2019年に発表された最近の研究では、AACが心臓や骨格筋などの非脂肪組織におけるミトコンドリアH+リークの原因となる主なタンパク質として特徴付けられました5。
このユニークなアプローチにより、ミトコンドリアの熱発生を担うミトコンドリアイオンチャネルとトランスポーターの直接高分解能機能解析が可能になりました。この方法の拡大を促進し、ミトコンドリア呼吸などの他の研究を補完するために、UCP1およびAACによって運ばれるH+ 電流を測定するための詳細なプロトコルを以下に説明する。1)UCP1依存性H+ 電流を分析するためのマウス褐色脂肪からのミトコンドリア単離およびAAC依存性H+ 電流を分析するための心臓からのミトコンドリア単離、2)外側ミトコンドリア膜(OMM)の機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製、3)IMM全体にわたるUCP1およびAAC依存性H+ 電流のパッチクランプ記録。
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Protocol
実施されたすべての動物実験手順は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:ミトコンドリア分離手順は、差動遠心分離に基づいており、組織ごとにわずかに異なります。例えば、褐色脂肪組織は脂質が非常に豊富であるため、ミトコンドリアを採取する前に細胞破片および細胞小器官を脂質相から分離するための追加のステップが必要である。混乱を避けるために、2つのミトコンドリア分離手順(1つは褐色脂肪から、もう1つは心臓から)を以下に詳述します。
1. マウス肩甲骨間褐色脂肪からのミトコンドリア単離(Bertholet et al. 2020より改変)15
- 米国獣医師会パネルおよびIACUC委員会が推奨するように、CO2 窒息およびその後の子宮頸部脱臼を用いてC57BL/6雄マウスを安楽死させる。
- 腹をテーブルに向けるようにマウスを配置した後、アルコールを噴霧して毛髪をきれいにし、濡らす(Mann et al., 2014から修正)16。
- ピンセットで皮膚をつかんだ後、背中上部に2cmの切開を行います。
- 蝶の形をした二葉の器官に対応するマウスの褐色の肩甲骨間脂肪を抽出する16。
- 褐色脂肪を、予め氷上に置いた5mLの低温単離緩衝液(表1)で満たされた35mmペトリ皿に移す。
- 双眼鏡の下の白い脂肪から茶色の脂肪をきれいにします。
- 褐色脂肪を5mLの冷間分離緩衝液(表1)を含む10mLビーカーに移し、それを細片に切り刻む。氷冷した10mLガラスホモジナイザー(プラスチック材料ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)乳棒)に移す。
- オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を275回転/分の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。
- ホモジネートを8,500 x g で15 mLの氷冷円錐管で4°Cで10分間遠心分離します。脂質相を含む上清を捨てる。
- ペレットを5mLの氷冷分離緩衝液(表1)に再懸濁し、275回転/分の速度で6回の低速ストロークで氷上で懸濁液を2回目に均質化する。
- ホモジネートを15mLの氷冷円錐管に移し、700 x g で4°Cで10分間遠心分離して、すべての核および未切断の細胞をペレット化する。
- 上清を新鮮な15mLチューブに集め、氷の上に置きます。
- 上清を8,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ミトコンドリアを含むペレットを得た。
- ミトコンドリアを含むペレットを3.8mLの氷冷高張マンニトール緩衝液(表2)に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。
2. マウス心臓からのミトコンドリア単離(Garg et al. 2019より改変)17
- 米国獣医師会パネルおよびIACUC委員会が推奨するように、CO2 窒息およびその後の子宮頸部脱臼を用いてC57BL/6雄マウスを安楽死させる。
- マウスを背中に置いた後、アルコールをスプレーして髪をきれいにし、濡らします。次に、ピンセットで皮膚をつかんだ後、胸郭に2cmの切開を行います。
- 動物の胸から心臓を解剖し、それをすすぎ、5mLの冷間隔離溶液を含む10mLビーカーですべての血液を除去した(表1)。
- 心臓から微量の血液が取り除かれたら、5 mLの冷間隔離バッファー(表1)を含む別の10 mLビーカーに移して、それを細かく切り刻みます。次いで、氷冷した10mLガラスホモジナイザー(PTFE乳棒)に移す。
- オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を275回転/分の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。
- ホモジネートを15mLの氷冷円錐管に移し、700 x g で4°Cで10分間遠心分離してペレット核および未破砕細胞を得た。
- 上清を新鮮な15mLチューブに集め、氷の上に置きます。
- 上清を8,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ミトコンドリアを含むペレットを得た。
- ミトコンドリアペレットを3.8mLの氷冷高張マンニトール緩衝液(表2)に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。
3.OMMの機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製。
メモ: フレンチプレス手順では、マトリックスやクリスタを含め、整合性を維持したまま IMM を OMM から解放することができます (図 2)18。ミトコンドリアは、高張マンニトール緩衝液中でプレインキュベートされ(表2)、OMMが破裂したときにIMMの劇的な伸張を避けるために、フレンチプレス手順中により低い圧力を受ける。
- ミトコンドリア-高張-マンニトール懸濁液をフレンチプレスの冷蔵ミニ圧力セル(ピストン直径3/8インチ)に充填します(図3A)。
- フレンチプレスの ミディアム モードを選択し、フレンチプレスのダイヤルの110で褐色脂肪ミトコンドリアの場合は110、心臓ミトコンドリアの場合は140(〜2,000psi)でミニ圧力セルを介して懸濁液を圧縮します。 懸濁液が約1滴/秒の割合でミニ圧力セルから出てくることを確認します。
- 15 mLの氷冷円錐管に滴を集める。
- 懸濁液を10,500 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
- ミトプラストペレットを0.5〜2mLの氷冷高張-KCl緩衝液(表3)に再懸濁し、懸濁液を氷上に保存する。
注:茶色の脂肪と心臓のマイトプラストはパッチクランプ録音の準備ができており、約3〜6時間使用可能なままであるはずです。
4. UCP1およびAAC 5,7,15を介したH+リークの電気生理学的記録
メモ:次の電気生理学的セットアップ(図3B)を使用してください:微分干渉コントラスト(DIC)を備えた倒立顕微鏡、60倍の水浸漬対物レンズ、防振テーブル、ファラデーケージ、低ノイズ記録をサポートする標準アンプ、電気生理学的セットアップに使用される標準デジタイザ、pClamp 10、マイクロマニピュレータ、バスリファレンス電極(銀/塩化銀ペレット成形を含むマイクロ電極ホルダー内に挿入された3M KCl寒天ソルトブリッジ) ホルダー本体(Liu et al. 2021に記載)19、0.13mmのガラスカバースリップ底部を有する灌流チャンバに、重力供給灌流システムに接続された。
- 記録当日にホウケイ酸ガラスフィラメントをマイクロピペットプーラーを用いて引き抜く。再現性の高いピペット20の生成に用いるプーラーにプログラムを設定する。
メモ: このプログラム設計では、IMM パッチクランプ用に最適化されたピペットを何度か入手する必要があります。標準的なピペットは、プログレッシブコーン形状の細かい先端を備えています。 - 1つのガラスフィラメントをプーラー内に挿入して引っ張り、1つのホウケイ酸フィラメントからほぼ2つの同一のパッチピペットを得る。
- プーラーの加熱ボックスフィラメントの経年劣化により、ピペットが引っ張りサイクル間で不整合になった場合は、プログラムを調整してください。
- ピペットをピペットポリッシャーの内側に置き、フィラメントの近くに先端を倍率100倍下に置き、ファイアーポリッシュします。
- フットペダルを数回押して、先端の曲線を詰まらせたり傷つけたりすることなくフィラメントを加熱します。
- TMAベースのピペット溶液で充填すると、25〜35MΩの間の抵抗を有するピペットが得られるまで磨く(テトラメチルアンモニウムヒドロキシドについてのTMA、 表4)。
- カバースリップ(直径5mm、厚さ0.1mm)を0.1%ゼラチンでプレインキュベートしてミトプラスト付着を減少させ、KCl浴溶液(表5)ですすいでから、ミトプラスト懸濁液を沈着させる。
- 濃縮マイトプラスト懸濁液35 μLと500 μLのKCl浴溶液(表5)を混合して生希釈液を調製し、4ウェルプレートのウェルに予め置いたカバースリップの上に置きます。
- 氷上で15〜20分間インキュベートし、マイトプラストをカバースリップに沈殿させる。
- 浴槽を約50μLのKCl浴液で完全に満たします(表5)。
- 先端が曲がった薄い微小解剖ピンセットを使用して、カミトプラストを含むカバースリップをチャンバー内に移す。
- カバースリップをチャンバーの底部に配置します。カバースリップ上でミトプラストを安定に保つためにチャンバーを灌流しないでください。
- 60倍の対物レンズで顕微鏡下でカバースリップをスキャンして、8の形の個々の非接着ミトプラストを選択します。
- ピペットにピペット溶液(約50 μL)をロードし、ピペットホルダーに入れます。
- マイクロマニピュレーターでピペットをバス溶液に入れ、選択したマイトプラストのすぐ上に近づけてIMMに近づきます。アンププログラムは、ピペットが入浴液に入ると、ピペットの抵抗を与えます。膜電位を0mVに保持し、アンププログラムのメンブレンテストコマンドを使用して10mVパルスを印加します。
- わずかな負圧をかけると、IMMでギガシールをすばやく作成します(図2B)。
- 実験中のピペットのドリフトによるシールの破損を避けるために、マイトプラストを取り付けてピペットを持ち上げ、カバースリップから遠ざけます。
- マイトプラスト全体の構成をテストする前に、アンププログラムの「メンブレンテスト」コマンドで浮遊容量トランジェントを補償し、侵入後のミトプラスト膜の正しい静電容量(Cm)測定値を取得します。
- アンププログラムで短時間(5~15ms)の電圧パルス(250~600mV)を印加し、ガラスピペットの下のメンブレンパッチを破裂させ、ミトプラスト全体の構成を実現します(図2C)。成功した慣らし運転は、容量トランジェントの再出現によって反映されます。
- ブレークイン後、容量トランジェントをアンププログラムのメンブレンテストオプションに合わせ、メンブレン容量(ミトプラストのサイズを反映する)とそのアクセス抵抗Ra(ミトプラスト構成全体の品質を反映する)を評価します。侵入後、Raは40~80MΩの範囲になります。パッチクランプ実験に使用されるミトプラスト(サイズが2〜6μm)は、典型的には0.5〜1.1pFの膜容量を有する。
- ブレークインの直後に、灌流を開始してKCl浴液(表5)をHEPES浴溶液(表6)に交換する。
- アンププログラムで設計された850 msのランププロトコルを、5 s間隔で-160 mV~+100 mVの範囲で適用し、ミトプラストを0 mVに保持します。このプロトコルは、UCP16、7、15およびAAC 5試験で機能します(図4および図5)。
メモ: UCP1 および AAC に依存する H+ 電流測定では、すべての電気生理学的データを 10 kHz で集録し、アンプとデジタイザを駆動する適切なソフトウェアを使用して 1 kHz でフィルタリングすることをお勧めします。
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Representative Results
ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の開発は、IMMとそれに関与するミトコンドリアトランスポーターUCP1およびAACを介したH+ リークの最初の直接研究を提供しました。UCP1およびAAC依存性のH+ リークの電気生理学的分析は、ミトコンドリアの熱発生能力の第一目瞭然を提供することができる。結果のセクションでは、UCP1 および AAC を介して H+ リークを測定するための標準的な手順について説明します。
UCP1依存のH+電流測定(図4)6、7、15
電圧ランププロトコルの適用は、UCPの必要な活性化剤である外因性脂肪酸(FA)を添加することなく、褐色脂肪のIMM両端に大きな振幅H+電流を誘導します(図4A)。これは、膜に関連するホスホリパーゼ活性によるFAの局所産生に起因する褐色およびベージュ色の脂肪IMMの特異的な特徴である。ランププロトコルに応答してH+電流が発生すると、電流振幅が安定するのを待つことが重要です。UCP1を介したH+電流振幅の定量化には、ゼロUCP1電流に対応するベースラインの決定が必要である。H+電流振幅の安定性に達したら、UCP1阻害剤グアノシン二リン酸(GDP - 1mM、図4A)またはFAキレート剤(0.5%FAフリーウシ血清アルブミン、図示せず)または10mMメチルベータシクロデキストリン(MβCD)のいずれかを内因性膜FA抽出のために灌流することが推奨される、図4B、黒色微量)。 残留電流は、UCP1電流の振幅が決定される電流です。異なるミトプラストにおけるUCP1電流の振幅を比較するために、各ミトプラストの電流密度(pA/pF)は、UCP1電流をミトプラスト容量(Cm)5,7で正規化することによって計算されます。電流は、アラキドン酸(AA)またはオレイン酸(OA)(1〜2μM)を用いた外因性長鎖FAの添加によって再活性化することができる。褐色およびベージュ色の脂肪IMMは両方ともPLA2活性を有するので、内因性膜FAは、浴からMβCD/アルブミンを洗浄してから数分以内に部分的に再生され、UCP1 6,7を介してH+電流の再活性化をもたらす。予想通り、この電流はUCP1-/-マウスのIMMで完全に消失します(図4A)6,7。
同じ組織の異なるミトプラストまたは異なる組織(茶色およびベージュ色の脂肪)からのミトプラストのUCP1の密度および活性を比較するより正確な方法は、IMM 6,7の表面におけるFA濃度を制御することである。実際、H+電流振幅は、IMMあたりのUCP1タンパク質量だけでなく、内因性FAの産生のためにも、ミトプラスト間で変動する可能性がある。したがって、IMMから内因性FAを抽出し、既知の濃度で外因性FAを添加することによってUCP1依存性H+電流を再活性化することが推奨される。これを行うには、まず、10mM MβCDを含むHEPES浴溶液(表6)を灌流することによって、内因性FAをIMMから抽出しなければならない。次に、UCP1を介したH+電流の再活性化を、外因性FAの正確な濃度のみによって可能にするために、後者はHEPES/MβCDバックグラウンド上で灌流され、IMMから産生されるFAを連続的に抽出する。
UCP1への結合に関するプリンヌクレオチドとFAとの間の競合の研究は、パッチクランプ技術6、7、15を用いても可能である。プリンヌクレオチド(例えば、Mg2+遊離ATP)によるUCP1の阻害は、2つの異なる濃度のFAと比較することができる(理想的には10倍)。この目的のために、内因性膜FAは、まず、10mM MβCDを塗布することによって除去される(図4B、黒色痕跡)。10mM MβCDの背景に適用される外因性FAs(例えば、ここでは、0.5mM FAのみが示されている)の適用は、局所的に産生されたFAが膜から直ちに抽出されるので、活性化FAの濃度の正確な制御を可能にする。この状態では、外因性FAは主にH+ 電流の発生に関与しています。その後、異なる濃度のATPをOA/MβCD溶液に添加して、試験したFA濃度ごとにIC50ATP を評価し、FAがUCP1への結合に関してプリンヌクレオチドと競合するかどうかを確立する。
AAC依存のH+電流測定(図5)5
褐色脂肪とは異なり、骨格筋や心臓などの非脂肪組織のIMMは、侵入直後に測定可能なH+を発症しない(図5、黒い痕跡)。AACを介して測定可能なH+電流を誘導するためには、1〜2μMの外因性FA(AA、図5A、赤色トレース)を含むHEPES浴溶液(表6)を適用することが不可欠です。これは、非脂肪組織のIMMが、茶色およびベージュの脂肪のIMMに見られるように、IMMにFA産生機構を有していないことを示している可能性がある。
AACを介したH+電流振幅の定量化のためのベースライン(またはゼロ電流)は、FAを添加する前にIMMの表面に灌流されたHEPES浴溶液(表6)に対応する。測定されたH+電流がAACによって運ばれることを確認するためには、FAに添加されたAACの特異的阻害剤、1μMのカルボキシアトラクチロシド(CATR、図5A)または4μMのボンクレキ酸(BKA、図示せず)5を適用することが重要であり、これはH+電流をほぼ完全に阻害する。この電流はAAC1-/-マウスのIMMにおいて完全に消失し(図5A)、AAC1は心臓5における優勢なアイソフォームである。
FA依存性H+ リークとヌクレオチド間の相互作用のパッチクランプ分析もAAC5で可能です。しかし、AACとUCP1の間には重要な違いがあります:AACはH+ を運ぶだけでなく、その主な機能はアデニンヌクレオチドADPとATP21を輸送することです。アデニンヌクレオチド交換がFA依存性H+ リークにどのように影響するかを調べるために、1mM Mg2+フリーADPをピペット溶液に添加する。次に、FAがパーフュージョンされ、AACを介してH+ 電流が活性化されます。ピペット溶液中のADPのみがH+ 電流5に干渉しない。安定したH+ 電流振幅に達すると、ADPはFAと同時にパーフューズされます。膜の両側にADPが存在する場合にのみ、AACを介して活性なヌクレオチド交換を生成することは、一定であるが、H+ リークの完全な阻害は決して達成されない(図5B)。これは、AACの2つの輸送モード(FA-H+ 電流およびADP/ATP交換)が競合し、同じ転座経路を介して発生する可能性が高いことを示している可能性がある。ADP/ADPホモ交換は、生理学的ADP/ATPヘテロ交換5に関連する追加の電流を回避するために選択された。
図1:熱とATP産生の間のミトコンドリアエネルギー分布 ミトコンドリアATPと熱産生のメカニズム。ミトコンドリアには2つの膜[OMM(紫色)とIMM(オレンジ色)]があり、ATPと熱生産のための機械が含まれています。ETCはIMM全体にH+ の電気化学的勾配を生成し、ATP合成酵素(AS)によってATPを生成するために使用され、UCPによって熱を生成するために使用される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミトコンドリアパッチクランプ技術(Bertholet et al. 2020から改変)15. (A)ミトコンドリアは遠心分離によって組織溶解物から単離される(紫色のOMM、オレンジ色のIMM)。(B)低圧フレンチプレスはOMMを破裂させ、ミトプラストを与えるIMMを放出する。左パネルはミトプラストを表しており、IMMにOMMの残骸が取り付けられた8字型の形をとっています。ガラスピペットをIMMにアプローチしてギガオームシールを形成します(ミトプラスト取り付け構成)。右パネルにミトプラスト付着体質の写真が示されている。(c)IMM全体の構成(左パネルの図)は、ピペットの下の膜パッチを数回の電圧パルス(200〜500mV)で破った後に得られる。IMM 構成全体の写真を右側のパネルに示します。内向きの電流(I、赤)は負です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フレンチプレスと電気生理学的セットアップ (A) OMMを破裂させてIMMをリリースするのに役立つフレンチプレスの写真。(B)ファラデーケージ、微分干渉コントラスト(DIC)を備えた倒立顕微鏡、60倍の水浸漬対物レンズ、防振テーブル、およびマイクロマニピュレータの写真。標準アンプ、標準デジタイザ、およびPCコンピュータは図に示されていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:褐色脂肪中のUCP1を介したH+電流。 (A)WT(上パネル)およびUCP1−/−マウス(下パネル)から単離された褐色脂肪ミトプラストから記録された代表的なUCP1依存性H+電流。黒で示されている制御H+電流トレースは、IMMが破壊された後の安定化電流振幅に対応しています。その後、1mM GDPを浴液(オレンジ色)に加える。電圧ランププロトコルは、WTトレースの上に示されています。浴およびピペット溶液のpHをピペットミトプラスト図に示す。(イ)褐色脂肪中のプリンヌクレオチドによるUCP1の阻害。代表的なUCP1依存性H+電流は、熱中性におけるマウスの褐色脂肪のIMMの細胞質ゾル表面上の様々な濃度のATPにおける痕跡である。UCP1依存性のH+電流は、0.5mMオレイン酸(OA)と10mM MβCDを混合して活性化された。下のパネルでは、同じトレースが表されていますが、ミトプラスト膜容量で正規化されていません。この図の褐色脂肪マイトプラストは、0.624pFの膜容量を有していた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:心臓ミトプラスト中のAACを介したFA依存性H+ 電流。 (A)WT心臓ミトプラストに2μM AAを浴液(上パネル、オレンジ色)に印加し、1μM CATR(紫色)によって阻害した場合の代表的なAAC依存性H+ 電流。 AAC1 −/−心臓ミトプラストに記録された代表的な痕跡は、下パネルにある。制御電流は黒色です。電圧ランププロトコルは、WTトレースの上に示されています。浴およびピペット溶液のpHをピペットミトプラスト図に示す。(B)ピペット溶液は1mM ADPを含んでいたが、AAC依存性のH+ 電流は2μM AA(オレンジ色)によって誘導され、1mM ADPを浴に添加することによって阻害される(紫色)。電圧ランププロトコルはトレースの上に示されています。浴およびピペット溶液のpHをピペットミトプラスト図に示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 最終濃度 |
| 蔗糖 | 250ミリオンメートル |
| ヘーペス | 10ミリオンメートル |
| ティッカー | 1 ミリオン |
| トリスベースでpHを7.2に調整 |
表1:ミトコンドリア分離バッファー(張度〜300ミリモル/kg)
| 試薬 | 最終濃度 |
| 蔗糖 | 140ミリオンメートル |
| D-マンニトール | 440ミリオンメートル |
| ヘーペス | 10ミリオンメートル |
| ティッカー | 1 ミリオン |
| トリスベースでpHを7.2に調整 |
表2:高張マンニトール緩衝液
| 試薬 | 最終濃度 |
| ティッカー | 750ミリオンメートル |
| ヘーペス | 20ミリオンメートル |
| ティッカー | 1 ミリオン |
| トリスベースでpHを7.2に調整 |
表 3: ハイパートニック KCl バッファー
| 試薬 | 最終濃度 |
| ティッカー | 130ミリオンメートル |
| ヘーペス | 100ミリアンペア月間 |
| ティッカー | 1 ミリオン |
| UCP1 記録のための MgCl2 | 2ミリオンユーロ |
| 又は | |
| AAC録音のためのTrisCl | |
| D-グルコン酸で7.0または7.5に調整されたpH |
表4:TMAベースのピペット溶液(1kgあたり360ミリモルの張度)
| 試薬 | 最終濃度 |
| ティッカー | 150ミリアンペア月間 |
| ヘーペス | 10ミリオンメートル |
| ティッカー | 1 ミリオン |
| トリスベースでpHを7.0に調整 |
表5:KCl浴溶液(1kgあたり〜300ミリモルの張度)
| 試薬 | 最終濃度 |
| 蔗糖 | UCP1 録音用に 100 mM |
| 又は | |
| AAC録音のための150 mM | |
| ヘーペス | UCP1 記録用に 150 mM |
| 又は | |
| AAC録音のための100 mM | |
| 1 ミリグラム EGTA | |
| トリスベースでpHを7.0に調整 |
表6:HEPES浴溶液(1kgあたり300ミリモルまでの張度)
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Discussion
この方法の記事は、ミトコンドリア熱発生を担当するIMMを介したH+リークを直接研究する新しいアプローチであるミトコンドリアに最近適用されたパッチクランプ技術を提示することを目的としています5,6,7,15。この技術は組織に限定されず、HAP1、COS7、C2C12、MEF細胞などの異なる標準ヒトおよび細胞モデルにおけるIMMのH+リークおよび他のコンダクタンスを分析するためにも使用することができる。しかし、各ミトコンドリア単離には、各細胞または組織タイプに固有の再調整が必要です。
褐色脂肪5,6および心臓5のIMMを通るH +電流の直接測定における主なステップは、特殊な熱発生組織および非脂肪組織におけるミトコンドリア熱発生に関与するメカニズムを説明するためにここに要約される。実際、この技術の開発により、1)ピペットおよび浴溶液のpH、2)IMM全体の膜電位の制御、3)H+以外のIMMに透過性のあるイオンおよび代謝産物を排除するための溶液の正確な組成などの重要な実験条件を正確に制御しながら、天然の膜環境における2つの主要なUCP(UCP1およびAAC)の高分解能機能解析が初めて可能になりました。TMAベースのピペット(表4)およびHEPESバスソリューション(表6)は、H+電流を記録するように配合されており、IMMに通常不透過性の大きな陰イオンおよび陽イオンに解離する塩のみを含む。浴液は灌流システムを用いて変更することができるが、膜の細胞質ゾル側に異なる処置を適用することを可能にするが、イントラピペット溶液の組成を変更することはできない。これは、マトリックス側で発生する規制メカニズムの理解を制限します。実際、化合物は、ピペットに充填する際にイントラピペット溶液中に存在しなければならない。したがって、H+リークは他の電流を絶縁して研究することができます。薬理学的研究およびKOマウスの使用は、様々な組織のIMMを通るH+電流の原因となるタンパク質の特性評価および同定に不可欠であった5、6、7。これらの結果は、UCP1が褐色およびベージュ色の脂肪、ならびに非脂肪組織におけるAACの主要なUCPであることを確立した。UCP1とAACによって媒介されない他のH+電流が存在する可能性を完全に排除することはできません。しかし、他のH+電流が存在する場合、その振幅は電気生理学的セットアップの分解能を超えていました。ETCのH+ポンピングは、本稿で説明した条件では測定しません。IMM全体の構成に達すると、ミトコンドリアマトリックスは、イントラピペット溶液の灌流によって洗い流されます。膜間空間は、フレンチ・プレスとのOMMを破るステップ以来、もはや存在しない。ETCを介したH+ポンピングに不可欠な呼吸器複合体の基質は追加されていない。したがって、ここで詳述した電気生理学的条件下で活性H+ポンピングを発症する可能性は低い。
切除パッチの単一チャンネル録画については、この記事では説明しません。IMMの両端のUCP1およびAAC依存H+ 電流は、タンパク質密度が高いため堅牢ですが、UCP1およびAACのユニタリ電流の振幅が小さすぎる可能性があるため、シングルチャネル開口部を解決できませんでした。
生化学的研究とは対照的に、この記事で説明するミトコンドリア単離は、高レベルのミトコンドリア純度をもたらす必要はない。実際、多数の個別化されたミトプラストと細胞破片からなるミトコンドリア製剤を顕微鏡下でスキャンして、パッチを当てる8字型のミトプラストを1つ見つける。ミトプラストの8字型は、フランスのプレス手順によって引き起こされたOMMの穴を通してIMMが放出されたことによるものです(図2)。密度の低いローブはIMM15,17に対応する。適切な調製物は、細胞破片と容易に区別することができる自由に動くマイトプラストによって定義することができる。しかし、IMMの汚染を避けるために破片の数を減らすことが重要であり、これは膜とのガラスピペットのシールの品質に影響を与える可能性があります。顕微鏡下でのこのスキャンステップにより、OMMで区切られたものよりも密度の低いローブによって認識される高いIMM完全性を有するミトプラストを選択することが可能になり、したがって、侵入が成功する可能性が高まる。
この技術は、UCP1およびAAC依存のH+ 電流を天然膜内で直接測定することを初めて提供しました。しかし、ミトコンドリアの完全性と区画化は、OMMの破裂とおそらくクリステのためにもはや存在しません。したがって、無傷のミトコンドリアにおける新たに特徴付けられたタンパク質の生理学的役割を確認するために、ミトコンドリア呼吸などの他の古典的な方法でパッチクランプ分析を補完することが不可欠です。
ミトコンドリアに適用されるパッチクランプ技術は、ミトコンドリアH+ リークと熱発生の原因となる分子メカニズムをよりよく理解するための新しい可能性を提供します。現代の細胞および分子技術と組み合わせることで、この革新的なアプローチは、ミトコンドリアの熱発生能力を制御するメカニズムと、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患と戦うためにそれらをどのように標的にすることができるかについての新しい洞察を提供するでしょう。
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Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
私が彼の研究室で参加した素晴らしい科学について、ユーリー・キリコック博士と、有益な議論をしてくれたキリコック研究所のメンバーに感謝します。また、 AAC1 ノックアウトマウスを提供してくれたダグラス・C・ウォレス博士にも感謝します。 資金調達:AMBは、米国心臓協会キャリア開発賞19CDA34630062の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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