Summary
이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아 열발생(미토콘드리아 비결합이라고도 함)은 대사 증후군과 싸우기 위해 에너지 소비를 증가시키는 가장 유망한 목표 중 하나입니다. 갈색 및 베이지 색 지방과 같은 열 생성 조직은 열 생산을 위해 고도로 전문화 된 미토콘드리아를 개발합니다. 주로 ATP를 생산하는 다른 조직의 미토콘드리아도 전체 미토콘드리아 에너지 생산의 최대 25 %를 열로 변환하므로 전신의 생리학에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아 열발생은 체온 유지에 필수적일 뿐만 아니라 식이요법으로 인한 비만을 예방하고 반응성 산소종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호합니다. 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 핵심 조절자이기 때문에, 이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리와 싸우기 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것이다. 중요하게도, 미토콘드리아에서 열발생의 급성 활성화를 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 제대로 정의되지 않았다. 이러한 정보의 부족은 주로 언커플링 단백질의 직접적인 측정을 위한 방법의 부족 때문이다. 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 최근 개발은 처음으로 미토콘드리아 열발생의 기원에서의 현상에 대한 직접적인 연구, IMM을 통한 H+ 누출, 그리고 이를 담당하는 미토콘드리아 운반체의 첫 번째 생물물리학적 특성화, 갈색 및 베이지 색 지방의 특이적인 단백질 1(UCP1), 그리고 다른 모든 조직에 대한 ADP/ATP 수송체(AAC)를 가능하게 했다. 이 독특한 접근법은 H + 누출 및 미토콘드리아 열 발생을 제어하는 메커니즘과 대사 증후군 퇴치를 목표로하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 논문은 IMM을 통해 H+ 전류를 직접 측정하여 열원성 능력을 연구하기 위해 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론을 설명합니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포의 강국으로 유명합니다. 실제로, 그들은 화학 에너지의 주요 원천 인 ATP입니다. 덜 알려진 것은 미토콘드리아도 열을 발생시킨다는 것입니다. 사실, 모든 미토콘드리온은 두 가지 유형의 에너지 (ATP와 열)를 지속적으로 생성하며 두 에너지 형태 사이의 미세한 균형은 대사 세포 항상성을 정의합니다 (그림 1). 미토콘드리아가 ATP와 열 사이에 에너지를 분배하는 방법은 아직 크게 알려지지 않았지만 생물 에너지 분야에서 가장 근본적인 질문입니다. 우리는 미토콘드리아 열 생산 (미토콘드리아 열 발생이라고 함)을 증가시키고 결과적으로 ATP 생산을 줄이면 에너지 소비가 증가한다는 것을 알고 있으며 이는 대사 증후군1과 싸우는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.
미토콘드리아 열발생은 미토콘드리아 내부 막(IMM)을 가로지르는 H+ 누출로 인해 기질 산화와 ATP 합성의 결합이 해제되어 결과적으로 열이 생성되므로 "미토콘드리아 비결합"1이라는 이름이 붙여집니다(그림 1). 이 H+ 누출은 언커플링 단백질(UCPs)이라고 불리는 미토콘드리아 수송체에 의존한다. UCP1은 최초로 확인된 UCP였다. 그것은 열원성 조직, 갈색 지방 및 미토콘드리아가 열 생산을 전문으로하는 베이지 색 지방에서만 발현됩니다 2,3,4. 골격근, 심장 및 간과 같은 비 지방 조직에서 UCP의 정체성은 논란의 여지가있다. 이들 조직 내의 미토콘드리아는 열로 변환된 총 미토콘드리아 에너지의 약 25%를 가질 수 있으며, 이는 전신의 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있다1. 핵심 체온을 유지하는 것 외에도 미토콘드리아 열 발생은 칼로리를 줄임으로써식이 요법으로 인한 비만을 예방합니다. 또한, 미토콘드리아에 의한 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호한다1. 따라서, 미토콘드리아 열발생은 정상적인 노화, 연령-관련 퇴행성 장애, 및 허혈-재관류와 같은 산화 스트레스를 수반하는 다른 병태에 관여한다. 따라서 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 강력한 조절자이며,이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리학을 퇴치하기위한 치료 전략의 개발을 촉진 할 것입니다.
미토콘드리아 호흡은 세포 대사에서 미토콘드리아 열발생의 중요한 역할을 밝혀내는 최초의 기술이었으며 여전히 지역 사회에서 가장 인기가 있습니다1. 이 기술은 미토콘드리아 H+ 누출이 활성화될 때 증가하는 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)에 의한 산소 소비량 측정을 기반으로 합니다. 이 기술은 도구적이지만 IMM1에서 미토콘드리아 H+ 누출을 직접 연구할 수는 없으므로 특히 ATP 생산과 비교하여 열 생산이 이차적인 비지방 조직에서는 이를 담당하는 단백질의 정확한 식별 및 특성화가 어렵습니다. 최근에, 미토콘드리아에 적용된 패치-클램프 기술의 개발은, 다양한 조직들(5,6,7)에서 전체 IMM에 걸친 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공하였다.
전체 IMM의 미토콘드리아 패치 클램프는 Kirichok et al.8에 의해 재현 가능한 방식으로 처음 확립되었습니다. 그들은 COS-7 세포주8의 미토플라스트를 사용하여 2004 년 미토콘드리아 칼슘 유니포터 (MCU) 전류의 첫 번째 직접 측정을 설명했습니다. 나중에, Kirichok 실험실은 마우스 9 및 초파리 조직9의 IMM에서 칼슘 전류를보여주었습니다. 다른 실험실에서는 MCU10,11,12,13,14의 생물 물리학 적 특성을 연구하기 위해이 기술을 일상적으로 사용합니다. 칼륨 및 염화물 전도도의 전체 IMM 패치-클램프 분석도 가능하며, 몇몇 논문에서 언급되었지만, 아직 간행물 6,7,9의 주요 주제가 되지 않았다. IMM을 통한 H+ 전류의 첫 번째 측정은 2012년 마우스 갈색 지방 미토콘드리아(6)로부터, 그리고 2017년 마우스 베이지색 지방 미토콘드리아(2017년7)로부터 보고되었다. 이러한 전류는 열원성 조직인 UCP1 6,7의 특이적 비결합 단백질에 기인한다. 2019 년에 발표 된 최근 연구는 AAC를 심장 및 골격근과 같은 비 지방 조직에서 미토콘드리아 H + 누출을 담당하는 주요 단백질로 특성화했습니다5.
이 독특한 접근 방식은 이제 미토콘드리아 이온 채널 및 미토콘드리아 열 발생을 담당하는 수송체의 직접적인 고해상도 기능 분석을 허용합니다. 이 방법의 확장을 촉진하고 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 연구를 보완하기 위해 UCP1 및 AAC에 의해 운반되는 H + 전류를 측정하기위한 상세한 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 세 가지 중요한 단계가 설명된다: 1) AAC 의존성 H+ 전류를 분석하기 위해 UCP1 의존성 H+ 전류 및 심장으로부터의 미토콘드리아 분리를 분석하기 위한 마우스 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리, 2) 외부 미토콘드리아 막(OMM)의 기계적 파열을 위한 프렌치 프레스를 이용한 미토플라스트 준비, 3) 전체 IMM에 걸친 UCP1 및 AAC 의존적 H+ 전류의 패치 클램프 기록.
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Protocol
수행 된 모든 동물 실험 절차는 국립 보건원 지침을 준수하며 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
참고: 미토콘드리아 분리 절차는 차동 원심분리를 기반으로 하며 조직마다 약간 다릅니다. 예를 들어, 갈색 지방 조직은 지질이 매우 풍부하기 때문에 미토콘드리아를 수확하기 전에 지질 단계에서 세포 파편과 소기관을 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 혼란을 피하기 위해 두 가지 미토콘드리아 분리 절차 (하나는 갈색 지방에서, 다른 하나는 심장에서)가 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
1. 마우스 견갑골 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리 (Bertholet et al. 2020에서 수정)15
- 미국 수의학 협회 패널 및 IACUC 위원회의 권고에 따라CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 C57BL/6 수컷 마우스를 안락사시킨다.
- 배를 탁자를 향하게 한 마우스를 위치시킨 후, 알코올을 분무하여 모발을 닦고 적셨다 (Mann et al., 2014에서 수정)16.
- 핀셋으로 피부를 잡은 후 등 위쪽에 2cm의 절개를하십시오.
- 나비 모양16을 갖는 두 개의 엽면 장기에 해당하는 마우스의 갈색 견갑골 간 지방을 추출한다.
- 갈색 지방을 얼음 위에 미리 놓은 5 mL의 차가운 분리 완충액 (표 1)으로 채워진 35 mm 페트리 접시로 옮긴다.
- 쌍안경 아래의 흰색 지방에서 갈색 지방을 청소하십시오.
- 갈색 지방을 5 mL의 차가운 분리 완충액 (표 1)과 함께 10 mL 비이커에 옮겨 얇은 조각으로 자른다. 얼음 냉각된 10 mL 유리 호모게나이저 (플라스틱 물질 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 페슬)로 옮긴다.
- 오버 헤드 교반기를 사용하여 275 회전 / 분의 제어 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에서 미리 절단 된 조직을 균질화하십시오.
- 균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브에서 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리한다. 지질상을 함유하는 상등액을 버리십시오.
- 펠렛을 5mL의 빙냉 분리 완충액(표 1)에 재현탁시키고, 두 번째로 275회전/분의 속도로 여섯 번의 느린 스트로크로 얼음 위에 현탁액을 균질화한다.
- 균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브에 옮기고, 이를 700 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 모든 핵 및 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다.
- 신선한 15 mL 튜브에 상층액을 모아 얼음 위에 놓습니다.
- 상층액을 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.
- 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 빙냉 고장성 만니톨 완충액 3.8 mL에 재현탁시키고(표 2) 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.
2. 마우스 심장으로부터의 미토콘드리아 분리 (Garg et al. 2019에서 수정)17
- 미국 수의학 협회 패널 및 IACUC 위원회의 권고에 따라CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 C57BL/6 수컷 마우스를 안락사시킨다.
- 마우스를 등에 대고 알코올을 뿌려 머리카락을 닦고 적시십시오. 그런 다음 핀셋으로 피부를 잡은 후 흉부를 2cm 절개하십시오.
- 동물의 가슴에서 심장을 해부하고 헹구어 차가운 격리 용액 5 mL로 10 mL 비이커에서 모든 혈액을 제거한다 (표 1).
- 심장이 혈액의 흔적을 제거한 후에는 5mL의 차가운 분리 버퍼가 들어있는 다른 10mL 비이커(표 1)로 옮겨 얇은 조각으로 자릅니다. 이어서, 얼음 냉각된 10 mL 유리 균질기(PTFE pestle)로 옮긴다.
- 오버 헤드 교반기를 사용하여 275 회전 / 분의 제어 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에서 미리 절단 된 조직을 균질화하십시오.
- 균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브로 옮기고, 이를 4°C에서 10분 동안 700 x g 에서 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다.
- 신선한 15 mL 튜브에 상층액을 모아 얼음 위에 놓습니다.
- 상층액을 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.
- 미토콘드리아 펠렛을 빙냉 고장성 만니톨 완충액 3.8 mL에 재현탁시키고(표 2) 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.
3. OMM의 기계적 파열을위한 프랑스 프레스로 미토플라스트 준비.
참고: 프랑스어 프레스 절차에서는 IMM을 매트릭스와 크리스타를 포함하여 무결성이 유지된 상태로 OMM에서 해제할 수 있습니다(그림 2)18. 미토콘드리아는 사전-고장성-만니톨 완충액(표 2)에서 인큐베이션되고, OMM이 파열될 때 IMM의 어떠한 급격한 연신도 피하기 위해 프렌치 프레스 절차 동안 더 낮은 압력을 받는다.
- 미토콘드리아-고장성-만니톨 현탁액을 프렌치 프레스의 냉장 미니압력 셀(피스톤 직경 3/8")에 채웁니다(그림 3A).
- 프렌치 프레스의 중간 모드를 선택하고 갈색 지방 미토콘드리아의 경우 프렌치 프레스의 다이얼에있는 110에서 미니 압력 셀을 통해 서스펜션을 압축하고 심장 미토콘드리아의 경우 140에서 (~ 2,000 psi). 현탁액이 약 1 방울 / s의 속도로 미니 압력 셀에서 나오는지 확인하십시오.
- 방울을 얼음으로 식힌 15mL 코니컬 튜브에 모으십시오.
- 현탁액을 4°C에서 10분 동안 10,500 x g 에서 원심분리한다.
- 미토플라스트 펠릿을 빙저온 하이퍼토닉-KCl 완충액 0.5-2 mL에 재현탁시키고(표 3) 현탁액을 얼음 위에 저장한다.
참고 : 갈색 지방과 심장 미토플라스트는 패치 클램프 녹음을 위해 준비가되어 있으며 약 3-6 시간 동안 사용할 수 있어야합니다.
4. UCP1 및 AAC5,7,15를 통한 H+ 누출의 전기생리학적 기록
참고: 다음 전기생리학적 설정을 사용하십시오(그림 3B): 차동 간섭 콘트라스트(DIC), 60x 침수 목표가 있는 반전 현미경, 진동 격리 테이블 및 패러데이 케이지, 저잡음 기록을 지원하는 표준 증폭기, 전기생리학적 설정에 사용되는 표준 디지타이저, pClamp 10, 마이크로 조작기, 욕조 기준 전극(3M KCl-agar 소금 브리지가 성형된 은/염화은 펠릿이 포함된 마이크로 전극 홀더 내에 삽입됨) 홀더 몸체 (Liu et al. 2021에 기재됨)19, 0.13 mm 유리 커버슬립 바닥을 갖는 관류 챔버 내로, 중력-공급 관류 시스템에 연결된다.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 녹화 당일에 붕규산 유리 필라멘트를 당깁니다. 재현성이 높은 피펫을 생성하기 위해 사용되는 풀러 상에 프로그램을 설정한다(20).
참고: 이 프로그램 설계에서는 IMM 패치 클램프에 최적화된 피펫을 얻기 위해 여러 번 시도해야 합니다. 표준 피펫에는 프로그레시브 원뿔 모양의 미세한 팁이 있습니다. - 풀러 내에 하나의 유리 필라멘트를 넣고 당겨서 하나의 붕규산염 필라멘트에서 거의 두 개의 동일한 패치 피펫을 얻습니다.
- 피펫이 풀러의 가열 상자 필라멘트의 노화로 인해 당기는 사이클 사이에 일치하지 않을 때 프로그램을 조정하십시오.
- 피펫 폴리셔 내부에 피펫을 놓고 팁을 필라멘트 근처에 100x 배율로 배치하여 불을 닦습니다.
- 발 페달을 여러 번 눌러 팁 곡선을 막히거나 손상시키지 않고 필라멘트를 가열하십시오.
- TMA계 피펫 용액으로 충전될 때 25 내지 35 MΩ 사이의 저항을 갖는 피펫이 얻어질 때까지 광택화한다(테트라메틸암모늄 하이드록사이드에 대한 TMA, 표 4).
- 미토플라스트 부착을 감소시키기 위해 0.1% 젤라틴으로 커버슬립(직경 5 mm, 두께 0.1 mm)을 사전 인큐베이션하고, 미토플라스트 현탁액을 증착하기 전에 KCl 배쓰 용액(표 5)으로 헹구었다.
- 농축된 미토플라스트 현탁액을 500 μL의 KCl 배쓰 용액과 혼합하여 ∼35 μL의 미희석액을 준비하고(표 5), 이를 4-웰 플레이트의 웰에 미리 놓은 커버슬립 상에 놓는다.
- 미토플라스트가 커버슬립에 침전될 수 있도록 15-20분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 욕조 챔버를 ~50 μL의 KCl 욕조 용액으로 완전히 채운다(표 5).
- 구부러진 팁이있는 얇은 미세 해부 핀셋을 사용하여 챔버 내에서 미토플라스트가있는 커버 슬립을 옮깁니다.
- 커버 슬립을 챔버 바닥에 배치하십시오. 커버 슬립에서 미토플라스트를 안정적으로 유지하기 위해 챔버를 관류하지 마십시오.
- 커버슬립을 현미경으로 60x 목표로 스캔하여 8 모양의 개별 비접착성 미토플라스트를 선택하십시오.
- 피펫 용액 (~ 50 μL)으로 피펫을 적재하고 피펫 홀더에 넣으십시오.
- 미세 조작기를 사용하여 피펫을 욕조 용액으로 가져 와서 선택한 미토플라스트 바로 위에 접근하여 IMM에 가까이 가십시오. 증폭기 프로그램은 피펫이 욕조 용액에 있으면 피펫의 저항을 제공합니다. 멤브레인 전위를 0mV로 유지하고 증폭기 프로그램에서 멤브레인 테스트 명령을 사용하여 10mV 펄스를 적용합니다.
- 약간의 음압을 가하여 IMM으로 기가살을 빠르게 생성합니다(그림 2B).
- 미토플라스트가 부착된 피펫을 올려 커버슬립으로부터 멀리 떨어뜨려 실험 중 피펫 드리프트로 인한 씰 파손을 방지합니다.
- 전체 미토플라스트 구성을 테스트하기 전에 증폭기 프로그램에서 "멤브레인 테스트" 명령으로 이탈 정전용량 과도 상태를 보상하여 침입 후 미토플라스트 멤브레인에 대한 정확한 커패시턴스(Cm) 측정을 얻습니다.
- 증폭기 프로그램을 사용하여 짧은 지속 시간(5-15ms) 전압 펄스(250-600mV)를 적용하여 유리 피펫 아래의 멤브레인 패치를 파열시키고 전체 미토플라스트 구성을 달성하십시오(그림 2C). 성공적인 침입은 정전 용량 과도 상태의 재출현에 의해 반영됩니다.
- 브레이크인 후, 정전용량 과도 상태를 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 옵션과 함께 맞추어 멤브레인 커패시턴스(미토플라스트의 크기 반영)와 액세스 저항 Ra(전체 미토플라스트 구성의 품질 반영)를 평가합니다. 침입 후 Ra는 40 ~ 80MΩ이어야 합니다. 패치 클램프 실험에 사용되는 미토플라스트(2-6 μm 크기)는 전형적으로 0.5-1.1 pF의 막 커패시턴스를 갖는다.
- 침입 직후에, 관류를 시작하여 KCl 배쓰 용액 (표 5)을 HEPES 배스 용액 (표 6)으로 교체하십시오.
- 증폭기 프로그램으로 설계된 850ms 램프 프로토콜을 -160mV ~ +100mV(5초 간격으로 적용)하면서 미토플라스트를 0mV로 유지합니다. 이 프로토콜은 UCP1 6,7,15 및 AAC 5 연구에 적용됩니다(그림 4 및 그림 5).
참고: UCP1 및 AAC 종속 H+ 전류 측정은 10kHz에서 모든 전기생리학적 데이터를 수집하고 증폭기 및 디지타이저를 구동하는 적절한 소프트웨어를 사용하여 1kHz에서 필터링하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 개발은 IMM과 이를 담당하는 미토콘드리아 수송체인 UCP1 및 AAC를 통한 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공했다. UCP1- 및 AAC 의존성 H+ 누출의 전기생리학적 분석은 미토콘드리아의 열원성 용량에 대한 첫눈에 제공할 수 있다. 결과 섹션에서는 UCP1 및 AAC를 통해 H+ 누출을 측정하는 표준 절차에 대해 설명합니다.
UCP1 종속 H+ 전류 측정(그림 4)6,7,15
전압 램프 프로토콜의 적용은 UCP의 필수 활성화제인 외인성 지방산(FA)의 첨가 없이 갈색 지방의 IMM에 걸쳐 큰 진폭 H+ 전류를 유도한다(도 4A). 이는 멤브레인과 관련된 포스포리파아제 활성에 의한 FA의 국부적 생산으로 인한 갈색 및 베이지색 지방 IMM의 특정 특성이다. 램프 프로토콜에 따라 H+ 전류가 발생하면 전류 진폭이 안정화될 때까지 기다리는 것이 중요합니다. UCP1을 통한 H+ 전류 진폭의 정량화는 제로 UCP1 전류에 대응하는 기준선의 결정을 필요로 한다. H+ 전류 진폭의 안정성에 도달하면, UCP1 억제제 구아노신 디포스페이트(GDP - 1 mM, 도 4A) 또는 FA 킬레이터(0.5% FA 프리 소 혈청 알부민, 미도시) 또는 내인성 막 FA 추출을 위한 10 mM 메틸베타 시클로덱스트린(MβCD), 도 4B, 블랙 트레이스)을 관류시키는 것이 좋다. 잔류 전류는 UCP1 전류의 진폭이 결정되는 전류입니다. 서로 다른 미토플라스트에서 UCP1 전류의 진폭을 비교하는 데 도움이 되도록 각 미토플라스트의 전류 밀도(pA/pF)는 UCP1 전류를 미토플라스트 정전용량(Cm)5,7로 정규화하여 계산합니다. 전류는 아라키돈산(AA) 또는 올레산(OA)(1-2 μM)을 사용하여 외인성 장쇄 FA의 첨가에 의해 재활성화될 수 있다. 갈색 및 베이지 색 지방 IMM은 모두 PLA2 활성을 가지고 있기 때문에 내인성 막 FA는 욕조에서 MβCD / 알부민을 세척 한 후 몇 분 이내에 부분적으로 재생되어 UCP1 6,7을 통해 H + 전류가 재활성화됩니다. 예상대로, 이 전류는 UCP1-/- 마우스의 IMM에서 완전히 사라진다(도 4A)6,7.
동일한 조직의 상이한 미토플라스트 또는 상이한 조직으로부터의 미토플라스트(갈색 및 베이지색 지방)의 UCP1의 밀도 및 활성을 비교하는 보다 정확한 방법은 IMM 6,7의 표면에서 FA 농도를 조절하는 것이다. 실제로, H+ 전류 진폭은 IMM 당 UCP1 단백질 양뿐만 아니라 내인성 FA의 생산으로 인해 미토플라스트간에 다를 수 있습니다. 따라서, IMM으로부터 내인성 FA를 추출하고 공지된 농도에서 외인성 FA를 첨가함으로써 UCP1 의존성 H+ 전류를 재활성화시키는 것이 좋다. 이를 위해, 내인성 FA는 먼저 10 mM MβCD를 함유하는 HEPES 배쓰 용액 (표 6)을 관류시킴으로써 IMM으로부터 추출되어야 한다. 그런 다음 외인성 FA의 정확한 농도만으로 UCP1을 통한 H+ 전류의 재활성화를 허용하기 위해 후자는 HEPES/MβCD 배경에 관류되어 IMM에서 생성된 FA를 지속적으로 추출합니다.
UCP1에 결합하기 위한 퓨린 뉴클레오티드와 FA 사이의 경쟁에 대한 연구는 또한 패치-클램프 기술 6,7,15로 가능하다. 퓨린 뉴클레오티드 (예를 들어,Mg2+-free ATP)에 의한 UCP1의 억제는 FA의 2개의 상이한 농도 (이상적으로 10배)와 비교될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 내인성 막 FA는 먼저 10 mM MβCD를 적용함으로써 제거된다 (도 4B, 검정 트레이스). 10 mM MβCD의 배경 상에 적용된 외인성 FAs(예를 들어, 여기서, 단지 0.5 mM FA들만이 도시됨)의 적용은 국부적으로 생성된 FA들이 멤브레인으로부터 즉시 추출되기 때문에 활성화 FA들의 농도의 정밀한 제어를 허용한다. 이 상태에서 외인성 FA는 주로 H+ 전류의 발달을 담당합니다. 상이한 농도의 ATP가 후속적으로 OA/MβCD 용액에 첨가되어 시험된 각 FA 농도에 대한 IC50ATP를 평가하고, 따라서 FA가 UCP1에 결합하기 위해 퓨린 뉴클레오티드와 경쟁하는지 여부를 확립한다.
AAC 종속 H+ 전류 측정(그림 5)5
갈색 지방과는 달리, 골격근 및 심장과 같은 비지방 조직의 IMM은 침입 직후에 측정 가능한 H+를 생성하지 않는다(그림 5, 검정색 흔적). AAC를 통해 측정 가능한 H+ 전류를 유도하기 위해서는 1-2 μM의 외인성 FA(AA, 도 5A, 적색 트레이스)를 함유하는 HEPES 배쓰 용액(표 6)을 적용하는 것이 필수적이다. 이는 비지방 조직의 IMM이 갈색 및 베이지 색 지방의 IMM에서 발견되는 바와 같이 IMM 내로의 FA 생산 기계장치를 갖지 않는다는 것을 나타낼 수 있다.
AAC를 통한 H+ 전류 진폭의 정량화를 위한 기준선(또는 제로 전류)은 FA의 첨가 전에 IMM의 표면에 관류된 HEPES 배쓰 용액(표 6)에 대응한다. 측정된 H+ 전류가 AAC에 의해 운반되는지를 확인하기 위해, H+ 전류를 거의 완전히 억제하는 FA, 1 μM의 카르복시아트랙틸로시드 (CATR, 도 5A) 또는 4 μM의 본크렉산(BKA, 미도시)5에 첨가된 AAC의 특정 억제제를 적용하는 것이 중요하다. 이 전류는 AAC1-/- 마우스의 IMM에서 완전히 사라지고(도 5A), AAC1은 심장에서 우세한 이소형(5)이다.
FA-의존성 H+ 누출과 뉴클레오티드 사이의 상호작용에 대한 패치-클램프 분석은AAC5로도 가능하다. 그러나 AAC와 UCP1 사이에는 중요한 차이점이 있습니다 : AAC는 H +를 운반 할뿐만 아니라 주요 기능은 아데닌 뉴클레오티드 ADP와 ATP21을 수송하는 것입니다. 아데닌 뉴클레오티드 교환이 FA 의존성 H+ 누출에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위해, 1 mMMg2+-free ADP가 피펫 용액에 첨가된다. 그 후, FA는 AAC를 통해 H+ 전류를 활성화하기 위해 관류된다. 피펫 용액의 ADP 만 H + 전류5를 방해하지 않습니다. 안정적인 H+ 전류 진폭에 도달하면 ADP는 FA와 동시에 관류됩니다. ADP가 AAC를 통해 활성 뉴클레오티드 교환을 생성하는 막의 양쪽에 존재할 때만 일정하지만 결코 H+ 누출의 완전한 억제가 달성되지 않는다 (도 5B). 이는 AAC(FA-H+ 전류 및 ADP/ATP 교환)의 두 전송 모드가 경쟁하고 동일한 전좌 경로를 통해 발생할 가능성이 있음을 나타낼 수 있습니다. ADP/ADP 호모교환은 생리학적 ADP/ATP 헤테로교환5와 연관된 추가적인 전류를 피하기 위해 선택되었다.
그림 1: 열과 ATP 생산 사이의 미토콘드리아 에너지 분포. 미토콘드리아 ATP와 열 생산의 메커니즘. 미토콘드리아에는 ATP 및 열 생산을위한 기계가 포함 된 두 개의 막 (OMM (보라색)과 IMM (오렌지))이 있습니다. ETC는 IMM을 통해 H + 의 전기 화학적 구배를 생성하며, 이는 ATP 신타제 (AS)가 ATP를 생성하는 데 사용되며 UCP가 열을 생성하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 미토콘드리아 패치-클램프 기술 (Bertholet et al. 2020으로부터 변형됨)15. (A) 미토콘드리아는 원심분리에 의해 조직 용해물로부터 분리된다(보라색의 OMM 및 오렌지색의 IMM). (B) 저압 프렌치 프레스는 OMM을 파열시켜 미토플라스트를 제공하는 IMM을 방출한다. 왼쪽 패널은 OMM의 잔해가 IMM에 부착된 8자형 형태를 가정하는 미토플라스트를 나타냅니다. 유리 피펫을 IMM에 접근하여 기가옴 씰(미토플라스트-부착 구성)을 형성합니다. 미토플라스트가 부착된 구성의 사진이 오른쪽 패널에 표시됩니다. (c) 전체 IMM의 구성(좌측 패널의 도면)은 여러 전압 펄스(200-500 mV)에 의해 피펫 하에서 멤브레인 패치를 파단한 후에 얻어진다. 전체 IMM 구성의 사진이 오른쪽 패널에 표시됩니다. 내류 (I, 빨간색)는 음수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 프렌치 프레스 및 전기 생리학 설정. (A) IMM을 해제하기 위해 OMM을 파열시키는 데 도움이되는 프랑스 언론의 사진. (B) 패러데이 케이지, 차동 간섭 대비 (DIC)가있는 반전 현미경, 60x 침수 목표, 진동 격리 테이블 및 미세 조작기의 사진. 표준 증폭기, 표준 디지타이저 및 PC 컴퓨터는 그림에 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 갈색 지방에서 UCP1을 통한 H+ 전류. (A) WT(상부 패널) 및 UCP1-/- 마우스(하부 패널)로부터 분리된 갈색 지방 미토플라스트로부터 기록된 대표적인 UCP1 의존적 H+ 전류. 검정색으로 표시된 제어 H+ 전류 트레이스는 IMM이 파손된 후 안정화된 전류 진폭에 해당합니다. 이어서, 1 mM GDP를 욕조 용액(오렌지)에 첨가한다. 전압 램프 프로토콜은 WT 트레이스 위에 표시됩니다. 욕조 및 피펫 용액의 pH는 피펫-미토플라스트 다이어그램에 표시되어 있습니다. (B) 갈색 지방에서 퓨린 뉴클레오티드에 의한 UCP1의 억제. 대표적인 UCP1-의존성 H+ 전류는 열중성에서 마우스의 갈색 지방의 IMM의 세포질 얼굴에서 ATP의 다양한 농도에서 추적된다. UCP1 의존성 H+ 전류는 10 mM MβCD와 혼합된 0.5 mM 올레산(OA)으로 활성화되었다.전압 프로토콜은 상단에 표시되어 있다. 하부 패널에서, 동일한 트레이스가 나타내어지지만 미토플라스트 멤브레인 커패시턴스로 정규화되지는 않는다. 이 그림에서 갈색 지방 미토플라스트의 막 커패시턴스는 0.624pF였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 심장 편위원체에서 AAC를 통한 FA 의존적 H+ 전류. (a) 대표적인 AAC 의존성 H+ 전류는 WT 심장 유사체에서 배쓰 용액(상부 패널, 오렌지색)에 2 μM AA를 인가하고 1 μM CATR(보라색)에 의해 억제되었다. AAC1 -/- 심장 미토플라스트에 기록된 대표적인 흔적은 하부 패널에 있다. 제어 전류는 검은색입니다. 전압 램프 프로토콜은 WT 트레이스 위에 표시됩니다. 욕조 및 피펫 용액의 pH는 피펫-미토플라스트 다이어그램에 표시되어 있습니다. (b) 피펫 용액이 1 mM ADP를 함유한 반면, AAC 의존성 H+ 전류는 2 μM AA (오렌지)에 의해 유도되고 1 mM ADP를 배쓰 (보라색)에 첨가함으로써 억제된다. 전압 램프 프로토콜이 트레이스 위에 표시됩니다. 욕조 및 피펫 용액의 pH는 피펫-미토플라스트 다이어그램에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 최종 농도 |
| 자당 | 250 밀리가바이트 |
| 헤페스 | 10 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 |
| pH를 트리스베이스로 7.2로 조정 |
표 1: 미토콘드리아 분리 완충액(긴장도 ~ kg 당 300mmol)
| 시약 | 최종 농도 |
| 자당 | 140 밀리지미터 |
| D-만니톨 | 440 밀리가바이트 |
| 헤페스 | 10 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 |
| pH를 트리스베이스로 7.2로 조정 |
표 2: 하이퍼토닉-만니톨 완충액
| 시약 | 최종 농도 |
| 증권 시세 표시기 | 750 밀리가바이트 |
| 헤페스 | 20 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 |
| pH를 트리스베이스로 7.2로 조정 |
표 3: 고장성-KCl 버퍼
| 시약 | 최종 농도 |
| 증권 시세 표시기 | 130 밀리가바이트 |
| 헤페스 | 100 밀리미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 |
| UCP1 레코딩을 위한MgCl2 | 2 밀리지미터 |
| 또는 | |
| AAC 녹음을 위한 TrisCl | |
| pH를 D-글루콘산으로 7.0 또는 7.5로 조정하였다. |
표 4: TMA계 피펫 용액(경도~kg당 360mmol)
| 시약 | 최종 농도 |
| 증권 시세 표시기 | 150 밀리가바이트 |
| 헤페스 | 10 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 |
| pH를 트리스베이스로 7.0으로 조정 |
표 5: KCl 배쓰 용액(강장도 ~ kg당 300mmol)
| 시약 | 최종 농도 |
| 자당 | UCP1 기록용 100mM |
| 또는 | |
| AAC 녹화용 150mM | |
| 헤페스 | UCP1 기록용 150mM |
| 또는 | |
| AAC 녹화용 100mM | |
| 1 mM EGTA | |
| pH를 트리스베이스로 7.0으로 조정 |
표 6 : HEPES 욕조 용액 (경도 ~ kg 당 300 mmol)
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Discussion
이 방법 논문은 미토콘드리아에 최근에 적용된 패치 클램프 기술을 제시하는 것을 목표로하며, 미토콘드리아 열발생 5,6,7,15를 담당하는 IMM을 통해 H + 누출을 직접 연구하는 새로운 접근 방식입니다. 이 기술은 조직에 한정되지 않으며, HAP1, COS7, C2C12 및 MEF 세포와 같은 상이한 표준 인간 및 세포 모델에서 IMM의 H+ 누출 및 다른 전도도를 분석하는데 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 미토콘드리아 단리에는 각 세포 또는 조직 유형에 특정한 약간의 재조정이 필요하다.
갈색 지방 5,6 및 심장 5의 IMM을 통한 H + 전류의 직접 측정의 주요 단계는 전문 열 생성 및 비 지방 조직에서 미토콘드리아 열 발생을 담당하는 메커니즘을 설명하기 위해 여기에 요약되어 있습니다. 실제로이 기술의 개발은 처음으로 1) 피펫 및 욕조 용액의 pH, 2) IMM을 통한 막 전위 제어, 3) H + 이외의 IMM에 투과 할 수있는 이온 및 대사 산물을 배제하기위한 용액의 정확한 구성과 같은 중요한 실험 조건을 정확하게 제어하여 네이티브 멤브레인 환경에서 두 가지 주요 UCP (UCP1 및 AAC)의 고해상도 기능 분석을 가능하게합니다. TMA 기반 피펫 (표 4) 및 HEPES 배스 용액 (표 6)은 H + 전류를 기록하도록 공식화되었으며 IMM에 일반적으로 불침투성 인 큰 음이온 및 양이온으로 해리되는 염 만 포함합니다. 욕조 용액은 관류 시스템을 사용하여 변경할 수 있지만, 다른 치료법이 막의 세포질 측에 적용될 수 있도록, 피펫 내 용액의 조성을 변경하는 것은 불가능합니다. 이것은 매트릭스 측에서 발생하는 규제 메커니즘에 대한 이해를 제한합니다. 실제로, 화합물은 피펫을 채울 때 피펫 내 용액 내에 존재해야합니다. 따라서 H+ 누설은 다른 전류와 분리되어 연구될 수 있다. 약리학적 연구 및 KO 마우스의 사용은 다양한 조직5,6,7의 IMM을 통해 H+ 전류를 담당하는 단백질의 특성화 및 동정에 필수적이었다. 이러한 결과는 UCP1이 갈색 및 베이지 색 지방의 주요 UCP이고 비 지방 조직에서 AAC임을 입증했습니다. 우리는 UCP1 및 AAC에 의해 중재되지 않은 다른 H + 전류의 존재 가능성을 완전히 배제 할 수 없습니다. 그러나 다른 H + 전류가 존재한다면, 그 진폭은 우리의 전기 생리 학적 설정의 해상도를 벗어났습니다. 우리는이 논문에 설명 된 조건 하에서 ETC의 H + 펌핑을 측정하지 않습니다. 일단 우리가 전체 IMM 구성에 도달하면, 미토콘드리아 매트릭스는 피펫 내 용액의 관류에 의해 세척된다. 막간 공간은 프랑스 언론과 OMM을 깨는 단계 이후로 더 이상 존재하지 않습니다. ETC를 통한 H+ 펌핑에 중요한 호흡 복합체의 기질은 추가되지 않았습니다. 따라서 여기에 자세히 설명된 전기생리학적 조건 하에서 활성 H+ 펌핑을 개발할 가능성은 거의 없습니다.
절제된 패치의 단일 채널 기록은 이 문서에서 설명하지 않습니다. IMM에 걸친 UCP1 및 AAC 종속 H+ 전류는 높은 단백질 밀도로 인해 견고하지만 UCP1 및 AAC 단일 전류의 진폭이 너무 작기 때문에 단일 채널 개구를 해결할 수 없습니다.
생화학 적 연구와는 달리,이 기사에서 설명 된 미토콘드리아 분리는 높은 수준의 미토콘드리아 순도를 초래할 필요가 없습니다. 실제로, 다수의 개별화된 미토플라스트와 세포 파편으로 구성된 미토콘드리아 제제는 현미경으로 스캔되어 패치할 8자형 미토플라스트 하나를 찾습니다. 8자형 형태의 미토플라스트는 프랑스 프레스 절차에 의해 야기된 OMM의 구멍을 통해 IMM의 방출로 인한 것이다(그림 2). 덜 조밀 한 엽은 IMM15,17에 해당합니다. 적합한 제제는 세포 파편과 쉽게 구별될 수 있는 자유롭게 움직이는 미토플라스트에 의해 정의될 수 있다. 그러나 멤브레인을 사용한 유리 피펫의 씰 품질에 영향을 줄 수있는 IMM의 오염을 피하기 위해 파편 수를 줄이는 것이 중요합니다. 현미경 하에서의 이 스캐닝 단계는 OMM에 의해 구분된 것보다 덜 조밀한 로브에 의해 인식되는 높은 IMM 무결성을 갖는 미토플라스트를 선택할 수 있게 하고, 따라서 성공적인 침입의 가능성을 증가시킨다.
이 기술은 처음으로 네이티브 멤브레인 내에서 UCP1 및 AAC 종속 H+ 전류의 직접 측정을 제공했습니다. 그러나, 미토콘드리아 완전성 및 구획화는 OMM과 아마도 크리스타의 파열로 인해 더 이상 존재하지 않는다. 따라서 패치 클램프 분석을 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 고전적인 방법으로 보완하여 손상되지 않은 미토콘드리아에서 새로 특성화 된 단백질의 생리적 역할을 확인하는 것이 필수적입니다.
미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 기술은 미토콘드리아 H+ 누출 및 열발생을 담당하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있는 새로운 가능성을 제공합니다. 현대 세포 및 분자 기술과 결합된이 혁신적인 접근법은 미토콘드리아의 열 생성 능력을 조절하는 메커니즘과 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질병을 퇴치하기 위해 어떻게 타겟팅 될 수 있는지에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
나는 Yuriy Kirichok 박사에게 내가 그의 실험실에서 참여했던 위대한 과학과 도움이되는 토론을 위해 Kirichok 실험실의 구성원들에게 감사한다. 또한 AAC1 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Douglas C. Wallace 박사님께도 감사드립니다. 기금: A.M.B는 American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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