Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

زرع ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الرئيسيات غير البشرية لأمراض الشبكية التنكسية

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

الرئيسيات غير البشرية (NHP) هي نموذج مثالي لدراسة العلاجات الخلوية للشبكية البشرية بسبب أوجه التشابه التشريحية والجينية. تصف هذه المخطوطة طريقة للزرع تحت الزرع تحت الجبهي للخلايا الظهارية الصباغية الشبكية في عين NHP واستراتيجيات لمنع المضاعفات أثناء الجراحة المرتبطة بالتلاعب البقعي.

Abstract

تحمل زراعة الشبكية الظهارية الصباغية (RPE) وعدا كبيرا لعلاج الأمراض التنكسية الموروثة والمكتسبة للشبكية. وتشمل هذه الحالات التهاب الشبكية الصباغي (RP) والأشكال المتقدمة من التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، مثل الضمور الجغرافي (GA). وتمثل هذه الاضطرابات مجتمعة نسبة كبيرة من العمى غير القابل للعلاج حاليا على مستوى العالم. وقد ولدت هذه الاحتياجات الطبية غير الملباة اهتماما أكاديميا متزايدا بتطوير أساليب استبدال RPE. من بين النماذج الحيوانية المستخدمة عادة للاختبار قبل السريري للعلاجات ، فإن الرئيسيات غير البشرية (NHP) هي النموذج الحيواني الوحيد الذي يحتوي على بقعة. نظرا لأنها تشترك في هذا التشابه التشريحي مع العين البشرية ، فإن عين NHP هي نموذج حيواني مهم ومناسب قبل السريرية لتطوير المنتجات الطبية العلاجية المتقدمة (ATMPs) مثل العلاج بالخلايا RPE.

تصف هذه المخطوطة طريقة للزرع تحت الدبقي لطبقة أحادية RPE ، مستنبتة على حامل خلية البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) ، تحت البقعة على جرح RPE تم إنشاؤه جراحيا في NHPs المثبطة للمناعة. ال fovea - الجزء اللاوعائي المركزي من البقعة - هو موقع أكبر ضعف ميكانيكي أثناء عملية الزرع. ستحدث صدمة الثقب إذا كان حقن السائل الأولي تحت الشبكية يولد قوة مفرطة على شبكية العين. وبالتالي، يوصى بالحقن البطيء تحت السدادة الزجاجية للسائل المشبع بالفلور (PFCL) باستخدام قنية حقن تحت الشبكية ثنائية التجويف في إعدادات ضغط العين المنخفض (IOP) لإنشاء غشاء شبكية العين.

ينصح أيضا بالمعالجة المسبقة بحقن البلازمينوجين داخل الجسم الزجاجي لإطلاق التصاقات المستقبلات الضوئية RPE-photoceptor parafoveal. هذه الاستراتيجيات مجتمعة يمكن أن تقلل من احتمال تمزق الأبقار بالمقارنة مع التقنيات التقليدية. NHP هو نموذج حيواني رئيسي في المرحلة ما قبل السريرية من تطوير العلاج الخلوي RPE. يعالج هذا البروتوكول التحديات التقنية المرتبطة بتقديم العلاج الخلوي RPE في عين NHP.

Introduction

تحمل زراعة الشبكية RPE وعدا كبيرا لعلاج الأمراض التنكسية الموروثة والمكتسبة في الشبكية. وتشمل هذه الحالات التهاب الشبكية الصباغي (RP ، حثل القضيب المخروطي) والأشكال المتقدمة من AMD مثل GA. بشكل جماعي ، تمثل هذه الاضطرابات نسبة كبيرة من العمى غير القابل للعلاج حاليا على مستوى العالم1,2. يتم تصنيف المراحل المتقدمة من AMD إلى AMD الوعائية الجديدة (nAMD) و GA. في حين أن هناك خيارات علاج فعالة ل nAMD ، مثل حقن عامل النمو البطاني المضاد للأوعية الدموية (anti-VEGF) ، فإن المرضى الذين يعانون من GA لديهم خيارات علاج محدودة. RP هي مجموعة غير متجانسة للغاية من اضطرابات الشبكية الموروثة التي تتميز بانحطاط مستقبلات ضوئية تدريجية للشبكية. في بعض المرضى ، يقع العيب الوراثي المسبب داخل RPE بدلا من المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، قد يكون العلاج البديل RPE استراتيجية بديلة إذا كان العلاج الجيني غير ممكن.

هناك اهتمام كبير بتطوير علاجات فعالة لهذه الحالات. على وجه الخصوص ، اكتسبت زراعة RPE زخما كنهج علاجي محتمل3،4،5،6،7،8. منذ ظهور التقارير الأولى عن زرع RPE في 1980s9 ، توسع المجال ليشمل مصادر خلايا RPE المختلفة ، واستراتيجيات التسليم ، والنماذج التجريبية للمرض والزرع 10،11،12،13،14. من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، فقط NHP لديها "البقعة اللوتية" مع "fovea centralis" ، وهو تخصص تشريحي في القطب الخلفي من شبكية العين مشترك مع البشر. يحتوي fovea على كثافة عالية جدا من المستقبلات الضوئية المخروطية التي تتيح رؤية مركزية عالية الدقة15. لدى NHP أيضا تركيبة جينومية وبروتينية مماثلة16 عند مقارنتها بالبشر. أوجه التشابه هذه تجعله نموذجا حيوانيا مهما ومناسبا لدراسة أمراض العين التي تؤثر على شبكية العين البشرية17,18.

تصف هذه المخطوطة طريقة للزرع تحت الدبقي ل RPE xenograft ، بدعم من حامل خلية PET ، في NHPs المثبطة للمناعة. تم وصف تقنية عبر الجسم الزجاجي لزرع RPE تحت الشبكية في الأرانب في مخطوطة سابقة19. ومع ذلك ، في NHPs ، يتطلب وجود fovea عناية خاصة أثناء التلاعب أثناء الجراحة20. على وجه الخصوص ، هناك خطر كبير من تمزق الحويصلة إذا كانت طرق حقن السائل تحت الشبكية تولد قوة مفرطة على شبكية العين20. لذلك ، ينصب تركيز هذه المخطوطة على استراتيجيات للحد من خطر صدمة البقر غير المقصودة في NHP.

وتشمل هذه استخدام حقن البلازمينوجين داخل الجسم الزجاجي قبل الجراحة لإطلاق الالتصاقات شبه البؤرية والتصوير المقطعي للتماسك البصري المتكامل بالمجهر الجراحي (miOCT) أثناء العملية الجراحية للتصور في الوقت الحقيقي لتشريح البؤرة. ويقترح إنشاء قنية تحت الشبكية مزدوجة التجويف 25/41 G حسب الطلب مع سدادة PFCL داخل العين تحت إعدادات IOP منخفضة للسماح بعملية أكثر تحكما في انفصال الحفريات. علاوة على ذلك ، يوصى بالاستئصال الجراحي ل RPE الأصلي قبل الزرع للسماح بتكامل أفضل بين خلايا RPE المزروعة والمستقبلات الضوئية المضيفة. وأخيرا، يتم وصف بروتوكول تثبيط المناعة الجهازية في الفترة المحيطة وبعد العملية الجراحية لنماذج NHP لتحسين بقاء زينوغرافيت RPE xenograft بعد الزرع11,21.

Protocol

ملاحظة: أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لجمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تم الحصول على موافقة الأخلاقيات من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، SingHealth ، سنغافورة. تم إيواء الحيوانات في مركز SingHealth للطب التجريبي المعتمد من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AAALAC). وتسلط هذه الموافقة الضوء على أن جميع التجارب على الحيوانات تمتثل لمعايير اللجنة الاستشارية الوطنية لبحوث المختبر التي وضعتها هيئة الأغذية الزراعية والبيطرية في سنغافورة. تم وضع البروتوكول التجريبي التالي بناء على التجارب التي أجريت في 6 عيون من 6 لفافة ماكاكا (4 ذكور و 2 إناث ، 4 إلى 6 سنوات ، 2.8 إلى 4.0 كجم) .

1. تحقيق كبت المناعة في نموذج NHP

  1. ابدأ كبت المناعة قبل 7 أيام من الجراحة واستمر في كبت المناعة طوال فترة المتابعة.
  2. وزن NHP قبل إعطاء كبت المناعة الجهازية لضمان جرعة الدواء الدقيقة. يتم وزن الحيوان عند خط الأساس وأسبوعيا بعد ذلك.
  3. استخدم سيروليموس عن طريق الفم ، دوكسيسيكلين ، ومينوسيكلين لتحقيق كبت المناعة الجهازية.
    1. إعطاء جرعة تحميل من 2 ملغ من سيروليموس عن طريق الفم تليها جرعات الصيانة اليومية من 1 ملغ. الحصول على مستوى سيروليموس الدم الأساسي قبل الإعطاء ومراقبة ذلك طوال فترة المتابعة. ضمان تركيز لا يقل عن 5 ميكروغرام / لتر لتثبيط المناعة الكافية.
      ملاحظة: جرعة سيروليموس ليست متكيفة مع الوزن.
    2. إعطاء جرعة من 7.5 ملغم / كغم من الدوكسيسيكلين عن طريق الفم يوميا ، مرتين في اليوم.
    3. إعطاء جرعة من 7.5 ملغم / كغم من المينوسيكلين عن طريق الفم يوميا ، مرتين في اليوم.
  4. أثناء كبت المناعة ، راقب جميع NHPs بحثا عن الآثار الجهازية الضارة. ابحث عن فقدان كبير في وزن الجسم (>10٪) ، وانخفاض الشهية واستهلاك المياه ، وفقدان الشعر غير المريح ، والسلوك غير الطبيعي مثل العدوان والخمول. سيتم إجراء التقييمات في اليوم 3 و 14 و 1 شهر ، تليها التقييمات الشهرية.

2. أداة التعقيم

  1. شطف الأدوات الجراحية باستخدام الماء المقطر.
  2. ضع الأدوات في حمام بالموجات فوق الصوتية مملوء ب 500 مل من الماء المقطر و 2 مل من مطهر الأداة. تنظيف الأدوات باستخدام وظيفة الاجتياح للحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة الأدوات من حمام بالموجات فوق الصوتية. اشطفيه جيدا مرتين بالماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل شطف. جفف الأدوات بالهواء بعد الشطف.
  4. ضع الأدوات في صندوق أدوات. قم بتعقيم الصندوق باستخدام إعداد البرنامج العالمي (تعقيم الأدوات عند 134 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة: 30 دقيقة للتعقيم ، 20 دقيقة للتجفيف).

3. إعداد تريامسينولون خالية من المواد الحافظة (40 ملغ / مل)

  1. باستخدام حقنة 1 مل ، اسحب 1 مل من محلول تريامسينولون (10 ملغ / مل). انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واخلطه مع 4 مل من محلول الملح المتوازن المعقم (BSS).
  2. جهاز الطرد المركزي الحل في 120 × غرام لمدة 5 دقائق. تأكد من وجود جميع جزيئات تريامسينولون في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. تخلص من المادة الفائقة (BSS) من الأنبوب المخروطي.
  3. أعد تعليق جزيئات تريامسينولون مع 5 مل من BSS المعقمة في الأنبوب المخروطي. جهاز الطرد المركزي الحل في 120 × غرام لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبرناتانت مرة أخرى.
  4. كرر الخطوة 3.3 لإكمال غسل جزيئات تريامسينولون باستخدام BSS (3x).
  5. أعد تعليق جزيئات تريامسينولون مع 0.25 مل من BSS المعقم لتحقيق تركيز 40 ملغم / مل.
  6. شفط تريامسينولون المعاد تعليقه (40 ملغم/مل) باستخدام حقنة جديدة 1 مل. قم بتوصيل إبرة ناي حادة الطرف 25 جم ، واحتفظ بالحقنة بمحلول triamcinolone جاهزة للاستخدام أثناء الجراحة.

4. المعالجة المسبقة للعيون NHP مع البلازمينوجين داخل الجسم الزجاجي (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر)

  1. قبل أسبوع واحد من الجراحة ، قم بإعطاء حقنة داخل الجسم الزجاجي (20 ميكرولتر) من بلازمينوجين القرد (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. تخدير NHP قبل الإجراء بحقن عضلي من الكيتامين (10-20 مغ/ كغ من وزن الجسم) وحقن تحت الجلد من الأتروبين (0.05 مغ/كغ من الأتروبين). إدارة قطرات العين التتراكايين للتخدير الموضعي.
  3. قبل الحقن داخل الجسم الزجاجي ، قم بتطهير المنطقة المحيطة بالحجاج بنسبة 10٪ من البوفيدون واليود. تطهير العين عن طريق إعطاء 5 ٪ من البوفيدون اليود إلى دهون الملتحمة في NHP. تأكد من بقاء المحلول في الفورنيس لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل شطفه جيدا باستخدام BSS المعقم.
  4. استخدم حقنة 250 ميكرولتر لشفط بلازمينوجين القرد المخفف مسبقا (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر) من القارورة. نعلق إبرة 30 G على المحقنة ، والحفاظ على البلازمينوجين القرد جاهزة للإعطاء داخل الجسم الزجاجي.
  5. استخدم زوجا من الفرجار لتحديد موقع الحقن على العين. إدارة الحقن داخل الجسم الزجاجي 3 ملم بعيدا عن النسيج.
  6. المضي قدما في الحقن مع الإبرة الموجهة نحو وسط الكرة الأرضية. عند إزالة الإبرة من الكرة الأرضية ، استخدم عصا قضيب قطنية لدك موقع الحقن ومنع ارتجاع محتويات العين.
  7. قم بإعطاء جل أو مرهم زيوت التشحيم لتقليل تهيج سطح العين الفوري بعد العملية الجراحية.

5. الجدول الجراحي وإعداد المعدات

  1. إنشاء حقل معقم. عندما تكون في الحقل المعقم ، ارتد المقشرات الجراحية والقناع وغطاء الشعر في جميع الأوقات.
  2. تحضير تريامسينولون الخالي من المواد الحافظة (40 ملغم / مل) للتصور أثناء العملية الجراحية للزجاجي (انظر القسم 3). تحضير BSS المعقمة في حقنة 10 مل ومواد التشحيم في حقنة 5 مل. ضعها على ستارة.
  3. حافظ على الأدوات الأخرى جاهزة على ستارة ، بما في ذلك الحرير 3-0 ، وخيوط الفيكاريل 7-0 ، وعصي قضيب القطن ، وشرائط إغلاق الجرح ، وأسلاك ألياف الإضاءة الداخلية للثريا.
  4. قم بتوصيل مجموعة استئصال الزجاجية، بما في ذلك الزجاجي عالي السرعة، وكاسيت فنتوري، وجهاز النفخ الداخلي للثريا سعة 25 جم بآلة استئصال الزجاجية باستخدام تقنية معقمة.
  5. افتح زجاجة BSS من فئة العيون سعة 500 مل وقم بتوصيلها بكاسيت Venturi وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. المضي قدما في فتيلة النظام.
  6. قم بتشغيل المجهر miOCT / الجراحي. حدد تكوينات محددة مسبقا للمجهر الجراحي لجراحة الجزء الخلفي والإضاءة. أدخل تفاصيل الإجراء، بما في ذلك الهوية والجنس والجانبية للعين الحيوانية واسم الإجراء.
  7. قم بتركيب عدسة قاع قاع غير ملامسة وواسعة الزاوية بزاوية 128 درجة.
  8. قم بتركيب أغطية يدوية معقمة يمكن التخلص منها على المجهر الجراحي / miOCT. اضبط موضع المجهر والتركيز باستخدام دواسة القدم. المضي قدما في الجراحة.

6. إعداد التخدير وتحديد موقع الحيوان (يفضل أن يقوم به فريق بيطري)

  1. تأكد من صيام NHP لمدة 8 ساعات على الأقل قبل تحريض التخدير لمنع القلس والقيء. تخدير NHP قبل تحريض التخدير (انظر الخطوة 4.2 للحصول على تعليمات التخدير).
  2. تطبيق 1 ٪ تروبيكاميد و 2.5 ٪ فينيليفرين قطرات العين على الأقل 3x مع فترات 5 دقائق لتحقيق توسيع حدقة العين.
  3. إعطاء حقن عضلي من البوبرينورفين (0.005-0.03 ملغم / كغم من وزن الجسم) قبل 30 دقيقة من الجراحة لتحقيق التسكين.
  4. تنبيب NHP مع أنبوب القصبة الهوائية ، وعادة ما يكون حجمها 3-5 ملم. عند محاولة التنبيب، تأكد من توفر عدة أحجام. استخدم أكبر حجم يمكن تمريره عبر الحنجرة دون التسبب في صدمة. قم بقياس CO2 في نهاية المد والجزر لضمان الموضع المناسب لأنبوب القصبة الهوائية.
  5. توصيل 2٪ من غاز الأيزوفلوران عبر أنبوب القصبة الهوائية للحث على التخدير العام. تأكد من حالة التخدير العام (عدم الاستجابة للمس) من خلال تقييم استجابة NHP للمحفزات المحيطة ، بما في ذلك الأصوات واللمس. استخدم 0.5-2٪ من غاز الأيزوفلوران للحفاظ على حالة التخدير العام.
  6. راقب باستمرار مخطط القلب الكهربائي NHP ومعدل التنفس وضغط الدم وتشبع الأكسجين أثناء الجراحة بأكملها.
  7. ضع NHP على الطاولة الجراحية بحيث تكون العين عمودية على المجهر الجراحي. قم بإعطاء جل أو مرهم زيوت التشحيم للعين ، والذي لا يتم تشغيله لتقليل تهيج سطح العين أثناء التخدير.
  8. قطع الرموش باستخدام المقص لتقليل فرصة العدوى.
  9. تطهير المنطقة المحيطة بالحجاج مع 10 ٪ بوفيدون اليود. تطهير العين عن طريق إعطاء 5 ٪ من البوفيدون اليود إلى دهون الملتحمة في NHP. تأكد من بقاء المحلول في الفورنيس لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل شطفه جيدا باستخدام BSS المعقم.
  10. ضع ستارة معقمة بحيث تتركز الفتحة المقطوعة مسبقا فوق العين للخضوع لعملية جراحية. قم بتغطية العين بستارة شق جراحي لاصق.
  11. إجراء استئصال الشمعدان الجانبي على العين للخضوع لعملية جراحية.
  12. أدخل منظار ليبرمان لضمان الفتح الكافي للجفون لتصور العين.

7. استئصال الزجاجية

ملاحظة: للوصول إلى المساحة تحت الشبكية لتوصيل الطعم RPE السقالة PET، يوصي هذا البروتوكول بإجراء استئصال الزجاجية 25 جم ب 4 منافذ (صمام) باستخدام إعداد جراحي قياسي للشبكية الزجاجية وعدسة قاع العين واسعة الزاوية غير ملامسة وواسعة الزاوية بزاوية 128 درجة. يوصي البروتوكول أيضا باستخدام المجهر الجراحي المجهز ب miOCT لتوجيه العديد من الخطوات الجراحية الحاسمة ، بما في ذلك تحريض انفصال البؤرة ، وزرع طعم RPE ، وتصريف السوائل تحت الشبكية.

  1. قم بإجراء فرط الملتحمة بزاوية 360 درجة عن طريق شق الملتحمة بالقرب من الحافة باستخدام زوج من مقص الفاناس. قم بتكبير الغشاء المحيط عن طريق إجراء تشريح حاد.
  2. باستخدام شفرة ميكروفيتوريوريتوريتورينية 25 G ، قم بإجراء استئصال التصلب عند الساعة 8 للعين اليمنى أو الساعة 4 للعين اليسرى. إجراء استئصال التصلب 3 مم من عرف العين.
  3. أدخل وخيط قنية ضخ منفذ جانبي مخصصة 25 G باستخدام خياطة 7-0 vicryl. بعد التأكد من الموقع داخل الجسم الزجاجي ، ابدأ ضخ BSS واضبط النظام للحفاظ على IOP من 20 مم زئبق.
  4. باستخدام تروشار رأس مسطح 25 G ، قم بإجراء استئصال التصلب عند الساعة 2 للعين اليمنى أو الساعة 10 للعين اليسرى ، كما في الخطوة 7.2.
  5. أدخل ضوء الثريا 25 G في التروشار المسطح الرأس وقم بتثبيته بشريط لاصق. اضبط مصدر الضوء على 60٪ تقريبا.
  6. قم بإجراء بضع تصلب آخر ، على غرار الخطوة 7.2 ، عند الساعة 10 للعين اليمنى أو الساعة 2 للعين اليسرى. ضع خيوط فيكريل 7-0 على شكل حرف U حول بضع التصلب دون ربط العقدة. أدخل طرف قاطع استئصال الزجاجية من خلال هذا الفغر المصلب.
  7. ابدأ استئصال الزجاجية حول منافذ الدخول ، متبوعا باستئصال الزجاجية الأساسية القصيرة مع الإعدادات التالية: الحد الأقصى 5000 قطعة في الدقيقة ، والحد الأقصى للشفط عند 400 مم زئبق.
  8. حقن 20-50 ميكرولتر من تريامسينولون (40 ملغ / مل) لتحسين تصور الجسم الزجاجي.
  9. تحفيز انفصال الجسم الزجاجي الخلفي (PVD) عن طريق فصل الجسم الزجاجي عن شبكية العين.
    1. ضع الموجه الزجاجي فوق القرص البصري للسماح بالحث اللطيف ل PVD. احتفظ بالمثبت الزجاجي فقط عند الشفط عند أقصى إعداد يبلغ 400 مم زئبق دون الحاجة إلى أي قطع.
    2. إذا لزم الأمر، استخدم ملقط العين 25 G لمعالجة الجسم الزجاجي على هامش القرص لخلق تمزق في القشرة الزجاجية لتسهيل الانفصال.
      ملاحظة: يعتبر PVD ناجحا إذا انزلقت بلورات تريامسينولون دون عوائق فوق سطح الشبكية.
  10. افتح الغشاء الهيالويدي الخلفي باستخدام القاطع ، وقم بإزالة التنورة الزجاجية المنفصلة حتى القاعدة الزجاجية (عند خط الاستواء الشبكي). شفط أي تريامسينولون متبقي على سطح الشبكية.

8. مفرزة الحفريات الموجهة بواسطة miOCT

  1. حقن 1-2 مل من PFCL لتغطية القطب الخلفي حتى الشبكية الأمامية الطرفية الوسطى.
  2. أدخل العين مع قنية حقن تحت الشبكية. اضبط IOP على 0-4 مم زئبق على جهاز استئصال الزجاجية (تأكد من وجود نظام مانع للماء تماما ؛ إذا لزم الأمر ، اربط الغرز حول المنافذ).
  3. باستخدام قنية الحقن تحت الشبكية ثنائية التجويف المخصصة 25/41 G أو قنية حقن تحت الشبكية 25/38 G متصلة بحقنة 250 ميكرولتر ، قم بإجراء حقنة تحت الشبكية من BSS بلطف للحث على انفصال الشبكية الموضعي. بمجرد أن يعبر البليب فقط fovea ، توقف عن الحقن. قم بإنشاء نقطة ثانية من اتجاه منفصل. دمج كل من blebs لفصل fovea تماما.
  4. تمكين وظيفة miOCT لتصور تشكيل bleb. تأكد من أن عمليات مسح الخط والمكعب في وضع HD باستخدام الإعدادات (512 × 128 بكسل ، عرض المسح الضوئي 4 مم) للحصول على صورة في fovea. راقب صورة miOCT للحصول على انفصال كامل للشبكية العصبية عن طبقة RPE عند الحفرة.
  5. قم بتكبير بضع الشبكية إلى 1.5 مم باستخدام زوج من المقص الزجاجي العمودي 25 جم للشبكية للسماح بالوصول إلى المساحة تحت الشبكية للزرع.

9. إزالة RPE الأصلي

  1. اضبط IOP على 50 مم زئبق على جهاز استئصال الزجاجية.
  2. قم بإزالة PFCL عن طريق البثق النشط باستخدام قنية طرف سيليكون مصقول.
  3. قم بتمديد بضع التصلب بسكين شق 1.4 مم للسماح بدخول جهاز 20 جم.
  4. باستخدام أداة حلقة قابلة للتوسيع 20 G مخصصة ، قم بكشط المضيف تحت المقر RPE لإزالته. كشط مساحة لا تقل عن 2 × 3 مم.

10. تحميل مطلق النار لتسليم زرع خلية RPE أحادية الطبقة

  1. للحصول على تعليمات عامة حول تحميل قطع طعم على شكل رصاصة من مزارع RPE على ناقلات خلايا PET ، راجع منشورا سابقا22.

11. زرع الكسب غير المشروع الموجه miOCT وتعديل الموقف

  1. أدخل طرف جهاز مطلق النار من خلال بضع التصلب عند IOP من 20 مم زئبق. حقن الغرسة نحو الفضاء تحت الشبكية عبر حافة بضع الشبكية التي تم إنشاؤها من سطح الشبكية.
  2. حقن الغرسة مع الجانب الناقل للخلية المواجه لغشاء Bruch وجانب RPE xenograft المواجه للمستقبلات الضوئية.
  3. قم بتمكين وظيفة miOCT لتصور موقع الزرع. تأكد من أن الغرسة تستقر بشكل مسطح على غشاء Bruch في الفضاء تحت الشبكية ، مع شبكية العين العلوية سليمة. تأكد من أنه يقع على مسافة معقولة بعيدا عن بضع الشبكية الذي تم إنشاؤه ولا يصطدم بموقع بضع الشبكية.
  4. اضبط موضع الزرع باستخدام قنية الحقن تحت الشبكية أو مقص داخل العين المنحني بوزن 25 جم لضمان وضعه الجيد تحت البقعة.

12. الصرف الموجه miOCT للسائل تحت الشبكية

  1. باستخدام قنية طرف السيليكون المصقول ، قم بإجراء تبادل للهواء السائل وتصريف السوائل تحت الشبكية بعناية. حاول شفط السائل تحت الشبكية بلطف من انفصال الشبكية وموضع حافة بضع الشبكية.
  2. قم بتمكين وظيفة miOCT للتصور في الوقت الفعلي لتصريف السائل تحت الشبكية الكافي حتى يتم إعادة توصيل الشبكية فوق الغرسة.

13. إنهاء العملية

  1. أغلق بضع تصلب منفذ العمل باستخدام خياطة الفيكاريل الموضوعة مسبقا 7-0. قم بإزالة الثريا 25 جم وقنية التسريب 25 جم. أغلق هذه التصلبات بخيوط فيكريل 7-0.
  2. إدارة 2 ملغ في 0.05 مل من تريامسينولون المواد الحافظة داخل الجسم الزجاجي (40 ملغ / مل) في بضع التصلب في الساعة 8 قبل الخياطة.
  3. جس العين للتأكد من أن IOP ضمن النطاق المقبول. حقن الهواء المصفى (أو BSS) عبر إبرة 30 جم إذا لزم الأمر.
  4. خياطة الملتحمة مع 7-0 خيوط فيكريل واستئصال الكانثوبت مع 5-0 برولين (إزالة بعد 10-14 يوما).

14. رعاية الحيوانات بعد العملية الجراحية

  1. ضع NHP وجها لأسفل لمدة 1 ساعة بعد الجراحة. لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يتم استعادة الوعي. تأكد من توفر طبيب بيطري وفني رعاية للمراقبة والدعم أثناء عملية ما بعد الجراحة.
  2. تطبيق المضادات الحيوية الموضعية (توبراميسين)، ومرهم الستيرويد (ديكساميثازون)، وقطرات العين هوماتروبين مرتين في اليوم لمدة 5 أيام بعد العملية الجراحية.
  3. إعطاء بوبرينورفين آخر تحت الجلد (0.005-0.03 ملغم / كغ من وزن الجسم) حقن 6 ساعات بعد الجراحة للسيطرة الكافية على الألم.
  4. أعد NHP إلى شركة الحيوانات الأخرى فقط عندما تستعيد وعيها بالكامل.
  5. إجراء متابعة التصوير متعدد الوسائط في اليوم 3 و 14 والشهر 1 بعد العملية ، تليها فحوصات شهرية. قم بإجراء ERGs كل شهر بعد الإجراء. قم بإزالة خيوط البرولين 5-0 لبضع الكانثوتوم في اليوم 14 بالتزامن مع فترة التخدير المستخدمة للتصوير متعدد الوسائط. الغرز المتبقية قابلة للامتصاص ، 7-0 خيوط فيكريل ، والتي لا تتطلب إزالة.

15. طرق المراقبة بعد العملية الجراحية للتصوير متعدد الوسائط

  1. سريع NHP بين عشية وضحاها. تخدير NHP قبل التصوير مباشرة (انظر الخطوة 4.2 للدواء والتركيز للتخدير). إذا كان التخدير غير كاف لوقف حركة العين ، ففكر في استخدام التخدير العام.
  2. ضع 1٪ تروبيكاميد و 2.5٪ فينيليفرين قطرات العين لتحقيق توسيع حدقة العين قبل التصوير (انظر الخطوة 6.2).
  3. قم بإجراء التألق الذاتي (AF) وتصوير الأوعية الدموية بالفلوريسين (FFA) والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) باستخدام جهاز OCT عالي الدقة مع عدسة مجال 55 درجة وعدسة مجال 30 درجة.
    1. إعطاء الفلوريسين عن طريق الوريد بنسبة 10٪ (0.1 مل / كجم من وزن الجسم) ل FFA. للحصول على صورة في مرحلة مبكرة، التقط صورة في غضون 30 ثانية من الحقن. للحصول على صورة في مرحلة متأخرة، التقط صورة بعد 5-10 دقائق من الحقن.
  4. قم بإجراء تصوير قاع العين باستخدام كاميرا قاع العين بين المرحلتين المبكرة والمتأخرة من FFA.

16. طرق المراقبة بعد العملية الجراحية لدراسات تخطيط كهربية الشبكية كامل المجال (ERG)

  1. سريع NHPs بين عشية وضحاها. تخدير NHP قبل دراسات ERG (انظر الخطوة 4.2 للدواء والتركيز للتخدير). في جميع تسجيلات ERG ، أعد إدارة التخدير عند الاقتضاء.
  2. افصل التصوير متعدد الوسائط وتسجيلات ERG بفاصل زمني لا يقل عن 2-3 أيام.
  3. بمجرد التخدير ، تأكد من تكييف NHP مع الظلام لمدة 30 دقيقة قبل تسجيل ERG.
  4. ضع أقطاب الإبرة تحت الجلد المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في الكانثي الجانبي الأيسر والأيمن (الأقطاب الكهربائية المرجعية) والجزء الخلفي من جسم NHP (القطب الأرضي). ضع أقطاب العدسات اللاصقة ERG على قرنية NHP باستخدام هلام vidisic للمساعدة في الاتصال والالتصاق.
  5. بناء جميع اختبارات ERG على البروتوكولات البشرية الموصى بها من قبل الجمعية الدولية للفيزيولوجيا الكهربية السريرية للرؤية (ISCEV)14. ابدأ تسجيل ERG في ظل ظروف سكوتوبية وابدأ بومضات باهتة. اتبع توصيات ISCEV للفترات الفاصلة بين المحفزات الموصى بها.
  6. تأكد من أن NHP يتكيف مع الضوء لمدة 10 دقائق قبل الاختبار الضوئي ، مرة أخرى باستخدام توصيات ISCEV القياسية لقوة الخلفية.

17. القتل الرحيم من NHP

  1. للقتل الرحيم NHP للاستئصال ، قم بإعطاء بنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الوريد (75 مغ / كغ) ، على النحو الموصى به من قبل الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية.

Representative Results

تسلط طرق التصوير متعددة الوسائط (تصوير قاع العين ، تصوير قاع العين الذاتي (FAF) ، تصوير الأوعية الدموية بالفلوريسين (FFA) - المرحلة المبكرة والمرحلة المتأخرة ، والتصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT)) الضوء على ميزات عملية زرع الكسب غير المشروع RPE تحت الرقعة تحت الغرامية (الشكل 1). يظهر تصوير قاع العين وضع عملية زرع الكسب غير المشروع RPE في الحفرة دون هجرة بمرور الوقت. يظهر تصوير FAF تغييرات طفيفة في فرط التألق الذاتي (كما هو موضح في المناطق البيضاء عالية الكثافة) المتداخلة مع طعم RPE. لا تظهر المرحلة المبكرة والمتأخرة من FFA أي تسرب واضح (كما هو موضح في المناطق البيضاء عالية الكثافة التي تتضخم مع مرور الوقت) المحيطة بطعم RPE. تظهر الصور الأولية في اليوم 3 عيبا في النافذة بسبب إزالة RPE الأصلي قبل زرع الكسب غير المشروع. تظهر صور OCT البقعية الحفاظ على طبقات الشبكية الخارجية (على وجه الخصوص ، طبقة المستقبلات الضوئية) فوق الكسب غير المشروع RPE مع تقدم الوقت. يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين طبقات شبكية العين سليمة مع عدم وجود دليل على وجود ستيرز دقيق. يشير الحفاظ على الطبقة النووية الخارجية فوق أطراف الكسب غير المشروع إلى أن خلايا RPE تؤدي وظائفها الفسيولوجية للحفاظ على صحة المستقبلات الضوئية.

تسلط المناظر داخل العين والخارجة للقنية ثنائية التجويف 25/41 G الضوء على الآلية التي يتم من خلالها التحكم في IOP أثناء الحقن تحت الشبكية (الشكل 2). يدخل BSS الفضاء تحت الشبكية أثناء حقن السائل تحت الشبكية عبر القنية المركزية الأطول. تؤدي الزيادات الكبيرة في ضغط العين إلى خروج BSS داخل التجويف الزجاجي من العين عبر التجويف المعدني الأكبر للقنية. ثم ينتقل BSS على طول القنية ويتم طرده في النهاية من منفذ الخروج بالقرب من محور القنية. لتقييم ما إذا كانت القنية تعمل كما هو متوقع ، تأكد من تدفق السوائل من منفذ الخروج بالقرب من محور القنية.

يسمح miOCT بتصور أبعاد البليف وتمزق فوفال محتمل أثناء العملية أثناء انفصال البؤرة (الشكل 3). الشكل 3A1-A3 يسلط الضوء على حالة من bleb مع تمزق foveal. في الشكل 3A1 ، في حين أن اللطخة السفلية مرئية تحت المجهر الجراحي ، فإن تصور المسيل للدموع أمر صعب. يوضح الشكل 3A2 القسم الطولي من البليب دون أي دموع. يوضح الشكل 3A3 تمزقا في الحفرة عند تقييم القسم الرأسي من اللطخة. يوضح الشكل 3B1-B3 بليب تم إنشاؤه بنجاح دون وجود أي دموع.

يشير عدم وجود تدهور كبير في الأشكال الموجية ERG إلى أن الوظيفة العالمية لكل من المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط يتم الحفاظ عليها باستخدام xenografts RPE تحت الشبكية (الشكل 4). تظهر الأشكال الموجية ERG الوظيفة الكلية للشبكية. على وجه الخصوص ، ينبغي إيلاء الاهتمام للموجات A لتحديد أي فقدان لوظيفة المستقبلات الضوئية.

Figure 1
الشكل 1: تحليل ما بعد الجراحة في الجسم الحي مع التصوير متعدد الوسائط. (أ) التصوير في الجسم الحي لزرع الكسب غير المشروع RPE تحت الجسم العظمي للعين اليسرى (أصفر في تصوير قاع العين) على طرق تصوير مختلفة (الأعمدة من اليسار إلى اليمين: تصوير قاع العين، التألق الذاتي، تصوير الأوعية الدموية بالفلورسين - المرحلة المبكرة، تصوير الأوعية الدموية بالفلوريسين - المرحلة المتأخرة، التصوير المقطعي للتماسك البصري) لنقاط زمنية تصل إلى 3 أشهر (الصفوف من الأعلى إلى الأسفل: الأيام 3، 14؛ الأشهر 1، 3). تشير العلامة النجمية على صورة قاع العين إلى موقع بضع الشبكية. يشير السهم الأبيض المتقطع إلى اتجاه فحص الخط. يسلط الشكل الأصفر المرسوم على تصوير قاع العين الذاتي الضوء على موقع عملية الزرع. تشير المثلثات البيضاء الموجودة على صور OCT إلى الحواف الجانبية للطعم (وفقا لمسح الخط على صورة قاع العين الملونة). (ب) تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين من عملية الزرع تحت فوفيا ضمورية (بسبب تمزق أثناء الجراحة) مع طبقات مسماة. أشرطة المقياس = 1 مم في A (صور التألق الذاتي و FA) ، و 200 ميكرومتر في A (صور OCT) ، و 100 ميكرومتر في B. الاختصارات: FA = تصوير الأوعية الدموية. OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري; RGC = طبقة خلية العقدة الشبكية; INL = الطبقة النووية الداخلية; ONL = الطبقة النووية الخارجية; RPE = ظهارة صبغة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مناظر داخل العين وخارجية للقنية ثنائية التجويف 25/41 G. (أ) منظر داخل العين للقنية ثنائية التجويف 25/41 G أثناء إنشاء اللطخة تحت الشبكية. يشير السهم الأبيض إلى القنية المركزية الأطول للحقن تحت الشبكية. يشير السهم المتقطع إلى فتح قنية الخروج التي يمر من خلالها BSS للخروج من العين. (ب) منظر خارجي للقنية مزدوجة التجويف 25/41 G. تشير العلامة النجمية إلى منفذ الخروج بالقرب من محور القنية الذي يتم تصريف BSS داخل العين منه. اختصار: BSS = محلول ملح متوازن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: صور المجهر أثناء الجراحة وصور miOCT للبلب تحت الشبكية المعقد بسبب تمزق في الحويصلة. (A1) صورة مجهرية أثناء الجراحة تظهر موضع المسح الطولي (الأزرق) والعرضي (الأحمر) في بليب مع تمزق بوفيال. (ج2) مسح miOCT طولي يظهر فقاعة تحت الشبكية في منطقة البوق (السهم الأصفر). (أ3) مسح miOCT عرضي يلتقط تمزقا فوريا (رأس سهم أبيض) ، إلى جانب بضع الشبكية (علامة نجمية وبليب تحت الشبكية (سهم أصفر). (ب1) صورة مجهرية أثناء العملية تظهر موضع المسح الطولي (الأزرق) والعرضي (الأحمر) في بقعة تشكلت بنجاح. (ب2) مسح miOCT طولي يظهر فقاعة تحت الشبكية في منطقة البوق (السهم الأصفر). (ب3) يظهر مسح miOCT المستعرض بليب تحت الشبكية تم إنشاؤه بنجاح مع فوفيا سليمة بشكل متفوق (الماس الأبيض). اختصار: miOCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري المتكامل بالمجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: ERG للعين المزروعة ب RPE xenograft. بالنسبة للتقييم الوظيفي لشبكية العين، لا تظهر تقييمات ERG الكاملة الميدانية للعين RPE-xenografted التي أجريت عند خط الأساس (الصف العلوي) و 3 أشهر بعد الزرع (الصف السفلي) أي تأثير كبير لزرع RPE xenograft على أي سعات استجابة أو توقيت أو شكل موجي في ظل ظروف مكيفة مع الظلام أو مكيفة مع الضوء. الاختصارات: RPE = ظهارة صبغة الشبكية. ERG = مخطط كهربية الشبكية; DA = الظلام التكيف; LA = تكييف الضوء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

هناك طريقتان رئيسيتان يجري تقييمهما لزرع RPE دون الدبقي - حقن تعليق RPE وزرع طعم RPE أحادي الطبقة. المقارنة التفصيلية بين الطريقتين خارج نطاق هذه المخطوطة. ومع ذلك ، قد يكون زرع طعم RPE أحادي الطبقة مفيدا لأن خلايا RPE أكثر تنظيما في طبقة أحادية من التعليق. يتم تنظيم خلايا RPE في الكسب غير المشروع في طبقة أحادية متقاربة ، تشبه تنظيم طبقة خلايا RPE الفسيولوجية وتمكن خلايا RPE المزروعة من أداء وظائفها الفسيولوجية. وهذا يتيح معلمات جرعات أكثر دقة مقارنة بتعليق الخلايا، وهو أمر وثيق الصلة بالعمل التنظيمي والتوسع الصناعي.

يتطلب توصيل الطعم التصحيحي RPE إلى الفضاء تحت الشبكية معالجة دقيقة للبقعة وإدخال دقيق للطعم في الفضاء تحت الشبكية. أدى التقدم التكنولوجي في الجراحة المجهرية ، مثل miOCT ، وفهم أفضل لديناميكيات أنسجة الشبكية أثناء الجراحة إلى تقليل منحنى التعلم لهذا الإجراء. في هذه المناقشة ، سيتم شرح الأسباب المنطقية للجوانب التالية: (أ) حقن البلازمينوجين قبل الجراحة. ب) استخدام miOCT أثناء العملية الجراحية ؛ ج) استخدام قنية مزدوجة التجويف 41 G مخصصة ، وإعدادات IOP منخفضة ، و PFCL لإنشاء bleb تحت الشبكية ؛ د) كشط طبقة خلايا RPE الأصلية قبل الزرع ؛ v) استخدام سيروليموس ، تريامسينولون ، دوكسيسيكلين ، ومينوسيكلين للحد من رفض الكسب غير المشروع المناعي.

حقن البلازمينوجين قبل الجراحة تطلق التصاقات الشبكية البارافوفية
في التجارب الأولية ، كان من الصعب فصل الحفرة بموجة سائلة واحدة. عند التقييم باستخدام miOCT ، كشفت الصور عن وجود التصاقات شبكية العين الخارجية شبه البؤرية ب RPE الأصلي إلى جانب أدلة على الصدمة داخل الشبكية20. قد تكون هذه الالتصاقات قد أدت إلى توسع رأسي في البليب بدلا من موجة السائل تحت الشبكية المنتشرة عبر محيط الشبكية ، مما أدى إلى صدمة بؤرية. البلازمينوجين هو السلائف غير النشطة للبلازمين ، وهو بروتياز يستهدف الفيبرونيكتين واللامينين. Ocriplasmin هو نوع مهندس بيولوجيا من البلازمين البشري ، معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية (EMA) لعلاج الجر الزجاجي العشوائي مع أو بدون ثقب بقعي مصاحب. ومع ذلك ، فقد اقترحت تقارير ما بعد الموافقة على تطور وذمة البقعة الكيسية بعد حقن الأوكريلازمين تأثيرا أكثر شمولا للإنزيم على شبكية العين23.

وعلى الرغم من عدم تحديد الآليات الدقيقة، فقد اقترح أن البلازمين يمكن أن يضعف التصاق الشبكية من خلال تدهور عناصر مصفوفة المستقبلات البينية المسؤولة عن التصاق المستقبلات الضوئية-RPE24. في هذا البروتوكول ، عولجت عيون NHP بالبلازمينوجين داخل الجسم الزجاجي قبل أسبوع من الجراحة لإطلاق التصاقات الشبكية الخارجية شبه البؤرية. على افتراض ضعف التصاق المستقبلات الضوئية-RPE، هناك حاجة إلى قوة أقل لفصل الشبكية العصبية الحسية، بما في ذلك الحلقة الشافوفية البعيدة، التي تقاوم عادة موجة السائل تحت الشبكية20. وبالتالي ، فإن القوة التي تدار أثناء انفصال الشبكية تؤدي إلى توسيع النقطة عبر محيط الشبكية بدلا من تمديد الشبكية بشكل عرضي. هذا يقلل من خطر تمزق الحمى. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن تأثير البلازمينوجين على البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الكسب غير المشروع لم يدرس في هذا البروتوكول. وينبغي أن تحاول الدراسات المستقبلية تحديد هذا التأثير.

يوفر miOCT التغذية الراجعة التشريحية لتوجيه إنشاء الفقاعات تحت الشبكية ، وزرع الكسب غير المشروع ، وتصريف السوائل تحت الشبكية
يعد التلاعب بالبقعة أثناء العملية الجراحية أمرا أساسيا لتحقيق نتائج جيدة في عملية الزرع. ومع ذلك ، قد لا تكون التغيرات الهيكلية المجهرية للبقعة المتعلقة بالتلاعب واضحة دائما على المجهر التشغيلي. في مثل هذه الإجراءات ، يعد miOCT أداة مهمة توفر ردود فعل في الوقت الفعلي وثلاثية الأبعاد وأثناء الجراحة للبنية البقعية. miOCT مفيد بشكل خاص خلال خطوات انفصال الثقب ، وزرع الكسب غير المشروع ، وتصريف السائل تحت الشبكية باستخدام تبادل السوائل والهواء. أثناء انفصال البؤرة ، يمكن ل miOCT تحديد الأبعاد الرأسية والأفقية لل bleb. يمكن تأكيد الميكروتيرات الدقيقة ، التي قد لا يتم تصورها بوضوح على المجهر الجراحي ، بواسطة miOCT (الشكل 3). أثناء زرع الكسب غير المشروع، يتم توجيه صور miOCT من خلال إظهار موقع الكسب غير المشروع أو قربه من الحفرة، من خلال شبكية العين المنفصلة الأقل شفافية في كثير من الأحيان. يمكن ل miOCT أيضا تسليط الضوء على المناطق المحتملة من التصاق الشبكية أثناء عملية زرع صعبة25. أخيرا ، في عملية تصريف السوائل تحت الشبكية ، يمكن ل miOCT توجيه تصريف السوائل تحت الشبكية بشكل موثوق حتى يتم تحقيق اتصال كامل بالطعم الشبكية RPE.

مزيج من قنية مزدوجة التجويف ، وإعدادات IOP منخفضة ، وسدادة زجاجية PFCL يقلل بشكل تآزري من الصدمة البقعية أثناء إنشاء bleb تحت الشبكية
يمكن أن يحدث تمدد الشبكية العرضي واضطراب السوائل أثناء حقن BSS تحت الشبكية لانفصال البقر مما يؤدي إلى تمزقات بؤرية غير مرغوب فيها. ولمواجهة هذه الظواهر، تبين أن عوامل مثل الموقع النسبي والمسافة من مركز الحفر حيث يبدأ الحقن، وحجم الحقن وسرعته، والدكدس الزجاجي، واختيار الأجهزة تحت الشبكية، وIOP كلها ذات صلة20،26،27. يجب أن يكون موقع اللطخة تحت الشبكية لانفصال البؤرة في مكان بعيد بشكل كاف عن الحفرة ، حيث قد يكون تمدد الشبكية أعلى في موقع بدء البليفة27. يجب أيضا إبقاء IOP منخفضا طوال فترة إنشاء اللطخة تحت الشبكية. عندما يكون IOP للعين مرتفعا ، لوحظت زيادة رأسية أعلى في حجم النفاث بدلا من التمدد على طول محيط شبكية العين ، في حين أن الفقاعات تكون ضحلة عند ضغوط أقل20. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن الحقن داخل الجسم الزجاجي من 50 ميكرولتر سيضاعف بشكل فعال IOP في البشر28 ، نظرا لطول العين الأقصر في NHPs ، فإن ارتفاع IOP أثناء الحقن تحت الشبكية سيكون على الأرجح أعلى وأكثر سرعة من البشر. في حين أن معظم آلات استئصال الزجاجية تتكيف مع تذبذب IOP ، فإن التعديل ليس متزامنا ولكنه عملية تفاعلية تحدث مع استمرار الحقن تحت الشبكية. وبالتالي ، كلما ارتفع IOP ، زاد خطر فرط تمدد الشبكية وما ينتج عن ذلك من صدمة في الفخذ. وبالتالي ، من الضروري الحفاظ على IOP منخفض مستقر أثناء الحقن تحت الشبكية.

يوصى باستخدام قنية تجارية 20/41 G (DORC) أو قنية تحت الشبكية مزدوجة التجويف 25/41 G حسب الطلب للحقن تحت الشبكية. تسمح القنية للسائل بالخروج من التجويف الزجاجي مقابل حقن BSS في الفضاء تحت الشبكية. وهذا يضمن التنظيم "المتزامن" ل IOP أثناء الحقن تحت الشبكية. يظهر مخطط للقنية ثنائية التجويف في الشكل 2. وأخيرا ، يتم استخدام PFCL للحد من خطر تمزقات الأعلاف 20،26،27. وبما أن PFCLs ، مثل الأوكتالين ، لها جاذبية نوعية أعلى ، فإنها تمارس قوة هبوطية على شبكية العين أثناء انفصال الفوفيل29. هذا يزيد من استقرار عملية إنشاء مفرزة البصيلة ويعزز توسع البليب على طول محيط الشبكية. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح للحقن تحت الشبكية من rtPA في وضع نزيف ضخم تحت العليقة بسبب nAMD30.

تسمح إزالة ما قبل الزرع ل RPE الأصلي باستعادة مجمع مستقبلات RPE الضوئية
يجب إزالة RPE المضيف قبل زرع الكسب غير المشروع. وذلك لأن استعادة مجمع المستقبلات الضوئية RPE مطلوب لتمكين عملية زرع RPE من أداء وظائفها الفسيولوجية المتمثلة في دعم المستقبلات الضوئية21. قد يشكل RPE المضيف ، إذا لم تتم إزالته ، حاجزا ميكانيكيا ، مما يمنع استعادة هذا المجمع. يمكن إزالته إما من خلال إعطاء المواد الكيميائية السامة RPE أو باستخدام الوسائل الفيزيائية للإزالة. تشمل طرق الإزالة الكيميائية الإدارة الجهازية أو تحت الشبكية ل يودات الصوديوم31,32. نظرا لأن يودات الصوديوم تسبب تنكسا واسع النطاق للمستقبلات الضوئية وخلايا RPE و Choriocapillaris عند إعطائها ، فإن سميتها الشبكية والجهازية تمنع استخدامها في التجارب البشرية32,33. وبالتالي ، يفضل التقنيات الفيزيائية أثناء الجراحة. تم تصور أساليب فيزيائية مختلفة. عند استخدام الطرق الفيزيائية ، من الأهمية بمكان أن يظل غشاء Bruch غير تالف. أظهرت العديد من الدراسات المخبرية اعتماد بقاء الكسب غير المشروع RPE على غشاء Bruch السليم34,35,36.

ارتبطت محاولات التنضير الهيدروليكي بفواصل في غشاء بروش، وزيادة معدل تطور الغشاء فوق الشبكية، واعتلال الجسم الزجاجي التكاثري، مما أدى إلى انفصال الشبكية الجري37. كما أدت ملعقة مغبرة بالماس مقترحة لتنضير RPE إلى فواصل في غشاء Bruch ، مما أدى إلى تكاثر خلوي من المشيمية إلى الفضاء تحت الشبكية38. ومن المثير للاهتمام أن أداة الحلقة القابلة للتمديد المصممة خصيصا يمكن أن تزيل RPE الفوقية مع الحفاظ على غشاء Bruch في عيون الأرانب والخنازير11,39. كما أن إزالة RPE الأساسي مفيد أيضا لإنشاء نماذج حيوانية مع RPE وضمور الشبكية الخارجي ، على غرار الشكل الضموري المتقدم من AMD. عندما تتم إزالة منطقة بؤرية من RPE من البقعة ، يغلق جرح RPE عن طريق تضخم خلايا RPE المتبقية. ومع ذلك ، ترتبط استجابة التئام الجروح هذه بضمور الطبقة النووية الخارجية40. في حين أن إنشاء نموذج حيواني خارج نطاق هذه المخطوطة، إلا أن إجراء مماثلا يمكن أن يخلق نموذجا حيوانيا للنمط الظاهري AMD الضموري المتقدم لاختبار علاجات الخلايا المشتقة من RPE.

استخدام سيروليموس ، تريامسينولون ، دوكسيسيكلين ، ومينوسيكلين للحد من رفض الكسب غير المشروع المناعي
ويعتقد أن الفضاء تحت الشبكية هو موقع متميز بالمناعة، يتم الحفاظ عليه بواسطة حاجز دم شبكي سليم وعوامل أخرى41. في العديد من الدراسات التي تنطوي على زرع مشتقات الخلايا الجذعية تحت الشبكية مع حاجز دم شبكي سليم، تلعب الأدوية المثبطة للمناعة دورا ضئيلا في بقاء الكسب غير المشروع42. يعتقد أن الحاجز الدموي الخارجي للشبكية يتكون من طبقة RPE الأصلية والتقاطعات الضيقة بين خلايا RPE. في حين أن إزالة RPE الأصلية تسمح بتكامل أفضل بين RPE المزروع والمستقبلات الضوئية المضيفة ، فإن حاجز الدم والشبكية يتعطل في هذه العملية ، مما يزيد من احتمال الرفض المناعي. تقليديا، الخلايا التائية هي محور عملية رفض زرع الأعضاء الأخرى مثل الكلى والكبد43. وبالتالي، استهدفت الأنظمة المثبطة للمناعة الأولية لزرع أنسجة الشبكية نحو الحد من هذه الاستجابات المناعية التكيفية.

سيروليموس ، وهو هدف ميكانيكي لمثبطات راباميسين ، وتاكروليموس ، مثبط الكالسينيورين ، هما مثالان على الأدوية المثبطة للمناعة التي تستهدف الاستجابات المناعية التكيفية. ومع ذلك ، على الرغم من قمع الخلايا التائية الكافية ، لا تزال معدلات البقاء على قيد الحياة من الكسب غير المشروع منخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن خلايا RPE تمنع تنشيط الخلايا التائية من خلال إطلاق العوامل المثبطة وتعزيز توليد الخلايا التائية التنظيمية44. وبالتالي، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن المناعة التكيفية قد لا تكون المساهم الوحيد في رفض الكسب غير المشروع42. يمكن أن يؤدي زرع المنتجات الخلوية تحت الشبكية إلى تراكم وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة45.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي البلاعم في شبكية العين. وهي تتكون من مجموعتين رئيسيتين: 1) الخلايا الدبقية الدقيقة حول الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الداخلية للشبكية و 2) الخلايا الدبقية الصغيرة داخل حمة أنسجة الشبكية. وبما أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي جزء من الاستجابة المناعية الفطرية، فإن القشرانيات السكرية داخل الجسم الزجاجي، مثل تريامسينولون، يمكن أن تقمع الانتشار بوساطة السيتوكين46. يمكن للدوكسيسيكلين والمينوسيكلين أيضا قمع تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ويجب اعتبارهما47,48. وأخيرا، فإن الاختلافات في الرفض المناعي ل RPE allografts مقابل xenografts مفهومة تماما49. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن الأجسام المضادة ضد خلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في مصل نماذج الرفض المناعي في الجسم الحي. ومع ذلك، لا يزال دور هذه الأجسام المضادة وأهمية الرفض بوساطة الأجسام المضادة في بقاء الكسب غير المشروع غير معروف50. وبالتالي ، يقترح نظام متعدد الأدوية يستخدم السيروليموس لقمع المناعة التكيفية ومزيج من تريامسينولون ودوكسيسيكلين ومينوسيكلين لقمع المناعة الفطرية. وقد استخدم هذا النظام بنجاح في الأرانب ذات النتائج الجيدة للبقاء على قيد الحياة من الكسب غير المشروع والحد الأدنى من الآثار النظامية11.

قيود هذه التقنية الجراحية
تصف هذه الورقة طريقة جراحية ممكنة لتوصيل ورقة تطعيم RPE إلى الفضاء تحت الشبكية ل NHP. ومع ذلك ، هذا لا يعني أن هذه هي الطريقة الوحيدة المحسنة. قد يكون لدى جراحي الشبكية والجسم الزجاجي المختلفين تفضيلات أخرى للأجهزة والتقنية. على سبيل المثال ، يمكن لتصميم جهاز الزرع هذا فقط تقديم غرسات مسطحة مدعومة بحامل خلايا أكثر صلابة ، وبالتالي قد لا تكون مناسبة للغرسات المرنة نسبيا (أو المدرفلة). يمكن لعمليات زرع تعليق RPE أن تحذف الكثير من هذه التقنية. وفقا لذلك ، ستتطلب التفاصيل الجراحية تعديلا بناء على كل استراتيجية توصيل.

مع استمرار تزايد الاهتمام بالعلاجات الخلوية لعلاج أمراض الشبكية التنكسية ، سيكون النموذج الحيواني NHP ضروريا في الدراسات قبل السريرية لدراسة العوامل التي تؤثر على بقاء الكسب غير المشروع RPE. في هذه المخطوطة، تم اقتراح استراتيجيات لتمكين التسليم السلس لطعم RPE أحادي الطبقة تحت الرقاقة في عين NHP. يوصى أيضا بطرق لتحسين تصور المضاعفات أثناء الجراحة. ومن المتوقع أن تستمر هذه الأساليب في التحسن مع توسع استخدام العلاجات الخلوية. وينبغي أن تنظر ورقات الطرائق المقبلة أيضا في اقتراح قائمة شاملة بالتحقيقات لتقييم مختلف الجوانب الهيكلية والوظيفية للكسب غير المشروع.

Disclosures

يحمل بوريس ستانزل 9980851 براءة اختراع أمريكي على أداة (مكشطة RPE) المستخدمة في هذه الدراسة. المتحدث الفخري من C. Zeiss Meditec و Geuder إلى Boris Stanzel. وليس لدى المؤلفين الآخرين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device ، A * STAR ، سنغافورة (H17/01/a0/013) ، منحة NUS Start-up NUS NUHSRO/2016/100/SU/01 ، منحة برنامج NUHS للعلماء السريريين (NCSP) وبرنامج البحوث التنافسية التابع للمؤسسة الوطنية للبحوث ، سنغافورة (NRF-CRP21-2018-0008) إلى X.S. ، Hong Leong أموال الأستاذية الممنوحة ل G.E.H. و B.V.S. نود أن نعرب عن تقديرنا للفريق البيطري في منصة النموذج ما قبل السريري الانتقالي (معهد سنغافورة لأبحاث العيون ، سنغافورة) لتقديم الدعم في إعداد جراحة NHP ومتابعة الحيوانات. نود أن نعرب عن تقديرنا لجيل تيو وزملائنا من C. Zeiss Meditec Singapore على الدعم الفني ل OPMI-Lumera 700 مع جهاز OCT المتكامل أثناء الجراحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Tags

الطب، العدد 172،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

زرع ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الرئيسيات غير البشرية لأمراض الشبكية التنكسية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter