Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinal Pigment Epithelium Transplantation i en icke-mänsklig primatmodell för degenerativa retinala sjukdomar

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den icke-mänskliga primaten (NHP) är en idealisk modell för att studera human retinal cellulära terapier på grund av de anatomiska och genetiska likheterna. Detta manuskript beskriver en metod för submacular transplantation av retinal pigment epitelial celler i NHP ögat och strategier för att förhindra intraoperativa komplikationer i samband med makulade manipulation.

Abstract

Retinal pigment epitelial (RPE) transplantation håller stort löfte för behandling av ärvda och förvärvade retinal degenerativa sjukdomar. Dessa villkor inkluderar retinitis pigmentosa (RP) och avancerade former av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), såsom geografisk atrofi (GA). Tillsammans utgör dessa störningar en betydande andel av den för närvarande obehandlade blindhet globalt. Dessa ouppfyllda medicinska behov har genererat ökat akademiskt intresse för att utveckla metoder för RPE ersättning. Bland de djurmodeller som vanligtvis används för preklinisk testning av terapier är den icke-mänskliga primaten (NHP) den enda djurmodellen som har en makula. Eftersom det delar denna anatomiska likhet med det mänskliga ögat är NHP-ögat en viktig och lämplig preklinisk djurmodell för utveckling av läkemedel för avancerad terapi (ATMPs) såsom RPE cellterapi.

Detta manuskript beskriver en metod för submacular transplantation av en RPE monolayer, odlas på en polyeten terephthalate (PET) cellbärare, under makula på en kirurgiskt skapad RPE sår i immunsuppressed NHPs. Fovea-den centrala avascular delen av makula-är platsen för den största mekaniska svagheten under transplantationen. Foveal trauma kommer att uppstå om den första subretinala vätskeinjektionen genererar en överdriven kraft på näthinnan. Därför rekommenderas långsam injektion under perfluorkarbonvätska (PFCL) glasaktig tamponad med en subretinal injektions cannula med dubbla borrhål vid inställningar för lågt intraokulära tryck (IOP) för att skapa en retinal bleb.

Förbehandling med en intravitreal plasminogen injektion för att frigöra parafoveal RPE-photoreceptor vidhäftningar rekommenderas också. Dessa kombinerade strategier kan minska sannolikheten för fostertårar jämfört med konventionella tekniker. NHP är en viktig djurmodell i den prekliniska fasen av RPE cellterapi utveckling. Detta protokoll behandlar de tekniska utmaningarna i samband med leverans av RPE cellulär terapi i NHP ögat.

Introduction

RPE transplantation håller stora löften för behandling av ärvda och förvärvade retinal degenerativa sjukdomar. Dessa villkor inkluderar retinitis pigmentosa (RP, stång-kon dystrofi) och avancerade former av AMD såsom GA. Kollektivt representerar dessa störningar en betydande andel av för närvarande obehandlad blindhet globalt1,2. De avancerade stadierna av AMD kategoriseras i neovaskulära AMD (nAMD) och GA. Medan det finns effektiva behandlingsalternativ för nAMD, såsom anti-vaskulär endoteltillväxtfaktor (anti-VEGF) injektioner, patienter med GA har begränsade behandlingsalternativ. RP är en mycket heterogen grupp av ärvda retinal störningar kännetecknas av progressiva retinal photoreceptor degeneration. Hos vissa patienter finns den orsakande genetiska defekten inom RPE snarare än fotoreceptorerna; Därför kan RPE substitutionsterapi vara en alternativ strategi om genterapi inte är genomförbar.

Det finns ett stort intresse för att utveckla effektiva behandlingar för dessa tillstånd. I synnerhet har RPE transplantation fått dragkraft som en potentiell terapeutisk strategi3,4,5,6,7,8. Sedan de första rapporterna om RPE transplantation dök upp i 1980s9, har fältet expanderat till att omfatta olika RPE cellkällor, leveransstrategier och experimentella modeller av sjukdom och transplantation10,11,12,13,14. Bland de olika djurmodellerna har endast NHP en "macula lutea" med en "fovea centralis", en anatomisk specialisering vid näthinnans bakre pol som delas med människor. Fovea innehåller en mycket hög densitet av konfotoreceptorer som möjliggör högupplöst central vision15. NHP har också en liknande genomisk och proteomisk make-up16 jämfört med människor. Dessa likheter gör det till en viktig och lämplig djurmodell för studier av okulära sjukdomar som påverkar den mänskliga näthinnan17,18.

Detta manuskript beskriver en metod för submacular transplantation av en RPE xenograft, stöds av en PET cell bärare, i immunsupprimerade NHPs. En transvitreal teknik för subretinal RPE transplantation hos kaniner har beskrivits i ett tidigare manuskript19. I NHPs kräver dock förekomsten av fovea särskild vård under intraoperativ manipulation20. I synnerhet finns det en hög risk för en foveal tår om subretinal vätskeinjektionsmetoder genererar en överdriven kraft på näthinnan20. Fokus för detta manuskript ligger därför på strategier för att minska risken för oavsiktliga fostertrauma i NHP.

Dessa inkluderar användning av preoperative intravitreal plasminogen injektion för frisättning av parafoveal vidhäftningar och kirurgiska mikroskop-integrerade optiska koherenstomografi (miOCT) intraoperatively för realtid visualisering av foveal anatomi. En skräddarsydd 25/41 G subretinal canretinal kanyl med intraokulära PFCL tampong under låga IOP inställningar föreslås för att möjliggöra en mer kontrollerad process av foveal detachement. Dessutom rekommenderas kirurgiskt avlägsnande av inbyggda RPE före implantation för att möjliggöra bättre integration mellan de transplanterade RPE-cellerna och värdfotoreceptorer. Slutligen beskrivs ett peri- och postoperativa systemiska immunsuppression protokoll för NHP modeller att förbättra överlevnaden av RPE xenograft efter transplantation11,21.

Protocol

OBS: Alla djurförsök utfördes i enlighet med The Association of Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Etikgodkännande erhölls från Institutional Animal Care and Use Committee, SingHealth, Singapore. Djuren inhysts vid SingHealth Experimental Medicine Centre som godkänts av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Detta godkännande belyser att alla djurförsök uppfyller normerna i den nationella rådgivande kommittén för riktlinjer för laboratoriedjurforskning som fastställts av Singapores jordbruks- och veterinärmyndighet. Följande experimentella protokoll fastställdes baserat på experiment som utförts i 6 ögon av 6 Macaca fascicularis (4 manliga och 2 kvinnor, 4 till 6 år gamla, 2,8 till 4,0 kg) .

1. Uppnå immunsuppression i NHP-modellen

  1. Starta immunsuppressionen 7 dagar före operationen och fortsätt immunsuppression under hela uppföljningsperioden.
  2. Väg NHP före administrering av systemisk immunsuppression för att säkerställa korrekt läkemedelsdosering. Djuret vägs vid baslinjen och därefter varje vecka.
  3. Använd oral sirolimus, doxycyklin och minocyklin för att uppnå systemisk immunsuppression.
    1. Administrera en laddningsdos på 2 mg oral sirolimus följt av en daglig underhållsdosering på 1 mg. Få baslinjen blod sirolimus nivå före administrering och övervaka detta under hela uppföljningsperioden. Säkerställ en koncentration på minst 5 μg/L för adekvat immunsuppression.
      OBS: Sirolimusdosen är inte viktanpassad.
    2. Administrera en dos på 7,5 mg/kg oralt doxycyklin per dag, två gånger per dag.
    3. Administrera en dos på 7,5 mg/kg oralt minocyklin per dag, två gånger per dag.
  4. Under immunsuppression, övervaka alla NHPs för negativa systemiska effekter. Leta efter betydande viktminskning (>10%), minskad aptit och vattenförbrukning, oroomed håravfall, och onormalt beteende som aggression och letargi. Bedömningar kommer att göras dag 3, 14 och 1 månad, följt av månatliga bedömningar.

2. Instrumentsterilisering

  1. Skölj de kirurgiska instrumenten med destillerat vatten.
  2. Placera instrumenten i ett ultraljudsbad fyllt med 500 ml destillerat vatten och 2 ml instrumentdesinfektionsmedel. Rengör instrumenten med ultraljudsbadets svepfunktion i 15 minuter.
  3. Ta bort instrumenten från ultraljudsbadet. Skölj två gånger noggrant med destillerat vatten i 5 min varje sköljning. Lufttorka instrumenten efter sköljningen.
  4. Placera instrumenten i en instrumentlåda. Autoklavera lådan med hjälp av den universella programinställningen (sterilisering av instrument vid 134 °C i 50 min: 30 min för autoklavering, 20 min för torkning).

3. Beredning av konserveringsmedelsfritt triamcinolon (40 mg/ml)

  1. Dra ut 1 ml triamcinolonlösning (10 mg/ml) med en 1 ml-spruta. Överför det till ett koniskt rör på 15 ml och blanda det med 4 ml steril balanserad saltlösning (BSS).
  2. Centrifugera lösningen vid 120 × g i 5 min. Se till att alla triamcinolonpartiklar finns i botten av det koniska röret. Kassera supernatanten (BSS) från koniska röret.
  3. Suspendera triamcinolonpartiklarna igen med 5 ml steril BSS i koniska röret. Centrifugera lösningen vid 120 × g i 5 min. Kassera supernatanten igen.
  4. Upprepa steg 3.3 för att slutföra tvättningen av triamcinolonpartiklarna med BSS (3x).
  5. Suspendera triamcinolonpartiklarna med 0, 25 ml steril BSS för att uppnå en koncentration på 40 mg/ml.
  6. Aspirera på den åter suspenderade triamcinolonen (40 mg/ml) med en ny 1 ml-spruta. Fäst en 25 G trubbig flöjtnål och håll sprutan med triamcinolonlösningen redo för intraoperativ användning.

4. Förbehandling av NHP-ögon med intravitreal plasminogen (0,25 μg/μL)

  1. En vecka före operationen, administrera en intravitreal injektion (20 μL) av apaplasminogen (0,25 μg/μL).
  2. Söva NHP före förfarandet med en intramuskulär injektion av ketamin (10-20 mg/kg BW) och en subkutan injektion av atropin (0, 05 mg/kg BW). Administrera tetrakainögondroppar för lokalbedövning.
  3. Innan intravitreal injektion, desinficera periorbital regionen med 10% povidone-jod. Desinficera ögat genom att administrera 5% povidone-jod till konjunktiva förischer av NHP. Se till att lösningen stannar i förnices i minst 1 min innan du sköljer noggrant med steril BSS.
  4. Använd en 250 μL-spruta för att aspirera den prediluterade apans plasminogen (0,25 μg/μL) från injektionsflaskan. Fäst en 30 G nål på sprutan och håll apan plasminogen redo för intravitreal administrering.
  5. Använd ett par bromsok för att identifiera injektionsstället på ögat. Administrera intravitreal injektionen 3 mm bort från limbus.
  6. Fortsätt med injektionen med nålen riktad mot mitten av världen. När nålen tas bort från jordklotet, använd en bomullsapplikatorpinne för att tamponda injektionsstället och förhindra reflux av det intraokulära innehållet.
  7. Administrera en smörjmedelsgel eller salva för att minska omedelbar postoperativ okulär ytirritation.

5. Kirurgiskt bord och utrustningsinställning

  1. Etablera ett sterilt fält. När du är i sterilt fält, bär kirurgiska scrubs, mask och hårskydd hela tiden.
  2. Förbered den konserveringsfria triamcinolonen (40 mg/ml) för intraoperativ visualisering av glaskropp (se avsnitt 3). Förbered den sterila BSS i en 10 ml spruta och smörjmedel i en 5 ml spruta. Placera dem på ett draperi.
  3. Håll andra instrument redo på ett draperi, inklusive 3-0 silke, 7-0 vicryl suturer, bomull applikatorpinnar, sårförslutningsremsor och ljuskrona endoillumination fibertråd.
  4. Anslut vitrectomy-uppsättningen, inklusive höghastighetsvitrector, Venturi-kassetten och 25 G ljuskrona endoilluminator till vitrectomy-maskinen med steril teknik.
  5. Öppna en 500 mL BSS-flaska av oftalmisk kvalitet och anslut den till Venturi-kassetten enligt tillverkarens instruktioner. Fortsätt med att grunda systemet.
  6. Slå på miOCT/kirurgiskt mikroskop. Välj förinställda konfigurationer av operationsmikroskopet för bakre segmentkirurgi och belysning. Ange detaljerna i proceduren, inklusive ID, kön, djurets sidlighet och namnet på proceduren.
  7. Montera en kontaktfri, vidvinkel, 128-graders funduslins.
  8. Fäst sterila engångsskydd på operationsmikroskopet/miOCT. Justera mikroskoppositionen och fokusera med fotpedalen. Fortsätt med operationen.

6. Beredning av anestesi och positionering av djuret (helst utförs av veterinärteamet)

  1. Se till att NHP är fastsatt i minst 8 timmar före induktion av anestesi för att förhindra uppstötning och kräkningar. Söva NHP före induktion av anestesi (se steg 4.2 för sederingsinstruktioner).
  2. Applicera 1% tropicamid och 2,5% fenylefrin ögondroppar minst 3x med 5 min intervaller för att uppnå pupill utvidgning.
  3. Administrera en intramuskulär injektion av buprenorfin (0, 005-0, 03 mg/kg BW) 30 min före operationen för att uppnå analgesi.
  4. Intubera NHP med ett endotrakchealrör, vanligtvis 3-5 mm i storlek. När du försöker intubera, se till att flera storlekar är tillgängliga. Använd den största storleken som kan passera genom struphuvudet utan att orsaka trauma. Mät slutvatten CO2 för att säkerställa lämplig placering av endotracheal rör.
  5. Leverera 2% isofluorangas via endotrakealröret för att inducera generell anestesi. Bekräfta tillståndet för generell anestesi (brist på svar på beröring) genom att bedöma NHP: s svar på omgivande stimuli, inklusive ljud och beröring. Använd 0,5-2% isofluorangas för att bibehålla tillståndet för generell anestesi.
  6. Övervaka kontinuerligt NHP-elektrokardiogram, andningshastighet, blodtryck och syremättnad under hela operationen.
  7. Placera NHP på operationsbordet så att ögat är vinkelrätt mot det kirurgiska mikroskopet. Administrera en smörjmedelsgel eller salva till ögat, som inte opereras för att minska okulär ytirritation under anestesi.
  8. Skär ögonfransarna med sax för att minska risken för infektioner.
  9. Desinficera periorbitalregionen med 10% povidone-jod. Desinficera ögat genom att administrera 5% povidone-jod till konjunktiva förischer av NHP. Se till att lösningen stannar i förnices i minst 1 min innan du sköljer noggrant med steril BSS.
  10. Placera ett sterilt draperi så att den förskurna öppningen är centrerad över ögat för att genomgå operation. Täck ögat med ett självhäftande kirurgiskt snitt draperi.
  11. Utför en lateral cantotomy på ögat för att genomgå kirurgi.
  12. Sätt in Lieberman-spektral för att säkerställa tillräcklig öppning av ögonlocken för visualisering av ögat.

7. Vitrectomy

OBS: För att få tillgång till det subretinala utrymmet för leverans av PET-byggnadsställning RPE ympkvist, rekommenderar detta protokoll en 4-portars (valved) 25 G vitrectomy som ska utföras med hjälp av en standard vitreoretinal kirurgisk inställning och en beröringsfri, vidvinkel, 128 ° fundus lins. Protokollet rekommenderar också användning av ett kirurgiskt mikroskop utrustat med miOCT för att vägleda flera kritiska kirurgiska steg, inklusive induktion av fovealavlossning, implantation av RPE-transplantatet och subretinal vätskedränering.

  1. Utför en 360° konjunktival peritomy genom att dra konjunktiva nära limbus med hjälp av ett par vannas sax. Förstora peritomy genom att utföra en trubbig dissekering.
  2. Använd ett 25 G microvitreoretinal blad, utför en sclerotomy klockan 8 för höger öga eller 4 klockan för vänster öga. Utför sclerotomy 3 mm från ögats limbus.
  3. Sätt i och suturera en 25 G anpassad sidoportinfusionsburyl med 7-0 vikryls sutur. Efter att ha bekräftat den intravitreala platsen, starta BSS-infusionen och ställ in systemet för att upprätthålla en IOP på 20 mmHg.
  4. Använd en 25 G platt huvud trochar, utför en sclerotomy klockan 2 för höger öga eller 10 klockan för vänster öga, som i steg 7.2.
  5. Sätt in ljuskronan på 25 G i det platta trocharet och fäst det med tejp. Justera ljuskällan till cirka 60 %.
  6. Utför en annan sclerotomy, liknande steg 7.2, klockan 10 för höger öga eller 2 för vänster öga. Placera U-formad vicryl 7-0 suturer runt sclerotomy utan att knyta knutarna. För in vitektomiskärarspetsen genom denna sclerotomy.
  7. Starta vitrectomy runt ingångsportarna, följt av en kort kärna vitrectomy med följande inställningar: maximalt 5000 skär per minut, maximal strävan vid 400 mmHg.
  8. Injicera 20-50 μL triamcinolon (40 mg/ml) för bättre glaskroppsvisualisering.
  9. Inducera en bakre glaskroppsavlossning (PVD) genom att separera glaskroppen från näthinnan.
    1. Placera vitrector ovanför den optiska skivan för att möjliggöra skonsam induktion av PVD. Håll vitrector endast på ambition vid den maximala inställningen 400 mmHg utan någon skärning inblandad.
    2. Vid behov, använd 25 G intraokulära tångar för att manipulera glaskroppen vid skivmarginalen för att skapa en reva i glaskroppen cortex för att underlätta avlossning.
      OBS: PVD anses framgångsrikt om triamcinolonkristaller glider obehindrat över näthinnans yta.
  10. Öppna det bakre hyaloidmembranet med fräsen och ta bort den lossnade glaskroppskjolen upp till glaskroppen (vid näthinnevekvatorn). Aspirera eventuella återstående triamcinolon på näthinnans yta.

8. miOCT-styrd avlossning av föl

  1. Injicera 1-2 ml PFCL för att täcka den bakre polen upp till den främre, mellersta perifera näthinnan.
  2. Gå in i ögat med en subretinal injektionsburyl. Ställ in IOP på 0-4 mmHg på vitrectomy-maskinen (se till att det är perfekt vattentätt system; vid behov knyt suturer runt portarna).
  3. Använd antingen 25/41 G anpassad subretinal injektionsburyl med dubbla borrhål eller 25/38 G subretinal injektionsburula ansluten till en 250 μL spruta, utför försiktigt en subretinal injektion av BSS för att inducera en lokaliserad näthinneavlossning. När bleben bara korsar fovea, stoppa injektionen. Skapa en andra bleb från en separat riktning. Sammanfoga båda blebsna för att helt lossa fovea.
  4. Aktivera miOCT-funktionen för att visualisera blebbildning. Se till att linje- och kubskanningarna är i HD-läge med inställningarna (512 x 128 pixlar, skanningsbredd 4 mm) för att få en bild vid fovea. Observera miOCT-bilden för en fullständig avlossning av neural näthinnan från RPE-skiktet vid fovea.
  5. Förstora retinotomy till 1,5 mm med ett par vertikala 25 G vitreoretinal saxar för att ge tillgång till det subretinala utrymmet för transplantation.

9. Avlägsnande av inbyggd RPE

  1. Ställ in IOP på 50 mmHg på vitrectomy-maskinen.
  2. Ta bort PFCL via aktiv extrudering med en borstad silikonspetspadyl.
  3. Förläng sclerotomy med en 1,4 mm snittkniv för att tillåta ingången till ett 20 G-instrument.
  4. Använd ett anpassat 20 G utökningsbart slinginstrument och skrapa den submakulära värden RPE för borttagning. Skrapa ett område som mäter minst 2 x 3 mm.

10. Lastning av skytten för leverans av RPE-cellmonlagertransplantation

  1. Allmänna anvisningar om lastning av ett skottformat transplantat som skurits från RPE-kulturer på PET-cellbärare finns i en tidigare publikation22.

11. miOCT-styrd transplantatimplantation och positionsjustering

  1. För in spetsen på skjutenheten genom sclerotomy vid en IOP på 20 mmHg. Injicera implantatet mot det subretinala utrymmet via retinotomykanten som skapas från näthinnans yta.
  2. Injicera implantatet med cellbärarsidan vänd mot Bruchs membran och RPE-xenograftsidan mot fotoreceptorerna.
  3. Aktivera miOCT-funktionen för att visualisera implantatets plats. Se till att implantatet vilar platt på Bruchs membran i det subretinala utrymmet, med en intakt överliggande näthinna. Se till att den ligger ett rimligt avstånd från den skapade retinotomy och inte inkräktar på retinotomy platsen.
  4. Justera implantatpositionen med subretinal injektionsburylen eller en 25 G böjd intraokulär sax för att säkerställa att den är väl placerad under makula.

12. miOCT-styrd dränering av subretinalvätska

  1. Använd en borstad silikonspetskantyl, utför ett vätske-luftutbyte och noggrann subretinal vätskedränering. Försök mild subretinal vätska strävan från bleb retinal avskildhet och retinotomy kant apposition.
  2. Aktivera miOCT-funktionen för visualisering i realtid av adekvat subretinal vätskedränering tills näthinnan sätts tillbaka över implantatet.

13. Avsluta operationen

  1. Stäng arbetsports sclerotomy med den förplacerade 7-0 vicryl suturen. Ta bort 25 G ljuskrona och 25 G infusions cannula. Stäng dessa sklerotomier med 7-0 vicryl suturer.
  2. Administrera 2 mg i 0, 05 ml intravitreal konserveringsmedel fritt triamcinolon (40 mg/ml) vid 8-tiden sclerotomy före suturering.
  3. Palpera ögat för att säkerställa att IOP är inom det acceptabla intervallet. Injicera filtrerad luft (eller BSS) via en 30 G nål vid behov.
  4. Sutur conjunctiva med 7-0 vicryl suturer och cantotomy med 5-0 prolene (ta bort efter 10-14 dagar).

14. Postoperativ djurvård

  1. Placera NHP med framsidan nedåt i 1 h efter operationen. Lämna inte djuret obevakat förrän medvetandet har återfåtts. Se till att en veterinär och djurvårdstekniker finns tillgänglig för observation och stöd under den postoperativa processen.
  2. Applicera aktuellt antibiotikum (tobramycin), steroid (dexametason) salva och homatropin ögondroppar två gånger om dagen i 5 dagar postoperatively.
  3. Administrera en annan subkutan buprenorfin (0, 005-0, 03 mg/kg BW) injektion 6 h efter operation för adekvat smärtkontroll.
  4. Återlämna NHP till sällskap med andra djur endast när det helt har återfått medvetandet.
  5. Utför multimodala avbildningsuppföljningar dag 3, 14 och månad 1 efter ingreppet, följt av månatliga kontroller. Utför ERGs varje månad efter proceduren. Ta bort 5-0 prolene suturer för cantotomy på dag 14 samtidigt med sederingsperioden som används för multimodal avbildning. De återstående suturerna är resorbable, 7-0 vicryl suturer, som inte kräver borttagning.

15. Postoperativa övervakningsmetoder för multimodal avbildning

  1. Snabba NHP över natten. Söva NHP strax före avbildning (se steg 4.2 för läkemedel och koncentration för sedering). Om sedering är otillräckligt för att stoppa ögonrörelser, överväga användningen av generell anestesi.
  2. Applicera 1% tropikamid och 2,5% fenylefrinögondroppar för att uppnå pupill utvidgning före avbildning (se steg 6,2).
  3. Utför autofluorescens (AF), fundus fluorescein angiografi (FFA) och optisk koherenstomografi (OCT) med hjälp av en högupplöst OCT-maskin med en 55° fältlins och 30° fältlins.
    1. Administrera intravenöst 10% fluorescein (0, 1 ml/kg BW) för FFA. För att få en tidig fasbild, ta en bild inom 30 s från injektionen. För en sen fasbild, ta en bild 5-10 min efter injektionen.
  4. Utför fundusfotografering med hjälp av en funduskamera mellan FFA:s tidiga och sena faser.

16. Postoperativa övervakningsmetoder för fullfältsstudier av elektroretinogram (ERG)

  1. Snabba NHPs över natten. Söva NHP före ERG-studierna (se steg 4.2 för läkemedel och koncentration för sedering). Under hela ERG-inspelningarna ska sedering på lämpligt sätt administreras på ett igen.
  2. Separata multimodala avbildnings- och ERG-inspelningar med ett intervall på minst 2-3 dagar.
  3. När NHP har sövts, se till att NHP är mörkanpassad i 30 minuter före ERG-inspelningen.
  4. Placera de subdermala nålelektroderna i rostfritt stål vid vänster och höger lateral canthi (referenselektroder) och baksidan av NHP-kroppen (jordelektrod). Placera ERG-kontaktlinselektroderna på NHP-hornhinnan med vidisisk gel för att underlätta kontakt och vidhäftning.
  5. Basera alla ERG-tester på de mänskliga protokoll som rekommenderas av International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Påbörja ERG-inspelningen under scotopiska förhållanden och börja med dimmerblixtrarna. Följ ISCEV-rekommendationerna för rekommenderade interstimulusintervall.
  6. Se till att NHP är ljusanpassad i 10 minuter före fotopic-testning, återigen med hjälp av isocev-standardsrekommendationer för bakgrundsstyrka.

17. Dödshjälp av NHP

  1. För att avliva NHP för enucleation, administrera intravenös natriumpentobarbital (75 mg/kg), i rekommendation av panelen för dödshjälp av American Veterinary Medical Association.

Representative Results

Multimodala bildframställningsmetoder (fundus photography, fundus autofluorescence imaging (FAF), fundus fluorescein angiography (FFA)-early-phase and late-phase, and optical coherence tomography (OCT)) belyser funktionerna i en framgångsrik submacular RPE graft transplantation (figur 1). Fundus fotografering visar placeringen av RPE transplantat transplantation vid fovea utan migration över tid. FAF imaging visar minimala förändringar i hyper-autofluorescens (visas av vita, högintensiva områden) överlappar RPE moderplantor. FFA i tidig och sen fas visar inte något uppenbart läckage (vilket framgår av vita högintensiva områden som förstoras med tiden) som omger RPE-transplantatet. De första bilderna på dag 3 visar fönsterdefekt på grund av avlägsnandet av inbyggd RPE före transplantatimplantation. Macular OCT bilder visar bevarandet av yttre retinal lager (i synnerhet fotoreceptor lagret) över RPE transplantat som tiden fortskrider. Hematoxylin och eosin färgning visar intakt retinal lager utan tecken på microtears. Bevarandet av det yttre kärnämnet lager ovanför periferin av transplantatet tyder på att RPE celler utför sina fysiologiska funktioner för att upprätthålla photoreceptor hälsa.

De intraokulära och yttre vyerna hos 25/41 G kanyl med dubbla borrningar belyser den mekanism genom vilken IOP styrs under subretinal injektion (figur 2). BSS kommer in i det subretinala utrymmet under subretinal vätskeinjektion via den centrala längre kanylen. Betydande ökningar av intraokulära tryck gör att BSS i glaskroppen lämnar ögat via kanylens större metallhål. BSS färdas sedan längs kanylen och kastas så småningom ut från utgångsporten nära kanylnavet. För att bedöma om kanylen fungerar som förväntat, se till att vätska strömmar från utgångsporten nära kanylnavet.

MiOCT tillåter visualisering av blebdimensionerna och en potentiell fosterskada intraoperativt under fovealavlossning (figur 3). Figur 3A1-A3 belyser ett fall av bleb med en foveal tår. I figur 3A1, medan den sämre bleben är synlig under det kirurgiska mikroskopet, är visualisering av revan svår. Figur 3A2 visar den längsgående delen av en bleb utan några tårar. Figur 3A3 visar en foveal tår vid bedömning av den vertikala delen av bleb. Figur 3B1-B3 visar en framgångsrikt skapad bleb utan närvaro av några tårar.

Avsaknaden av betydande försämringar av ERG vågformer tyder på att den globala funktionen hos både stång och kon fotoreceptorer upprätthålls med subretinala RPE xenografts (figur 4). ERG-vågformerna visar näthinnans övergripande funktion. I synnerhet bör uppmärksamhet ägnas åt A-vågorna för att bestämma eventuell förlust av fotoreceptorfunktionen.

Figure 1
Figur 1: Postoperativ in vivo-analys med multimodal avbildning. (A) In vivo-avbildning av submakulär RPE-transplantattransplantation för vänster öga (gul på fundusfotografering) på olika bildframställningsmetoder (vänster till höger kolumner: fundusfotografering, autofluorescens, fundus fluorescein angiografi-tidig fas, fundus fluorescein angiografi-sen fas, optisk koherenstomografi) för tidspunkter upp till 3 månader (topp till nedre rader: Dag 3, 14; Månad 1, 3). Asterisken på fundus-fotografiet anger platsen för retinotomy; den vita streckade pilen anger linjegenomsökningens riktning. Den guldragna formen på fundus autofluorescens imaging belyser platsen för transplantationen. De vita trianglar på OCT-bilderna anger transplantatets respektive sidokanter (enligt linjeskanningen på bilden av färgfonden). B) Hematoxylin- och eosinfärgning av transplantationen under atrofisk fovea (på grund av intraoperativ tår) med skikt märkta. Skalstänger = 1 mm i A (autofluorescens- och FA-bilder), 200 μm i A (OCT-bilder) och 100 μm i B. Förkortningar: FA = fundus angiography; OCT = optisk koherenstomografi; RGC = näthinne ganglion cell lager; INL = inre kärn- lagrar; ONL = yttre kärnskikt; RPE = näthinnepigment epitel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Intraokulära och yttre vyer av 25/41 G dubbelhåls cannula. (A) Intraokulära vyn av 25/41 G dubbelhåls cannula under subretinal bleb skapande. Den vita pilen pekar på den längre centrala kanylen för subretinal injektion. Den streckade pilen pekar på öppningen av utgångskanylen genom vilken BSS passerar för att lämna ögat. B) Extern vy av kanylen 25/41 G med dubbla borr. Asterisken markerar utgångsporten nära kanylnavet från vilket den intraokulära BSS töms. Förkortning: BSS = balanserad saltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Intraoperativa mikroskopbilder och miOCT-bilder av subretinal bleb kompliceras av en foveal tår. (A2) Longitudinell miOCT-skanning som visar en subretinal bleb vid fovealområdet (gul pil). (A3) Tvärgående miOCT-skanning som fångar en foveal tår (vit pilspets), tillsammans med en retinotomy (asterisk och en subretinal bleb (gul pil). (B1) En intraoperativ mikroskopisk bild som visar positionen för longitudinell (blå) och tvärgående (röd) skanningar i en framgångsrikt bildad bleb. (B2) Longitudinell miOCT-skanning som visar en subretinal bleb vid fovealområdet (gul pil). (B3) Tvärgående miOCT-skanning som visar en framgångsrikt skapad subretinal bleb med en intakt fovea överlägsen (vit diamant). Förkortning: miOCT = mikroskopintegrerad optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: ERG av RPE xenograft-transplanterat öga. För funktionell bedömning av näthinnan visar hela FÄLTET ERG bedömningar av RPE-xenografted öga utförs vid baslinjen (översta raden) och 3 månader efter transplantation (nedre raden) ingen betydande effekt av RPE xenograft transplantation på några svar amplituder, timing eller vågform under antingen mörkanpassade eller ljusanpassade villkor. Förkortningar: RPE = retinal pigment epitel; ERG = elektroretinogram; DA = mörkanpassad; LA = ljusanpassad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Det finns två huvudsakliga metoder utvärderas för submacular RPE transplantation-injektionen av en RPE suspension och transplantation av en monolayer RPE transplantat. En detaljerad jämförelse mellan de två metoderna ligger utanför ramen för detta manuskript. Transplantation av en monolayer RPE ympkvist kan dock vara fördelaktigt eftersom RPE-cellerna är mer organiserade i en monolayer än i en suspension. RPE-celler i transplantatet är organiserade i ett sammanflödesmonolayer, som liknar organisationen av det fysiologiska RPE-cellskiktet och gör det möjligt för de transplanterade RPE-cellerna att utföra sina fysiologiska funktioner. Detta möjliggör mer exakta doseringsparametrar jämfört med cellavstängningar, vilket är mycket relevant för regulatoriskt arbete och industriell uppskalning.

Leverans av RPE patch moderplantor i det subretinala utrymmet kräver noggrann manipulering av makula och korrekt införande av transplantatet i subretinal utrymmet. Tekniska framsteg inom mikrokirurgi, såsom miOCT, och en bättre förståelse av intraoperativ retinal vävnad dynamik har minskat inlärningskurvan för denna procedur. I denna diskussion kommer skälen till följande aspekter att förklaras: i) preoperativ plasminogen injektion; ii) Användning av intraoperativ miOCT. iii) Användning av en anpassad kanyl med dubbla 41 G dubbla borr, låga IOP-inställningar och PFCL för subretinal bleb-skapande. iv) skrapning av det ursprungliga RPE-cellskiktet före transplantation. v) Användning av sirolimus, triamcinolon, doxycyklin och minocyklin för att minska immunogent ympkvistavstötning.

Preoperative plasminogen injektioner frigör parafoveal retinal vidhäftningar
I de första experimenten var det utmanande att lossa fovea med en enda vätskevåg. Vid bedömning med miOCT visade bilderna förekomsten av parafoveal yttre retinal vidhäftningar till den ursprungliga RPE tillsammans med bevis på intraretinal trauma20. Dessa vidhäftningar kan ha lett till en vertikal expansion av bleb snarare än subretinal vätska våg sprider sig över retinal konturen, vilket resulterar i foveal trauma. Plasminogen är den inaktiva föregångaren till plasmin, ett proteas som riktar sig mot fibronectin och laminin. Ocriplasmin är en bioengineered variant av humant plasmin, godkänd av Food and Drug Administration (FDA) och Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) för behandling av symtomatisk vitreomakulär dragkraft med eller utan ett samtidig makulat hål. Postapproval rapporter om cystoid makula ödem utveckling efter ocriplasmin injektion har dock föreslagit en mer omfattande effekt av enzymet på näthinnan23.

Även om de exakta mekanismerna inte har identifierats, föreslogs det att plasmin kunde försvaga retinal vidhäftning genom nedbrytningen av interphotoreceptor matriselement som ansvarar för photoreceptor-RPE vidhäftning24. I detta protokoll behandlades NHP ögon med intravitreal plasminogen 1 vecka före kirurgi för att släppa parafoveal yttre retinal vidhäftningar. Under antagandet att fotoreceptor-RPE vidhäftningen är försvagad krävs en lägre kraft för att lossa neurosensoriska näthinnan, inklusive den distala parafoveal ringen, som vanligtvis motstår subretinalvätskan våg20. Således resulterar kraften som administreras under retinal bleb detachement i expansionen av bleb över näthinnan kontur snarare än stretching näthinnan tangentiellt. Detta minskar risken för fostertårar. Det bör dock noteras att effekten av plasminogen på långsiktig transplantatöverlevnad inte studerades i detta protokoll. Framtida studier bör försöka fastställa denna effekt.

miOCT ger anatomisk feedback för att vägleda subretinal bleb skapande, transplantat implantation och subretinal vätskedränering
Intraoperativ, atraumatic manipulation av makula är nyckeln till att uppnå bra transplantation resultat. Mikrostrukturella förändringar av makula relaterade till manipulation kanske inte alltid är uppenbara på driftmikroskopet. I sådana förfaranden är miOCT ett viktigt verktyg som ger realtid, tredimensionell, intraoperativ feedback av den makulade strukturen. miOCT är särskilt användbart under stegen för fovealavlossning, transplantatimplantation och dränering av subretinalvätskan med hjälp av ett vätske-luftutbyte. Under fovealavlossning kan miOCT bestämma blebens vertikala och horisontella dimensioner. Foveal mikrotears, som kanske inte visualiseras tydligt på kirurgiskt mikroskop, kan bekräftas av miOCT (figur 3). Under transplantatimplantationen vägleder miOCT-bilder genom att visa transplantatets plats eller närhet till fovea, genom den ofta mindre transparenta, fristående näthinnan. miOCT kan också belysa möjliga områden av retinal vidhäftning under en svår transplantationsprocess25. Slutligen, i subretinal flytande dräneringsprocessen, miOCT kan tillförlitligt styra subretinal vätska dränering tills fullständig retinal-RPE transplantat kontakt uppnås.

Kombinationen av en kanyl med dubbla borr, låga IOP-inställningar och PFCL glasaktig tamponad minskar synergistiskt makula trauma under subretinal bleb skapande
Tangentiell retinal stretching och flytande turbulens kan uppstå under subretinal BSS injektion för foveal detachement leder till oönskade foveal tårar. För att motverka dessa fenomen har faktorer, såsom den relativa positionen och avståndet från fovealcentret där injektionen initieras, injektionsvolym och hastighet, glasaktig tamponad, val av subretinal instrumentering och IOP alla visat sig vara relevanta20,26,27. Den subretinala bleben för avlossning av foster bör placeras på en plats som är tillräckligt avlägsen från fovea, eftersom näthinneutsträckning kan vara högst vid blebinitieringsplatsen27. IOP bör också hållas lågt under hela skapandet av subretinal bleb. När ögats IOP är hög observeras en högre vertikal ökning av blebstorlek snarare än expansion längs näthinnans kontur, medan blebs är grundare vid lägre tryck20. Dessutom, även om en intravitreal injektion på 50 μL effektivt kommer att fördubbla IOP hos människor28, med tanke på den kortare ögonlängden hos NHPs, kommer IOP-ökningen under subretinal injektion förmodligen att vara högre och snabbare än hos människor. Medan de flesta vitrectomy maskiner justera för IOP fluktuation, justeringen är inte en samtidig utan snarare en reaktiv process som uppstår som subretinal injektion fortsätter. Ju högre IOP, desto högre är risken för näthinneöversträckning och resulterande fostertrauma. Därför är det viktigt att upprätthålla en stabil låg IOP under subretinal injektion.

En kommersiell 20/41 G (DORC) eller en specialtillverkad 25/41 G subretinal canretinal cannula rekommenderas för subretinal injektion. Kanylen tillåter vätska att lämna glaskroppen i utbyte mot BSS injiceras i det subretinala utrymmet. Detta säkerställer en "samtidig" reglering av IOP under subretinal injektionen. En schematisk av den dubbla bore cannula ses i figur 2. Slutligen används PFCL för att minska risken för fostertårar20,26,27. Eftersom PFCLs, såsom oktalin, har högre specifik gravitation, utövar de en nedåtriktad kraft på näthinnan under foveal detachement29. Detta stabiliserar ytterligare processen för att skapa bleb för fovealavlossning och förbättrar blebens expansion längs näthinnekonturen. Denna teknik har framgångsrikt använts för subretinal injektion av rtPA i inställningen av massiva submacular blödning på grund av att nAMD30.

Förtransplantation avlägsnande av inbyggd RPE gör det möjligt att återställa RPE-fotoreceptorkomplex
Värd RPE bör tas bort före transplantat transplantation. Detta beror på att restaureringen av RPE-fotoreceptorkomplexet krävs för att RPE-transplantationen ska kunna utföra sina fysiologiska funktioner för att stödja fotoreceptorerna21. Värden rpe, om den inte tas bort, kan utgöra en mekanisk barriär, vilket förhindrar restaurering av detta komplex. Det kan avlägsnas antingen genom administrering av RPE-giftiga kemikalier eller genom att använda fysiska medel för avlägsnande. Kemiska avlägsnandemetoder inkluderar systemisk eller subretinal administrering av natrium iodate31,32. Eftersom natriumnitdate orsakar utbredd degenerering av fotoreceptorer, RPE-celler och Choriocapillaris när det administreras, utesluter dess näthinne- och systemiska toxicitet dess användning för försök på människa32,33. Därför är fysiska intraoperativa tekniker att föredra. Olika fysiska metoder har konceptualiserats. När fysiska metoder används är det viktigt att Bruchs membran förblir oskadat. Många in vitro-studier har visat beroendet av RPE moderplantor överlevnad på en intakt Bruchs membran34,35,36.

Försök till hydraulisk debridement var associerade med brott i Bruchs membran, en ökad hastighet av epiretinal membran utveckling och proliferative vitreoretinopathy, vilket resulterar i traktionell retinal detachement37. En diamant-dammad spatel som föreslås för RPE debridement ledde också till brott i Bruchs membran, vilket resulterade i cellulär spridning från choroid till subretinal utrymme38. Intressant nog kan ett specialtillverkat utdragbart slinginstrument ta bort den övergående RPE med bevarande av Bruchs membran i ögonen på kaniner och grisar11,39. Avlägsnandet av den underliggande RPE är också användbart för att upprätta djurmodeller med RPE och yttre retinal atrofi, liknande den avancerade bestod formen av AMD. När ett fokalområde av RPE avlägsnas från makula stängs RPE-såret via hypertrofi av de återstående RPE-cellerna. Detta sår helande svar är dock associerad med atrofi av det yttre kärnämnet skiktet40. Medan skapandet av en djurmodell ligger utanför ramen för detta manuskript, kan ett liknande förfarande skapa en djurmodell av en avancerad atrofisk AMD-fenotyp för testning av RPE-härledda cellterapier.

Användning av sirolimus, triamcinolon, doxycyklin och minocyklin för att minska immunogen ympkvistavstötning
Det subretinala utrymmet tros vara en immun-privilegierad plats, upprätthålls av en intakt blod-retinal barriär och andra faktorer41. I många studier som involverar subretinal transplantation av stamcellsderivat med en intakt blod-retinal barriär, immunsuppressiva läkemedel spelar en försumbar roll i transplantat överlevnad42. Den yttre blod-retinal barriären tros bildas av det ursprungliga RPE-skiktet och de snäva korsningarna mellan RPE-cellerna. Medan infödda RPE borttagning möjliggör bättre integration av transplanterade RPE och värd fotoreceptorer, blod-retinal barriären störs i processen, vilket ökar sannolikheten för en immun avstötning. Klassiskt är T-celler centrala för processen att transplantera avstötning av andra organ som njure och lever43. Därför var initiala immunsuppressiva regimer för retinal vävnad transplantation inriktade på att minska dessa adaptiva immunsvar.

Sirolimus, ett mekanistiskt mål för rapamycinhämmare, och tacrolimus, en kalcineurinhämmare, är exempel på immunsuppressiva läkemedel som riktar sig mot adaptiva immunsvar. Trots adekvat T-cells suppression är dock transplantatöverlevnaden fortfarande låg. Dessutom är RPE-celler kända för att undertrycka T-cellsaktivering genom frisättning av hämmande faktorer och främja generering av regulatoriska T-celler44. Därför har det blivit alltmer uppenbart att adaptiv immunitet kanske inte är den enda bidragsgivaren till transplantatavstötning42. Subretinal transplantation av cellulära produkter kan resultera i ackumulering och aktivering av microglia45.

Microglia är makrofagerna i näthinnan. De består av två huvudpopulationer: 1) den perivascular mikroglia av den inre retinal vaskulaturen och 2) mikroglian inom retinal vävnad parenkym. Eftersom mikroglia är en del av det medfödda immunsvaret kan intravitreala glukokortikoider, såsom triamcinolon, undertrycka cytokinmedierad spridning46. Doxycyklin och minocyklin kan också undertrycka mikroglial aktivering och bör övervägas47,48. Slutligen är skillnader i immun avvisande av RPE allografts jämfört med xenografts ofullständigt förstådda49. Till exempel har alloantibodies mot inducerad pluripotent stamcell-härledda RPE celler rapporterats i serumet av in vivo immun avstötning modeller. Dessa antikroppars roll och vikten av antikroppsmedierad avstötning i transplantat överlevnad är dock fortfarande okänd50. Därför föreslås en multidrog regim som använder sirolimus för undertryckande av adaptiv immunitet och en kombination av triamcinolone, doxycyklin och minocyklin för medfödd immunitet undertryckande. Denna regim har framgångsrikt använts i kaniner med bra transplantat överlevnad resultat och minimal systemiska effekter11.

Begränsningar av denna kirurgiska teknik
Detta dokument beskriver en möjlig kirurgisk metod för att leverera en RPE moderplantor ark i subretinal utrymmet i NHP. Detta betyder dock inte att detta är det enda optimerade sättet. Olika vitreo-retinal kirurger kan ha andra preferenser för instrumentering och teknik. Till exempel kan denna implantationsenhetsdesign endast leverera platta implantat som stöds med en styvare cellbärare och därför kanske inte är lämplig för relativt flexibla (eller rullade) implantat. RPE suspension transplantationer kan utelämna mycket av denna teknik. Följaktligen kommer kirurgiska detaljer att kräva modifiering baserat på varje leveransstrategi.

Eftersom intresset för cellulära terapier för behandling av degenerativa näthinnesjukdomar fortsätter att växa, kommer NHP-djurmodellen att vara avgörande i prekliniska studier för att studera de faktorer som påverkar RPE-transplantatöverlevnaden. I detta manuskript föreslås strategier för att möjliggöra smidigare leverans av en submacular monolayer RPE ympkvist i NHP ögat. Metoder för bättre visualisering av intraoperativa komplikationer rekommenderas också. Det förväntas att dessa metoder kommer att fortsätta att förbättras när användningen av cellulära terapier expanderar. Framtida metoddokument bör också överväga att föreslå en omfattande förteckning över undersökningar för att bedöma olika strukturella och funktionella aspekter av transplantatet.

Disclosures

Boris Stanzel har ett amerikanskt patent 9980851 på ett instrument (RPE-skrapa) som används i denna studie. Speaker honoraria från C. Zeiss Meditec och Geuder till Boris Stanzel. De andra författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), NUS Start-up grant NUHSRO/2016/100/SU/01, NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) grant och National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-01) Vi vill tacka veterinärteamet vid Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapore) för att ge stöd i NHP-kirurgiberedning och djuruppföljning. Vi vill rikta vår uppskattning till Jill Teo och kollegor från C. Zeiss Meditec Singapore för teknisk support för OPMI-Lumera 700 med integrerad intraoperativ OCT-enhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Tags

Medicin nummer 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Retinal Pigment Epithelium Transplantation i en icke-mänsklig primatmodell för degenerativa retinala sjukdomar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter