Summary
Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte sleuteltussenproducten observeren, die niet toegankelijk zijn voor conventionele ensemblemethoden vanwege het gemiddelde effect.
Abstract
Het ribosoom is een groot ribonucleoproteïnecomplex dat eiwitten processief assembleert langs mRNA-sjablonen. De diameter van het ribosoom is ongeveer 20 nm om grote tRNA-substraten op de A-, P- en E-locaties te huisvesten. Bijgevolg wordt de ribosoomdynamiek op natuurlijke wijze snel gedefaseerd. Single molecule-methode kan elk ribosoom afzonderlijk detecteren en inhomogene populaties onderscheiden, wat essentieel is om de gecompliceerde mechanismen van meercomponentensystemen te onthullen. We rapporteren de details van een smFRET-methode op basis van de Nikon Ti2 omgekeerde microscoop om de ribosoomdynamiek tussen het ribosomale eiwit L27 en tRNA's te onderzoeken. De L27 is gelabeld op zijn unieke Cys 53-positie en gereconstitueerd tot een ribosoom dat is ontworpen om L27 te missen. Het tRNA is gelabeld op zijn ellebooggebied. Naarmate het tRNA zich tijdens de verlengingscyclus naar verschillende locaties in het ribosoom verplaatst, zoals pre- en posttranslocatie, vertonen de FRET-efficiëntie en -dynamiek verschillen, die meerdere subpopulaties hebben gesuggereerd. Deze subpopulaties zijn niet detecteerbaar met ensemblemethoden. De op TIRF gebaseerde smFRET-microscoop is gebouwd op een handmatige of gemotoriseerde omgekeerde microscoop, met zelfgebouwde laserverlichting. De ribosoommonsters worden gezuiverd door ultracentrifugatie, geladen in een zelfgebouwde meerkanaals monstercel en vervolgens verlicht via een evanescent laserveld. De reflectielaserspot kan worden gebruikt om feedbackcontrole van perfecte focus te bereiken. De fluorescentiesignalen worden gescheiden door een gemotoriseerd filterkoepeltje en opgevangen door twee digitale CMOS-camera's. De intensiteiten worden opgehaald via de NIS-Elements software.
Introduction
Het ribosoom is een ø 20 nm groot ribonucleoproteïnecomplex van een grote (50S) en een kleine (30S) subeenheid. Het assembleert lange peptiden langs de mRNA-sjabloon processief en coöperatief. Het ribosoom 30S bindt zich aan het fMet-tRNAfMet en mRNA om de eiwitsynthese te starten, en de 50S komt dan samen om het 70S-initiatiecomplex te vormen. De tRNA's brengen aminozuren naar het ribosoom op de A-site (aminoacyl-tRNA-bindingsplaats), terwijl de langwerpige peptidylketen op de P-site (peptidyl-tRNA-bindingsplaats) wordt gehouden. In het pre-translocatiecomplex wordt de peptidylketen overgebracht naar het tRNA op de A-site met één aminozuur toegevoegd. Ondertussen is het P-site tRNA gedeacyleerd. Vervolgens verplaatsen de A-, P-tRNA's zich naar de P-, E-sites om het post-translocatiecomplex te vormen, waarin de E-site de tRNA-exitsite vertegenwoordigt. In deze toestand verplaatst het peptidyl-tRNA zich terug naar de P-site. De verlengingscyclus gaat door tussen de pre- en post-conformaties terwijl het ribosoom transloceert op het mRNA, één codon per keer1. Het ribosoom is zeer coördinerend van verschillende functionele sites om dit proces efficiënt en nauwkeurig te maken, zoals inter-subunit ratelen2,tRNA hybridisatiefluctuaties3,GTPase-activeringen4,L1-stengel opening-closing5,enz. Bijgevolg defaseren ribosomen snel omdat elk molecuul in zijn eigen tempo beweegt. De conventionele methoden kunnen alleen schijnbare gemiddelde parameters afleiden, maar laagbevolkte of kortlevende soorten zullen worden gemaskeerd in het gemiddelde effect6. Single molecule-methode kan deze beperking doorbreken door elk ribosoom afzonderlijk te detecteren en vervolgens verschillende soorten te identificeren via statistische reconstructie7. Verschillende labelingplaatsen zijn geïmplementeerd om ribosoomdynamica te onderzoeken, zoals de interacties tussen tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,enz. Bovendien worden door het labelen van de grote en kleine subeenheden, respectievelijk, inter-subunit ratelkinetiek en coördinatie met factoren waargenomen11,12. Ondertussen heeft de smFRET-methode brede toepassingen in andere centrale biologische processen en zijn er meerkleurige FRET-methoden in opkomst13.
Eerder werd een nieuw ribosoom FRET-paar ontwikkeld14,15. Het recombinante ribosomale eiwit L27 is tot expressie gebracht, gezuiverd en gelabeld en weer opgenomen in het ribosoom. Dit eiwit interageerde met de tRNA's op korte afstand en hielp het P-site tRNA in het post-translocatiecomplex te stabiliseren. Wanneer tRNA zich van de A- naar de P-site verplaatst, wordt de afstand tussen dit eiwit en het tRNA verkort, wat kan worden onderscheiden door het smFRET-signaal. Meerdere ribosoomsubpopulaties zijn geïdentificeerd met behulp van statistische methoden en mutagenese, en spontane uitwisseling van deze populaties in het pre- maar niet posttranslocatiecomplex suggereert dat het ribosoom flexibeler is voordat het op het mRNA beweegt, en meer rigide tijdens het decoderen16,17,18. Deze variaties zijn essentieel voor de ribosoomfunctie. Hier beschrijft het protocol de details van ribosoom / tRNA-labeling, hun opname in het ribosoom, smFRET-monstervoorbereiding en gegevensverzameling / -analyse19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van gelabeld ribosoom en tRNA voor FRET-detectie
- Isoleer ribosoom zonder L27 van E. coli stam IW312 volgens standaardprotocollen20,21. Extraheer het reguliere ribosoom uit E. coli stam MRE600.
- Kloon het rpmA-gen van de L27 met C-terminale His-tag in pET-21b (+) plasmide, dat wordt getransformeerd en tot expressie wordt gebracht in BL21(DE3)pLysS-cellen15. Zuiver het eiwit via een voorverpakte sepharosekolom.
- Etikettering van L27
- Incubeer 20-100 μM gezuiverd L27 in 100 μL met een 2-10-voudig overschot aan TCEP (Tris-2-carboxyethyl-fosfine) bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten. Buffer wissel de oplossing uit in PBS-buffer (10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4,2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), met behulp van een nap-5 kolom. Voeg een 10-voudige overmaat aan Cy5-maleimide mono-reactieve kleurstof in DMSO toe aan de oplossing en incubeer bij RT in het donker gedurende 2 uur.
- Plaats de hierboven genoemde gelabelde eiwitoplossing (500 μL) op een Nap-5-kolom om de overtollige kleurstof te verwijderen. Zorg ervoor dat het eiwit in de eerste gekleurde band elueert, gevolgd door de vrije kleurstof elute in de tweede band, respectievelijk. Verzamel het eluteerde eiwit in 1 ml TAM10-buffer (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2,30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA en 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
- Reconstitueer het ribosoom met L27. Meng het gelabelde L27-eiwit met een gelijke hoeveelheid IW312-ribosoom in TAM10-buffer en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. Verwijder het vrije eiwit door sucrosekussen ultracentrifugatie (100.000 x g, 's nachts) om het ribosoom een blauwgekleurde pellet te laten vormen op de bodem van de buis.
- Label de tRNAPhe volgens het eerder gepubliceerde rapport22. Incubeer eerst het tRNA (10 A260 in 1 ml water) met 100 μL NaBH4 (100 mM bouillon, druppelsgewijs toevoegen) bij 0 °C gedurende 1 uur. Bevrijd de tRNA's van niet-gereageerde NaBH4 via drievoudige ethanolneerslag door 1/10 volume van 3 M KAc (pH 5,0) en 2,5x volume ethanol toe te voegen. Incubeer het gereduceerde tRNA met 1 μL Cy3-NHS-kleurstofoplossing (1 mg in 10 μL DMSO) in een minimumvolume (~ 20 μL) van 0,1 M natriumformate (pH 3,7). Na 2 uur incubatie bij 37 °C scheidt u het tRNA van de niet-gereageerde kleurstof via een kleine G25 Sephadex-kolom en verwijdert u vervolgens de vrije kleurstof via tweevoudige ethanolneerslag.
2. Bereiding van de ribosoomcomplexen
- Druk de His-tagged eiwitten van IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts en tRNA-synthetasen uit en zuiver ze met behulp van standaardmethoden15.
- Bereid de initiatiemix door de volgende ingrediënten toe te voegen in tam10-buffer bij 37 °C gedurende 15 minuten: 1 μM van het gelabelde ribosoom; 1,5 μM elk van IF1, IF2 en IF3; 2 μM gebiotinyleerd mRNA (coderend voor MF voor de eerste twee aminozuren); 4 μM geladen fMet-tRNAfMet; en 1 mM GTP.
- Bereid de EF-Tu_G mix door de volgende ingrediënten te mengen in TAM10 buffer bij 37 °C gedurende 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP en 0,02 mg/ml Pyruvaat Kinase.
- Bereid de EF-Tu_NoG mix vergelijkbaar met stap 2.3 zonder EF-G.
- Bereid het Phe-mengsel door de volgende ingrediënten te mengen in nucleasevrij water bij 37 °C gedurende 15 minuten: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Fenylalanine-specifieke synthetase, 2 A260/ml gelabelde tRNAPheen 50 μM fenylalanine.
- Bereid het pre-translocatiecomplex (PRE) voor door de initiatie-, EF-Tu_NoG- en Phe-mixen te mengen in de verhouding 1:2:2, bij 37 °C gedurende 2 minuten. Na incubatie zuivert u de PRE met 1,1 M sucrosekussen ultracentrifugatie gedurende de nacht bij 100.000 x g.
- Bereid het posttranslocatiecomplex (POST) door de initiatie-, EF-Tu_WG- en Phe-mengsels te mengen in de verhouding 1:2:2, bij 37 °C gedurende 10 minuten. Na incubatie zuivert u de POST met 1,1 M sucrosekussen ultracentrifugatie gedurende de nacht bij 100.000 x g.
3. Voorbereiding van monsterglaasjes
- Reinig de glazen dia's van de microscoop (75 mm x 25 mm) met zes paar gaten (diameter 1 mm). Elk paar vormt een inlaatopening van de monsterkamer. Zorg ervoor dat de afstand tussen elk inlaat-uitlaatgat 13 mm is en de hart-op-hartafstand tussen twee kanalen 6 mm. Plaats zes dia's in een glazen kroes.
- Vul de smeltkroes met aceton en soniceer ze gedurende 5 minuten. Decanteer de aceton en spoel de glaasjes drie keer af met ultraptaal water. Vul de kroes opnieuw met water en 1 ml 10 M KOH. Sonicate gedurende 20 min.
- Spoel de glaasjes drie keer af met ultrapijn water. Vul de kroes opnieuw met ethanol en soniceer gedurende 5 minuten. Decanteer het oplosmiddel volledig. Laat de glijden drogen in de zuurkast.
- Reinig de microscoopglas coverslips (#1.5 dikte, 24 x 40 mm). Voer de reinigingsstappen uit zoals beschreven in de stappen 3.1-3.3.
- Bak de gereinigde glijbanen en coverslips gedurende 3 uur op 300 °C. Bewaar ze een nacht in de oven om af te koelen.
- Bedek de coverslip met aminosilaan. Giet in de kroes met coverslips methanolmengsel (100 ml methanol, 5 ml water, 0,5 ml HAc en 1 ml aminosilaan). Verwarm de kroes gedurende 10 minuten in een waterbad, soniceer hem gedurende 10 minuten en verwarm de smeltkroes vervolgens nog eens 10 minuten in het waterbad. Decanteer het methanolmengsel, spoel de afdeksels goed af in drie kroezen schoon water. Spoel de oppervlakken met een droge stikstofstroom door een naald.
- Bekleed de coverslips met biotine-PEG in een laminaire schone kap.
- Gebruik voor het maken van de PEG-oplossing 98 mg PEG en 2-3 mg biotine-PEG in 200 μL 100 mM NaHCO3-oplossing.
- Leg één deklip plat op een oppervlak. Laat voorzichtig 60 μL PEG-oplossing op de bovenrand vallen. Leg er vervolgens nog een coverslip op, waardoor het capillaire effect de oplossing tussen de twee coverslips verspreidt. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden gevormd.
- Herhaal stap 3.7.2 voor nog twee paar coverslips. Bestrijk zes stukken coverslips met biotine. Als er meer coverslips nodig zijn, pas dan de hoeveelheid PEG en Biotine PEG dienovereenkomstig aan om meer PEG-oplossing te maken.
- Bewaar deze coverslips in een lege tip-box gevuld met water en incubeer gedurende 3 uur in het donker.
- Na 3 uur scheidt u de dekens, spoelt u af met water in drie opeenvolgende kroezen en zuivert u met een droge stikstofstroom. Plaats de gecoate coverslips op een keramisch rek. Markeer het oppervlak met coating.
- Monteer de monsterkamers19.
- Trek scherpe pipetpunten door de gaten op de glasplaten tot ze goed passen. Schraap de scherpe uiteinden eraf totdat deze volledig vlak is op het glasoppervlak. Snijd het andere uiteinde van de punt op ongeveer 5 mm voor het laden van het monster.
- Knip een dubbelzijdige tape met het kanaalpatroon erop (25 x 40 mm).
- Plak de dubbelzijdige tape op de glazen platen aan de vlakke kant.
- Plak de gecoate deklip op de dubbelzijdige tape. Druk erop om de monsterkamer goed af te sluiten. Zorg ervoor dat de gecoate kant naar binnen is gericht.
4. Single molecule FRET beeldvorming
- Schakel de computer in.
- Schakel de microscoopschakelaar in.
- Start de laserbesturingsinterface en schakel de laser in. Druk op de inschakelen-knop op de laserbesturingskast om de laser op te warmen.
- Schakel de camera's in.
- Start het aan de microscoop gekoppelde softwareprogramma. Klik op de bovenste sluiter uit en klik op het lampje Aan.
- Bereid de TAM10_WT buffer door 10 μL van 5% Tween-20 toe te voegen aan 1 ml TAM10 buffer.
- Bereid de deoxy-oplossing door 3 mg glucoseoxidase in een kleine microcentrifugebuis te wegen. Voeg 45 μL catalase toe. Vortex voorzichtig om de vaste stof op te lossen. Draai 20.000 x g in een microcentrifuge gedurende 1 min. Neem het supernatant.
- Bereid 30% glucoseoplossing in water en 200 mM Trolox-oplossing in DMSO.
- Bereid 0,5 mg/ml streptavidinoplossing in nucleasevrij water.
- Voeg één druppel beeldolie toe aan de TIRF-doelstelling.
- Plaats de monsterkamers op het doel.
- Vul de kamer met 10 μL streptavidin-oplossing. Wacht 1 min.
- Was de kamer met 30 ml TAM10_WT buffer en verzamel de doorloopoplossing met een gevouwen filtreerpapier. Wacht 1 min.
- Verdun de ribosoomcomplexen (PRE of POST) tot een concentratie van 10-50 nM met TAM10_WT buffer.
- Laad 20 μL van het ribosoommonster in het kanaal. Wacht 2 min.
- Maak de beeldvormingsbuffer (50 μL TAM10-buffer plus 0,5 μL elk van deoxy-, glucose- en Trolox-oplossingen). Meng de buffer goed.
- Spoel de kamer met 30 μL van de beeldvormingsbuffer.
- Stel de camera in op 100 ms/frame, 16 bits, 4 x 4 binning.
- Klik op de bovenste sluiter aan en de lamp uit.
- Start camera-acquisitie. Verspreid de beelden in drie vensters die twee afzonderlijke camera's en de overlay vertegenwoordigen.
- Klik op Autofocus. Verfijn om de beste focus te vinden.
- Klik op een methode. Stel de veldpunten, bestandsopslag en het lusnummer in.
- Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: Er verschijnt een nieuw venster met realtime beeldvorming. De voortgang van de tijdreeksen en gezichtsveldreeksen worden boven aan het venster weergegeven. - Zodra de beeldacquisitie is voltooid, sluit u het pop-upvenster.
- Open het ND-bestand (verworven bestand).
- Klik op ROI / eenvoudige ROI-editor. Kies de optie Circle.
- Selecteer de ROI op de afbeelding. Klik op Voltooien wanneer het is voltooid.
- Klik op Meting/Tijdmeting om de gegevens als plot of als spreadsheet weer te geven.
- Open het tabblad Exporteren. Stel de exportparameters in.
- Klik op Exporteren om de intensiteiten op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De smFRET had het ribosoom gelabeld op de middelste positie van tRNA-verkeer, om de tRNA-translocatie van de A- naar de P-site te onderscheiden (Figuur 1)15. De afstand van het L27-etiketteringsresidu tot het A- of P-site tRNA is respectievelijk 52 of 61 Å, wat overeenkomt met een FRET-efficiëntie van 0,47 en 0,65. Na de beeldverzameling werden fluorescentie-intensiteiten van de donor- en acceptorkanalen opgehaald en uitgezet als time-lapses(figuur 1). Fret efficiëntie werd berekend door de formule Iacceptor/(Iacceptor+Idonor). Een zelfgemaakt programma detecteerde het in één stap bleken van de donor / acceptor en paste de gegevens aan vóór de bleekpunten om berekening van FRET van geluiden te voorkomen. Na het bleken van de donor naderden beide sporen de uitgangswaarde omdat er geen excitatie direct op de acceptor kan optreden(figuur 2A). Na het bleken van de acceptor nam de donorintensiteit toe omdat minder reactieroutes de excitatie-energie afvoeren (figuren 2B, C).
Het bleek dat de individuele ribosomen verschillende fluctuaties vertonen, zoals in de voorbeelden in figuur 2. Deze fluctuaties zijn te wijten aan de wiebelende beweging van de tRNA's, die afstandsfluctuaties tot de L2717,18veroorzaakt. In figuur 2zijn de stippellijnen de oorspronkelijke gegevens en zijn ononderbroken lijnen de aangepaste gegevens uit het programma. De aangebrachte sporen veranderen de ruwe gegevensuitlezing niet, maar verkorten de time-lapse-sporen na het bleken. De blauwe sporen zijn de berekende FRET-efficiënties. Door exact dezelfde ribosomen na 5 minuten incubatie bij RT te volgen, bleek dat het ene type dynamiek kan overschakelen naar een ander23. Omdat deze signalen rapporteren over tRNA-bewegingen die worden gedicteerd door het omringende ribosoom, werden vergelijkbare FRET-efficiënties gegroepeerd in verschillende ribosoomsubpopulaties.
Figuur 3 toont zeer diverse subpopulaties in het PRE-complex. Er zijn ongeveer 70% (640/951) van fluctuerende soorten en 30% (311/951) van niet-fluctuerende soorten. Deze twee categorieën kunnen verder worden gegroepeerd in fijnere subpopulaties. Aan de andere kant toont figuur 4 de tegenovergestelde dynamische verdeling. In POST is 65% van de subpopulaties niet fluctuerend en de meerderheid van hen vertoonde een hoge FRET-efficiëntie. Deze resultaten geven aan dat het ribosoom flexibeler is in de PRE-toestand dan de POST-toestand, wat een cryo-EM-studie bevestigt die concludeerde dat de peptidylketen op de P-site de ribosoomdynamiek in de POST-toestand vergrendelt. In de PRE-staat wordt de peptidylketen echter overgebracht naar de A-site, waardoor het ribosoom wordt ontgrendeld en5wordt bevorderd . De resultaten ondersteunden de conclusie van de structuurstudie onder meer fysiologische omstandigheden. De ontgrendelde toestand is gecorreleerd met de ratelbeweging tussen de 30S en 50S en de vergrendelde toestand is gecorreleerd met de niet-ratelende conformatie.
De subpopulatiesorteermethode onthult de ribosoomconformatie bij remming door het antibioticum viomycine, zoals weergegeven in figuur 514. Het totale FRET-efficiëntieh histogram toont een grote piek op 0,47, de klassieke toestand, zonder sortering. In deze toestand is het ribosoom vergrendeld en ongekraakt. Uit het sorteren van de subpopulaties is echter gebleken dat 60% van de bevolking fluctueert als het ontgrendelde PRE-complex. Daarom heeft viomycine het ribosoom in de rateltoestand gevangen. De resultaten van deze studie waren in tegenspraak met een röntgenstructuurresultaat op het moment van publicatie (2010), maar werden onlangs ondersteund door een andere structuurstudie (2020).
Figuur 1: De labelpositie van de Cy3/Cy5 op het ribosoom en het tRNA. De afstanden tussen het etiketteringsresidu van L27 tot het A- en P-site tRNA worden weergegeven (de rode en blauwe sterren tonen de geschatte etiketteringslocaties van respectievelijk de Cy5 en Cy3). Er wordt één representatief time-lapse-spoor van fluorescentie-intensiteiten van het CY3/Cy5 FRET-paar getoond. Een programma detecteert bleekpunten op donor/acceptorsporen en kapt het spoor voor dat punt af. Dit cijfer is gewijzigd van Altuntop, M. E. et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De typische ribosoomsporen werden geclassificeerd op hun verschillende dynamiek. (A) Een niet-fluctuerend ribosoomspoor. (B) Een fluctuerend ribosoomspoor dat alleen FRET-waarden lager dan 0,6 bemonstert. (C) Een fluctuerend ribosoomspoor dat de FRET-waarde hoger dan 0,6 bemonstert. De legendes worden getoond in de plot. De fluorescentie-intensiteiten van donor en acceptor zijn respectievelijk groen en magenta. FRET-waarden worden berekend als Iacceptor/(Iacceptor+Idonor) en afzonderlijk in blauw uitgezet. De oorspronkelijke gegevens worden weergegeven in stippellijnen en gegevens worden afgekapt voordat de bleekpunten in ononderbroken lijnen worden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Altuntop, M. E. et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: FRET efficiëntie histogrammen van het Pre-complex. De topplots tonen het FRET-histogram van de totale ribosomen. De tweederangsplots tonen de FRET-histogrammen van de ribosomen gescheiden in fluctuerende (F) en niet-fluctuerende (NF) groepen. De derde-laagse plots tonen de FRET-histogrammen van de ribosomen verder onderverdeeld in groepen fluctuaties die boven of onder een FRET-waarde van 0,6 lagen. Vergelijkbare criteria werden toegepast op de NF-ribosomen om ze te scheiden in stabiele FRET-toestanden onder of boven 0,6 (NF-laag, NF-hoog). De percelen van het vierde niveau tonen de representatieve sporen voor elke subpopulatie. Dit cijfer is gewijzigd van Altuntop, M. E. et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: FRET efficiëntie histogrammen van POST-Complex. De rangschikking en groepering zijn vergelijkbaar met figuur 3. In tegenstelling tot figuur 3is de NF-High populatie in de meerderheid. Dit cijfer is gewijzigd van Altuntop, M. E. et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histogrammen van het PRE-complex in aanwezigheid van 100 μM viomycine. De rangschikking en groepering zijn vergelijkbaar met figuur 3. Dit cijfer is gewijzigd van Ly, C. T. et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SmFRET is gevoelig voor achtergrondsignalen. Eerst is het noodzakelijk om de monsterkamer te coaten met 0,05% tween en vervolgens gelijktijdig met de ribosoomoplossing te worden toegevoegd om de niet-specifieke binding van het ribosoom aan het oppervlak te blokkeren. Om fluorescentie van de acceptor Cy5-emissie te zien, is de zuurstofaasetercocktail (deoxy-, glucose- en Trolox-oplossingen) essentieel. Zonder deze oplossing is het bleken te snel in het acceptorkanaal om nuttige informatie te verkrijgen. Een andere cruciale stap voor ribosoomexperimenten, met name, is de PEG-coating op het glasoppervlak. De ribosoomactiviteit is gevoelig voor de oppervlakteomgeving; daarom zijn lange borstelpolymeren essentieel om ongunstige oppervlakte-effecten af te schermen.
Als de monsterfase zich te ver van de scherpstelling bevindt, werkt het autofocussysteem niet. Als dit gebeurt, schakelt u de autofocus uit en past u de objectiefpositie handmatig aan terwijl u de gereflecteerde laservlek observeert. Dit is een voordeel van een zelfgebouwde totale interne reflectieverlichting omdat de laserspot zichtbaar is. Wanneer het doel in de buurt van de focus is, moeten de invallende en gereflecteerde laservlekken naast elkaar staan en beweegt de reflecterende spot met de aanpassing van de objectiefpositie. Wanneer deze twee plekken dichtbij zijn, werkt de autofocus weer.
Een beperking van smFRET is het zeer lage concentratiebereik. Slechts tot 50 nM fluorescerend gelabelde substraten kunnen worden geladen zonder remming van achtergrondgeluiden te veroorzaken. Hoewel oppervlaktegebonden monsters langdurige acquisitie op hetzelfde molecuul kunnen vereisen, is de tijdresolutie beperkt tot het ms-bereik, terwijl op diffusie gebaseerde confocale smFRET de dynamiek van het μs-bereik24kan bereiken. Een andere beperking van de FRET-methode is de nauwkeurige berekening van de afstand tot de FRET-efficiëntie. Door verschillende kleurstoflinkers en omgevingen varieert de Forster-afstand van lab tot lab. Daarom kan het vergelijken van absolute afstand problematisch zijn25. Hoewel fret-efficiëntieverandering het translocatiemechanisme onthult, werd een meer directe strategie ontwikkeld om de exacte dekking van ribosoom op het mRNA26,27te meten.
Niettemin is het gebruik van FRET-waarden als relatieve referenties om inhomogene populaties binnen één experimentele setting te onderscheiden een krachtige methode om mechanisme en dynamiek één molecuul tegelijk te onthullen, wat niet toegankelijk is met conventionele methoden. Bovendien zullen meerkleurige FRET en de combinatie van FRET met een optische val in de toekomst meer georkestreerde ribosoomdynamiek onthullen28. Deze ontwikkelingen zorgen voor een ongekende gevoeligheid (verplaatsing van Å-afstand) en nieuwe parameters (zoals krachten van pico-Newton magnitude) die niet haalbaar zijn met bestaande methoden28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y. Wang verklaart geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452) en de Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
