Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføring er en metode som sporer tRNA-dynamikken under ribosomal proteinsyntese. Ved å spore individuelle ribosomer identifiseres inhomogene populasjoner, som kaster lys over mekanismer. Denne metoden kan brukes til å spore biologiske konformasjonsendringer generelt for å avdekke dynamiske funksjonsrelasjoner i mange andre komplekse biosystemer. Enkeltmolekylmetoder kan observere ikke-rate begrensende trinn og lavfylte viktige mellomprodukter, som ikke er tilgjengelige ved konvensjonelle ensemblemetoder på grunn av den gjennomsnittlige effekten.

Abstract

Ribosomet er et stort ribonukleoproteinkompleks som samler proteiner prosessivt langs mRNA-maler. Diameteren på ribosomet er ca. 20 nm for å imøtekomme store tRNA-substrater på A-, P- og E-anleggene. Følgelig blir ribosomdynamikken naturlig avfaset raskt. Enkeltmolekylmetode kan oppdage hvert ribosom separat og skille inhomogene populasjoner, noe som er viktig for å avsløre de kompliserte mekanismene til flerkomponentsystemer. Vi rapporterer detaljene i en smFRET-metode basert på Nikon Ti2 invertert mikroskop for å sondere ribososomdynamikken mellom ribosomalproteinet L27 og tRNAer. L27 er merket i sin unike Cys 53-posisjon og rekonstituert til et ribosom som er konstruert for å mangle L27. TRNA er merket i albueområdet. Når tRNA beveger seg til forskjellige steder inne i ribosomet under forlengelsessyklusen, for eksempel pre- og posttranslokasjon, viser FRET-effektiviteten og dynamikken forskjeller, som har foreslått flere subpopulations. Disse subpopulasjonene kan ikke påvises ved hjelp av ensemblemetoder. Det TIRF-baserte smFRET-mikroskopet er bygget på et manuelt eller motorisert invertert mikroskop, med hjemmebygd laserbelysning. Ribosomets prøver renses ved ultracentrifugation, lastes inn i en hjemmebygd flerkanals prøvecelle og deretter belyses via et unnvikende laserfelt. Refleksjon laser spot kan brukes til å oppnå tilbakemelding kontroll av perfekt fokus. Fluorescenssignalene skilles av et motorisert filtertårn og samles inn av to digitale CMOS-kameraer. Intensitetene hentes via NIS-Elements-programvaren.

Introduction

Ribosomet er et ø 20 nm stort ribonukleoproteinkompleks av en stor (50S) og en liten (30S) underenhet. Den monterer lange peptider langs mRNA-malen prosessivt og samarbeidsvillig. Ribosomet 30S binder seg til fMet-tRNAfMet og mRNA for å starte proteinsyntese, og 50S blir deretter med for å danne 70S initieringskomplekset. TRNAene bringer aminosyrer til ribosomet på A-stedet (aminoacyl-tRNA bindingssted), mens det langstrakte peptidylkjeden holdes på P-stedet (peptidyl-tRNA bindingssted). I pretranslokasjonskomplekset overføres peptidylkjeden til tRNA på A-stedet med en aminosyre tilsatt. I mellomtiden er P-området tRNA deacylated. Deretter flytter A-, P- tRNAene til P-, E-områdene for å danne posttranslokasjonskomplekset, der E-området representerer tRNA-utgangsstedet. I denne tilstanden beveger peptidyl-tRNA seg tilbake til P-området. Forlengelsessyklusen fortsetter mellom pre- og postkonformasjonene mens ribosomet translokaliseres på mRNA, en kodon om gangen1. Ribosomet er svært koordinerende for forskjellige funksjonelle nettsteder for å gjøre denne prosessen effektiv og nøyaktig, for eksempel inter-subenhet ratcheting2, tRNA hybridiseringsvingninger 3, GTPase aktiveringer4,L1 stilk åpning-lukking5,etc. Følgelig avfaser ribosomer raskt fordi hvert molekyl beveger seg i sitt eget tempo. De konvensjonelle metodene kan bare utlede tilsynelatende gjennomsnittlige parametere, men lavbefolkede eller kortvarige arter vil bli maskert i gjennomsnittlig effekt6. Enkeltmolekylmetode kan bryte denne begrensningen ved å oppdage hvert ribosom individuelt, og deretter identifisere forskjellige arter via statistisk rekonstruksjon7. Ulike merkingssteder er implementert for å undersøke ribosomdynamikk, for eksempel interaksjonene mellom tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10, etc. I tillegg, ved å merke de store og små underenhetene, observeres henholdsvis inter-subenhet ratcheting kinetikk og koordinering med faktorer11,12. I mellomtiden har smFRET-metoden brede applikasjoner i andre sentrale biologiske prosesser, og flere farger FRET-metoder dukker opp13.

Tidligere ble et nytt ribosome FRET-par utviklet14,15. Det rekombinante ribosomale proteinet L27 har blitt uttrykt, renset og merket, og innlemmet tilbake i ribosomet. Dette proteinet interagerte med tRNAene på nært hold og bidro til å stabilisere P-området tRNA i posttranslokasjonskomplekset. Når tRNA flyttet fra A- til P-området, blir avstanden mellom dette proteinet og tRNA forkortet, noe som kan preges av smFRET-signalet. Flere ribosole subpopulasjoner har blitt identifisert ved hjelp av statistiske metoder og mutagenese, og spontan utveksling av disse populasjonene i pre- men ikke post-translokasjonskomplekset antyder at ribosomet er mer fleksibelt før du beveger deg på mRNA, og stivere under dekoding16,17,18. Disse variasjonene er avgjørende for ribosomefunksjonen. Her beskriver protokollen detaljene for ribosom/tRNA-merking, deres innlemmelse i ribosomet, smFRET prøvepreparering og datainnsamling/analyse19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av merket ribosom og tRNA for FRET-deteksjon

  1. Isoler ribosomet uten L27 fra E. coli-stammen IW312 i henhold til standardprotokollene20,21. Trekk ut det vanlige ribosomet fra E. coli-stammen MRE600.
  2. Klone L27s rpmA-gen med C-terminal His-tag til pET-21b (+) plasmid, som forvandles og uttrykkes i BL21(DE3)pLysS-celler15. Rens proteinet via en forhåndspakket sepharosekolonne.
  3. Merking av L27
    1. Inkuber 20-100 μM renset L27 i 100 μL med 2-10 ganger overskudd av TCEP (Tris-2-karboksyetyl-fosfin) ved romtemperatur (RT) i 30 minutter. Bufferen bytter løsningen inn i PBS-buffer (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), ved hjelp av en nap-5-kolonne. Tilsett 10 ganger overflødig Cy5-maleimid monoreaktivt fargestoff i DMSO i løsningen og inkuber ved RT i mørket i 2 timer.
    2. Last den merkede proteinoppløsningen (500 μL) nevnt ovenfor på en Nap-5-kolonne for å fjerne overflødig fargestoff. Forsikre deg om at proteinet elutes i det første fargede båndet, etterfulgt av henholdsvis det frie fargestoffet elute i det andre båndet. Samle det eluterte proteinet i 1 ml TAM10-buffer (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA og 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
  4. Rekonstituer ribosomet med L27. Bland det merkede L27-proteinet med like mye IW312 ribosot i TAM10 buffer og inkuber ved 37 °C i 1 time. Fjern det frie proteinet ved sukrosepute ultracentrifugation (100,000 x g, over natten) slik at ribosomet danner en blåfarget pellet nederst på røret.
  5. Merk tRNAPhe i henhold til den tidligere publiserte rapporten22. Først inkuberer du tRNA (10 A260 i 1 ml vann) med 100 μL NaBH4 (100 mM lager, tilsett dropwise) ved 0 °C i 1 time. Frigjør tRNAene fra uberørt NaBH4 via tre ganger etanolnedbør ved å legge til 1/10 volum 3 M KAc (pH 5.0) og 2,5x volum etanol. Inkuber den reduserte tRNA med 1 μL Cy3-NHS fargestoffoppløsning (1 mg i 10 μL DMSO) i et minimumsvolum (~20 μL) på 0,1 M natriumformat (pH 3,7). Etter 2 timers inkubasjon ved 37 °C, separer tRNA fra det uberørte fargestoffet via en liten G25 Sephadex-kolonne, og fjern deretter det frie fargestoffet via to ganger etanolnedbør.

2. Forberedelse av ribosomekompleksene

  1. Uttrykk og rens de hismerkede proteinene til IF1-, IF2-, IF3-, EF-G-, EF-Tu-, EF-T- og tRNA-synthetaser ved hjelp av standardmetodene15.
  2. Forbered initieringsblandingen ved å tilsette følgende ingredienser i TAM10 buffer ved 37 °C i 15 minutter: 1 μM av det merkede ribosomet; 1,5 μM hver av IF1, IF2 og IF3; 2 μM biotinylert mRNA (koding MF for de to første aminosyrene); 4 μM ladet fMet-tRNAfMet; og 1 mM GTP.
  3. Forbered EF-Tu_G blanding ved å blande følgende ingredienser i TAM10 buffer ved 37 °C i 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP og 0,02 mg/ml Pyruvate Kinase.
  4. Forbered EF-Tu_NoG blanding som ligner på trinn 2.3 uten EF-G.
  5. Forbered Phe-blandingen ved å blande følgende ingredienser i nukleasefritt vann ved 37 °C i 15 min: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Fenylalaninspesifikksyntese,2 A260/ml merket tRNA Phe og 50 μM fenylalanin.
  6. Forbered pretranslokasjonskomplekset (PRE) ved å blande initiering, EF-Tu_NoG og Phe-blandinger i forholdet 1:2:2, ved 37 °C i 2 minutter. Etter inkubasjon, rens PRE med 1,1 M sukrose pute ultracentrifugation over natten på 100,000 x g.
  7. Forbered posttranslokasjonskomplekset (POST) ved å blande initiering, EF-Tu_WG og Phe-blandinger i forholdet 1:2:2, ved 37 °C i 10 minutter. Etter inkubasjon, rens POST med 1,1 M sukrose pute ultracentrifugation over natten på 100,000 x g.

3. Forberedelse av prøvelysbilder

  1. Rengjør mikroskopglassskliene (75 mm x 25 mm) som inneholder seks hullpar (1 mm i diameter). Hvert par danner et innløpsuttak av prøvekammeret. Pass på at avstanden mellom hvert innløpshull er 13 mm og at avstanden fra midten til midten mellom to kanaler er 6 mm. Plasser seks sklier i en glassdigel.
  2. Fyll digelen med aceton og soniker dem i 5 min. Dekanter acetonen og skyll lysbildene tre ganger med ultrarent vann. Fyll digelen igjen med vann og 1 ml 10 M KOH. Soniker i 20 min.
  3. Skyll lysbildene tre ganger med ultrarent vann. Fyll digelen igjen med etanol og soniker i 5 min. Dekanter oppløsningsvæsken helt. La skliene tørke i avtrekkshetten.
  4. Rengjør mikroskopglassdekslene (#1,5 tykkelse, 24 x 40 mm). Utfør rengjøringstrinnene som beskrevet i trinn 3.1-3.3.
  5. Stek de rensede skliene og dekslene ved 300 °C i 3 timer. Hold dem i ovnen over natten for å avkjøles.
  6. Belegge dekslene med aminosilane. I smeltedigelen som inneholder deksler, hell i metanolblanding (100 ml metanol, 5 ml vann, 0,5 ml HAc og 1 ml aminosilane). Varm digelen i et vannbad i 10 min, soniker den i 10 min, og varm deretter digelen i vannbadet i ytterligere 10 minutter. Dekanter metanolblandingen, skyll dekslene godt i tre digler rent vann. Rens overflatene med en tørr nitrogenstrøm gjennom en nål.
  7. Belegge dekslene med biotin-PEG i en laminær ren hette.
    1. For å lage PEG-oppløsningen, bruk 98 mg PEG og 2-3 mg biotin-PEG i 200 μL 100 mM NaHCO3-oppløsning.
    2. Legg ett deksle flatt på en overflate. Slipp forsiktig 60 μL PEG-oppløsning på overkanten. Legg deretter en annen deksle på toppen av den, la kapillæreffekten spre løsningen mellom de to dekslene. Pass på at det ikke dannes bobler.
    3. Gjenta trinn 3.7.2 for to par til med deksler. Frakk seks stykker deksler med biotin. Hvis det er behov for flere deksler, justerer du mengden PEG og Biotin PEG tilsvarende for å lage mer PEG-løsning.
    4. Oppbevar disse dekslene i en tom spissboks fylt med vann og inkuber i 3 timer i mørket.
    5. Etter 3 timer, separer dekslene, skyll med vann i tre påfølgende digler og rens med en tørr nitrogenstrøm. Legg de belagte dekslene på et keramisk stativ. Merk overflaten med belegg.
  8. Monter prøvekamrene19.
    1. Trekk skarpe pipettespisser gjennom hullene på glasssklierene til de sitter godt fast. Skrap de skarpe endene av til den er helt flat til glassoverflaten. Klipp den andre enden av spissen til ca. 5 mm for prøvelasting.
    2. Klipp et dobbeltsidig tape med kanalmønsteret på (25 x 40 mm).
    3. Fest den doble tapen på glasssklier på den flate siden.
    4. Fest de belagte dekslene på den doble tape. Trykk på den for å lage en tett forsegling av prøvekammeret. Pass på at den belagte siden vender innover.

4. Enkeltmolekyl FRET-avbildning

  1. Slå på datamaskinen.
  2. Slå på mikroskopbryteren.
  3. Start laserkontrollgrensesnittet og slå på laseren. Trykk på aktiveringsknappen på laserkontrollboksen for å varme opp laseren.
  4. Slå på kameraene.
  5. Start det mikroskop-tilknyttede programmet. Klikk den øvre lukkeren Av , og klikk lampen På.
  6. Klargjør TAM10-_WTbuffer ved å legge til 10 μL 5 % Tween-20 i 1 ml TAM10-buffer.
  7. Forbered deoksyoppløsningen ved å veie 3 mg glukoseoksidase i et lite mikrocentrifugerør. Tilsett 45 μL katase. Virvel forsiktig for å oppløse det faste. Spinn på 20,000 x g i en mikrocentrifuge i 1 min. Ta supernatanten.
  8. Forbered 30% glukoseoppløsning i vann og 200 mM Trolox-oppløsning i DMSO.
  9. Forbered 0,5 mg/ml streptavidinoppløsning i nukleasefritt vann.
  10. Legg til en dråpe bildeolje til TIRF-målet.
  11. Sett prøvekamrene på målet.
  12. Fyll kammeret med 10 μL streptavidinoppløsning. Vent i 1 min.
  13. Vask kammeret med 30 ml TAM10_WT buffer og samle gjennomkjøringsløsningen med et brettet filterpapir. Vent i 1 min.
  14. Fortynn ribosomekompleksene (PRE eller POST) til 10-50 nM konsentrasjon med TAM10_WT buffer.
  15. Last 20 μL av ribosomets prøve inn i kanalen. Vent i 2 min.
  16. Lag bildebufferen (50 μL TAM10 buffer pluss 0,5 μL hver av deoksy-, glukose- og Trolox-løsninger). Bland bufferen godt.
  17. Skyll kammeret med 30 μL av bildebufferen.
  18. Still inn kameraet til å hente 100 ms/ramme, 16 biter, 4 x 4 binning.
  19. Klikk den øvre lukkeren På og lampen Av.
  20. Start kameraanskaffelse. Spre bildene i tre vinduer som representerer to individuelle kameraer og overlegget.
  21. Klikk Automatisk fokusering. Finjuster for å finne det beste fokuset.
  22. Klikk på en metode. Angi feltpunkter, fillagring og løkkenummeret.
  23. Klikk Kjør.
    MERK: Et nytt vindu vises med sanntidsbilder. Fremdriften for tidsseriene og synsfeltet vises øverst i vinduet.
  24. Når bildeanskaffelsen er fullført, lukker du popup-vinduet.
  25. Åpne ND-filen (hentet fil).
  26. Klikk på AVKASTNING / enkel ROI editor. Velg alternativet Sirkel.
  27. Velg avkastningen på bildet. Klikk på Fullfør når den er fullført.
  28. Klikk på Måling / Tidsmåling for å vise dataene enten som et plott eller som et regneark.
  29. Åpne Eksporter-fanen. Angi eksportparameterne.
  30. Klikk på Eksporter for å lagre intensitetene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SmFRET hadde ribosomet merket i midtposisjonen av tRNA-trafikk, for å skille tRNA-translokasjonen fra A- til P-området (figur 1)15. Avstanden fra L27-merkingsrester til A- eller P-området tRNA er henholdsvis 52 eller 61 Å, tilsvarende FRET-effektivitet på henholdsvis 0,47 og 0,65. Etter bildesamlingen ble fluorescensintensiteter fra donor- og akseptorkanalene hentet og plottet inn etter hvert som tiden går bort (figur 1). FRET effektivitet ble beregnet av formelen jeggodtar/(Jeggodtar+jegdonor). Et hjemmelaget program oppdaget enkelttrinnsbleking av donoren / akseptoren og monterte dataene før blekingspunktene for å unngå beregning av FRET fra lyder. Etter donorbleking nærmet begge sporene seg grunnlinjen fordi ingen eksitasjon kan forekomme direkte på akseptoren (figur 2A). Etter akseptorbleking økte donorintensiteten fordi færre reaksjonsveier sprer eksitasjonsenergien (Figur 2B, C).

Det ble funnet at de enkelte ribosomene viser forskjellige svingninger, for eksempel i eksemplene vist i figur 2. Disse svingningene skyldes tRNAs vinglete bevegelse, noe som forårsaker avstandssvingninger til L2717,18. I figur 2er de prikkede linjene de opprinnelige dataene, og heltrukne linjer er de monterte dataene fra programmet. De monterte sporene endrer ikke rådataavlesningen, men avkorter tidsforløpsporene etter bleking. De blå sporene er den beregnede FRET-effektiviteten. Ved å spore nøyaktig de samme ribosomene etter 5 min inkubasjon på RT, ble det funnet at en type dynamikk kan bytte til en annen23. Fordi disse signalene rapporterer om tRNA-bevegelser diktert av det omkringliggende ribosomet, ble lignende FRET-effektivitet gruppert i ulike ribosole subpopulasjoner.

Figur 3 viser svært varierte delpopulasjoner i PRE-komplekset. Det er ca. 70% (640/951) av svingende arter og 30% (311/951) av ikke-svingende arter. Disse to kategoriene kan grupperes videre i finere delpopulasjoner. På den annen side viser figur 4 den motsatte dynamikkfordelingen. I POST er 65% av subpopulasjonene ikke-svingende, og de fleste av dem viste høy FRET-effektivitet. Disse resultatene indikerer at ribosomet er mer fleksibelt i PRE-tilstanden enn POST-staten, noe som bekrefter en kryo-EM-studie som konkluderte med at peptidylkjeden på P-området låser ribosomdynamikken i POST-tilstanden. Men i PRE-tilstand overføres peptidylkjeden til A-området, låser opp ribosomet og fremmer5. Resultatene støttet strukturstudiekonklusjonen under mer fysiologiske forhold. Den ulåste tilstanden er korrelert med ratcheting bevegelsen mellom 30S og 50S, og den låste tilstanden er korrelert med den ikke-ratcheted konformasjonen.

Subpopulation sorteringsmetoden avslører ribosomet konformasjon ved hemming av antibiotika viomycin, som vist i figur 514. Det generelle FRET-effektivitets histogrammet viser en stor topp på 0,47, den klassiske tilstanden, uten sortering. I denne tilstanden er ribosomet låst og ikke ratket. Sortering av delpopulasjonene har imidlertid vist at 60% av befolkningen svinger som det ulåste PRE-komplekset. Derfor har viomycin fanget ribosomet i ratcheted tilstand. Resultatene av denne studien motsatte seg et røntgenstrukturresultat på publiseringstidspunktet (2010), men ble nylig støttet av en annen strukturstudie (2020).

Figure 1
Figur 1: Merkeposisjonen til Cy3/Cy5 på ribosomet og tRNA. Avstandene mellom etikettrester av L27 til A- og P-området tRNA vises (de røde og blå stjernene viser de omtrentlige merkingsstedene til henholdsvis Cy5 og Cy3). Et representativt tidsforløpspor av fluorescensintensiteter fra CY3/Cy5 FRET-paret vises. Et program oppdager blekepunkter på donor/akseptorspor og avkorter sporingen før dette punktet. Denne figuren er endret fra Altuntop, M. E. et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: De typiske ribosomesporene ble klassifisert etter deres forskjellige dynamikk. (A) Et ikke-svingende ribosomspor. (B) Et varierende ribosolespor som bare tar prøver av FRET-verdier som er lavere enn 0,6. (C) Et varierende ribosomspor som tar prøver av FRET-verdien høyere enn 0,6. Forklaringene vises i plottet. Fluorescensintensitetene til donor og akseptor er henholdsvis grønne og magenta. FRET-verdier beregnes som jeggodtar/(Jeggodtar+Igiver) og tegnes separat i blått. De opprinnelige dataene vises i prikkede linjer, og data avkortes før blekepunktene vises i heltrukne linjer. Denne figuren er endret fra Altuntop, M. E. et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: FRET-effektivitets histogrammer av Pre-komplekset. De øverste plottene viser FRET-histogrammet til de totale ribosomene. Plottene på andre nivå viser FRET-histogrammene til ribosomene atskilt i svingende (F) og ikke-svingende (NF) grupper. De tredje tier tomtene viser FRET histogrammer av ribosomer ytterligere delt inn i grupper av svingninger som var over eller under en FRET-verdi på 0,6. Lignende kriterier ble brukt på NF-ribosomene for å dele dem opp i stabile FRET-tilstander under eller over 0,6 (NF-lav, NF-høy). Plottene på fjerde lag viser de representative sporene for hver delbefolkning. Denne figuren er endret fra Altuntop, M. E. et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: FRET-effektivitets histogrammer av POST-Complex. Ordningen og grupperingen ligner på figur 3. I motsetning til figur 3er den NF-høye befolkningen flertallet. Denne figuren er endret fra Altuntop, M. E. et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Histogrammer av PRE-komplekset i nærvær av 100 μM viomycin. Ordningen og grupperingen ligner på figur 3. Denne figuren er endret fra Ly, C. T. et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFRET er følsom for bakgrunnssignaler. For det første er det nødvendig å belegge prøvekammeret med 0,05% tween og deretter tilsetts samtidig med ribosomet for å blokkere ikke-spesifikk binding av ribosomet til overflaten. For å se fluorescens fra akseptoren Cy5-utslipp, er oksygenfangercocktailen (deoksy-, glukose- og Trolox-løsninger) viktig. Uten denne løsningen er blekingen for rask i akseptorkanalen for å få nyttig informasjon. Et annet kritisk skritt for ribosomeksperimenter, spesielt, er PEG-belegget på glassoverflaten. Ribosomets aktivitet er følsom for overflatemiljøet; Derfor er lange børstepolymerer avgjørende for å beskytte ugunstige overflateeffekter.

Hvis prøvetrinnet er for langt fra fokus, vil ikke systemet for automatisk fokusering fungere. Hvis dette skjer, slår du av autofokuset og justerer den objektive posisjonen manuelt mens du observerer det reflekterte laserpunktet. Dette er en fordel med en hjemmebygd total intern refleksjonsbelysning fordi laserpunktet er synlig. Når målet er nær fokus, bør hendelsen og reflekterte laserpunkter være side om side, og reflekterepunktet beveger seg med justeringen av den objektive posisjonen. Når disse to flekkene er nær, vil autofokuset fungere igjen.

En begrensning av smFRET er det svært lave konsentrasjonsområdet. Bare opptil 50 nM fluorescerende merkede substrater kan lastes uten å forårsake hemmende bakgrunnsstøy. Selv om overflatebundne prøver kan kreve langvarig oppkjøp på samme molekyl, er tidsoppløsningen begrenset til ms-området, mens diffusjonsbasert konfomisk smFRET kan nå dynamikken i μs-området24. En annen begrensning ved FRET-metoden er den nøyaktige beregningen av avstanden fra FRET-effektivitet. På grunn av forskjellige fargekoblinger og miljøer varierer Forster-avstanden fra lab til lab. Derfor kan det være problematisk å sammenligne absolutt avstand25. Selv om FRET-effektivitetsendring avslører translokasjonsmekanismen, ble det utviklet en mer direkte strategi for å måle den nøyaktige dekningen av ribosom på mRNA26,27.

Likevel er bruk av FRET-verdier som relative referanser for å skille inhomogene populasjoner innenfor en eksperimentell setting en kraftig metode for å avsløre mekanisme og dynamikk ett molekyl om gangen, som ikke er tilgjengelig med konvensjonelle metoder. Videre vil multi-farge FRET og kombinasjonen av FRET med en optisk felle avsløre mer orkestrert ribosomdynamikk i fremtiden28. Denne utviklingen gir enestående følsomhet (forskyvning av Å-avstand) og nye parametere (for eksempel krefter av pico-Newton størrelse) som ikke er oppnåelige med eksisterende metoder28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y. Wang erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av US National Institutes of Health (R01GM111452) og Welch Foundation (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 173
Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. Single Molecule… More

Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter