Summary
Denne protokol demonstrerer en ny metode til anvendelse af genterapier på subpopulationer af celler hos nyfødte rotter i postnatale aldre 5-10 dage ved at injicere en anterograd kemogenetisk modifikator i den somatomotoriske cortex og en retrograd transportabel Cre-rekombinase i cervikal rygmarven.
Abstract
Vellykket håndtering af de forhindringer, der begrænser forskning på neonatale rotter, er vigtig for at studere forskellene i resultater, der ses i pædiatriske rygmarvsskader (SCI'er) sammenlignet med voksne SCI'er. Derudover kan pålidelig introduktion af terapier i målcellerne i centralnervesystemet (CNS) være udfordrende, og unøjagtigheder kan kompromittere effektiviteten af undersøgelsen eller terapien. Denne protokol kombinerer viral vektorteknologi med en ny kirurgisk teknik til nøjagtigt at introducere genterapier til nyfødte rotter på postnatal dag 5. Her introduceres en virus konstrueret til retrograd transport (retroAAV2) af Cre ved axonterminalerne af kortikospinale neuroner i rygmarven, hvor den efterfølgende transporteres til cellelegemerne. En dobbeltfloxed omvendt orientering (DIO) designerreceptor, der udelukkende aktiveres af designer drug (s) (DREADD) virus, injiceres derefter i hjernens somatomotoriske cortex. Denne dobbeltinfektionsteknik fremmer kun ekspressionen af DREADD'erne i de co-inficerede kortikospinalkanal (CST) neuroner. Således er den samtidige co-injektion af den somatomotoriske cortex og cervikale CST-terminaler en gyldig metode til undersøgelse af den kemogenetiske modulering af genopretning efter cervikale SCI-modeller hos nyfødte rotter.
Introduction
Mens SCI er en relativt sjælden forekomst i den pædiatriske befolkning, er den særlig traumatisk og forårsager et permanent handicap, der kræver enorm logistisk fremsyn. Desuden klassificeres en højere andel af pædiatriske SCI'er som cervikale og komplette sammenlignet med den voksne befolkning 1,2. Et kendetegn på tværs af pattedyrarter er, at nyfødte kommer sig markant bedre fra SCI end voksne, og dette giver mulighed for at vurdere drivmekanismerne for genopretning i yngre populationer 3,4,5. På trods af dette er der færre multimodale undersøgelser, der tackler nyfødte og spædbarnsgnaverforskning, dels på grund af den ekstra vanskelighed ved nøjagtigt at målrette udvalgte populationer af neuroner i de meget strammere anatomiske landemærker hos yngre dyr6. Denne artikel fokuserer på direkte injektion af højeffektive anterograd og retrograd adeno-associerede vektorer i rotterygmarven for at modulere større motorveje med anvendelse af Cre-dependent-DREADD'er, hvilket udvider rækkevidden af multimodale regenereringsundersøgelser.
Virale vektorer er vigtige biologiske værktøjer med en bred vifte af anvendelser, herunder introduktion af genetisk materiale til erstatning for målgener, opregulering af vækstproteiner og sporing af det anatomiske landskab i CNS 7,8,9. Mange af de anatomiske detaljer i spinalmotoriske veje er blevet undersøgt ved hjælp af klassiske sporstoffer, dvs. biotinyleret dextranamin. Mens traditionelle sporstoffer har været medvirkende til at afdække neuroanatomi, er de ikke uden deres ulemper: de mærker vilkårligt veje, selvom de injiceres korrekt, og undersøgelser har vist, at de optages af beskadigede axoner10,11,12. Derfor kan dette føre til forkerte fortolkninger i regenereringsundersøgelser, hvor afskårne axoner kan forveksles med regenererende fibre.
Følgende metode anvender det tovirale vektorsystem, der for nylig blev populariseret i modulationsundersøgelser, med to forskellige virale vektorer i to separate områder af den samme neuron13,14. Den første er en vektor, der lokalt inficerer cellelegemerne af projektionsneuroner. Den anden er en retrograd vektor, der transporteres fra axonterminalerne i projektionsneuronerne (figur 1). Den retrograde vektor bærer Cre rekombinase, og den lokale vektor inkorporerer "Cre-On" dobbeltfloxed sekvens, hvori et fluorescerende protein (mCherry) er kodet. Det oprindelige transgen, der udtrykker både hM3Dq og mCherry, er omvendt i forhold til promotoren og flankeres af to LoxP-steder (figur 2). Således udtrykkes mCherry kun i de dobbelt transducerede projektionsneuroner, hvor Cre-rekombinase inducerer en rekombinationsbegivenhed mellem LoxP-stederne, vender transgenets orientering ind i den passende læseramme og tillader ekspression af både DREADD og det fluorescerende protein. Når det virale transgen er i den rigtige retning, og når det er relevant, kan DREADD'erne forbigående inducere neuromodulation gennem en separat injiceret ligand, dvs. clozapin-N-oxid. Protokollen blev designet til at autentificere inducerbar neuromodulationsforskning hos nyfødte, hvor DREADDS injiceres for at modulere CST'erne selektivt. Det tovirale system fungerer som en forsikringspolice, der sikrer, at hver DREADD-positiv celle kan spores under fluorescens med høj troskab for at validere injektionerne.
Denne metode hjælper også med at bygge bro over kløften i neonatal forskning. Pædiatrisk SCI præsenterer sine udfordringer, og forskning, der analyserer regenerering, spiring eller plasticitet, bør understrege forskellene mellem nyfødte og voksne 3,15,16,17. Ved at optimere det kirurgiske indgreb og udføre tidligere anatomiske undersøgelser med Nissl-farvning blev koordinaterne for både kranie- og rygmarvsinjektionerne valideret. Målet var at tilvejebringe en metode til dobbelt injektion i en neonatal rotte med øget troskab og overlevelsesevne.
For den nuværende model blev anterogradvektoren injiceret i cellelegemerne i den somatomotoriske cortex ved hjælp af bregma som reference18,19. Med hensyn til rygmarvsinjektionerne blev retrogradvektoren injiceret i laminae V-VII, hvor CST-axonterminalerne befinder sig20,21. Der ligger mange grundlæggende spørgsmål til grund for, hvordan visse læsionsmodeller påvirker yngre dyr forskelligt, og hvordan den efterfølgende bedring afviger fra et ældre dyr. Denne undersøgelse viser et robust middel til at studere livmoderhalsskader og genoprettelsen af forbensfunktionen hos neonatale gnavere. I modsætning hertil har størstedelen af tidligere undersøgelser behandlet genopretningsbevægelse efter lænde- eller thoraxskader 5,22,23,24. Ved at parre den dobbeltvirale vektor med den nye injektionsteknik, der er beskrevet her, hjælper denne protokol med at afbøde visse problemer (dvs. overlevelsesevne), der kan plage neonatal gnaverundersøgelser. Denne metode er robust, praktisk og alsidig: små variationer i teknikken giver mulighed for at målrette forskellige veje, dvs. ventral CST, dorsal CST og de stigende dorsale veje.
Til dette system injiceres en lokalt virkende virus (f.eks. AAV2) i regionen af neuronale cellelegemer af interesse. En anden retrograd transporteret virus, der styrer ekspressionen af den lokale virus, injiceres ved axonterminalerne for den neuronale population. Således er per definition kun kortikospinale neuroner mærket. RetroAAV-Cre-virus blev valgt med en konstitutivt aktiv CMV-promotor, da shuttleplasmidet bruges til at generere flere AAV-serotyper til Cre-afhængig ekspression i flere celletyper. Til kortikale injektioner blev AAV2 valgt med transgenet drevet af synapsin-1-promotoren for at begrænse enhver ekspression til neuroner. Fordi det 2-virale system er mere afhængig af oprindelsen og afslutningen af den neuronale population af interesse, kan flere forskellige promotorer bruges, hvis de kan drive ekspressionen af generne af interesse inden for den neuronale population af interesse. For eksempel kunne den excitatoriske neuronale promotor, CamKII, erstattes af synapsin-1. Ud over brugen af disse AAV-serotyper kan retrograd transport til umodne og i meget mindre grad voksne kortikospinale motorneuroner også opnås ved anvendelse af det høje retrograd transportable lentivirus (HiRet)25. HiRet lentivirus bruger et kimært rabies/VSV-glycoprotein til at målrette optagelsen ved synapsen til retrograd transport. Kombineret med en Tet-On-promotor understøtter dette 2-virale system inducerbart udtryk på en retrogradafhængig måde26,27.
Retrograde vira indsætter vektorer i det synaptiske rum af en målneuron, så den kan optages af cellens axon og transporteres til cellekroppen. Mens lentivirale vektorer tidligere har haft enorm succes og givet langsigtet ekspression i genterapistudier, drejede denne metode sig mod adeno-associerede virale vektorer af nogle få enkle grunde26,28: AAV er mere økonomisk, tilsvarende effektiv og udgør mindre af en logistisk byrde, da den har en lavere biosikkerhedsniveaubetegnelse29,30,31,32 . Mens AAV2, den mest anvendte serotype, demonstrerer robust transfektion af CST-axoner, kan fremtidige forskere bemærke, at AAV1 tilbyder en vis alsidighed, da den mærker transynaptisk og dermed fremsætter flere mulige iterationer i fremtidige undersøgelser33. Den endelige tilpasning er at kode retrogradviruset med Cre-rekombinase, så flere anterogradvektorer kan introduceres samtidigt, hvorved unødvendigt internt virusaffald reduceres, og sandsynligheden for, at DREADD'erne udtrykker sig i den rigtige retning, maksimeres.
I sidste ende demonstrerer denne protokol samtidig injektion i cortex og cervikal rygsøjle, specifikt rettet mod henholdsvis cellelegemerne og axonterminalerne i kortikospinalkanalen. High-fidelity transfektion ses i hjernebarken og rygmarven. Mens den beskrevne protokol blev perfektioneret til Sprague Dawley rotter 5 dage gamle, er den velegnet til postnatale dage 4-10 med mindre justeringer af anæstesi og stereotaktiske koordinater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle følgende kirurgiske og dyreplejeprocedurer er blevet godkendt af Animal Care and Use Committee ved Temple University. Den beskrevne protokol er en overlevelsesoperation, og dyrene blev til sidst aflivet ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg natriumpentobarbital ved afslutningen af deres tidspunkter.
1. Prækirurgisk forberedelse
- Forbered mindst to trukne glasnåle til viral injektion ved hjælp af 3,5 nL glaskapillærpipetter; en nål til DREADD og en nål til rCre. Som en sikkerhedsforanstaltning skal du forberede 4-5 nåle, hvis de bryder intraoperativt.
- Brug en mikrosaks til at afskære 1-2 mm overskydende glas fra nålen.
- For hver nål skal du placere den ved 30°, bruge en mikropipette-beveller til at skabe en spids med en 30-40 μm blænde og en 45° skrå vinkel.
- Opbevar nålene i en overdækket petriskål og steriliser dem derefter ved at placere petriskålen i en biosikkerhedshætte under UV-lys i 15 min.
- De nødvendige vira fremstilles ved at fjerne et passende rumfang fra -80 °C-fryseren inden proceduren, idet der tages hensyn til, at hvert dyr skal bruge 3 μL af hver virus.
BEMÆRK: Transport og opbevar virussen på is, når den ikke er i brug. Denne protokol blev udviklet ved hjælp af AAV2-hM3Dq-mCherry og AAV2-retroCre til at injicere 3 μL af hver virus pr. Dyr. DREADD-plasmidet, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (se materialetabellen), blev brugt til at fremstille anterograd AAV2 med en viral titer på 1,54 × 1012 genomkopier (GC) / ml. Cre-plasmidet, pAAV-CMV-scCre, blev brugt til at fremstille retrograd AAV2 med en viral titer på 4,27 × 1012 GC / ml. - Sæt injektoren i mikropumpen, og placer den i en mikromanipulator med en Vernier-skala.
- For at hjælpe visuelt med at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af virus i nålen skal du lægge farvet farvestof, dvs. rød olie, i nålen. Undgå bobler i nålen.
- Indsæt glasnålen i injektoren, og sørg for, at nålen sidder korrekt.
- Gentag hele processen med en separat injektionspumpe for hver virus, hvis det er muligt. Hvis der kun er én tilgængelig injektionspumpe, skal du klargøre to separate nåle og udskifte den brugte nål, når det er tid til at udskifte virussen.
2. Anæstesi og kirurgisk forberedelse af stedet
- Væg dyret på en digital skala. Optag den præoperative vægt for at bestemme mængden af bedøvelsesmiddel, der kræves.
BEMÆRK: Denne protokol fandt, at den mest pålidelige bedøvelsesteknik til at sikre et tilfredsstillende bedøvelsesplan i hele driftstiden er en kombination af ketamin og hypotermi. Ketamin er utilstrækkelig til at sikre anæstesi alene, og at supplere det med xylazin har en smal tærskel, før den øger intraoperativ dødelighed. Hypotermi alene er ikke tilstrækkelig til langvarige operationer (dobbelt rygsøjle og hjernekirurgi kræver sandsynligvis >1 times stabil anæstesi). - Bedøv hvalpen ved at injicere fortyndet ketamin (10 mg / ml) subkutant mellem skulderbladene, så dyret får en dosis ketamin på 100 mg / kg; vent i 5 min.
BEMÆRK: For eksempel vejer en rotteunge på postnatal dag 5 10 g og modtager 0,1 ml af den fortyndede ketaminopløsning (10 mg / ml). - Placer hvalpen på knust is i 6-8 min. Beskyt det mod forfrysninger ved at placere dyret i en latexhandske eller parafilm for at undgå direkte kontakt med is.
- Klem foden fast ved hjælp af tang for at bekræfte et passende bedøvelsesplan. Hvis der opstår refleksiv tilbagetrækning, skal du lade det stå i yderligere 2 minutter på is, før du fortsætter.
- Påfør bredt antiseptisk middel på dyrets hoved- og rygområde ved hjælp af sterilt gasbind gennemblødt med en 5% iodopløsning. Derefter steriliseres med gasbind gennemblødt i 70% ethanol. Påfør de antiseptiske klude tre gange hver, skiftevis mellem jod og ethanol for at suge gasbindet.
BEMÆRK: Der er ikke behov for øjenpleje, da unge hvalpe først åbner øjnene, når de er 14 dage gamle. - Hvis et dyr skal have dobbeltkirurgi (hjerne + rygsøjle), skal du give en normal saltvandsbolus før operationen (0,02 ml / g) subkutant mellem skulderbladene.
BEMÆRK: Hvis dyret reagerer under operationen, og yderligere bedøvelse er påkrævet, skal du udskifte dyret på is i 5 minutter.
3. Kirurgisk felt og instrumentforberedelse
- Autoklave de kirurgiske værktøjer, der inkluderer en skalpelholder, rongeurs, hæmostater, mellempunkts buede tang og retraktorer
- Gør mikroskopet klar, og installer stereotaksisk adapter til nyfødte rotter for at placere det solidt i den stereotaksiske holder til voksne.
- Udfør operationen ved hjælp af steriliserede handsker. Åbn en pakke færdigpakkede sterile kirurgiske handsker, og læg den sterile handskeindpakning på bordet ved hjælp af indpakningen som et ekstra område til at placere brugt værktøj.
BEMÆRK: Det er vigtigt at følge god kirurgisk praksis og opretholde sterilitet under hele proceduren. - Fastgør et 11-blad i skalpelholderen. Placer sterilt saltvand, 4,0 kromisk catgut sutur, 4,0 silkesutur og materialer til kontrol af blødning, fx sterilt gaze, sterile bomuldsspidsede applikatorer og trekanter.
- Opret to kirurgiske felter som beskrevet ovenfor, med et sted tildelt til kraniotomi og det andet sted tildelt cervikal laminektomi.
- Hent dyret og fastgør det i stereotaksadapteren: Da nyfødte er meget brusk, skal du fastgøre dem forsigtigt ved at rette ørestængerne bredt mod mandibulære led. Når det er vandret stabiliseret, skal du forsigtigt indføre det forreste mundstykke.
BEMÆRK: En ikke-bindende regel, der bruges til at give et "fladt" kirurgisk område, er at fastgøre ørestængerne i samme højde og mundstykket ca. 2-3 niveauer lavere.
4. Udførelse af kraniotomi og eksponering af den somatomotoriske cortex
- Identificer det område, hvor snittet vil blive lavet ved at trykke på tangen i midterlinjen på toppen af hovedbunden og føle efter sagittal sutur. Lav et snit på 1 cm langs det sagittale suturplan, der starter umiddelbart over øjenlinjen. Hold huden stram for at sikre et rent, lige og præcist snit.
- Identificer bregma (konvergensen mellem koronale og sagittale suturer) ved forsigtigt at undersøge tangen langs overfladen af kraniet og være meget opmærksom på suturlinjerne samt enhver fordybning forårsaget af tangen, der løber langs parietal- og frontknoglerne.
- Oprethold åbningen med påføring af vægtede kroge på siden af interesse. Bemærk, at rygmarvsinjektionen er lavet på højre side, kranieinjektionen er på venstre side.
- Ryd aponeurosen med en kombination af bomuldsspidserne og mikrosaksen for at maksimere eksponeringen af bregma for øget nøjagtighed. Sørg for, at koronal sutur er i klart syn langt nok sideværts til at give en grov skabelon til efterfølgende injektioner.
- Brug mikrosaksen til at klippe ca. 3 x 2 mm sektion af venstre frontale kranieknogle umiddelbart ved siden af bregma.
BEMÆRK: Når knogleklappen er blevet forsigtigt fjernet, skal der være et klart vindue med eksponeret hjernemateriale klar til injektion. De resterende suturlinjer på den kontralaterale side af hjernen vil fungere som en visuel vejledning til opretholdelse af nøjagtighed langs den forreste bageste (AP) akse. - Ryd op i snavs, cerebrospinalvæske (CSF) og blod med bomuldsspidser.
BEMÆRK: Det er normalt, at blod eller CSF lidt skjuler den visuelle linje, så det tilrådes at rydde området med bomuldsspidser regelmæssigt.
Figur 3: En skematisk illustration af kranieinjektionskoordinaterne (mm) i forhold til bregma. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Indlæsning af virussen og placering af injektoren
- Læg virussen i injektoren ved at pipettere ~5 μL på et stykke parafilm, og placer nålen, så spidsen hviler oven på virusdråben.
- Sørg for, at ekstra virus er indlæst i injektoren for at sikre jævn injektion. Når du f.eks. injicerer i alt 3 μL (1 μL for hvert injektionssted), trækkes 4 μL af virussen ud med en hastighed på 250 nL/s ved hjælp af mikropumpen.
- Fjern overskydende virus med en laboratorieserviet.
- Placer mikromanipulatoren, så Vernier-skalaen er synlig, og placer nålen over den sagittale sutur.
- Sænk nålen til lige over det område, der repræsenterer bregma (figur 3), og noter AP og medial-laterale (ML) koordinater.
- Da injektionerne vil være på venstre side, skal du generere målkoordinater ved at trække 1, 1,5 og 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) fra ML-koordinaterne for bregma.
BEMÆRK: AP-positionen vil være +0,5 mm fra bregma for alle tre injektioner. - Flyt nålen på plads til den første injektion. AP: +0,5, ML: -1,0
- Sænk nålen til den udsatte hjerne, indtil den indrykker den ydre cortex. Notér nålens højde og bring nålen ned på plads ved at trække 0,6 mm fra højden på hjernens overflade. Injektionsdybde: kortikal overflade -0,6 mm.
BEMÆRK: Det er vigtigt at notere dybden af overfladen for hver injektion, da der kan forekomme mindre forstyrrelser i rottens positionering.
6. Injektion af virus i den somatomotoriske cortex
- Når nålen er på plads, programmeres injektoren til at injicere 1 μL med en hastighed på 250 nL/min.
- Når injektionen er afsluttet, lad nålen hvile i cortex i 3 min.
- Gentag injektionerne for de andre koordinater: i alt 3 injektioner langs cortex i forhold til bregma, alle i en dybde på -0,6 mm: 1) AP: +0,5 mm, ML: -1,0 mm 2) AP: +0,5 mm, ML: -1,5 mm 3) AP: +0,5 mm, ML: -2,0 mm.
- Efter endt injektion henvises til punkt 9 til sutur, og dyret overføres til det andet operationsbord for cervikal laminektomi.
7. Oprettelse af et rygmarvsvindue til præcise rygmarvsinjektioner
- Identificer snitstedet ved at bruge fingrene til at palpere bunden af kraniet. Ved midterlinjen skal du begynde snittet 1-2 mm bageste til kraniebasen ved hjælp af et #11 blad og forlænge snittet 1 cm bageste for at udsætte den overfladiske muskel. Hold huden stram ved at påføre spænding med tommel- og pegefinger for at sikre et rent snit.
- Brug bladets skarpe punkt til forsigtigt at lave en række snit langs midterlinjen af den overfladiske muskel for at udsætte ryghulen og dybe rygmuskler. Brug et par tang til at sprede musklen og visualisere det kirurgiske vindue.
BEMÆRK: Den overfladiske muskel vil fremstå lyserød, mens de dybe rygmuskler vil fremstå som en lys hvidlig-grå. - Når de dybe rygmuskler er blevet udsat, skal du indsætte retraktorer i det kirurgiske vindue. Brug om nødvendigt tang til at gribe fat i den laterale hud og muskler for at strække dem rundt om retraktorernes tænder. Træk det kirurgiske vindue tilbage til 7-8 mm i bredden, hvilket giver et uhindret udsyn til rygsøjlen.
- Identificer den anden cervikale (C2 eller akse) hvirvel ved sin fremtrædende spinøse proces, der projicerer dorsalt og indkapsling i en stor kuppelformet muskel. Brug tang eller en stump sonde til at føle efter og identificere denne proces, da dette vil være det vejledende vartegn.
BEMÆRK: Den tilstødende C3-ryghvirvel er ofte let blokeret af den store C2-muskel; derfor hjælper blid dissektion af muskler ved C3 med tang eller en knogleskraber med at definere ryghvirvlen og hjælpe med at tælle hvirveldyr. - Brug den flade kant af en knogleskraber til at udsætte C3-C7 ryghvirvler ved forsigtigt at skrabe den dybe rygmarvsmuskel væk til siderne. Start medial og skrab sideværts langs retningen parallelt med vertebrale laminer for at sikre korrekt eksponering, hvilket vil muliggøre klar skelnen mellem vertebrale laminer. Kontroller enhver blødning med bomuldsspidser.
- Brug en mikrosaks til forsigtigt at skære sidekanterne af brusklaminerne ved C6 og C7. Brug C2 som vejledning, når du tæller vertebrale niveauer.
- Brug et par fine tang til forsigtigt at fjerne den dissekerede del af lamina for at udsætte rygmarven. Sørg for, at rygmarvsvinduet er stort nok til at rumme det ønskede injektionssted. Fjern eventuelle skarpe eller takkede dele af knoglen, der kan punktere rygmarven med mikrosaks og tang som beskrevet ovenfor.
- Anbring dyret i den stereotaksiske kranieholder som beskrevet i punkt 3.6. Derudover skal du placere et sammenrullet stykke gasbind under dyrets bagagerum for at hæve bagfjerdingen.
BEMÆRK: Forhøjelse af dyrets bagfjerdinger løfter effektivt brystkassen fra holderens overflade for at forhindre, at åndedrætsbevægelser påvirker kanylens position under injektionen. - Før du begynder injektioner, skal du rydde rygmarvsvinduet for blod eller cerebrospinalvæske ved forsigtigt at anvende bomuldsspidser og Sugi-trekanter på området uden at fornærme rygmarven. Opret endvidere en barriere omkring vinduets omkreds for at forhindre okklusion af injektionsstedet ved kontinuerlig blødning eller CSF-lækage. For at gøre dette skal du placere et lille stykke absorberbar bomuld i de laterale dele af rygmarvsvinduet.
8. Direkte injektioner i rygmarven rettet mod axonterminaler
- Brug spidsen af glasinjektionsnålen til at tilnærme rygmarvens midterlinje ved at identificere rygmarven. Men hvis rygmarvsarterien er mærkbart off-center eller afviger på nogen måde, skal du tilnærme midterlinjen ved at bruge positionen af C2-spinøs proces og ekstrapolere dette ned langs rygsøjlen.
BEMÆRK: Se afsnit 5.1 for instruktioner om indlæsning af virussen. - Når nålen er identificeret, placeres den lige bagved C5-laminaen ved den omtrentlige midterlinje og bruges som referencepunkt. Brug derefter mikromanipulatoren til at flytte nålen sideværts til højre med 0,3 mm. Sænk nålen, indtil den lige rører rygmarvens overflade; Fra denne dybde skal du kaste nålen 0,6 mm ind i rygmarven. Fortsæt om nødvendigt med at kaste nålen, indtil den punkterer rygmarven; Træk derefter nålen tilbage eller sænk den til den passende dybde.
- Der indsprøjtes 1 μL retroAAV2-scCre ved 250 nL/min. Når injektionen er færdig, skal du vente 2 minutter på, at virussen diffunderer ind i rygmarven, før nålen langsomt trækkes ud. Gentag injektionerne med de samme laterale koordinater og dybdekoordinater yderligere to steder i rygmarvsvinduet, et i midtpunktet og det sidste lige foran T1 laminaen.
9. Sårlukning og postoperativ pleje
- Fjern dyret fra stereotaksholderen og tag retraktorerne eller krogene ud. Ryd sårområdet ud med et par dråber sterilt normalt saltvand.
- Sutur hovedbunden med 4,0 silkesutur, to eller 3 suturer i alt.
- Når du suturerer livmoderhalsåbningen, skal du bruge 4,0 kromtarm til tæt at fastgøre muskellagene igen (2 suturer skal være tilstrækkelige). Sutur den cervikale hudåbning med 4,0 silke (4 suturer forventes).
- Når dyret er lukket, skal du forsigtigt anvende flydende bandage over suturerne.
- Anbring dyret under en varmelampe og overvåg det nøje, indtil det vækkes helt igen. Når dyret er vågen, bevæger sig og tørt, skal du forsigtigt rense sårene med sterilt gasbind. Efterlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
- Returner dyret til hjemmeburet med sin mor. Pas på at forhindre forsømmelse og spædbarnskannibalisering fra moderen mod hvalpene:
- Gør undersøgerne fortrolige med moderen i forventning om operation gennem skånsom håndtering (5-10 min) to gange dagligt, begyndende en uge før operationen.
- Returner hvalpene til hjemmeburet sammen for at begrænse forstyrrelsen for moderen.
- Injicer moderen med acepromazin 1,5 mg/kg q12 timer subkutant på operationsdagen.
BEMÆRK: Smertebehandling tjener det dobbelte formål at give analgesi til hvalpene og tilskynde til tidligere tilbagevenden til aktivitet og dermed fremme reintegration med moderen. - Buprenorphin injiceres 0,05 mg/kg subkutant q8 timer startende efter operationen i 3 dage i alt (postoperative dage 0, 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket injektion og transport af den virale vektor bør resultere i transduktion af ensidige neuroner i rygmarven og motorcortex. Figur 4 demonstrerer mærkning af lag V CST-neuroner i motorcortex i en hjernekoronal sektion, der udtrykker Cre-afhængig-DREADDs-mCherry co-injiceret med en kontralateral rygsøjleinjektion af rCre. Sektionerne var farvet med dsRed antistof.
Figur 1: En illustration, der viser de tovirale injektionsmetoder, der anvendes i denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustration af de virale konstruktioner, der anvendes i denne protokol, sammen med den dobbeltfloxede inverterede orientering, der korrigeres af retroAAV2-scCRE. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Transduktion af neuroner i motorcortex. (A) Forstørrelse af 5x. dsRed immunhistokemi, der demonstrerer mCherry-ekspression i lag V-neuroner i dyrets venstre motoriske cortex. Skalabjælke = 500 μm.(B) Forstørrelse af 10x. dsRed immunhistokemi, der demonstrerer mCherry-ekspression i lag V-neuroner i dyrets venstre motoriske cortex. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inducerbar genetisk modulering af hjerneaktivitet med injicerbare kemogenetiske modifikatorer er et kraftfuldt værktøj til at studere de forskellige mekanismer, der ligger til grund for genopretningen fra SCI. Nøjagtigheden af målretningen for de inducerbare G-proteinkoblede receptorer (DREADD'er) øges yderligere, når man overvejer, at fluorescenssporing validerer den anatomiske præcision i histologi. Dette papir diskuterer en pålidelig metode til at undersøge, om hæmning eller stimulering af udvalgte neuronale veje (med enten excitatoriske eller hæmmende DREADDS) resulterer i forbedret axonregenerering eller spiring34,35. Injektion af en retrograd transportabel vektor i rygmarven kan henlede opmærksomheden på udvalgte neuronale populationer, enten direkte eller via deres synaptiske forbindelse, hvilket gør denne metode til et glimrende valg til vurdering af det neurobiologiske respons på skade.
Som illustreret tjener undersøgelse af SCI i neonatale modeller for at belyse eventuelle tidligere ukendte uoverensstemmelser mellem pædiatriske populationer og voksne populationer kun til at komplicere forskningen yderligere. Som sådan er undersøgelsesdesignene smallere. Konsensus i neonatal forskning er, at de forbedrede resultater, der ses efter SCI, afhænger af øget aksonal regenerering og øget spiring indtil omkring postnatal dag 7 hos gnavere 3,4,5,36. Denne forstærkede plasticitet ses imidlertid ikke ud over postnatal dag 10 og genopretningsplateauer, før den også repræsenterer voksne gnaverskademodeller 37,38,40. De underliggende mekanismer for den forbedrede plasticitet hos nyfødte er undvigende og forbliver debatterede, hvilket fremhæver vigtigheden af at udvikle let replikerede, overlevelsesdygtige og effektive kirurgiske modeller for at lette fokuseret forskning i neonatal SCI.
For eksempel har nogle hævdet, at det uforholdsmæssigt store spiringsniveau, der ses hos yngre dyr, ophæver visse aspekter af funktionel genopretning fra CST-fornærmelse19. I sidste ende er der stadig spørgsmål, om den spontane genopretning skyldes organisk regenerering eller simpelthen øget spiring af afvigende veje, der bekvemt omgår læsionen. Den beskrevne protokol er en relativt ligetil og modulær teknik, der kan bruges til at studere kortikospinalkanalregenerering eller spiring gennem kunstig hæmning eller stimulering af genopretningsprocesser med fremkomsten af inducerbare vektorer.
De vira, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev valgt for at give en plan for fremtidig forskning, der undersøger sandsynligheden for at påvirke genopretning fra SCI hos yngre gnavere. Ved design ville transgenet, der udtrykker mCherry, kun mærke positivt under fluorescens, hvis DREADD (hM3Dq) udtrykte samtidigt, da de begge er til stede på det samme transgen. Selvom den nuværende protokol ikke inkluderer adfærdsmæssige og fænotypiske vurderinger, har den lagt grunden til en vellykket undersøgelse af DREADD-aktivitet i fremtidige undersøgelser.
De mest kritiske elementer til vellykkede injektioner af virale vektorer er at kende den korrekte anatomi og sikre tilstrækkelig diffusion af virus. Med hensyn til injektion af anterogradvektoren i den sensorimotoriske cortex er der adskillige metoder beskrevet i litteraturen, herunder tre injektioner i nærheden af bregma på en lav dybde (0,5-0,7 mm). Målretning af det korrekte område til retrograd injektion af en vektor i rygmarven kræver præcision og en behændig forståelse af neurobiologien af neuronerne af interesse. Størstedelen af CST-terminalerne er lokaliseret til laminer V-VII i hele rygmarvens grå substans, og vellykket transfektion kan kræve injektioner på flere cervikale niveauer41. For eksempel kan segmenter C4-C7 lokaliseres med forskellige landemærker, hvilket primer det kirurgiske vindue til rutinemæssige laminektomier og efterfølgende injektioner. Sikring af tilstrækkelig diffusion af det injicerede materiale afhænger af vektorens egenskaber, injektionsvolumen og densiteten af neuronvævet.
Heldigvis er den neonatale hjerne meget modtagelig for transfektion, da den lavere densitet giver mulighed for en hurtigere og formidlet spredning af det injicerede materiale. Spinalkomponenten er mere kompleks med et betydeligt strammere injektionsvindue. Ikke desto mindre er retroAAV effektiv til at transducere målsynapserne. Det er vigtigt at bemærke, at retrogradvektoren tager tid at nå cellelegemet og vende DREADD-vektoren i den korrekte rækkefølge, så den anbefalede tid, før der udføres adfærdsvurderinger eller histologiske undersøgelser, er ± 4 uger fra injektionsdatoen. Sammenfattende er retrograd AAV passende, da den har flere umiddelbare fordele, og da det dobbeltfloxede system kun fluorescerer målneuronale populationer. På trods af det smalle operative vindue er den neonatale rygmarv ligeledes modtagelig for transfektion og demonstrerer florid ekspression42.
Pædiatrisk rygmarvsforskning er en niche inden for et felt, der har mange barrierer for flerlagede undersøgelser. Med hver ny iteration og kirurgisk gennembrud i metodologi bliver selve forskningen lettere, og til gengæld øges sandsynligheden for at afdække deterministiske resultater. Præcis injektion af en viral vektor i en rygmarvsvej er nyttig af en lang række undersøgelsesmæssige årsager, og udvidelse af viral vektorteknologi til at omfatte DREADD'er er nyttig til selektivt at forbedre eller dæmpe målproteiner. Håbet er, at den forbedrede nøjagtighed fra det dobbeltfloxede injektionssystem parret med den nye kirurgiske protokol vil fremme en lang række lignende forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et stipendietilskud fra Shriners Hospitals for Children SHC-84706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
References
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447 (2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L.
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
