Summary
이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.
Abstract
신생아 쥐에 대한 연구를 제한하는 장애물을 성공적으로 해결하는 것은 성인 SCI와 비교하여 소아 척수 손상(SCI)에서 나타나는 결과의 차이를 연구하는 데 중요합니다. 또한 중추신경계(CNS)의 표적 세포에 치료법을 안정적으로 도입하는 것은 어려울 수 있으며 부정확성은 연구 또는 치료의 효능을 손상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터 기술과 새로운 수술 기술을 결합하여 출생 후 5 일에 신생아 쥐에게 유전자 치료법을 정확하게 도입합니다. 여기에서 Cre의 역행 수송 (retroAAV2)을 위해 설계된 바이러스가 척수에있는 피질 척수 뉴런의 축삭 말단에 도입되어 세포체로 운반됩니다. 그런 다음 디자이너 약물(DREADD) 바이러스에 의해 독점적으로 활성화된 이중 플록스 역 배향(DIO) 디자이너 수용체를 뇌의 체성 운동 피질에 주입합니다. 이 이중 감염 기술은 공동 감염된 피질 척수관 (CST) 뉴런에서만 DREADD의 발현을 촉진합니다. 따라서, 체성 운동 피질과 자궁 경부 CST 말단의 동시 주사는 신생아 쥐에서 자궁 경부 SCI 모델에 따른 회복의 화학 유전 조절을 연구하기위한 유효한 방법이다.
Introduction
SCI는 소아 인구에서 비교적 드물게 발생하지만 특히 외상이며 엄청난 물류 선견지명이 필요한 영구 장애를 유발합니다. 또한, 소아 SCI의 더 높은 비율은 성인 인구에 비해 자궁 경부 및 완전으로 분류됩니다 1,2. 포유류 종의 특징은 신생아가 성인보다 SCI에서 현저히 잘 회복된다는 것이며, 이는 젊은 인구 3,4,5에서 회복을위한 추진 메커니즘을 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 신생아 및 유아 설치류 연구를 다루는 다중 모드 연구는 더 적으며, 부분적으로는어린 동물의 훨씬 더 엄격한 해부학적 랜드마크에서 선택된 뉴런 집단을 정확하게 표적으로 삼는 것이 어렵기 때문입니다6. 이 기사는 Cre 의존적 DREADD를 적용하여 주요 운동 경로를 조절하기 위해 쥐 척수에 고효율 전방 및 역행 아데노 관련 벡터를 직접 주입하여 다중 모드 재생 연구의 범위를 확장하는 데 중점을 둡니다.
바이러스 벡터는 표적 유전자를 대체하고, 성장 단백질을 상향 조절하고, CNS 7,8,9의 해부학적 환경을 추적하기 위한 유전 물질의 도입을 포함하여 광범위한 응용 분야를 가진 중요한 생물학적 도구입니다. 척추 운동 경로의 많은 해부학적 세부 사항은 고전적인 추적자, 즉 비오티닐화된 덱스트란 아민을 사용하여 연구되었습니다. 전통적인 추적자는 신경 해부학을 발굴하는 데 중요한 역할을했지만, 올바르게 주입 되더라도 무차별 적으로 경로를 표시하고 연구 결과에 따르면 손상된 축삭10,11,12에 의해 흡수된다는 단점이 없습니다. 결과적으로, 이것은 절단 된 축삭이 재생 섬유로 오인 될 수있는 재생 연구에서 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다.
다음의 방법은 동일한 뉴런13,14의 2개의 개별 영역에 2개의 상이한 바이러스 벡터를 갖는 변조 연구에서 최근에 대중화된 2-바이러스 벡터 시스템을 이용한다. 첫 번째는 투영 뉴런의 세포체를 국부적으로 감염시키는 벡터입니다. 다른 하나는 투영 뉴런의 축삭 말단에서 운반되는 역행 벡터입니다(그림 1). 역행 벡터는 Cre 재조합 효소를 운반하고 로컬 벡터는 형광 단백질 (mCherry)이 인코딩되는 "Cre-On"이중 플록스 서열을 통합합니다. hM3Dq와 mCherry를 모두 발현하는 네이티브 전이유전자는 프로모터에 대해 반전되고 두 개의 LoxP 부위가 측면에 있습니다(그림 2). 따라서 mCherry는 Cre 재조합 효소가 LoxP 부위 간의 재조합 이벤트를 유도하여 전이 유전자의 방향을 적절한 판독 프레임으로 뒤집고 DREADD와 형광 단백질 모두의 발현을 허용하는 이중 형질 도입 된 투영 뉴런에서만 발현됩니다. 바이러스 전이유전자가 올바른 방향에 있고 적용 가능한 경우 DREADD는 별도로 주입된 리간드, 즉 클로자핀-N-옥사이드를 통해 일시적으로 신경 조절을 유도할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아에서 유도성 신경조절 연구를 인증하도록 설계되었으며, 여기서 DREADDS는 CST를 선택적으로 조절하기 위해 주입됩니다. 2-바이러스 시스템은 보험 정책 역할을 하여 모든 DREADD 양성 세포가 형광 하에서 높은 충실도로 추적되어 주사를 검증할 수 있도록 합니다.
이 방법은 또한 신생아 연구의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 소아 SCI는 그 도전 과제를 제시하며 재생, 발아 또는 가소성을 분석하는 연구는 신생아와 성인의 차이점을 강조해야합니다 3,15,16,17. 수술 절차를 최적화하고 Nissl 염색으로 이전 해부학 적 연구를 수행하여 두개골 및 척추 주사에 대한 좌표를 검증했습니다. 목표는 충실도와 생존성이 증가된 신생아 쥐에 이중 주사하는 방법을 제공하는 것이었습니다.
현재 모델의 경우, 전방 벡터는 bregma를 참조18,19로 사용하여 체성 운동 피질의 세포체에 주입되었습니다. 척추 주사의 관점에서, 역행 벡터는 CST 축삭 말단이20,21 개상하는 층류 V-VII에 주입되었다. 특정 병변 모델이 어린 동물에게 어떻게 다르게 영향을 미치는지, 그리고 후속 회복이 나이든 동물과 어떻게 다른지에 대한 많은 근본적인 질문이 있습니다. 이 연구는 신생아 설치류에서 자궁 경부 손상과 앞다리 기능의 회복 가능성을 연구하는 강력한 수단을 보여줍니다. 대조적으로, 이전 연구의 대부분은 요추 또는 흉부 손상 5,22,23,24 후 회복 운동을 다루었습니다. 이중 바이러스 벡터를 여기에 설명된 새로운 주입 기술과 페어링함으로써 이 프로토콜은 신생아 설치류 조사를 방해할 수 있는 특정 문제(즉, 생존 가능성)를 완화하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 강력하고 실용적이며 다재다능합니다 : 기술의 약간의 변형은 다른 경로, 즉 복부 CST, 등쪽 CST 및 오름차순 등쪽 경로를 표적으로 삼을 수 있습니다.
이 시스템의 경우, 하나의 국소 작용 바이러스 (예를 들어, AAV2)가 관심있는 뉴런 세포체의 영역에 주입된다. 국소 바이러스의 발현을 제어하는 두 번째 역행 수송 바이러스는 해당 뉴런 집단의 축삭 말단에 주입됩니다. 따라서 정의에 따라 피질 척수 뉴런 만 표시됩니다. 셔틀 플라스미드가 여러 세포 유형에서 Cre 의존성 발현을 위한 여러 AAV 혈청형을 생성하는 데 사용되기 때문에 레트로AAV-Cre 바이러스는 구성적으로 활성 CMV 프로모터와 함께 선택되었습니다. 피질 주사의 경우, AAV2는 뉴런에 대한 발현을 제한하기 위해 시냅신 -1 전구 운동에 의해 구동되는 전이 유전자로 선택되었습니다. 2-바이러스 시스템은 관심 뉴런 집단의 기원과 종결에 더 의존하기 때문에, 관심 뉴런 집단 내에서 관심 유전자의 발현을 유도할 수 있다면, 몇몇 상이한 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 흥분성 신경 촉진제 인 CamKII는 시냅신 -1을 대체 할 수 있습니다. 이러한 AAV 혈청 형의 사용 외에도, 미성숙으로의 역행 수송, 그리고 훨씬 적은 정도로, 성인 피질 척수 운동 뉴런은 높은 역행 수송 가능한 렌티 바이러스 (HiRet) 25를 사용하여 달성 될 수 있습니다. HiRet 렌티바이러스는 키메라 광견병/VSV 당단백질을 사용하여 역행 수송을 위해 시냅스에서 흡수를 목표로 합니다. Tet-On 프로모터와 결합 된이 2- 바이러스 시스템은 역행 의존적 방식으로 유도 가능한 발현을 지원합니다26,27.
역행 바이러스는 표적 뉴런의 시냅스 공간에 벡터를 삽입하여 해당 세포의 축삭에 흡수되어 세포체로 운반되도록합니다. 렌티바이러스 벡터는 이전에 유전자 치료 연구에서 장기간 발현을 제공하여 엄청난 성공을 거두었지만 이 방법은 몇 가지 간단한 이유로 아데노 관련 바이러스 벡터로 전환되었습니다.26,28: AAV는 더 경제적이고 유사하게 효과적이며 생물안전성 수준 지정이 낮기 때문에 물류 부담이 적습니다. 29,30,31,32 . 가장 많이 사용되는 혈청형인 AAV2는 CST 축삭의 강력한 형질감염을 보여주지만, 미래의 연구자들은 AAV1이 일시적으로 표지될 때 약간의 다양성을 제공하므로 향후 연구에서 몇 가지 가능한 반복을 제시한다는 점에 주목할 수 있습니다33. 최종 적응은 역행 바이러스를 Cre-recombinase로 인코딩하여 여러 전방 벡터를 동시에 도입할 수 있도록 하여 불필요한 사내 바이러스 낭비를 줄이고 DREADD가 올바른 방향으로 발현될 가능성을 최대화하는 것입니다.
궁극적으로이 프로토콜은 피질과 경추에 동시에 주사하는 것을 보여 주며, 특히 피질척수관의 세포체와 축삭 말단을 각각 표적으로 삼습니다. 고충실도 형질감염은 대뇌 피질과 척수에서 볼 수 있습니다. 설명 된 프로토콜은 5 일령의 Sprague Dawley 쥐에게 완벽했지만 마취 및 정위 좌표를 약간 조정하여 출생 후 4-10 일에 적합합니다.
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Protocol
다음의 모든 수술 및 동물 관리 절차는 템플 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 설명된 프로토콜은 생존 수술이며, 동물은 결국 시점이 완료될 때 100mg/kg 나트륨 펜토바르비탈의 복강 내 주사로 안락사되었습니다.
1. 수술 전 준비
- 3.5nL 유리 모세관 피펫을 사용하여 바이러스 주사를 위해 적어도 두 개의 뽑은 유리 바늘을 준비하십시오. DREADD용 바늘 하나와 rCre용 바늘 하나. 예방 조치로 수술 중 부러질 경우를 대비하여 4-5 개의 바늘을 준비하십시오.
- 마이크로 가위를 사용하여 바늘에서 1-2mm의 초과 유리를 잘라냅니다.
- 각 바늘에 대해 30°에 배치하고 마이크로피펫 베벨러를 사용하여 조리개가 30-40μm이고 비스듬한 각도가 45°인 팁을 만듭니다.
- 뚜껑을 덮은 페트리 접시에 바늘을 보관 한 다음 페트리 접시를 자외선 아래 생물 안전 후드에 15 분 동안 넣어 살균하십시오.
- 각 동물은 각 바이러스의 3μL가 필요하다는 점을 염두에두고 절차 전에 -80 ° C 냉동고에서 적절한 부피를 제거하여 필요한 바이러스를 준비하십시오.
알림: 사용하지 않을 때는 바이러스를 얼음 위에 옮겨 보관하십시오. 이 프로토콜은 AAV2-hM3Dq-mCherry 및 AAV2-retroCrery를 사용하여 동물 당 각 바이러스의 3μL를 주입하기 위해 개발되었습니다. DREADD 플라스미드인 pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry( 재료 표 참조)를 사용하여 바이러스 역가가 1.54 ×10 12 게놈 카피(GC)/mL인 전방 AAV2를 만들었습니다. Cre 플라스미드 pAAV-CMV-scCre를 사용하여 바이러스 역가가 4.27 ×10 12 GC/mL인 역행 AAV2를 만들었습니다. - 인젝터를 마이크로 펌프에 연결하고 버니어 스케일이있는 마이크로 매니퓰레이터에 넣으십시오.
- 바늘에 바이러스의 존재 여부를 시각적으로 확인하려면 컬러 염료, 즉 빨간색 오일을 바늘에 넣으십시오. 바늘에 거품이 생기지 않도록하십시오.
- 유리 바늘을 인젝터에 삽입하여 바늘이 올바르게 맞는지 확인하십시오.
- 가능한 경우 각 바이러스에 대해 별도의 주입 펌프로 전체 프로세스를 반복하십시오. 사용 가능한 주입 펌프가 하나만 있는 경우 두 개의 개별 바늘을 준비하고 바이러스를 교체할 때 사용한 바늘을 교체하십시오.
2. 마취 및 수술 부위 준비
- 디지털 저울로 동물의 무게를 측정합니다. 필요한 마취제의 양을 결정하기 위해 수술 전 체중을 기록하십시오.
참고: 이 프로토콜은 수술 시간 동안 만족스러운 마취 평면을 보장하는 가장 신뢰할 수 있는 마취 기술이 케타민과 저체온증의 조합임을 발견했습니다. 케타민은 자체적으로 마취를 보장하기에 충분하지 않으며 자일라진으로 보충하면 수술 중 사망률이 증가하기 전에 문턱이 좁습니다. 저체온증 자체만으로는 장기간의 수술에 충분하지 않습니다 (이중 척추 및 뇌 수술에는 >1 시간의 꾸준한 마취가 필요할 수 있음). - 동물이 100mg/kg 용량의 케타민을 받도록 견갑골 사이에 희석된 케타민(10mg/mL)을 피하 주사하여 강아지를 마취합니다. 5분 동안 기다립니다.
알림: 예를 들어, 출생 후 5일째에 쥐 강아지의 무게는 10g이고 희석된 케타민 용액(0.1mg/mL)을 10mL 받습니다. - 강아지를 으깬 얼음 위에 6-8분 동안 놓습니다. 얼음과의 직접적인 접촉을 피하기 위해 동물을 라텍스 장갑이나 파라 필름에 넣어 동상으로부터 보호하십시오.
- 적절한 마취면을 확인하기 위해 집게를 사용하여 발을 단단히 꼬집습니다. 반사적 금단이 발생하면 계속하기 전에 얼음 위에 2분 더 두십시오.
- 5 % 요오드 용액에 적신 멸균 거즈를 사용하여 동물의 머리와 등 부위에 방부제를 광범위하게 바르십시오. 그런 다음 70 % 에탄올에 담근 거즈로 소독하십시오. 소독 물티슈를 각각 세 번 바르고 요오드와 에탄올을 번갈아 가며 거즈를 담그십시오.
알림: 어린 새끼는 생후 14일에만 눈을 뜨기 때문에 안과 치료가 필요하지 않습니다. - 동물이 이중 수술(뇌 + 척추)을 받을 경우 수술 전에 견갑골 사이에 피하(0.02mL/g)의 생리식염수 볼루스를 제공합니다.
알림: 수술 중 동물이 반응하고 추가 마취가 필요한 경우 동물을 얼음 위에 5 분 동안 교체하십시오.
3. 수술 분야 및기구 준비
- 메스 홀더, 론저, 지혈제, 중간 지점 곡선 겸자 및 견인기를 포함하는 수술 도구를 오토클레이브
- 현미경을 준비하고 신생아 쥐 정위 어댑터를 설치하여 성인 정위 홀더 내에 단단히 배치합니다.
- 멸균 된 장갑을 사용하여 수술을하십시오. 사전 포장된 멸균 수술용 장갑 팩을 열고 포장지를 사용한 도구를 배치하기 위한 추가 영역으로 사용하여 멸균 장갑 랩을 테이블 위에 놓습니다.
알림: 좋은 수술 관행을 따르고 절차 전반에 걸쳐 불임을 유지하는 것이 중요합니다. - 메스 홀더에 11 블레이드를 고정하십시오. 멸균 식염수, 4.0 크롬 캣거트 봉합사, 4.0 실크 봉합사 및 출혈을 제어하는 재료(예: 멸균 거즈, 멸균 면 팁 어플리케이터 및 삼각형)를 배치합니다.
- 위에서 설명한 대로 두 개의 수술 필드를 설정하고, 한 부위는 개두술에 할당하고 다른 부위는 자궁경부 후궁 절제술에 할당합니다.
- 동물을 회수하여 정위 어댑터에 고정하십시오 : 신생아는 매우 연골이므로 이어 바를 하악 관절쪽으로 넓게 향하게하여 부드럽게 고정하십시오. 수평으로 안정화되면 전면 마우스피스를 부드럽게 삽입합니다.
알림: "평평한" 수술 부위를 제공하는 데 사용되는 구속력이 없는 규칙은 이어바를 같은 높이에 고정하고 마우스피스를 약 2-3단계 낮게 고정하는 것입니다.
4. 개두술 시행 및 체성 운동 피질 노출
- 시상 봉합사를 느끼면서 두피 상단의 정중선에있는 집게를 눌러 절개 할 부위를 확인하십시오. 시상 봉합면을 따라 1cm 절개를하고 아이 라인 바로 위에서 시작합니다. 깨끗하고 똑 바르고 정확한 절개를 위해 피부를 팽팽하게 유지하십시오.
- 두개골 표면을 따라 집게를 부드럽게 탐색하고 봉합사와 정수리 및 정면 뼈를 따라 흐르는 집게로 인한 움푹 들어간 곳에주의를 기울여 bregma (관상 및 시상 봉합의 수렴)를 식별하십시오.
- 관심 측면에 가중치 후크를 적용하여 개구부를 유지하십시오. 척추 주사는 오른쪽에, 두개골 주사는 왼쪽에 있습니다.
- 면봉과 미세 가위의 조합으로 동맥 경화증을 제거하여 브레그마의 노출을 최대화하여 정확도를 높입니다. 관상 봉합사가 후속 주사를 위한 대략적인 템플릿을 제공할 수 있을 만큼 충분히 측면으로 명확하게 보이는지 확인하십시오.
- 마이크로 가위를 사용하여 브레그마 바로 옆에 있는 왼쪽 정면 두개골 뼈의 약 3 x 2mm 부분을 잘라냅니다.
알림: 뼈 플랩이 조심스럽게 제거되면 주입 준비가 된 노출 된 뇌 물질이있는 투명한 창이 있어야합니다. 뇌의 반대쪽에있는 나머지 봉합선은 전후 (AP) 축을 따라 정확도를 유지하기위한 시각적 가이드 역할을합니다. - 면봉으로 파편, 뇌척수액(CSF) 및 혈액을 청소하십시오.
알림: 혈액이나 CSF가 시야를 약간 가리는 것은 정상이므로 정기적으로 면봉으로 해당 부위를 청소하는 것이 좋습니다.
그림 3: 브레그마에 대한 두개골 주입 좌표(mm)의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 바이러스 로딩 및 인젝터 배치
- 파라필름 조각에 ~5μL를 피펫팅하여 바이러스를 주입기에 넣고 팁이 바이러스 방울 위에 놓이도록 바늘을 배치합니다.
- 원활한 주입을 위해 추가 바이러스가 인젝터에 로드되었는지 확인하십시오. 예를 들어, 총 3 μL (각 주사 부위 당 1 μL)를 주입 할 때 마이크로 펌프를 사용하여 250 nL / s의 속도로 4 μL의 바이러스를 회수합니다.
- 실험실 닦음으로 과도한 바이러스를 제거하십시오.
- 버니어 스케일이 보이도록 마이크로 매니퓰레이터를 배치하고 바늘을 시상 봉합사 위에 놓습니다.
- 브레그마를 나타내는 영역 바로 위로 바늘을 내리고 (그림 3) AP 및 내측 (ML) 좌표를 기록해 둡니다.
- 주입이 왼쪽에 있다고 가정하면 브레그마의 ML 좌표에서 1, 1.5 및 2.0mm(ML: -1.0, -1.5, -2.0)를 빼서 대상 좌표를 생성합니다.
알림: AP 위치는 세 번의 주입 모두에 대해 브레그마에서 +0.5mm입니다. - 바늘을 첫 번째 주사 위치로 이동합니다. 공격력: +0.5, ML: -1.0
- 바깥 쪽 피질이 들여 쓰기가 될 때까지 노출 된 뇌로 바늘을 내립니다. 바늘의 높이를 기록하고 뇌 표면 높이에서 0.6mm를 빼서 바늘을 제자리로 가져옵니다. 주입 깊이 : 피질 표면 -0.6 mm.
알림: 쥐의 위치에 약간의 방해가 발생할 수 있으므로 각 주사에 대한 표면의 깊이를 기록하는 것이 중요합니다.
6. 체성 운동 피질에 바이러스 주입
- 바늘이 제자리에 놓이면 250nL/min의 속도로 1μL를 주입하도록 주입기를 프로그래밍합니다.
- 주사가 완료되면 바늘을 피질에 3 분 동안 두십시오.
- 다른 좌표에 대해 주사를 반복하십시오 : 브레그마와 관련하여 피질을 따라 총 3 회 주사, 모두 -0.6 mm의 깊이 : 1) AP : + 0.5 mm, ML : -1.0 mm 2) AP : +0.5 mm, ML : -1.5 mm 3) AP : +0.5 mm, ML : -2.0 mm.
- 주사가 끝나면 섹션 9를 참조하여 봉합하고 자궁 경부 후궁 절제술을 위해 동물을 다른 수술대로 옮깁니다.
7. 정확한 척수 주사를 위한 척추창 만들기
- 손가락을 사용하여 두개골 바닥을 촉지하여 절개 부위를 식별합니다. 정중선에서 #11 날을 사용하여 두개골 기저부 뒤쪽 1-2mm 절개를 시작하고 절개 부위를 후방 1cm 연장하여 표재성 근육을 노출시킵니다. 깨끗한 절개를 위해 엄지와 검지로 장력을 가하여 피부를 팽팽하게 유지하십시오.
- 칼날의 날카로운 부분을 사용하여 표면 근육의 정중선을 따라 일련의 절단을 부드럽게 만들어 척추강과 깊은 척추 근육을 노출시킵니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 근육을 펴고 수술 창을 시각화하십시오.
알림: 표재성 근육은 밝은 분홍색으로 나타나고 깊은 척추 근육은 밝은 희끄무레 한 회색으로 나타납니다. - 깊은 척추 근육이 노출되면 견인기를 수술 창에 삽입하십시오. 필요한 경우 집게를 사용하여 측면 피부와 근육을 잡고 견인기의 치아 주위로 늘립니다. 수술 창을 너비 7-8mm로 집어 넣어 척추를 방해받지 않고 볼 수 있습니다.
- 두 번째 자궁 경부 (C2 또는 축) 척추를 등쪽으로 돌출시키고 큰 돔 모양의 근육으로 캡슐화하는 두드러진 가시 돌기로 식별합니다. 집게나 무딘 프로브를 사용하여 이 과정을 느끼고 식별하면 이것이 안내 랜드마크가 될 것입니다.
알림: 인접한 C3 척추는 종종 큰 C2 근육에 의해 약간 가려집니다. 따라서 집게나 뼈 스크레이퍼로 C3에서 근육을 부드럽게 해부하면 척추를 정의하고 척추 계산을 돕는 데 도움이 됩니다. - 뼈 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여 깊은 척추 근육을 옆으로 부드럽게 긁어 C3-C7 척추를 노출시킵니다. 내측을 시작하고 척추 층과 평행 한 방향을 따라 옆으로 긁어 적절한 노출을 보장하면 척추 층을 명확하게 구별 할 수 있습니다. 면 끝으로 출혈을 조절하십시오.
- 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 C6 및 C7에서 연골 층의 측면 가장자리를 조심스럽게 자릅니다. 척추 수준을 계산할 때 C2를 지침으로 사용하십시오.
- 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 얇은 판의 해부 부분을 조심스럽게 제거하여 척수를 노출시킵니다. 척추 창이 원하는 주사 부위를 수용 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 위에서 설명한대로 미세 가위와 집게로 척수를 뚫을 수있는 뼈의 날카 롭거나 들쭉날쭉 한 부분을 제거하십시오.
- 섹션 3.6에 설명 된대로 동물을 정위 두개골 홀더에 설치하십시오. 또한 동물의 몸통 아래에 롤업 된 거즈 조각을 놓아 뒷부분을 높입니다.
알림: 동물의 뒷부분을 높이면 호흡 운동이 주사 중 바늘의 위치에 영향을 미치지 않도록 홀더 표면에서 흉부를 효과적으로 들어 올립니다. - 주사를 시작하기 전에 척수를 모욕하지 않고 면봉과 Sugi 삼각형을 해당 부위에 부드럽게 적용하여 혈액이나 뇌척수액의 척추 창을 청소하십시오. 또한, 지속적인 출혈 또는 CSF 누출에 의한 주사 부위의 폐색을 방지하기 위해 창 둘레에 장벽을 만듭니다. 이렇게하려면 척추 창의 측면 부분에 흡수성이있는 작은면 조각을 놓으십시오.
8. 축삭 말단을 표적으로 하는 척수에 직접 주사
- 유리 주사 바늘의 끝을 사용하여 척수 동맥을 식별하여 척수의 정중선을 근사화합니다. 그러나 척추 동맥이 눈에 띄게 중심에서 벗어나거나 어떤 식 으로든 벗어난 경우 C2 가시 돌기의 위치를 사용하고이를 척추 길이만큼 외삽하여 정중선을 근사화합니다.
참고: 바이러스 로드에 대한 지침은 섹션 5.1을 참조하십시오. - 식별되면 바늘을 대략적인 정중선에서 C5 층 바로 뒤에 위치시키고 이것을 기준점으로 사용합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 오른쪽으로 0.3mm 이동합니다. 척수 표면에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 이 깊이에서 바늘을 척수에 0.6mm 밀어 넣으십시오. 필요한 경우 척수에 구멍이 뚫릴 때까지 바늘을 계속 밀어 넣으십시오. 그런 다음 바늘을 적절한 깊이로 집어 넣거나 내립니다.
- 1 μL의 레트로AAV2-scCre를 250 nL/분으로 주입합니다. 주사가 완료된 후 바이러스가 척수로 확산 될 때까지 2 분 동안 기다렸다가 바늘을 천천히 빼냅니다. 척추 창 내의 두 개 이상의 부위, 즉 중간 지점과 T1 층 바로 앞쪽의 마지막 부위에서 동일한 측면 및 깊이 좌표를 사용하여 주사를 반복합니다.
9. 상처 봉합 및 수술 후 관리
- 정위 고정 홀더에서 동물을 제거하고 견인기 또는 후크를 꺼냅니다. 멸균 된 생리 식염수 몇 방울로 상처 부위를 청소하십시오.
- 4.0 실크 봉합사로 두피를 봉합하고 총 2 개 또는 3 개의 봉합사.
- 자궁 경부 개구부를 봉합 할 때 4.0 크롬 내장을 사용하여 근육층을 단단히 다시 부착하십시오 (2 개의 봉합사로 충분해야 함). 4.0 실크로 자궁 경부 피부 개구부를 봉합하십시오 (4 봉합 예상).
- 동물이 닫히면 봉합사 전체에 액체 붕대를 신중하게 적용하십시오.
- 동물을 가열 램프 아래에 놓고 완전히 다시 깨어날 때까지 면밀히 모니터링하십시오. 동물이 깨어 있고 움직이고 건조되면 멸균 거즈로 상처를 부드럽게 닦으십시오. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
- 동물을 어머니와 함께 집새장으로 돌려 보내십시오. 어미가 새끼를 향한 방치와 유아 식인을 방지하기 위해 주의하십시오.
- 수술 1주일 전부터 매일 두 번 부드러운 취급(5-10분)을 통해 수술을 앞두고 연구자에게 산모에게 친숙해집니다.
- 새끼를 함께 집새장으로 돌려보내 어미의 방해를 제한하십시오.
- 수술 당일 산모에게 아세프로마진 1.5mg/kg q12h를 피하 주사합니다.
알림: 통증 관리는 새끼에게 진통제를 제공하고 조기 활동 복귀를 장려하여 어미와의 재 통합을 촉진하는 이중 목적을 제공합니다. - 부프레노르핀 0.05mg/kg을 수술 후 시작하여 q8h에 총 3일(수술 후 0, 1, 2일) 피하 주사합니다.
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Representative Results
바이러스 벡터의 성공적인 주입 및 수송은 척수와 운동 피질에서 일방적 인 뉴런의 형질 도입을 초래해야합니다. 그림 4 는 rCre의 반대쪽 척추 주입과 함께 Cre 의존적 DREADDs-mCherry를 발현하는 뇌 관상 절편의 운동 피질에서 층 V CST 뉴런의 표지를 보여줍니다. 절편을 dsRed 항체로 염색하였다.
그림 1: 이 프로토콜에서 사용되는 두 가지 바이러스 주입 방법을 보여주는 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이 프로토콜에 사용된 바이러스 구조체와 retroAAV2-scCRE에 의해 보정되는 이중 플록스 반전 방향의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 운동 피질의 뉴런 변환. (A) 5x의 배율. dsRed 면역 조직 동물의 왼쪽 운동 피질의 V 층 뉴런에서 mCherry 발현을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm.(B) 10x의 배율. dsRed 면역조직화학 동물의 왼쪽 운동 피질의 V 층 뉴런에서 mCherry 발현을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
주사 가능한 화학 유전 변형제를 사용한 뇌 활동의 유도 가능한 유전 적 조절은 SCI로부터의 회복의 기초가되는 다양한 메커니즘을 연구하는 강력한 도구입니다. 유도성 G-단백질 결합 수용체(DREADD)에 대한 표적화의 정확도는 형광 추적이 조직학의 해부학적 정밀도를 검증한다는 점을 고려할 때 더욱 향상됩니다. 이 논문은 선택적 신경 경로(흥분성 또는 억제성 DREADDS 포함)를 억제하거나 자극하면 축삭 재생 또는 발아가 향상되는지 여부를 탐색하는 신뢰할 수 있는 방법에 대해 설명합니다34,35. 역행적으로 수송 가능한 벡터를 척수에 주입하면 직접 또는 시냅스 연결을 통해 선택된 신경 집단에 주의를 기울일 수 있으므로 이 방법은 손상에 대한 신경생물학적 반응을 평가하는 데 탁월한 선택입니다.
그림에서 볼 수 있듯이 신생아 모델에서 SCI를 연구하여 소아 인구와 성인 인구 간의 이전에 알려지지 않은 불일치를 설명하는 것은 연구를 더욱 복잡하게 만드는 역할을 할 뿐입니다. 따라서 연구 설계가 더 좁습니다. 신생아 연구의 합의는 SCI 후 나타난 개선된 결과는 설치류 3,4,5,36에서 출생 후 7일경까지 축삭 재생 증가와 발아 증가에 달려 있다는 것입니다. 그러나 이러한 증폭 된 가소성은 출생 후 10 일 및 회복 고원 이후에도 성인 설치류 손상 모델37,38,40을 나타낼 때까지 보이지 않습니다. 신생아의 향상된 가소성에 대한 기본 메커니즘은 파악하기 어렵고 여전히 논쟁의 여지가 있으며, 신생아 SCI에 대한 집중 연구를 촉진하기 위해 쉽게 복제되고 생존 가능하며 효율적인 수술 모델을 개발하는 것의 중요성을 강조합니다.
예를 들어, 일부 사람들은 어린 동물에서 볼 수있는 불균형 한 발아 수준이 CST 모욕19에서 기능적 회복의 특정 측면을 무효화한다고 가정했습니다. 궁극적으로 자발적인 회복이 유기적 재생으로 인한 것인지 아니면 단순히 병변을 편리하게 우회하는 비정상적인 경로의 발아 증가로 인한 것인지에 대한 의문이 남아 있습니다. 설명 된 프로토콜은 유도 성 벡터의 출현으로 회복 과정의 인공 억제 또는 자극을 통해 피질 척수 재생 또는 발아를 연구하는 데 사용할 수있는 비교적 간단하고 모듈 식 기술입니다.
이 연구에 사용 된 바이러스는 젊은 설치류에서 SCI로부터의 회복에 영향을 미칠 가능성을 조사하는 향후 연구를위한 청사진을 제공하기 위해 선택되었습니다. 설계상 mCherry를 발현하는 전이유전자는 DREADD(hM3Dq)가 동시에 발현되는 경우에만 형광 하에서 양성으로 표지되는데, 이는 둘 다 동일한 전이유전자에 존재하기 때문입니다. 현재 프로토콜에는 행동 및 표현형 평가가 포함되어 있지 않지만 향후 연구에서 DREADD 활동을 성공적으로 조사하기 위한 토대를 마련했습니다.
바이러스 벡터의 성공적인 주입에 가장 중요한 요소는 올바른 해부학을 알고 바이러스의 충분한 확산을 보장하는 것입니다. 전방 벡터를 감각 운동 피질에 주입하는 것과 관련하여, 얕은 깊이 (0.5-0.7 mm)에서 브레그마 부근에 3 회 주사하는 것을 포함하여 문헌에 설명 된 수많은 방법이 있습니다. 벡터를 척수에 역행적으로 주입하기 위한 올바른 영역을 목표로 하려면 관심 뉴런의 신경생물학에 대한 정확성과 능숙한 이해가 필요합니다. CST 말단의 대부분은 척수 회백질 전체에 걸쳐 층판 V-VII에 국한되어 있으며, 성공적인 형질주입은 다수의 자궁경부 수준(41)에서의 주사를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 세그먼트 C4-C7은 뚜렷한 랜드마크와 함께 위치할 수 있으므로 일상적인 층막 절제술 및 후속 주사를 위한 수술 창을 준비할 수 있습니다. 주입된 물질의 적절한 확산을 보장하는 것은 벡터의 특성, 주입의 부피 및 신경 조직의 밀도에 의존한다.
다행스럽게도 신생아의 뇌는 밀도가 낮을수록 주입된 물질이 더 빠르고 전파될 수 있기 때문에 형질감염을 매우 잘 받아들입니다. 척추 구성 요소는 더 복잡하며 주입 창이 훨씬 더 좁습니다. 그럼에도 불구하고 retroAAV는 표적 시냅스를 형질도입하는 데 효율적입니다. 역행 벡터가 세포체에 도달하고 DREADD 벡터를 올바른 순서로 뒤집는 데 시간이 걸리므로 행동 평가 또는 조직 학적 연구를 수행하기 전에 권장되는 시간은 주사 일로부터 4 주 ±입니다. 요약하면, 역행 AAV는 몇 가지 즉각적인 이점이 있고 이중 플록스 시스템이 표적 뉴런 집단을 형광으로만 발현한다는 점을 감안할 때 적절합니다. 좁은 수술 창에도 불구하고, 신생아 척수는 형질감염에 유사하게 수용적이며, 화려한 발현42를 나타낸다.
소아 척수 연구는 다층 조사에 많은 장벽이있는 분야의 틈새 시장입니다. 방법론에서 새로운 반복과 외과적 돌파구가 있을 때마다 연구 자체가 더 쉬워지고 결과적으로 결정론적 결과를 발견할 가능성이 높아집니다. 바이러스 벡터를 척수 경로에 정확하게 주입하는 것은 여러 가지 연구상의 이유로 유용하며, DREADD를 포함하도록 바이러스 벡터 기술을 확장하는 것은 표적 단백질을 선택적으로 강화하거나 약화시키는 데 유용합니다. 희망은 새로운 수술 프로토콜과 결합 된 이중 플록스 주사 시스템의 향상된 정확도가 유사한 연구 목표를 촉진 할 것이라는 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 슈라이너스 아동 병원 SHC-84706의 펠로우십 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
References
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