Summary
כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.
Abstract
מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה גורם התמותה המשמעותי ביותר ממחלות זיהומיות בעולם עד להופעת COVID-19. Mtb התפתח כדי להתמיד בסביבה התוך-תאית שלו, להתחמק מהגנות המארח, ופיתח עמידות לתרופות רבות נגד שחפת. גישה אחת לפתרון עמידות היא זיהוי תרופות מאושרות קיימות שיגבירו את התגובה החיסונית של המארח ל-Mtb. לאחר מכן ניתן יהיה לשנות את ייעודן של תרופות אלה כטיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) כדי לקצר את זמן הטיפול ולסייע להתגבר על עמידות לאנטיביוטיקה.
כימות של גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים הוא היבט מכריע בהערכת HDT פוטנציאלי. תקן הזהב למדידת גידול Mtb הוא ספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU) על לוחות אגר. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אוטומטית, מבוססת מרק, המשמשת בדרך כלל יותר לאיתור Mtb בדגימות קליניות, הותאמה לסינון פרה-קליני של טיפולים מכווני מארח. הוערכה יכולתה של מערכת בדיקת התרבית הנוזלית לחקור גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים שטופלו ב-HDT. ה-HDTs שנבדקו על יכולתם לעכב צמיחת Mtb היו חומצה רטינואית כל-טרנסית (AtRA), הן בתמיסה והן במיקרו-חלקיקים של פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) והשילוב של אינטרפרון-גמא ולינזוליד. היתרונות של טכניקה אוטומטית זו המבוססת על תרבית נוזלית על פני שיטת CFU כוללים פשטות התקנה, הכנה פחות עתירת עבודה וזמן מהיר יותר לתוצאות (5-12 ימים לעומת 21 ימים או יותר עבור צלחות אגר).
Introduction
מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה הרוצח המשמעותי ביותר למחלות זיהומיות בעולם בשנת 20191. כדי להתחמק מהגנות המארח, Mtb חותר תחת הפעילות המיקובקטריאלית של תאי מערכת החיסון המולדת כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs), ומאפשר לו להתמיד תוך תאית ולהשתכפל2. היעדר חיסון יעיל למניעת שחפת ריאתית למבוגרים והופעתם הגוברת של זנים עמידים לתרופות מדגישים את הצורך הדחוף בטיפולים חדשים.
טיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) יכולים לקצר את זמן הטיפול ולעזור להתגבר על התנגדות3. הערכה פרה-קלינית של מועמדי HDT במבחנה כדי לקבוע פעילות מיקובקטריצידלית בתוך מקרופאגים מסתמכת לעתים קרובות על כימות של גידול Mtb על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFU) על צלחות אגר מוצקות. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. מערכות זיהוי מיקרוביאליות אוטומטיות מבוססות מרק, הזמינות מסחרית, נפוצות יותר במעבדות מיקרוביולוגיה קליניות לזיהוי ובדיקת רגישות לתרופות של Mtb ומינים מיקובקטריאליים אחרים בדגימות קליניות4. מכשירים אלה מודדים גדילה בעקיפין על סמך הפעילות המטבולית החיידקית המובילה לשינויים פיזיים במדיית התרבית (שינוי ברמות CO 2 או O2 או לחץ) המנוטרים לאורך זמן5. הקריאה היא זמן לחיוביות (TPP), שבעבר הוכח כי היא מתואמת עם Mtb CFU בדגימות כיח של חולי שחפת בתגובה לטיפול 6,7 ובליזטים של ריאה וטחול מורין נגועים8. בנוסף, נעשה שימוש במערכות לזיהוי תרביות נוזליות כדי למדוד את ההשפעה של טיפולים קונבנציונליים המכוונים לפתוגנים על צמיחת מיקובקטריה בתרבית אקסנית ומקרופאגים בתרבית 9,10. המכשיר שימש גם כדי לחקור את היכולת המולדת של תאים דנדריטיים ושל מקרופאגים אלוואולריים לשלוט בצמיחה תוך-תאית של Mtb11,12. פרוטוקול ניסיוני זה מדגים כי ניתן להתאים מערכת אבחון של תרבית נוזלית לביצוע בדיקות סקר פרה-קליניות של HDT לשחפת במקרופאגים בתרבית. בהשוואה לספירה של CFU, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה במידה ניכרת את העבודה הניסיונית ואת הזמן הדרוש לכימות גדילה/הישרדות של מיקובקטריאליים תוך-תאיים. טכניקה זו מסתמכת על גישה לכלי תרבית אוטומטי שניתן להשתמש בו כדי להעריך את הישרדות המיקובקטריאליים התוך-תאיים בתאי מערכת החיסון שטופלו במגוון רחב של ריאגנטים פרמקולוגיים המכוונים לתפקודים תאיים כדי להגביר את חסינות המארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות זן H37Ra מוחלש של Mtb, אשר ניתן לטפל בו במעבדת הכלה רמה 2. כל המניפולציות של מיקובקטריה חיה בוצעו בארון הבטיחות הביולוגי מסוג II (BSC). הליכים ניסיוניים נועדו למזער את הדור של אירוסולים. תרבית תאים אאוקריוטים (תאי THP-1) בוצעה גם ב-BSC מדרגה II. המעבדה ביצעה הערכת סיכונים והבטיחה כי כל ההליכים יבוצעו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית והארצית. קו התאים המונוציטי האנושי THP-1 שימש לביצוע השיטה כמתואר (שלב 1). התאים מתמיינים למקרופאגים לאחר גירוי עם פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) לפני זיהום במיקובקטריה.
1. תרבית תאים
- הפיצו מלאי זרעים H37Ra כדי לרשום שלב בציר Middlebrook 7H9 (MB) בתוספת העשרת אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (ADC) (10%) ו-0.05% פוליסורבט 80. יש לאחסן מלאי H37Ra ב-1 מ"ל במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך עד שנה.
- הפשירו בקבוקון של 1 מ"ל של Mtb-H37Ra והעבירו אותו לבקבוקון T25 עם מכסה מסנן המכיל 9 מ"ל של מרק נוסף MB כשבוע לפני הניסוי המתוכנן. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 ימים באינקובטור סטטי.
- לגדל תאי THP-1 ב-RPMI-1640 בתוספת 10% סרום עגל עוברי ללא חום (שלם (c)RPMI) בבקבוק T75 באינקובטור לח CO 2 ב-5% CO2/37 °C ותת-תרבית פעמיים בשבוע כדי לשמור על צפיפות של פחות מ-1 x 106 תאים למ"ל.
- התמינו תאי THP-1 למקרופאגים 3 ימים לפני ההדבקה על ידי פיפטינג עדין של תאים מספר פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית בבקבוקי T75 כדי לפזר את כל הגושים ולהניח אותם בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
- תאים צנטריפוגים בגודל 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מסירים את הסופר-נטנט, ומניחים בעדינות את הכדור ב-2 מ"ל של RPMI. בצע ספירת תאים כדי להעריך תאים/מ"ל.
- זרע 2 מ"ל של מקרופאגים THP-1 ב-12 צלחות תרבית רקמה בצפיפות של 100,000 תאים/מ"ל ב-cRPMI עם 100 ננוגרם/מ"ל PMA למשך 72 שעות. הסר את המדיום המכיל PMA מהתאים וחדש עם cRPMI טרי לפני זיהום Mtb.
- הגדר לוחות נפרדים עבור כל נקודת זמן נדרשת.
- תאי זרעים באותה צפיפות (100,000 תאים/מ"ל) בשקופיות של 2 תאי זכוכית כדי לקבוע את ריבוי הזיהום (MOI).
- מניחים באינקובטור 5% CO2 לח למשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
2. כימות קליטת MTB
- קביעת ספיגת MTB על ידי מקרופאגים (MOI)
- הגדר את ארון הבטיחות הביולוגי Class II (BSC) ביום ההדבקה ועבוד על שתי שכבות של נייר טישו כדי לתפוס כל נזילה. הגדירו מיכלי פסולת להשלכה בהתאם לתקנות המקומיות.
- הסר 6-8 מ"ל של תרבית מיקובקטריאלית מבקבוק T25 והעבר אותו לצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל.
הערה: ניתן להשתמש בצינורות בנפח קטן יותר לניסויים קטנים יותר. - צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה ספסל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 2890 x גרם.
- הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה והעבר אותו לארון הבטיחות הביולוגי. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
- שפכו את חומר החיטוי לתוך מיכל ההשלכה של חומר החיטוי, שפופרת הסיכום והרחיקו את החיידקים בתווך הנותר על ידי הקשה על צד הצינור. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
- מוסיפים 2 מ"ל של cRPMI שחומם מראש, מערבבים בעדינות ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
- יש להשעות את המיקובקטריה בזהירות רבה באמצעות מחט של 25 גרם ומזרק של 5 מ"ל. כדי לבצע החייאה, משכו את תרחיף המיקובקטריה לתוך המזרק ופלטו בעדינות רבה לאורך דופן הצינור כדי למזער את ייצור האירוסול. חזור על 6-8 פעמים.
הערה: נקוט זהירות מרבית מכיוון שמדובר בתרבית בצפיפות גבוהה של מיקובקטריה. כדי למנוע את הסיכון של פגיעה במקל המחט, השתמש במחטים קהות במידת האפשר, ומזרקי Luer. - השליכו את המחט והמזרק במיכל חדים ב- BSC.
- העבירו את המתלים לצינור מיקרופוגה בגודל 2 מ"ל (עם מכסה הברגה) וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ב-100 x גרם כדי לגלגל את כל הגושים שנותרו. החזירו את הצינור לארון הבטיחות והמתינו דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
- העבר את 1-1.5 המ"ל העליונים של הסופרנטנט לצינור חדש. יש להשליך את השפופרת המקורית לדלי הפסולת המכיל חומר חיטוי. מערבבים היטב ומוסיפים כמויות שונות של מתלה המיקובקטריאלי (למשל, 5, 25, 50, 150 μL) למגלשות תא הזכוכית של 2 בארות ודוגרים במשך 3 שעות באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- צביעה על חיידקים מהירים חומצית (AFB)
הערה: לאחר דגירה של 3 שעות, המקרופאגים נשטפים ומקובעים עם פרפורמלדהיד כדי להשבית מיקובקטריה. לאחר מכן, השקופיות מוכתמות באמצעות ערכת Auramine O שעברה שינוי (ראו טבלת חומרים) כדי להעריך מיקובקטריה פאגוציטוזה לכל תא. בשל דופן תא השעווה שלהם, מיקובקטריה שומרים על צבע האורמין לאחר שטיפת חומצה-אלכוהול. גרעיני המקרופאגים מוכתמים לאחר מכן ב-Hoechst. שיטה זו מאפשרת לספור את מספר החיידקים הפאגוציטוזים לכל תא ומשמשת לקביעת ריבוי הזיהום (MOI) של המקרופאגים.- הסר את המדיום ממגלשת תא הזכוכית לאחר צנרת למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לעקור חיידקים שלא טופלו פאגוציטוזה.
- לשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
- מלאי חנות של 4% paraformaldehyde, מומס PBS ב aliquots ב -20 °C (70 °F) עד 6 חודשים. להפשיר אליקוט של 4% פרפורמלדהיד מיד לפני השימוש. יש לדלל ל-2% פרפורמלדהיד עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל לכל באר.
- דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את מגלשת תא הזכוכית מארון הבטיחות בשלב זה לצורך צביעה.
- שטפו את המגלשה מתחת לזרם עדין של מי ברז.
- יש לפזר מספיק אורמין על המגלשה כדי לכסות את התאים באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק ולדגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר בחושך (לכסות בנייר אלומיניום).
- שטפו את עודפי הצבע מהמגלשה עם מי ברז והוסיפו את מסיר הצבעים / quencher למשך דקה אחת בחושך.
- שטפו את העודפים במי ברז ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) בחושך.
- שטפו את כתם ההוכסט במי ברז, הסירו את התאים, נקזזו עודפי מים מהמגלשה, הוסיפו טיפת אנטיפדה וכיסוי, ויייבשו באוויר.
- בחן את השקופית מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות המטרה 100x שמן. מיקובקטריה תזרח בירוק מתחת למסנן FITC. הגרעינים מתנוססים בכחול מתחת למסנן DAPI (איור 1C).
- קבע את MOI על ידי ספירת מספר המיקובקטריה פאגוציטוזה לכל תא ואחוז התאים הנגועים.
- חשב את נפח ההשעיה המיקובקטריאלית הדרושה להשגת ה- MOI הנדרש בהתבסס על שטח הפנים של באר בצלחת; לדוגמה, שטח הפנים של שקופיות תא הזכוכית ששימשו בניסוי זה הוא 4 ס"מ2. MOI נמוך (כ-1-2 בצילי לתא) רצוי לניסויים הנערכים במשך מספר ימים (למשל, 5 ימים).
- זיהום של מקרופאגים
- ערבבו היטב את תרחיף המיקובקטריה והוסיפו את הכמות הדרושה לתאים על לוחות של 12 בארות לאחר שנקבע הנפח הדרוש להשגת ה-MOI הרצוי.
- דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות כדי לאפשר למיקובקטריה להיות פאגוציטוזה.
- הסר חיידקים חוץ תאיים על ידי שטיפת הבארות עם RPMI חם או HBSS מספר פעמים.
- שים את המקרופאגים בבאר אחת (דגימה של 3 שעות) כדי לקבוע את אחוז הזמן לחיוביות (TTP) של האינוקולום הראשוני (דגימה של 3 שעות) כמתואר בשלב 3 להלן.
- הוסף cRPMI טרי ואת מינוני התרופה הנדרשים או בקרת רכב לבארות הנותרות, לדגור את הצלחות בחממת CO2 ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הדרוש (תלוי בתכנון הניסוי אבל בדרך כלל במספר מרווחים בין 1 ל 8 ימים).
3. קצירת דגימות למערכת זיהוי תרבית נוזלית
הערה: ביום ההדבקה, מיקובקטריה חוץ-תאית מוסרת על-ידי שטיפה, ומיקובקטריה תוך-תאית נקטפת על-ידי תזה של באר אחת של מקרופאגים (דגימה של 3 שעות) כדי לקבוע את הכמות הראשונית של פאגוציטוזה כבקרה בסיסית לזיהום. בזמנים שלאחר מכן משולבים גם המדיום, ליזאט התאים וגם השטיפות כדי למדוד את הצמיחה המיקובקטריאלית הכוללת. ניתן גם להעריך צמיחה חוץ-תאית ותוך-תאית בנפרד במידת הצורך.
- קציר דגימה של 3 שעות כדי לקבוע TTP
- יש לשטוף מיקובקטריה חוץ-תאית מכל הבארות לאחר 3 השעות הראשונות של הזיהום כמתואר בשלב 2.3.3. הוסף 1 מ"ל של מדיה טרייה לבאר הבקרה של 3 שעות כדי להשוות את עוצמת הקול של ליזאט עם אלה של נקודות זמן מאוחרות יותר.
הערה: ראה שלב 3.2.7 אם יש להוציא מיקובקטריה חוץ-תאית מהניתוח.
- יש לשטוף מיקובקטריה חוץ-תאית מכל הבארות לאחר 3 השעות הראשונות של הזיהום כמתואר בשלב 2.3.3. הוסף 1 מ"ל של מדיה טרייה לבאר הבקרה של 3 שעות כדי להשוות את עוצמת הקול של ליזאט עם אלה של נקודות זמן מאוחרות יותר.
- איסוף דגימות
- בקבוקי מרק MB חמים ותרבית כלי נגינה כדי להביא אותם לטמפרטורת החדר.
- העבר את המדיום מצלחת 12 הבאר לצינורות החרוטיים המסומנים המתאימים.
- הוסף 500 μL של מאגר ליזיס סטרילי (0.1% Triton x-100 ב- PBS מסונן דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר) לכל באר למשך 10 דקות.
- מגרדים בעדינות את התאים מהבאר עם מגרד סטרילי ומשלבים עם המדיום בצינור החרוטי המתאים.
- לשטוף את הבאר עם 0.5 מ"ל של PBS סטרילי ולהעביר את הצינור המתאים.
- מעבירים בעדינות כל דגימה דרך מחט ומזרק (25 גרם) 6-8 פעמים כדי לפרק את הגושים. לדלל דגימות 1:10 במרק MB; 100 μL מדגם + 900 μL MB בינוני.
- בזמנים/ימים הנדרשים (בדרך כלל בין 1 ל-8 ימים), קצרו את הדגימות הנותרות על ידי ביצוע השלבים 3.2.1-3.2.6 לעיל.
הערה: החוקרים עשויים להעדיף להוציא מיקובקטריה חוץ-תאית מהניתוח שלהם, ובמקרה זה, בשלב 3.2.2 לעיל, התווך מכל באר מושלך, ומקרופאגים נשטפים מספר פעמים לפני הוספת מאגר תזה.
- בקבוקי תרבית מכשירים לחיסון וטעינה
הערה: פרטים על כלי התרבית הנוזלית והחומרים המתכלים הקשורים אליו מסופקים בטבלת החומרים.- יש לעקר את פקק הגומי של בקבוק תרבית המכשיר בנייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול ולאפשר לו להתייבש באוויר.
הערה: שלב זה צריך להתבצע ב- BSC. - הכינו את הבקבוקים על ידי העברת כמות מספקת של תוספי תזונה עבור כל הדגימות לתוך צינור חרוטי (0.5 מ"ל/בקבוק). השתמשו במחט ובמזרק כדי להזריק 0.5 מ"ל של תוסף תזונה לבקבוק תרבית המכשירים.
- פיפטה 500 μL של הדגימה המדוללת (1:10) לתוך צינור 1 מ"ל עם תחתית V.
- השתמש במחט ובמזרק כדי להזריק את הדגימה של 500 μL לתוך בקבוק תרבית המכשיר שהוקצה.
- יש לעקר את פקק הגומי של בקבוק תרבית המכשיר בנייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול ולאפשר לו להתייבש באוויר. נגבו את הבקבוקים עם נייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול לפני הוצאתם מה-BSC.
- העבירו בזהירות בקבוקים מארון הבטיחות הביולוגית למכשיר הטעינה.
- לחץ על לחצן הטעינה במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית.
- סרוק את הברקודים על בקבוקי תרבית מכשירים והכנס את הבקבוקים לחממה של מערכת הגילוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 42 יום. קרא והקלט את הזמן שנדרש כדי להגיע לחיוביות ממסך המכשיר.
הערה: הברקוד מאפשר למכשיר לזהות את הבקבוק ולקשר קריאות השתקפות עם בקבוק מסוים. - חשב את זמן האחוזים לחיוביות (TTP) על-ידי השוואת ה-TTP של האינוקולום התוך-תאי הראשוני (יום 0) לזה של מקרופאגים שגודלו בתרבית עבור הזמנים שצוינו. שינוי חיובי באחוז TTP פירושו צמיחה מיקובקטריאלית13.
לדוגמה, עבור היום השלישי:
אחוז השינוי בזמן לחיוביות =
- יש לעקר את פקק הגומי של בקבוק תרבית המכשיר בנייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול ולאפשר לו להתייבש באוויר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכשיר התרבית הנוזלית האוטומטי ששימש במחקר זה מנטר רמות CO2 כל 10 דקות. שינוי צבע בחיישן בתחתית בקבוק המכשיר נמדד באופן צבעוני ומתבטא כיחידות רפלקציה. לאחר מכן, תוכנת המכשיר מיישמת אלגוריתמי זיהוי כדי לחשב את הזמן לחיוביות (TTP), כלומר את מספר הימים מהחיסון ועד שהתרביות מסומנות כחיוביות (איור 1A). קשר הפוך בין TTP לבין לוג10CFU (שנקבע על ידי שיטת צלחת אגר)12 באינוקולום הראשוני מודגם באיור 1B. כאשר גדילת Mtb בתוך מקרופאגים נגועים ב-MOI שנעה בין 1-2 ל-5-10 בנוכחות או היעדר מעכבים פרמקולוגיים (איור 1C) הושוותה על-ידי שיטת התרבית האוטומטית שתוארה או על-ידי ספירת מושבות על אגר מוצק, נמצא מתאם משמעותי בין התוצאות שהתקבלו בשתי השיטות (איור 1D). כדי להציג את צמיחת Mtb באופן גרפי, השינוי באחוזים ב- TTP חושב על פי המשוואה לעיל על-ידי השוואת ערכי ה- TTP למשך עד 8 ימים לאחר הדבקת מקרופאגים לערך ה- TTP הראשוני12. התוצאות הראו מגמה דומה בין תרבית נוזלית ל-CFU, והראו עיכוב משמעותי של גידול Mtb במקרופאגים בנוכחות AtRA בתמיסה או במינון שווה ערך של AtRA עטוף במיקרו-חלקיקים של PLGA (MP) (איור 2A,B).
כמו כן נבדקה יעילותו של HDT אחר, IFNγ, אשר שימש לטיפול בשחפת14 עמידה לתרופות מרובות, בשילוב עם קו שני של אנטיביוטיקה linezolid. ניסוי מינון-תגובה בוצע לראשונה בתאי THP-1 נגועים כדי לקבוע את היעילות של לינזוליד לבדו בריכוזים הנעים בין 0.6-5.0 מיקרוגרם/מ"ל (איור 2C) לפני שנבדק השילוב של לינזוליד במינון לא אופטימלי (1.25 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IFNγ: לא הייתה אינטראקציה משמעותית בין התרופות (איור 2D).
איור 1: כימות של צמיחת Mtb על-ידי תרבית נוזלית אוטומטית ועל מדיום מוצק. Mtb H37Ra דולל בציר מידלברוק על פני טווח של דילולים (1:2 עד 1:100,000). אליקוט של 300 μL מכל דילול הוזרק לבקבוקי תרבית מכשירים כפולים, דגירה על מכשיר התרבית הנוזלי, וגידולם היה במעקב. במקביל, אליקוט (10 μL) הופץ על לוחות אגר MB המכילים 0.5% גליצרול ו-10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, תוסף קטלאז) במשולש, עבור ספירת CFU כפי שפורסם קודםלכן 12. (A) נקודות נתונים ממערכת התרבית הנוזלית של כל דילול משורטטות כיחידות השתקפות לעומת זמן15. כדי לאפשר השוואה בין דגימות, הרקע היה מנורמל לקריאת ההשתקפות של 9 שעות עבור כל דגימה. הצמיחה הייתה במעקב במשך 42 ימים בסך הכל (21 הימים הראשונים מוצגים בגרף), זמן לחיוביות (TTP) נע בין 3.83 ל -11.1 ימים. (B) TTP מדגימות מדוללות תוכנן כנגד אומדן CFUשל log 10 ; כל נקודת נתונים מייצגת את הערכים עבור שני שכפולים מניסוי אחד ומתארת שני ניסויים נפרדים. הקו של מקדם ההתאמה והרגרסיה הטובים ביותר (r2) מוצגים. (C) דוגמה לצביעת AFB של Mtb H37Ra תוך-תאי במקרופאגים THP-1 עם אורמין (ירוק) המשמש לחישוב ריבוי הזיהום, גרעינים מוכתמים ב- Hoechst 333258 (כחול). התמונות נוצרו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מפתח צמצם מספרי של פי 100 (NA], 1.3) מטרת שמן. סרגל קנה המידה מייצג 2 מיקרומטר. (D) ניתוח מתאם (פירסון) של TTP מזווג (תרבית נוזלית) והערכת CFU של גידול Mtb H37Ra בליזאטים של מקרופאגים THP-1 מניסויים מרובים (n = 23), שטופלו עם/בלי ריאגנטים פרמקולוגיים ונדבקו ב-MOI הנעים בין 1-2 ל-5-10 מקרופאג'ים בציליים/נגועים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכה של טיפולים מוכווני מארח לשחפת באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית. מקרופאגים של THP-1 הודבקו ב-Mtb H37Ra במשך 3 שעות, חיידקים חוץ-תאיים הוסרו, ותאים טופלו בטיפולים מועמדים המכוונים על ידי מארח למשך עד 192 שעות. (A) הערכת CFU של גידול Mtb במקרופאגים שטופלו בתמיסת AtRA (Sol) או 2 מיקרו-חלקיקים AtRA (MP) (10-20 מיקרוגרם/מ"ל). (B) % שינוי ב-(זמן ל-TTP חיובי) במקרופאגים שטופלו בתמיסת AtRA או ב-AtRA PLGA MP. תאי THP1 נגועים בתרבית ב-0.1% DMSO ב-cRPMI הוגדרו כבקרות לא מטופלות. (C) מקרופאגים טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של תמיסת לינזוליד (0.6 מיקרוגרם/מ"ל עד 5 מיקרוגרם/מ"ל), % השינוי ב-TTP נקבע 24 ו-72 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית. (D) מקרופאגים שנדבקו ב-Mtb H37Ra טופלו בלינזוליד בלבד (1.25 מיקרוגרם/מ"ל) או בלינזוליד + IFNγ (5 ננוגרם/מ"ל) עד 72 שעות, חישוב % השינוי ב-TTP. בקרות שלא טופלו כללו תאי THP1 נגועים שגודלו בתרבית ב-cRPMI בלבד עבור הזמנים שצוינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החוקרים השתמשו בשיטת התרבית הנוזלית המתוארת בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר צמיחת Mtb במקרופאגים שמקורם במונוציטים ובמקרופאגים אלוואולריים ובתאי THP-1 הממוינים ב-PMA11,16,17. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה לשימוש עם תאים שאינם דבקים12. לאחרונה, המכשיר שימש גם במחקרים פרה-קליניים להערכת חומצה רטינואית כל-טרנס בשאיפה (AtRA) כ-HDT לשחפת17. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים (1) שליטה על ספיגת Mtb על ידי צביעת AFB כדי למתן גורמים כגון פאגוציטוזה דיפרנציאלית עקב טיפול מקדים בתרופות ולמזער את המוות התאי אשר פחות סביר שיתרחש ב- MOI נמוך יותר, (2) בהתאם למשרד הפנים, ייתכן שיהיה צורך לדלל את הליזטים של התאים כדי למקסם את הטווח הדינמי של הבדיקה. השאיפה ל-TTP של כ-5-12 ימים הניבה תוצאות הניתנות לשחזור.
בפרוטוקול זה, Mtb H37Ra מוחלש שימש כפונדקאית ל-Mtb ארסי, אך ניתן ליישם את השיטה גם כדי לחקור יעילות תרופות נגד זנים מעבדתיים וקליניים ארסיים במתקן Containment Level 3 עם שינוי מתאים. אישור התוצאות הללו במודל עכברי של שחפת ארסית לפיו שאיפה של AtRA, הן בתמיסה והן עטיפה במיקרו-חלקיקים פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית (PLGA) (MP), שיפור משמעותי בפינוי של Mtb-H37Rv מהריאה תוך הפחתת הפתולוגיה, מצביעה על כך ש-H37Ra הוא פונדקאית מועילה ל-Mtb ארסי במחקרים אלה17.
מכיוון ש- HDTs נועדו לשמש כנספחים לטיפולים קונבנציונליים, חיוני להעריך את יעילותם במבחנה בשילוב עם אנטיביוטיקה נגד שחפת כדי לנתח אינטראקציות פוטנציאליות ביןתרופתיות 18. כדי להשיג TTP מדיד, אנטיביוטיקה - במיוחד אלה עם יעילות תוך תאית גבוהה - חייבת תחילה להיות מכוונת לריכוזים לא אופטימליים (מתחת לריכוז המעכב המינימלי) לפני הערכת שילובי HDT/אנטיביוטיקה במקרופאגים. בדוגמה המוצגת בפרוטוקול זה (איור 2C,D), linezolid לבדו הוערך לראשונה לפני שהוערך בשילוב עם IFN-γ. בדוגמה אחרת, ליזאטים של מקרופאגים THP-1 נגועים ב-H37Ra שטופלו בריפאמפיצין ב-0.6 מיקרוגרם/מ"ל או יותר אינם הופכים חיוביים באופן אמין במערכת התרבית הנוזלית17. לכן, יש צורך בריכוז נמוך יותר של ריפאמפיצין כדי להעריך כל HDT בשילוב עם אנטיביוטיקה זו במקרופאגים.
בשל הנטייה של Mtb ליצור אגרגטים, יש צורך לפרק גושים כדי לספק תרחיף של תא יחיד כדי להשיג ציטוט אחיד של מיקובקטריה לתוך בארות מרובות של מקרופאגים בתרבית בכל ניסוי. באופן דומה, שלב פירוק זה חוזר על עצמו לאחר שמקרופאגים הוכנסו כדי לספק הערכה מדויקת של הצמיחה. בפרוטוקול הנוכחי, המיקובקטריה מועברים דרך מחט של 25 גרם באמצעות מזרק כדי ליצור השעיה של תא בודד. שיטות פיזור אחרות כוללות סוניקציה של תרחיף המיקובקטריאלי באמבט מים מתפרץ או מערבולת עם חרוזי זכוכית19. עם זאת, שתי הטכניקות הללו יכולות לשנות את הרכב הקפסולה החיצונית של Mtb 20,21 ועשויות להשפיע על קשירה ופאגוציטוזה על ידי מקרופאגים21.
תרכובות פרמקולוגיות יכולות להשפיע על ספיגת מיקובקטריה אם הם דוגרים עם מקרופאגים לפני או במהלך זיהום. בנוסף, בעת ביצוע ניסויים עם מקרופאגים אנושיים ראשוניים, עשויה להיות שונות phagocytosis של מיקובקטריה בין תורמים. בנסיבות אלה, שימוש ביחס קבוע של מיקובקטריה: מקרופאגים יובילו להבדלים בספיגה במהלך תקופת ההדבקה של 3 שעות. זה עלול להוביל להנחות שגויות לגבי היעילות של תרכובות. ניתן להימנע מכך על ידי ביצוע צביעה עבור חומצה מהירה bacilli (AFB) באמצעות שיטת auramine המתוארת כאן (או כתם AFB אחר) בנוכחות כל HDT והתאמת האינוקולום הראשוני בהתאם22. בעוד שנוטה לכמות מסוימת של טעויות עקב קושי להבחין בין מיקובקטריה חוץ-תאית למיקובקטריה תוך-תאית19 והסבירות שעדיין קיימים גושים קטנים, הליך הכתמת AFB מסייע להשוות את הרמה הראשונית של זיהום תוך תאי עבור כל טיפול.
בפרוטוקול זה, עבור דגימות שנאספו בזמנים שאינם דגימת הזיהום הראשונית של 3 שעות, הליזאט והסופרנטנט משולבים כדי לאסוף מיקובקטריה תוך-תאית וכאלה ששוחררו באופן חוץ-תאי. הסיבה לכך היא שמכיוון שהמקרופאגים נשטפו לאחר הדגירה הראשונית של 3 שעות עם Mtb, מיקובקטריה חוץ-תאית קיימת ככל הנראה שוחררה על ידי מקרופאגים נמקיים. מצד שני, אם החוקרים מעדיפים לקצור את המיקובקטריה התוך-תאית הנותרת ולא לכלול מיקובקטריה חוץ-תאית, שיטה זו מותאמת בקלות לעשות זאת.
היתרונות של מכשירים אוטומטיים מבוססי תרבית נוזלית בהשוואה למדיום המוצק הם פשטות ההתקנה, זרימת עבודה ניסיונית יעילה יותר מכיוון שניתוח של דילולים סדרתיים אינו נחוץ, מתקבלת קריאה מדויקת בהשוואה לספירה ידנית סובייקטיבית יותר של מושבות, זמן מהיר יותר לתוצאות (כ 5-12 ימים לעומת 21 או יותר עבור צלחות אגר), ורגישות גבוהה יותר5. החסרונות כוללים (1) תלות בכך שלחוקרים תהיה גישה למכשיר מתאים, (2) רכישת בקבוקי מכשירים יכולה להוסיף משמעותית לעלות לדגימה. בנוסף, (3) זיהוי הגדילה תלוי בשכפול חיידקים: תת-אוכלוסיות של מיקובקטריה רדומה שאינה משתכפלת לא יתנו אות23,24. עם זאת, חיסרון זה חל גם על גידול במדיה מוצקה ודגרה ממושכת במדיה נוזלית עשויה להחזיר את הצמיחה של תת-אוכלוסיות אלה25,26. יתר על כן, (4) השימוש בשיטת תרבית מרק נוזלית זו מחייב קציר ידני של ליזטים ולא יתאים לתזרימי עבודה בעלי תפוקה בינונית עד גבוהה הנדרשים לסינון ספריות מורכבות. במקרים כאלה, מערכות הדמיה אוטומטיות הן אפשרות מעשית יותר27. עם זאת, גם בניסויים בתפוקה גבוהה, חיוני לאשר את הפעילות האנטי מיקרוביאלית של להיטים באמצעות שיטה המודדת צמיחה ישירות28. בעתיד, המחברים מתכננים להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את ההשפעות החיידקיות של תרופות מעוררות אוטופגיה בשילוב עם תרופות קונבנציונליות נגד שחפת על הישרדות Mtb במקרופאגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע של אירלנד (SFI 08/RFP/BMT1689), המועצה לחקר הבריאות באירלנד [HRA-POR/2012/4 ו-HRA-POR-2015-1145] וקרן בית החולים רויאל סיטי אוף דבלין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
