Summary
Snabb och effektiv kvantifiering av intracellulär M . tuberkulostillväxt är avgörande för att driva förbättrade behandlingar mot tuberkulos (TB). Detta protokoll beskriver en buljongbaserad kolorimetrisk detektionsanalys med hjälp av ett automatiserat vätskeodlingssystem för att kvantifiera Mtb-tillväxt i makrofager behandlade med kandidatvärdstyrda terapier.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), orsaksmedlet för tuberkulos (TB), var den viktigaste infektionssjukdomsdödaren globalt fram till tillkomsten av COVID-19. Mtb har utvecklats för att kvarstå i sin intracellulära miljö, undvika värdförsvar och har utvecklat resistens mot många anti-tuberkulära läkemedel. Ett sätt att lösa resistens är att identifiera befintliga godkända läkemedel som kommer att öka värdens immunsvar mot Mtb. Dessa läkemedel kan sedan återanvändas som kompletterande värdstyrda terapier (HDT) för att förkorta behandlingstiden och hjälpa till att övervinna antibiotikaresistens.
Kvantifiering av intracellulär Mtb-tillväxt i makrofager är en avgörande aspekt för att bedöma potentiell HDT. Guldstandarden för mätning av Mtb-tillväxt räknar kolonibildande enheter (CFU) på agarplattor. Detta är en långsam, arbetsintensiv analys som inte lämpar sig för snabb screening av droger. I detta protokoll har ett automatiserat, buljongbaserat odlingssystem, som oftare används för att detektera Mtb i kliniska prover, anpassats för preklinisk screening av värdstyrda terapier. Kapaciteten hos analyssystemet för flytande kultur att undersöka intracellulär Mtb-tillväxt i makrofager behandlade med HDT utvärderades. De HDT:er som testades för sin förmåga att hämma Mtb-tillväxt var all-trans retinsyra (AtRA), både i lösning och inkapslad i mikropartiklar av poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) och kombinationen av interferon-gamma och linezolid. Fördelarna med denna automatiserade vätskeodlingsbaserade teknik jämfört med CFU-metoden inkluderar enkel installation, mindre arbetsintensiv beredning och snabbare tid till resultat (5-12 dagar jämfört med 21 dagar eller mer för agarplattor).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), orsaksmedlet till TB, var den mest betydande infektionssjukdomsdödaren globalt 20191. För att undvika värdförsvar undergräver Mtb den mykobaktericida aktiviteten hos medfödda immunceller såsom makrofager och dendritiska celler (DC), vilket gör att den kan bestå intracellulärt och replikera2. Bristen på ett effektivt vaccin för att förhindra lung-tbc hos vuxna och den ökande uppkomsten av läkemedelsresistenta stammar belyser det akuta behovet av nya terapier.
Tilläggsbaserade värdstyrda terapier (HDT) kan förkorta behandlingstiden och hjälpa till att övervinna resistens3. Preklinisk bedömning av HDT-kandidater in vitro för att bestämma mykobaktericid aktivitet inom makrofager förlitar sig ofta på kvantifiering av Mtb-tillväxt av kolonibildande enheter (CFU) på fasta agarplattor. Detta är en långsam, arbetsintensiv analys som inte lämpar sig för snabb screening av droger. Kommersiellt tillgängliga automatiserade, buljongbaserade mikrobiella detektionssystem används oftare i kliniska mikrobiologiska laboratorier för detektion och läkemedelskänslighetstestning av Mtb och andra mykobakteriella arter i kliniska prover4. Dessa instrument mäter tillväxt indirekt baserat på bakteriens metaboliska aktivitet som leder till fysiska förändringar i odlingsmediet (förändring iCO2- ellerO2-nivåer eller tryck) övervakat över tid5. Avläsningen är time to positivity (TPP), som tidigare har visat sig korrelera med Mtb CFU i sputumprover av TB-patienter som svar på behandling 6,7 och i lysater av infekterad murin lunga och mjälte8. Dessutom har system för detektering av flytande kultur använts för att mäta effekten av konventionella patogenstyrda terapier på tillväxten av mykobakterier i axenkultur och odlade makrofager 9,10. Instrumentet har också använts för att undersöka den medfödda förmågan hos dendritiska celler och alveolära makrofager att kontrollera intracellulär tillväxt av Mtb11,12. Detta experimentella protokoll visar att ett diagnostiskt system för flytande odling kan anpassas för att utföra preklinisk screening av HDT för TB i odlade makrofager. Jämfört med CFU-uppräkning är den största fördelen med denna teknik att den avsevärt minskar det experimentella arbetet och den tid som krävs för att kvantifiera intracellulär mykobakteriell tillväxt / överlevnad. Denna teknik bygger på tillgång till ett automatiserat odlingsinstrument som kan användas för att bedöma intracellulär mykobakteriell överlevnad i immunceller behandlade med ett brett spektrum av farmakologiska reagenser riktade mot cellulära funktioner för att öka värdimmuniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten som beskrivs i detta protokoll utfördes med användning av den dämpade H37Ra-stammen av Mtb, som kan hanteras i ett inneslutningsnivå 2-laboratorium. Alla manipuleringar av levande mykobakterier utfördes i klass II biologiskt säkerhetsskåp (BSC). Experimentella förfaranden utformades för att minimera genereringen av aerosoler. Eukaryot cellodling (THP-1-celler) utfördes också i en klass II BSC. Laboratoriet genomförde en riskbedömning och såg till att alla procedurer utfördes i enlighet med institutionella och nationella biologiska säkerhetsbestämmelser. Den humana monocytiska THP-1-cellinjen användes för att utföra metoden enligt beskrivningen (steg 1). Celler differentieras till makrofager efter stimulering med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) före infektion med mykobakterier.
1. Cellodling
- Föröka H37Ra-fröbeståndet till loggfas i Middlebrook 7H9 (MB) buljong kompletterat med albumin-dextros-katalas (ADC) anrikning (10%) och 0,05% polysorbat 80. Förvara H37Ra i 1 ml alikvoter i en frys på -80 °C i upp till 1 år.
- Tina en 1 ml injektionsflaska med Mtb-H37Ra och överför den till en T25-kolv med ett filterlock som innehåller 9 ml MB kompletterad buljong ungefär 1 vecka före det planerade experimentet. Inkubera vid 37 °C i 5–7 dagar i en statisk inkubator.
- Odla THP-1-celler i RPMI-1640 kompletterat med icke-värmedödat 10% fosterkalvserum (komplett (c) RPMI) i en T75-kolv i en CO2-fuktad inkubator vid 5% CO2/37 ° C och subkultur två gånger per vecka för att bibehålla en densitet på mindre än 1 x 106 celler / ml.
- Differentiera THP-1-celler i makrofager 3 dagar före infektion genom att försiktigt pipettera celler flera gånger med hjälp av en serologisk pipett i T75-kolvar för att sprida eventuella klumpar och placera dem i ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur, dekantera supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i 2 ml RPMI. Utför cellantal för att uppskatta celler/ml.
- Frö 2 ml THP-1-makrofager i 12-brunns vävnadsodlingsplattor med en densitet av 100 000 celler / ml i cRPMI med 100 ng / ml PMA i 72 timmar. Ta bort PMA-innehållande medium från cellerna och fyll på med färsk cRPMI före Mtb-infektion.
- Ställ in enskilda plattor för varje tidpunkt som krävs.
- Fröceller med samma densitet (100 000 celler / ml) i 2-brunns glaskammarglas för att bestämma infektionsmultipliciteten (MOI).
- Placera i en 5%CO2 fuktad inkubator i 3 dagar vid 37 °C.
2. Kvantifiering av upptag av Mtb
- Bestämning av Mtb-upptag av makrofager (MOI)
- Sätt upp det biologiska säkerhetsskåpet klass II (BSC) på infektionsdagen och arbeta med två lager silkespapper för att fånga upp spill. Ställ in avfallsbehållare enligt lokala föreskrifter.
- Ta bort 6-8 ml mykobakteriell kultur från T25-kolven och överför den till ett 15 ml polypropenrör.
OBS: Rör med mindre volym kan användas för mindre experiment. - Centrifugera röret i en bänkcentrifug vid rumstemperatur i 10 min vid 2890 x g.
- Ta försiktigt bort röret från centrifugen och överför det till det biologiska säkerhetsskåpet. Vänta 1 min så att bakterierna sätter sig.
- Häll av supernatanten i desinfektionsbehållaren, sammanfatta röret och återsuspendera bakterierna i det återstående mediet genom att knacka på sidan av röret. Vänta 1 min så att bakterierna sätter sig.
- Tillsätt 2 ml förvärmd cRPMI, blanda försiktigt och överför till ett 50 ml koniskt rör.
- Återsuspendera mykobakterierna mycket försiktigt med en 25 G nål och 5 ml spruta. För att återuppliva, dra upp mykobakteriesuspensionen i sprutan och mata ut mycket försiktigt ner i rörets sidovägg för att minimera aerosolproduktionen. Upprepa 6-8 gånger.
OBS: Var ytterst försiktig eftersom detta är en kultur med hög densitet av mykobakterier. För att undvika risken för nålsticksskada, använd trubbiga nålar där det är möjligt och Luer-låssprutor. - Kassera nålen och sprutan i en behållare för vassa föremål i BSC.
- Överför suspensionen till ett 2 ml mikrofugerör (med skruvlock) och centrifugera vid rumstemperatur i 3 minuter vid 100 x g för att pelletera eventuella kvarvarande klumpar. Sätt tillbaka röret i säkerhetsskåpet och vänta 1 min så att bakterierna sätter sig tillrätta.
- Överför de översta 1-1,5 ml av supernatanten till ett nytt rör. Kasta originalröret i avfallshinken som innehåller desinfektionsmedel. Blanda väl och tillsätt olika mängder av den mykobakteriella suspensionen (t.ex. 5, 25, 50, 150 μl) till 2-brunns glaskammarglasen och inkubera i 3 timmar i enCO2-inkubator vid 37 °C.
- Färgning för syrafasta bakterier (AFB)
OBS: Efter 3 timmars inkubation tvättas makrofagerna och fixeras med paraformaldehyd för att inaktivera mykobakterier. Objektglasen färgas sedan med hjälp av ett modifierat Auramine O-kit (se materialtabell) för att uppskatta mykobakterier som fagocytoseras per cell. På grund av sin vaxartade cellvägg behåller mykobakterier Auramine-färgämnet efter en syra-alkoholtvätt. Makrofagkärnorna motfärgas sedan med Hoechst. Denna metod gör det möjligt att räkna antalet fagocytoserade bakterier per cell och används för att bestämma multipliciteten av infektion (MOI) hos makrofagerna.- Ta bort mediet från glaskammarens glid efter pipettering upp och ner tre gånger för att lossa bakterier som inte har fagocytoserats.
- Tvätta en gång med 2 ml rumstemperatur PBS.
- Förvara lager av 4% paraformaldehyd, upplöst i PBS i alikvoter vid -20 °C i upp till 6 månader. Tina en alikvot på 4% paraformaldehyd omedelbart före användning. Späd till 2% paraformaldehyd med PBS och tillsätt 2 ml per brunn.
- Inkubera i 10 min vid rumstemperatur. Glaskammarens glid kan tas bort från säkerhetsskåpet i detta skede för färgning.
- Tvätta bilden under en mild ström av kranvatten.
- Fördela tillräckligt med Auramine på bilden för att täcka cellerna med en plastöverföringspipett och inkubera i 1 min vid rumstemperatur i mörkret (täck med aluminiumfolie).
- Tvätta överflödigt färgämne från rutschkanan med kranvatten och tillsätt avfärgningsmedel/släckare i 1 min i mörkret.
- Tvätta bort överskottet med kranvatten och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur med Hoechst 33342 (10 μg/ml i PBS) i mörker.
- Tvätta av Hoechst-fläcken med kranvatten, ta bort kamrarna, dränera överflödigt vatten från bilden, tillsätt en droppe antifade och täckglas och lufttorka.
- Undersök bilden under det fluorescerande mikroskopet med hjälp av 100x oljemålet. Mykobakterier fluorescerar grönt under FITC-filtret. Kärnorna fluorescerar blått under DAPI-filtret (figur 1C).
- Bestäm MOI genom att räkna antalet mykobakterier som fagocytoseras per cell och andelen infekterade celler.
- Beräkna volymen av mykobakteriell suspension som behövs för att uppnå den erforderliga MOI baserat på ytan av en brunn i plattan; Till exempel är ytan på glaskammarglasen som används i detta experiment 4 cm2. Låg MOI (cirka 1-2 baciller/cell) är önskvärt för experiment som utförs under flera dagar (t.ex. 5 dagar).
- Infektion av makrofager
- Blanda mykobakteriesuspensionen väl och tillsätt den mängd som behövs till cellerna på 12-brunnsplattor när volymen som krävs för att uppnå önskad MOI har bestämts.
- Inkubera vid 37 °C i 3 timmar så att mykobakterier kan fagocytoseras.
- Ta bort extracellulära bakterier genom att tvätta brunnarna med antingen varm RPMI eller HBSS flera gånger.
- Lyse makrofagerna i en brunn (3 h prov) för att bestämma den procentuella tiden till positivitet (TTP) för det ursprungliga inokulumet (3 h provet) som beskrivs i steg 3 nedan.
- Tillsätt färsk cRPMI och erforderliga läkemedelsdoser eller vehikelkontroll till de återstående brunnarna, inkubera plattorna i CO 2-inkubatorn vid 37 °C under den tid som krävs (beroende på experimentell design men vanligtvis med flera intervall mellan 1 och 8 dagar).
3. Uttag av prover för detekteringssystemet för flytande kultur
OBS: På infektionsdagen avlägsnas extracellulära mykobakterier genom tvättning och intracellulära mykobakterier skördas genom lys av en brunn makrofager (3 h prov) för att bestämma den initiala mängden fagocytoserad som en baslinjekontroll för infektion. Vid efterföljande tillfällen kombineras både mediet, celllysat och tvättar för att mäta total mykobakteriell tillväxt. Extracellulär och intracellulär tillväxt kan också bedömas separat om så önskas.
- Skörd av 3 h prov för att bestämma TTP
- Tvätta bort extracellulära mykobakterier från alla brunnar efter de första 3 timmarna av infektion enligt beskrivningen i steg 2.3.3. Tillsätt 1 ml färskt media till 3 h-kontrollbrunnen för att utjämna lysatvolymen med senare tidpunkter.
OBS: Se steg 3.2.7 om extracellulära mykobakterier ska uteslutas från analysen.
- Tvätta bort extracellulära mykobakterier från alla brunnar efter de första 3 timmarna av infektion enligt beskrivningen i steg 2.3.3. Tillsätt 1 ml färskt media till 3 h-kontrollbrunnen för att utjämna lysatvolymen med senare tidpunkter.
- Insamling av prover
- Varm MB-buljong och instrumentodlingsflaskor för att få dem till rumstemperatur.
- Överför mediet från 12-brunnsplattan till motsvarande märkta koniska rör.
- Tillsätt 500 μl steril lysbuffert (0,1% Triton x-100 i PBS filtrerat genom ett sterilt 0,2 μm filter) till varje brunn i 10 min.
- Skrapa försiktigt cellerna från brunnen med en steril skrapa och kombinera med mediet i lämpligt koniskt rör.
- Tvätta brunnen med 0,5 ml steril PBS och överför till lämpligt rör.
- För försiktigt varje prov genom en nål och spruta (25 G) 6-8 gånger för att bryta upp klumparna. Späd proverna 1:10 i MB buljong; 100 μL prov + 900 μL MB medium.
- Vid de erforderliga tiderna/dagarna (vanligtvis mellan 1 och 8 dagar), skörda de återstående proverna genom att följa steg 3.2.1-3.2.6 ovan.
OBS: Utredare kanske föredrar att utesluta extracellulära mykobakterier från sin analys, i vilket fall, i steg 3.2.2 ovan, kasseras mediet från varje brunn och makrofager tvättas flera gånger innan de tillsätter lysbuffert.
- Inokulering och laddning av instrumentodlingsflaskor
OBS: Detaljer om det flytande odlingsinstrumentet och relaterade förbrukningsvaror finns i materialförteckningen.- Sterilisera gummilocket på instrumentodlingsflaskan med silkespapper indränkt i 70% alkohol och låt det lufttorka.
OBS: Detta steg måste utföras i BSC. - Förbered flaskor genom att överföra tillräckligt med näringstillskott för alla prover till ett koniskt rör (0,5 ml / flaska). Använd en nål och spruta för att injicera 0,5 ml näringstillskott i instrumentodlingsflaskan.
- Pipettera över 500 μl av det utspädda provet (1:10) till ett 1 ml V-bottnat rör.
- Använd en nål och spruta för att injicera 500 μl prov i den tilldelade instrumentodlingsflaskan.
- Sterilisera gummilocket på instrumentodlingsflaskan med silkespapper indränkt i 70% alkohol och låt det lufttorka. Torka av flaskorna med silkespapper indränkt i 70% alkohol innan de tas bort från BSC.
- Transportera försiktigt flaskor från biosäkerhetsskåpet till instrumentet för lastning.
- Tryck på laddningsknappen på det automatiska mikrobiella detekteringssystemet.
- Skanna streckkoderna på instrumentodlingsflaskor och placera flaskorna i detektionssystemets inkubator vid 37 °C i upp till 42 dagar. Läs och registrera den tid det tar att nå positivitet från instrumentskärmen.
OBS: Streckkoden gör det möjligt för instrumentet att identifiera flaskan och länka reflektansavläsningar med en viss flaska. - Beräkna procentuell tid till positivitet (TTP) genom att jämföra TTP för det initiala intracellulära inokulumet (dag 0) med det för makrofager odlade för de angivna tiderna. En positiv förändring i procent TTP betyder mykobakteriell tillväxt13.
Till exempel för dag 3:
Procentuell förändring i tid till positivitet =
- Sterilisera gummilocket på instrumentodlingsflaskan med silkespapper indränkt i 70% alkohol och låt det lufttorka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiserade flytande odlingsinstrumentet som används i denna studie övervakar CO2-nivåer var 10: e minut. En färgförändring i sensorn längst ner på instrumentflaskan mäts kolorimetriskt och uttrycks som reflektansenheter. Instrumentprogramvaran tillämpar sedan detektionsalgoritmer för att beräkna tid till positivitet (TTP), dvs. antalet dagar från inokulering tills kulturer flaggas som positiva (figur 1A). Ett omvänt förhållande mellan TTP och log10CFU (bestämd med agarplattmetoden)12 i den initiala ympningen illustreras i figur 1B. När Mtb-tillväxt inom makrofaginfekterade vid MOI från 1-2 till 5-10 i närvaro eller frånvaro av farmakologiska hämmare (figur 1C) jämfördes med den automatiserade odlingsmetoden som beskrivs eller genom uppräkning av kolonier på fast agar, fanns det en signifikant korrelation mellan resultat som erhållits med båda metoderna (Figur 1D). För att visa Mtb-tillväxt grafiskt beräknades den procentuella förändringen i TTP enligt ekvationen ovan genom att jämföra TTP-värdena i upp till 8 dagar efter infektion av makrofager med det ursprungliga TTP-värdet12. Resultaten visade en liknande trend mellan flytande odling och CFU, som visade signifikant hämning av Mtb-tillväxt i makrofager i närvaro av AtRA i lösning eller ekvivalentdosen av AtRA inkapslad i PLGA-mikropartiklar (MP) (figur 2A,B).
Effekten av en annan HDT, IFNγ, som har använts för att behandla multiresistent TB14, i kombination med andra linjens antibiotikum linezolid, undersöktes också. Ett dos-responsexperiment utfördes först i infekterade THP-1-celler för att bestämma effekten av linezolid ensam vid koncentrationer från 0,6-5,0 μg / ml (figur 2C) innan kombinationen av linezolid vid en suboptimal dos (1,25 μg / ml) och IFNγ testades: det fanns ingen signifikant interaktion mellan läkemedlen (Figur 2D).
Figur 1: Kvantifiering av Mtb-tillväxt genom automatiserad vätskekultur och på fast medium. Mtb H37Ra späddes i Middlebrook buljong över en rad utspädningar (1:2 till 1:100 000). En alikvot på 300 μl av varje utspädning injicerades i dubbla instrumentodlingsflaskor, inkuberades på det flytande odlingsinstrumentet och deras tillväxt övervakades. Samtidigt spreds en alikvot (10 μL) på MB-agarplattor innehållande 0,5% glycerol och 10% OADC (oljesyra, albumin, dextros, katalastillskott) i tre exemplar, för CFU-uppräkning som tidigare publicerats12. (A) Datapunkter från vätskeodlingssystemet för varje utspädning plottas som reflektansenheter jämfört med tiden15. För att möjliggöra jämförelser mellan prover normaliserades bakgrunden till 9 timmars reflektansavläsning för varje prov. Tillväxten övervakades i 42 dagar totalt (de första 21 dagarna visas i diagrammet), tiden till positivitet (TTP) varierade från 3,83 till 11,1 dagar. (B) TTP från utspädda prover plottades mot log10 CFU-uppskattning; Varje datapunkt representerar värdena för två replikat från ett experiment och beskriver två separata experiment. Linjen med bästa passform och regressionskoefficient (r2) visas. (C) Exempel på AFB-färgning av intracellulär Mtb H37Ra i THP-1-makrofager med auramin (grön) som används för att beräkna infektionsmultiplicitet, kärnor motbeläggs med Hoechst-333258 (blå). Bilder genererades med hjälp av ett epifluorescerande mikroskop med ett 100x (numeriskt bländare [NA], 1.3) oljemål. (D) Korrelationsanalys (Pearson) av parad TTP (flytande kultur) och CFU-uppskattning av Mtb H37Ra-tillväxt i THP-1-makrofaglysater från flera experiment (n = 23), behandlade med / utan farmakologiska reagenser och infekterade vid MOI från 1-2 till 5-10 baciller / infekterad makrofag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Utvärdering av värdstyrda terapier för TB med hjälp av ett automatiserat vätskeodlingssystem. THP-1-makrofager infekterades med Mtb H37Ra i 3 timmar, extracellulära bakterier avlägsnades och celler behandlades med kandidatvärdriktade terapier i upp till 192 h. (A) CFU-uppskattning av Mtb-tillväxt i makrofager behandlade med AtRA-lösning (Sol) eller 2 μM AtRA-mikropartiklar (MP) (10-20 μg / ml). (B) % förändring i (tid till positivitet TTP) i makrofager behandlade med AtRA-lösning eller AtRA PLGA MP. Infekterade THP1-celler odlade i 0,1% DMSO i cRPMI betecknades som obehandlade kontroller. (C) Makrofager behandlades med ökande koncentrationer av linezolidlösning (0,6 μg/ml till 5 μg/ml), % förändring av TTP bestämdes 24 och 72 timmar efter infektion med hjälp av ett automatiserat vätskeodlingssystem. (D) Makrofager infekterade med Mtb H37Ra behandlades med enbart linezolid (1,25 μg/ml) eller linezolid + IFNγ (5 ng/ml) upp till 72 timmar, % förändring av TTP beräknades. Obehandlade kontroller bestod av infekterade THP1-celler odlade i cRPMI ensamt under de angivna tiderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Författarna har använt den flytande odlingsmetoden som beskrivs i detta protokoll för att övervaka Mtb-tillväxt i monocyt-härledda makrofager och alveolära makrofager och THP-1-celler differentierade med PMA11,16,17. Denna teknik kan också modifieras för användning med icke-vidhäftande celler12. På senare tid har instrumentet också använts i prekliniska studier för att utvärdera inhalerad all-trans retinsyra (AtRA) som en HDT för TB17. Kritiska steg i protokollet inkluderar (1) kontroll för upptag av Mtb genom AFB-färgning för att mildra faktorer som differentiell fagocytos på grund av läkemedelsförbehandling och minimera celldöd som är mindre sannolikt att inträffa vid lägre MOI, (2) beroende på MOI kan celllysater behöva spädas för att maximera analysens dynamiska omfång. Att sikta på en TTP på cirka 5-12 dagar har gett reproducerbara resultat.
I detta protokoll har försvagad Mtb H37Ra använts som surrogat för virulent Mtb, men metoden kan också tillämpas för att studera läkemedelseffekt mot virulenta laboratorie- och kliniska stammar i en inneslutningsnivå 3-anläggning med lämplig modifiering. Bekräftelse av dessa resulterar i en musmodell av virulent TB där inhalerad AtRA, både i lösning och inkapslad i mikropartiklar av poly (mjölk-co-glykolsyra (PLGA) (MP), signifikant förbättrad clearance av Mtb-H37Rv från lungan samtidigt som patologin reduceras, indikerar att H37Ra är ett användbart surrogat för virulent Mtb i dessa studier17.
Eftersom HDT är utformade för att användas som tillägg till konventionella terapier är det viktigt att utvärdera deras effekt in vitro i kombination med anti-tuberkulära antibiotika för att analysera potentiella läkemedelsinteraktioner18. För att få en mätbar TTP måste antibiotika - särskilt de med hög intracellulär effekt - först titreras till suboptimala koncentrationer (under den minsta hämmande koncentrationen) innan man utvärderar HDT / antibiotikakombinationer i makrofager. I exemplet som visas i detta protokoll (figur 2C,D) titrerades linezolid ensamt först innan det utvärderades i kombination med IFN-γ. I ett annat exempel blir lysater av H37Ra-infekterade THP-1-makrofager behandlade med rifampicin vid eller över 0,6 μg / ml inte tillförlitligt positiva i vätskeodlingssystemet17. Därför behövs en lägre koncentration av rifampicin för att utvärdera eventuell HDT i kombination med detta antibiotikum i makrofager.
På grund av Mtb: s tendens att bilda aggregat är det nödvändigt att bryta upp klumpar för att tillhandahålla en enda cellsuspension för att uppnå enhetlig alikvotering av mykobakterier i flera brunnar av odlade makrofager i varje experiment. På samma sätt upprepas detta disaggregeringssteg efter att makrofager har lyserats för att ge en exakt uppskattning av tillväxten. I detta protokoll passerar mykobakterierna genom en 25 G nål med användning av en spruta för att generera en encellssuspension. Andra spridningsmetoder inkluderar ultraljudsbehandling av den mykobakteriella suspensionen i ett ultraljudsvattenbad eller virvel med glaspärlor19. Båda dessa tekniker kan dock förändra sammansättningen av den yttre kapseln av Mtb 20,21 och kan påverka bindning till och fagocytos av makrofager21.
Farmakologiska föreningar kan påverka upptaget av mykobakterier om de inkuberas med makrofager före eller under infektion. Dessutom kan det finnas variation i fagocytos av mykobakterier mellan givare när man utför experiment med primära humana makrofager. Under dessa omständigheter, med hjälp av ett fast förhållande mellan mykobakterier: makrofager skulle leda till skillnader i upptag under 3 timmars infektionsperioden. Detta kan leda till felaktiga antaganden om effekten av föreningar. Detta kan undvikas genom att utföra färgning för syrafasta baciller (AFB) med hjälp av auraminmetoden som beskrivs här (eller en annan AFB-fläck) i närvaro av varje HDT och justera den initiala inokulum i enlighet därmed22. Medan den är benägen för en viss mängd fel på grund av svårigheter att skilja extracellulära från intracellulära mykobakterier19 och sannolikheten för att små klumpar fortfarande är närvarande, hjälper AFB-färgningsproceduren till att utjämna den initiala nivån av intracellulär infektion för varje behandling.
I detta protokoll, för prover som samlats in vid andra tidpunkter än det initiala 3 h-infektionsprovet, kombineras lysat och supernatant för att samla intracellulära mykobakterier och de som har frisatts extracellulärt. Anledningen till detta är att eftersom makrofagerna har tvättats efter den första 3 h-inkubationen med Mtb, har extracellulära mykobakterier som finns sannolikt frigjorts av nekrotiska makrofager. Å andra sidan, om utredare föredrar att skörda de återstående intracellulära mykobakterierna och utesluta extracellulära mykobakterier, är denna metod lätt anpassad för att göra det.
Fördelarna med automatiserade vätskekulturbaserade instrument jämfört med det fasta mediet är enkel installation, ett effektivare experimentellt arbetsflöde eftersom analys av seriella utspädningar är onödig, en exakt avläsning erhålls jämfört med den mer subjektiva manuella räkningen av kolonier, snabbare tid till resultat (cirka 5-12 dagar jämfört med 21 eller mer för agarplattor), och högre känslighet5. Nackdelar inkluderar (1) beroende av att forskare har tillgång till ett lämpligt instrument, (2) inköp av instrumentflaskor kan öka kostnaden per prov avsevärt. Dessutom beror (3) detektering av tillväxt på bacillärreplikation: delpopulationer av icke-replikerande vilande mykobakterier kommer inte att ge en signal23,24. Denna nackdel gäller dock även tillväxt på fasta medier och långvarig inkubation i flytande medier kan återställa tillväxten av dessa delpopulationer25,26. Dessutom (4) kräver användning av denna flytande buljongodlingsmetod manuell skörd av lysater och skulle inte vara lämplig för arbetsflöden med medelhög till hög genomströmning som krävs för att screena sammansatta bibliotek. I sådana fall är automatiserade bildsystem ett mer praktiskt alternativ27. Men även i experiment med hög genomströmning är det viktigt att bekräfta träffarnas antimikrobiella aktivitet med hjälp av en metod som mäter tillväxt direkt28. I framtiden planerar författarna att använda denna metod för att bedöma de bakteriedödande effekterna av autofagiinducerande läkemedel i kombination med konventionella anti-tuberkulära läkemedel på Mtb-överlevnad i makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), Health Research Board i Irland [HRA-POR/2012/4 och HRA-POR-2015-1145] och Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
