Summary
Мы описываем внутрипаренхимальную трансплантацию нейронных клеток-предшественников человека, трансдуцированных двойным репортерным вектором, экспрессирующим люциферазно-зеленый флуоресцентный белок (GFP) в мозге мыши. После трансплантации сигнал люциферазы многократно измеряется с использованием биолюминесценции in vivo и GFP-экспрессирующих трансплантированных клеток, идентифицированных в участках мозга с помощью флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Клеточная терапия уже давно является новой парадигмой лечения в экспериментальной нейробиологии. Тем не менее, исследования клеточной трансплантации часто полагаются на измерения конечных точек и, следовательно, могут оценивать только продольные изменения миграции клеток и выживаемости в ограниченной степени. В этой статье представлен надежный, минимально инвазивный протокол для трансплантации и продольного отслеживания нейронных клеток-предшественников (NPC) в мозге взрослой мыши. Перед трансплантацией клетки трансдуцируют лентивирусным вектором, включающим биолюминесцентный (светлячок-люцифераза) и флуоресцентный (зеленый флуоресцентный белок [GFP]) репортер. NPC пересаживаются в правое корковое полушарие с помощью стереотаксических инъекций в сенсомоторную кору. После трансплантации трансплантированные клетки были обнаружены через неповрежденный череп в течение пяти недель (в дни 0, 3, 14, 21, 35) с пределом разрешения 6000 клеток с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo . Впоследствии трансплантированные клетки идентифицируются в гистологических срезах мозга и далее характеризуются иммунофлуоресценцией. Таким образом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для трансплантации, отслеживания, количественной оценки и характеристики клеток в мозге мыши.
Introduction
Мозг млекопитающих имеет ограниченные регенеративные способности после травмы или заболевания, что требует инновационных стратегий для содействия тканевому и функциональному восстановлению. Доклинические стратегии сосредоточены на различных аспектах регенерации мозга, включая нейропротекцию, нейрогенез, ангиогенез 1,2, восстановление гематоэнцефалического барьера 3,4 или клеточнуютерапию 5,6. Преимущество клеточной терапии заключается в том, что она способна одновременно способствовать многим из этих процессов восстановления. В экспериментах с трансплантацией клеток восстановление тканей происходило посредством (1) прямой замены клеток и (2) производства цитокинов, приводящих к ангиогенезу и нейрогенезу7. Последние достижения в технологии стволовых клеток еще больше способствовали разработке масштабируемых, хорошо охарактеризованных источников нервных клеток, которые в настоящее время находятся в стадии клинических испытаний (рассмотрено в 7,8,9). Хотя клеточная терапия достигла клинической стадии для нескольких неврологических заболеваний (например, болезнь Паркинсона10, инсульт11 и повреждение спинного мозга12), их эффективность была переменной, и для понимания механизмов взаимодействия трансплантата и хозяина необходимы дополнительные доклинические исследования.
Одним из основных ограничений многих доклинических исследований является непрерывное отслеживание трансплантированных клеток внутри хозяина. Часто проводятся только измерения конечных точек, исключая динамические миграционные процессы и процессы выживания у хозяина 6,13. Эти ограничения приводят к плохой характеристике привитых клеток и требуют большого количества животных для понимания продольных изменений. Чтобы преодолеть эти ограничения, в этом исследовании мы трансдуцируем индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из нейронных клеток-предшественников, с коммерчески доступным лентивирусным вектором с двойным репортером, состоящим из люциферазы красного светлячка и усиленного зеленого флуоресцентного белка (rFluc-eGFP). Эти клетки трансплантируются с помощью стереотаксической интрапаренхимальной инъекции в мозг мыши и продольно отслеживаются с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo в течение 5 недель. После забора мозговой ткани GFP-экспрессирующие трансплантированные клетки идентифицируются и далее характеризуются в гистологических срезах мозга. Этот метод может быть плавно адаптирован к альтернативным трансдуцируемым клеточным источникам и путям трансплантации для применения in vivo в мозге грызунов. В целом, процедура ценна для получения продольной информации о выживании и миграции трансплантата в мозге мыши и облегчает последующую гистологическую характеристику.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с правительственными, институциональными и руководящими принципами ARRIVE и были одобрены Кантональным ветеринарным управлением Цюриха. Использовались взрослые самцы и самки без ожирения диабетических мышей SCID gamma (NSG) (10-14 недель, 25-35 г). Мышей размещали в обычных клетках типа II/III в группах по меньшей мере по два животных на клетку в помещении с контролируемой влажностью и температурой с постоянным циклом света/темноты 12/12 ч. .).
1. Клеточная культура и вирусная трансдукция
- Дифференцировать нейронные клетки-предшественники (NPC) от иПСК с помощью ингибиторов малых молекул, как описано ранее14.
- Культивирование NPC15 начиная с отрывка 2 и далее в среде поддержания нервных стволовых клеток (NSMM; Таблица 1) дополнен малыми молекулами (таблица 1) в 6-луночных пластинах (2 мл среды на скважину), покрытых полиорнитином/ламинином521 (pLO/L521). Меняйте среду ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для прохождения NPC добавляют 1 мл реагента диссоциации клеток на лунку (см. Таблицу материалов) и инкубируют при 37 °C в течение 1 мин, пока большинство клеток не отсоединятся.- Для нанесения покрытия инкубируют 150 мкл pLO в 1 мл 0,1 М фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) на скважину в течение 2 ч при комнатной температуре (RT). После трех промывок PBS инкубируют 10 мкг L521 в 1 мл PBS на скважину в течение 2 ч при RT.
- Для вирусной трансдукции добавляйте 50 000 клеток на лунку в 24-луночной пластине, покрытой pLO/L521, и добавляйте в каждую лунку предварительно упакованные вирусные векторы (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество предоставленных инфекционных единиц (IFU) составляет >2 × 106 IFU и достаточно для заражения 100 000 клеток при множественности инфекции (MOI) 20. Подсчет клеток был выполнен с помощью автоматизированного счетчика ячеек. Эффективность трансдукции сильно зависит от используемой клеточной линии. Работа с лентивирусом требует соблюдения местных руководящих принципов для продуктов уровня биобезопасности 2 (BSL-2). - Инкубируют клетки при 37 °C в течение 72 ч, продолжая при этом суточные изменения среды.
- Подтвердите успешную трансдукцию, проверив клетки на экспрессию GFP в флуоресцентном микроскопе. Установите увеличение микроскопа на 10x или 20x и используйте соответствующее возбуждение (460-480 нм) и диапазон излучения (490-520 нм) для обнаружения трансдуцированных GFP-экспрессирующих клеток.
- Количественно оценить отношение GFP-трансдуцированных к общему количеству клеток для оценки общей эффективности трансдукции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость трансдукции 65-95% была достигнута с помощью этого протокола. Эффективность трансдукции >50% рекомендуется в качестве критерия перед трансплантацией. Если эффективность трансдукции 50% не может быть достигнута, выполните отбор пуромицина или отсортируйте клетки с помощью проточной цитометрии для увеличения выхода трансдуцированных клеток. - Опционально: Замораживание клеток
- Раскрутите клетки вниз (300 × г, 5 мин) и выбросьте супернатант. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл морозильной среды (см. Таблицу материалов) и перекладывают суспензию во флаконы с получением 106 клеток/флакон. Переложите ячейки в морозильные камеры в течение 24 ч при -80 °C, а затем до -150 °C для длительного хранения.
2. Клеточная подготовка к трансплантации
- Соберите флакон с клетками из хранилища -150 °C и перенесите его в лабораторию. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флакон содержит 1,5-2 × 106 клеток. - Быстро перенесите флакон на водяную баню с температурой 37 °C до тех пор, пока не останутся кристаллы льда (2-3 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быстро оттаивать, чтобы свести к минимуму любое повреждение клеточных мембран. Не погружайте флакон полностью в водяную баню, так как это может увеличить риск загрязнения. - Перенесите флакон в шкаф биобезопасности и пипетку всего содержимого (~1 мл) в стерильную коническую трубку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с лентивирально трансдуцированными клетками требуется BSL-2. Однако промывка и пассаж клеток удаляют вирусные частицы из среды. Информацию о том, когда разрешен переход с BSL-2 на BSL-1, следует получить у местных властей. - Добавьте 9 мл стерильного 1x PBS и центрифугу в течение 5 мин при 300 × г, RT.
- Удалить супернатант путем аспирации с помощью пипетки (1-10 мл); осторожно наклоните подвеску в сторону кончика пипетки и начните аспирацию. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу.
- Промывайте клетки путем повторного использования в 10 мл стерильного 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно вставьте трубку, чтобы повторно суспендировать ячейки в остаточном объеме. Медленно тритурируйте клеточную суспензию, используя пипетку объемом 1 мл, пока она не будет содержать комков или агрегатов. - Подсчитайте ячейки перед окончательным вращением с помощью автоматизированного счетчика ячеек.
- Центрифуга в течение 5 мин при 300 × г, RT.
- Удалить надосадочный (этап 2.5) и повторно суспендировать клеточную гранулу в необходимом объеме стерильного PBS до концентрации 8 × 104 клеток/мкл. Поместите клетки на лед и используйте их для трансплантации в течение следующих 5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался объем 1,6 × 105 клеток/2 мкл PBS.
3. Процедура трансплантации
- Подготовка к операции
- Очистите и стерилизуйте хирургическое оборудование.
- Подготовьте стереотаксическое устройство и систему микроинъекционного насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно протестировать шприц Гамильтона и иглу 30 G, 2 дюйма перед запуском. Вставьте иглу в пробирку, содержащую стерильный 0,9% NaCl, и медленно втягивайте раствор внутрь и наружу. - Установите аппарат для анестезии. Протестируйте машину, прежде чем привлекать животных. Очистите индукционную камеру 70% этанолом.
- Заготовка животных
- Держите мышей не менее 7 дней до экспериментов в стандартных условиях, чтобы акклиматизировать их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовались следующие животные: самка NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 г, также известная как NSG) и самка C57BL/6J (20-25 г, также известная как B6). Процедура также может быть выполнена с самцами мышей. - Измерьте массу тела мыши и скорректируйте дозу обезболивающего, которое необходимо ввести. Вводите карпрофен (5 мг / кг массы тела) внутрибрюшинно, чтобы уменьшить боль и / или предотвратить воспалительную реакцию.
- Обезболивать животных с помощью изофлурана (3% в фазе индукции и 1,5-2% в поддерживающей фазе во время операции), испаренного в кислороде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Газообразная анестезия предпочтительна из-за быстрого пробуждения после хирургической процедуры и потому, что уровни анестезирующего газа могут быть легко отрегулированы. - Используйте ноцицептивные рефлексы, чтобы убедиться, что животное глубоко обезболено (например, щипки пальцев ног). Когда глубокая анестезия достигнута, транспортируйте животное из индукционной камеры в стереотаксическую рамку. Поддерживайте анестезию с помощью маски для лица.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания должна контролироваться визуально на протяжении всей процедуры (40-60 вдохов в минуту). Используйте согревающую прокладку, чтобы избежать переохлаждения во время процедуры. - Нанесите офтальмологическую смазку, чтобы предотвратить высыхание глаз.
- Сбрить кожу головы мыши электрической бритвой и продезинфицировать кожу 5% раствором бетадина с помощью ватных тампонов.
- Закрепите головку мыши и вставьте ушные вкладыши во внешний меатус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки. Нанесите лидокаиновую мазь на оба ушных канала перед введением ушных вкладышей. Чтобы проверить, находится ли голова животного в устойчивом положении, осторожно надавите на голову, чтобы увидеть, есть ли движение. Если движение отмечено, либо ушная перекладина, либо расположение носовой части, либо и то, и другое неправильно и должны быть перенастроены.
- Держите мышей не менее 7 дней до экспериментов в стандартных условиях, чтобы акклиматизировать их.
- Трепанация черепа
- Используйте хирургическое лезвие, чтобы сделать разрез вдоль средней линии, достаточно большой, чтобы выявить ориентиры лямбды и брегмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Втягивающие средства кожи могут быть применены, чтобы держать череп открытым. - Втягивайте надкостницу и фасцию скальпелем и используйте стерильные ватные тампоны для сушки поверхности черепа.
- Отрегулируйте полосы уха и рта, чтобы стандартизировать положение головы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальные координаты брегмы и лямбды должны быть идентичными для переднезаднего позиционирования. - Поместите иглу на брегму и рассчитайте координаты нужных точек инъекции (координаты интереса выбраны для этого протокола: передне-задние (AP): + 0,5 мм, медиально-латеральные (ML): + 1,5 мм). Переместите иглу в эту точку и пометьте ее чернилами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты были выбраны на основе Атласа мозга мыши Франклина и Паксиноса 16. Расстояния составляют мм от брегмы. - Нанесите стерильный 0,9% NaCl на череп и просверлите отверстие диаметром 2-3 мм через череп хирургическим, стоматологическим бормашином.
- Переместите иглу на поверхность твердой мозговой оболочки и рассчитайте координаты глубины.
- Используйте хирургическое лезвие, чтобы сделать разрез вдоль средней линии, достаточно большой, чтобы выявить ориентиры лямбды и брегмы.
- Процедура трансплантации
- Повторно суспендируют клетки в трубке (стадия 2.9) и втягивают 2 мкл клеточной суспензии в шприц (5 мкл или 10 мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в суспензии ячейки нет пузырьков воздуха. Шприц необходимо держать в горизонтальном положении до тех пор, пока он не будет установлен в стереотаксическое устройство, чтобы избежать осаждения клеток. - Поместите шприц над целевым участком (расчетные координаты: AP: + 0,5 мм, ML: + 1,5 мм) и медленно переместите иглу к поверхности твердой мозговой оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не уверены в правильных координатах, выполните инъекции с красителем и гистологическую оценку места инъекции перед трансплантацией клеток (подробнее см. 17). - Направьте иглу со скоростью 0,02 мм/с в мозг до нужной глубины (координата, выбранная для этого протокола, дорсально-вентральная (DV) – 0,8 мм). Превысите глубину на 0,1 мм и выведите иглу на такое же расстояние, чтобы создать карман для введенных клеток.
- Нанесите тканевый клей вокруг иглы с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку клеток.
- Вводят 2 мкл приготовленной клеточной суспензии с постоянной скоростью 3-5 нл/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура инъекции будет длиться от 7 до 12 минут. - После инъекции оставьте иглу на месте, по крайней мере, на 5 минут, прежде чем медленно вынимать ее. Нанесите тканевый клей, чтобы запечатать отверстие в черепе и подождите еще 2 минуты.
- Повторно суспендируют клетки в трубке (стадия 2.9) и втягивают 2 мкл клеточной суспензии в шприц (5 мкл или 10 мкл).
- Швы и последующий уход
- Наносите стерильный 0,9% раствор NaCl на открытый череп, чтобы избежать обезвоживания.
- Закройте рану шелковой шовной нитью 5/0.
- Увлажняют животное 0,5 мл раствора лактата Рингера, подкожно вводимого в нижнюю часть спины.
- Прервите доставку анестезии и осторожно извлеките мышь из стереотаксического аппарата и поместите ее обратно в клетку, содержащуюся на грелке.
- Наблюдение за животными во время острой фазы после травмы. Проверяйте шов, вес животного и общее состояние здоровья, по крайней мере, два раза в день.
4. Визуализация in vivo
- Препарат люциферина
- Разморозьте калийную соль D-люциферина на RT и приготовьте свежий запасной раствор D-люциферина в 30 мг/мл в PBS.
- Стерилизуйте исходный раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленное использование рабочего раствора. При необходимости растворенный люциферин можно хранить при -20 °C. Однако длительное хранение может привести к ухудшению сигнала. Люциферин является светочувствительным реагентом; держите его подальше от прямого света, когда это возможно. Альтернативные подложки также могут быть рассмотрены, например, циклук, для улучшения предела разрешения18.
- Отображение
- Первоначальная настройка
ПРИМЕЧАНИЕ: Биолюминесцентная визуализация выполнялась с использованием системы визуализации in vivo (см. Таблицу материалов), состоящей из темной камеры и камеры с охлаждаемой зарядовой связью (ПЗС).- Дважды щелкните значок программного обеспечения Living Image и выберите идентификатор пользователя из раскрывающегося списка.
- Нажмите кнопку Инициализировать на появившейся панели управления . Как только процесс инициализации будет завершен, температурный блок на панели управления станет зеленым.
- На панели управления установите флажки Люминесцент и Фотография и выберите Автоматическая экспозиция (~60 с). Выберите поле зрения (для этого протокола было выбрано D/12,5 см). Введите высоту объекта (1,5 см) и выберите параметр фокусировки по высоте объекта . Вручную задайте следующие параметры: большое биннинг, f/2, фильтр замедленного возбуждения и открытый эмиссионный фильтр.
- Определяют инъекционное количество D-люциферина при 300 мг/кг массы тела. ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная рекомендуемая доза составляет 150 мг/кг D-люциферина. Эта процедура была скорректирована в соответствии с протоколом, сообщающим о более высокой чувствительности с использованием 300 мг / кг18.
- Вводят люциферин внутрибрюшинно (в т.п.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное нуждается в седации перед инъекцией, имейте в виду, что это может продлить время пиковой экспрессии люциферазы. - Подождите 5 мин, затем обезболивайте животных непрерывным поступлением изофлурана (4,5% в фазе индукции и 1,5-2% в поддерживающей фазе во время процедуры визуализации).
- Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, затем побрейте успокоенных животных на область головы с помощью обычной бритвы для волос. Поместите животных в камеру визуализации и начните визуализацию через 15 минут после инъекции люциферина, нажав « Получить » на панели управления .
- Первоначальная настройка
5. Перфузия
- Обезболивание животных путем внутривенной инъекции пентобарбитала натрия (150 мг/кг массы тела). Подождите, пока мышь больше не будет реагировать на болезненные раздражители, такие как щипки пальцев ног.
- Положите мышь на спину и используйте пинцет и ножницы, чтобы открыть грудную полость.
- Используйте стандартные ножницы, чтобы открыть диафрагму.
- Обнажите сердце и вставьте иглу (из трубки с рингером/4% раствором параформальдегида (PFA)) в верхушку левого желудочка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы держать кончик иглы в просвете желудочка. - Вырежьте правый желудочек ножницами.
- Перфуз с раствором рингера (может храниться при РТ) в течение 3-4 мин (расход: 17 мл/мин). Продолжайте до тех пор, пока сердце не очистится.
- Переключите запорный кран, чтобы обеспечить поток PFA (хранить при 4 °C; держать на льду во время процедуры) и перфузить еще 5 минут (~ 100 мл).
- Остановите насос и извлеките иглу из левого желудочка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия с PFA сохраняет целостность тканей равномерно. Это также облегчает сохранение сигнала GFP в трансплантатах, который в противном случае может быть потерян из-за диффузии.
6. Обработка
- Коллекция тканей
- Снимите голову стандартными ножницами и сделайте разрез средней линии в коже.
- Переверните кожу над глазами, чтобы обнажить череп.
- Начните с каудальной части в точке теменной кости и сделайте небольшой разрез с помощью пружинных ножниц. Выдвигайте ножницы рострально вдоль среднего сагиттального шва до точки между глазами. Начните снова с каудальной части и сделайте два разреза параллельно и ~ 4 мм друг от друга в сагиттальной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг, прижимая ножницы к внутренней поверхности черепа. - Используйте щипцы, чтобы осторожно наклонить одну сторону теменной кости и отломить ее. Проделайте то же самое с другой стороной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микропатул, чтобы освободить кость от мозговых оболочек; в противном случае они могут повредить мозг при отломке черепа. Если части лобной кости остались, сделайте небольшой разрез, чтобы наклонить и отломить костную пластину. - Чтобы освободить мозг, осторожно сдвиньте микропатчок под мозг (обонятельные луковицы) и осторожно наклоните его вверх.
- После сбора держат мозг в 4% растворе ПФА в течение 4-6 ч при 4 °C. После этого перенесите его на стерильный 1x PBS.
- Иммуногистохимия
- Переводят мозг на 30% раствор сахарозы в течение не менее 48 ч при 4 °C для предотвращения образования кристаллов при замораживании.
- Используйте скользящий микротом для резки корональных сечений толщиной 40 мкм. Соберите и храните срезы в виде свободно плавающих секций (в 24-луночной пластине) в растворе криопротектора (таблица 1) при -20 °C до дальнейшей обработки.
- Промыть участки 450 мкл 1x PBS для каждой скважины (3 раза, по 5 мин, RT).
- Блокируют неспецифические участки 450 мкл блокирующего раствора на каждую скважину (табл. 1) в течение 1 ч на РТ.
- Инкубируйте каждую лунку с 450 мкл первичных антител при 4 °C в течение ночи. Разводят антитела 1:200 в 3% ослиной сыворотке; 0,1% Тритон-Х-100 в PBS. Для идентификации донорского материала в среде хозяина используют антитело к специфическим для человека ядрам (Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1).
- Промывайте секции по 450 мкл по 1x PBS для каждой скважины (3 раза по 5 мин, RT).
- Инкубировать каждую лунку с 450 мкл соответствующих флуоресцентных вторичных антител в течение 2-3 ч (RT). Разводят антитела в 3% ослиной сыворотке; 0,1% Тритон-Х-100 в 1x PBS.
- Промывайте секции по 450 мкл по 1x PBS для каждой скважины (3 раза по 5 мин, RT).
- Окрашивают ядра 450 мкл 0,1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
Representative Results
Мы стремимся продольно отслеживать трансплантированные нейронные клетки-предшественники в мозге мыши с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo и идентифицировать трансплантированные клетки в последующем гистологическом анализе (рисунок 1A). Поэтому нейронные клетки-предшественники трансдуцируются лентивирусным вектором, состоящим из EF1α-rFluc-eGFP. Перед трансплантацией клетки тестировали на успешную трансдукцию экспрессией eGFP in vitro (рисунок 1B). Успешно трансдуцированные клетки были стереотаксически пересажены в мозг мыши по заданным координатам (например, в сенсомоторную кору). После трансплантации мышам систематически вводили D-люциферин, субстрат для rFluc, и измеряли интенсивность сигнала трансплантированных клеток для подтверждения успешной трансплантации (рисунок 1C).
Чтобы оценить предел обнаружения биолюминесцентной визуализации in vivo, диапазон 6000-1800000 клеток был пересажен в правую сенсомоторную кору мыши (рисунок 2A). Мы обнаружили <6000 клеток и сигнал биолюминесценции, пропорциональный количеству трансплантированных клеток непосредственно после трансплантации (рисунок 2B). Поскольку человеческие клеточные источники являются иммуногенными и иммунокомпетентными мышами, иммунодефицитные мыши NOD scid gamma (NSG) использовались для наблюдения за долгосрочной выживаемостью клеточных трансплантатов. Долгосрочная выживаемость и обнаружение сигнала биолюминесценции в течение 5 недель были подтверждены после трансплантации клеток (рисунок 2C,D). Трансплантированные клетки были успешно обнаружены ex vivo в последующем гистологическом анализе с помощью репортера eGFP и иммуноокрашивания античеловеческими ядрами и античеловеческими митохондриальными антителами (рисунок 2E).
Рисунок 1: Трансплантация нейронных клеток-предшественников. (A) Схематический обзор генерации и трансплантации NPC rFluc-eGFP. (B) Репрезентативное иммунофлуоресцентное изображение трансдуцированных NPC (репортер GFP, зеленый), окрашенное DAPI (синий); шкала баров = 5 мкм. (C) Обнаружение in vivo сигнала биолюминесценции в трансплантированных клетках; цветовая полоса = синий (0, мин, без сигнала), красный (4 потока, п/с × 105, максимальный сигнал) Сокращения: NPC = нейронные клетки-предшественники; GFP = зеленый флуоресцентный белок; rFluc-eGFP = люцифераза красного светлячка и усиленный зеленый флуоресцентный белок; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; p/s = фотоны/с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Временной ход пересаженных клеток. (A) Схематическое представление номеров клеток для трансплантации. (B) Предел обнаружения трансплантированных клеток через 1 ч после трансплантации. (С, Г) Срок трансплантации (180 000 клеток) до 35 дней у мышей NSG; цветовая полоса = синий (0, мин, без сигнала), красный (4 потока, p/s × 105, максимальный сигнал) Данные средние ± SEM (n = 3). (E) Репрезентативные флуоресцентные изображения гистологических срезов и трансплантированных клеток через 5 недель после трансплантации. Шкала бар = 10 мкм. Аббревиатуры: D = сутки после трансплантации; NSG = иммунодефецитный NOD scid гамма; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; GFP = зеленый флуоресцентный белок; HuNu = античеловеческое ядерное антитело, клон 235-1; p/s = фотоны/с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Регенерация поврежденного мозга для функционального восстановления остается нерешенной задачей. Многие инновационные доклинические подходы развили таргетирование, например, иммунная модуляция19,20, ангиогенез 1,21,22,23, целостность гематоэнцефалического барьера 2,3,24,25 и замена клеток 5,26 . Особенно в последние годы клеточная терапия стала многообещающей стратегией лечения мозга благодаря значительным достижениям в технологии стволовых клеток и эффективным протоколам дифференцировки15,28. Эта статья предоставляет ценный протокол для трансплантации и отслеживания нервных клеток в мозге мыши. Метод применим для всех трансдуцируемых клеточных линий для применения in vivo в мозге мыши.
Представленная установка использует трансплантаты человеческого происхождения у мыши. Эти трансплантации нежизнеспособны в долгосрочной перспективе у иммунокомпетентных мышей дикого типа из-за иммуногенности. Следовательно, иммунодефицитные мыши NSG использовались для преодоления этого ограничения. Альтернативно, использование мышиных трансплантатов может быть предпочтительным для преодоления иммуногенных аспектов. Если требуется трансплантация клеток человека, гуманизированные мышиные модели представляют собой новую альтернативу для снижения вероятности отторжения трансплантата29.
Для визуализации трансплантатов использовался коммерческий вирусный вектор с двойным репортером, состоящий из люциферазы светлячка и eGFP под промотором EF1α. Этот промотор был выбран для достижения высокой интенсивности сигнала15. Однако, помимо NPC, было показано, что другие типы клеток способствуют функции мозга после травмы, включая перициты30 и астроциты31; следовательно, в зависимости от используемой клеточной линии, другие промоторы могут быть более подходящими для достижения высоких уровней экспрессии. Кроме того, использование трансгенных промоторов, таких как ЦМВ, может привести к понижению регуляции, особенно в долгосрочных экспериментах32. Эффективность трансдукции лентивирусного вектора сильно зависит от используемой клеточной линии и может варьироваться между одиночными экспериментами. Поэтому эффективность трансдукции должна быть оценена до начала экспериментов in vivo и для коррекции вариаций эффективности трансдукции между экспериментами. Область мозга при трансплантации также влияет на силу сигнала. Хотя предел обнаружения <6000 клеток был достигнут для трансплантации коры, может потребоваться больше клеток для обнаружения сигнала в более глубоких областях мозга, например, полосатом теле или гиппокампе.
Объемы трансплантации в мозге мыши ограничены 1-2 мкл. Поэтому важно определить подходящий номер ячейки для экспериментов. Ранее было замечено, что увеличение количества клеток приводит к снижению выживаемости, скорее всего, из-за ограниченной доступности питательных веществ и кислорода в области трансплантации33. Биолюминесцентная визуализация in vivo обеспечивает относительно низкое пространственное разрешение по сравнению с другими методами визуализации in vivo , такими как МРТ или КТ. Поэтому короткие миграционные пути привитых клеток могут быть достоверно оценены только при последующем пост-хок анализе .
Абсолютная сила сигнала биолюминесценции, как правило, пропорциональна количеству трансплантированных клеток. Однако сила сигнала может быть уменьшена, если трансплантаты пересаживаются в более глубокие структуры мозга или если сила сигнала находится за пределами линейного спектра обнаружения системы визуализации in vivo . В настоящее время разрабатываются новые субстраты для обеспечения более эффективного проникновения через гематоэнцефалический барьер, чем D-люциферин, включая цикл1. Эти субстраты могут дополнительно улучшить предел обнаружения привитых клеток в будущем18. В целом, этот протокол позволяет проводить простую, минимально инвазивную процедуру трансплантации и наблюдения за трансплантатами в мозге мыши.
Disclosures
У авторов нет потенциальных конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы RR и CT признают поддержку со стороны Фонда Mäxi и Центра компетенции 3R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Rust, R., et al. Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke. Scientific Reports. 9 (1), 20040 (2019).
- Weber, R. Z., et al. Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model. Frontiers in Physiology. 11, 58226 (2020).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Wang, Y., et al. 3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).
- Llorente, I. L., et al. Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents. Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells. Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Schweitzer, J. S., et al. Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease. The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).
- Muir, K. W., et al. Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2). Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).
- Kawabori, M., et al. Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial. Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).
- George, P. M., et al. Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery. Biomaterials. 178, 63-72 (2018).
- Sancho-Martinez, I., et al. Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells. Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Rust, R., et al. Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications. bioRxiv. , (2022).
- Franklin, K., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams. , Academic Press. (2019).
- Baker, S., Götz, J. A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions. Acta Neuropathologica Communications. 4, 32 (2016).
- Cao, J., et al. In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model. ASN Neuro. 10, (2018).
- Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies. PLoS One. 8 (2), 55662 (2013).
- Roth, S., et al. Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke. Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).
- Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis. Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).
- Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications. FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).
- Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair. Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642 (2018).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Montagne, A., et al. APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline. Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Weber, R. Z., et al. Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery. bioRxiv. , (2021).
- Nair, R. R., et al. Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease. Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).
- Kirabali, T., Rust, R. iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration. European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601 (2021).
- Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick. Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999 (2021).
- Johansen, J., et al. Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS. Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).
- Vogel, S., et al. Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).
