Summary
Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.
Abstract
Dieses Protokoll zeigt die Schritte, die erforderlich sind, um optogenetische Werkzeuge zu verwenden, um die Kokain-induzierte Plastizität an Thalamo-Amygdala-Schaltkreisen umzukehren, um das nachfolgende Kokainsuchverhalten bei der Ratte zu reduzieren. In unserer Forschung hatten wir herausgefunden, dass, wenn Ratten intravenöses Kokain gepaart mit einem audiovisuellen Hinweis selbst verabreichen, Synapsen, die an Eingängen aus dem medialen genikulären Kern des Thalamus (MGN) auf die Hauptneuronen der lateralen Amygdala (LA) gebildet werden, stärker werden, wenn die Cue-Kokain-Assoziation erlernt wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Umkehrung der Kokain-induzierten Plastizität an diesen Synapsen das Kokain-motivierte Kokain-Suchverhalten reduzieren würde. Um diese Art der Neuromodulation in vivo zu erreichen, wollten wir eine synaptische Langzeitdepression (LTD) induzieren, die die Stärke der MGN-LA-Synapsen verringert. Zu diesem Zweck haben wir die Optogenetik verwendet, die die Neuromodulation von Gehirnschaltkreisen mit Hilfe von Licht ermöglicht. Das exzitatorische Opsin oChiEF wurde an präsynaptischen MGN-Terminals in der LA exprimiert, indem ein AAV, das oChiEF enthält, in das MGN infundiert wurde. Optische Fasern wurden dann in die LA implantiert und 473 nm Laserlicht wurde 15 Minuten lang mit einer Frequenz von 1 Hz gepulst, um LTD zu induzieren und die Kokain-induzierte Plastizität umzukehren. Diese Manipulation führt zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, die mit Kokain in Verbindung gebracht werden, Drogensuchaktionen zu induzieren.
Introduction
Drogenmissbrauch ist ein sehr ernstes Problem der öffentlichen Gesundheit in den USA und weltweit. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es nur sehr wenige wirksame Therapieoptionen 1,2. Ein großer Rückschlag für die Behandlung ist die Tatsache, dass chronischer Drogenkonsum langfristige assoziative Erinnerungen zwischen Umweltreizen und der Droge selbst erzeugt. Die erneute Exposition gegenüber drogenbezogenen Hinweisen führt zu physiologischen und Verhaltensreaktionen, die zu fortgesetztem Drogenkonsum und Rückfällen motivieren3. Eine neuartige therapeutische Strategie besteht darin, gedächtnisbasierte Behandlungen durchzuführen, die darauf abzielen, die Schaltkreise zu manipulieren, die an der Regulierung von Medikamenten-Cue-Assoziationen beteiligt sind. Kürzlich wurde beobachtet, dass Synapsen in der lateralen Amygdala (LA), insbesondere solche, die aus dem medialen Genikularkern (MGN) des Thalamus entstehen, durch wiederholte Cue-assoziierte Kokain-Selbstverabreichung verstärkt werden und dass diese Potenzierung das Kokainsuchverhalten unterstützen kann 4,5. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Cue-induzierte Wiedereinsetzung durch Umkehrung der Plastizität an MGN-LA-Synapsen abgeschwächt werden könnte.
Die Fähigkeit, die synaptische Plastizität eines bestimmten Gehirnschaltkreises präzise zu steuern, war eine große Herausforderung für das Feld. Traditionelle pharmakologische Werkzeuge haben einige Erfolge bei der Verringerung des Rückfallverhaltens erzielt, sind jedoch durch die Unfähigkeit, einzelne Synapsen zu manipulieren, begrenzt. Die jüngste Entwicklung der In-vivo-Optogenetik hat jedoch die Werkzeuge zur Verfügung gestellt, die benötigt werden, um diese Einschränkungen zu überwinden und neuronale Bahnen mit zeitlicher und räumlicher Präzision zu kontrollieren 6,7,8. Durch die Expression von lichtempfindlichen Opsinen in einem bestimmten Gehirnschaltkreis kann Laserlicht dann verwendet werden, um den Schaltkreis zu aktivieren oder zu hemmen. Frequenzabhängige optische Stimulation kann genutzt werden, um die synaptische Plastizität des Schaltkreises in einem sich verhaltenden Tier gezielt zu manipulieren.
Dieses Manuskript skizziert das Verfahren zur Manipulation des verhaltensrelevanten MGN-LA-Schaltkreises mit Hilfe von In-vivo-Optogenetik . Zuerst wurde das exzitatorische Opsin oChIEF im MGN exprimiert und optische Fasern wurden bilateral in das LA implantiert. Die Tiere wurden dann darauf trainiert, Kokain in einer reizabhängigen Art und Weise selbst zu verabreichen, was den MGN-LA-Signalweg potenziert. Als nächstes wurde eine anhaltende, niederfrequente Stimulation mit 473 nm Laserlicht verwendet, um schaltungsspezifische LTD zu erzeugen. Die Umkehrung der durch Kokainkonsum induzierten Plastizität führte zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, Handlungen auszulösen, die mit Drogensuchverhalten verbunden sind.
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Protocol
Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt. Alle Verfahren wurden mit erwachsenen, naiven Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt, die bei der Ankunft 275-325 g wogen.
1. Konstruktion von Lichtwellenleiterimplantaten und Patchkabeln
- Bereiten Sie Glasfaserimplantate nach zuvor veröffentlichten Protokollenvor 9. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente verwendeten eine 200-μm-Kernfaser (0,5 NA) und eine Ø1,25-mm-Multimode-LC/PC-Keramikferrule, eine Lochgröße von Ø230 μm.
- Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, um das untere Drittel einer Ferrule (am nächsten am flachen Ende der Ferrule) zu bewerten. Das Ritzen der Aderendhülsen hilft ihnen, mit Zahnzement verbunden zu bleiben, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie während des gesamten Experimentierens sicher bleiben.
- Verwenden Sie Drahtschneider, um ~ 35 mm Faser zu schneiden. Verwenden Sie ein Faserabisolierwerkzeug, um ~ 25 mm Faser zu entfernen und 10 mm unbelichtet zu lassen.
- Bereiten Sie wärmehärtendes Epoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. 1 g Harzpulver in 100 mg Härtermasse auflösen. Befestigen Sie eine abgestumpfte 25-Gauge-Nadel an einer 1-ml-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit Epoxidharz und befestigen Sie eine abgestumpfte 25-Gauge-Nadelspitze.
- Verwenden Sie einen Schraubstock oder eine Klemme, um die Ferrule sicher zu halten, wobei die flache Seite nach oben und die konvexe Seite nach unten zeigt. Geben Sie mit der mit Epoxidharz gefüllten Spritze einen Tropfen Epoxidharz auf die flache Seite der Ferrule und wischen Sie überschüssiges Epoxidharz vorsichtig von den Seiten der Ferrule ab.
- Führen Sie den abgestreiften Teil der Faser durch die Ferrule ein, so dass zusätzliche 5 mm der abgestreiften Faser freigelegt werden. Im Falle von LA-Implantaten wird die Faser 7,9 mm ventral zu Bregma implantiert, so dass die exponierte Länge der nicht abgestreiften Faser ~ 13 mm betragen sollte.
- Härten Sie das Epoxidharz mit einer Heißluftpistole für ca. 30-40 s aus, bis es schwarz / bernsteinfarben wird.
- Ritzen Sie die Faser direkt an der Schnittstelle des konvexen Endes der Ferrule mit einem Diamantmesser ein und klopfen Sie die Faser mit einem Finger vorsichtig ab.
- Polieren Sie das konvexe Ende der Ferrule mit einem Hämostaten, achten Sie darauf, gleichmäßigen Druck auszuüben und machen Sie jeweils 20 kreisförmige Drehungen auf einer Reihe von Polierpapier (von hoher Qualität bis zu niedriger Qualität; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Befestigen Sie die nicht abisolierte Faser mit Klebeband und Rillenabzug auf dem Tisch, so dass zusätzliche 2 mm über die ventrale Koordinate hinaus verbleiben (bei LA-Implantaten beträgt die endgültige Länge der Faser ~ 10 mm). Verwenden Sie einen Hämostaten, um an der Ferrule zu ziehen und die Faser gleichmäßig zu brechen, wo sie geritzt wurde. Achten Sie darauf, die Faser beim Schneiden nicht vollständig zu schneiden, da sonst der Kern der Faser beschädigt wird.
- Bauen Sie Patchkabel, die mit Glasfaserimplantaten kompatibel sind. Es wurden kundenspezifische Patchkabel angeschafft (siehe Materialtabelle). Alternativ können Patchkabel nach zuvor veröffentlichten Protokollen9 aufgebaut werden.
HINWEIS: Der Durchmesser und die NA der Ferrulenfaser und der Patchkabelfaser müssen an der Koppelverbindung übereinstimmen, um einen übermäßigen Lichtverlust zu vermeiden, der dazu führen kann, dass die neuronale Aktivität nicht ausreichend stimuliert wird. - Messen Sie die Lichtleistung durch das Patchkabel und die Lichtwellenleiterimplantate, indem Sie das Patchkabel/die optische Faser an eine geeignete Laserlichtquelle (473 nm, 1 mW Leistung) anschließen und die Leistung mit einem Lichtsensor messen. Eine erfolgreich konstruierte Faser emittiert einen konzentrischen Lichtkreis und hat nicht mehr als 30% Lichtverlust.
2. Intravenöse Katheterisierung von Nagetieren, Virusabgabe und Glasfaserimplantation
- Bereiten Sie das Tier auf die Operation vor.
- Ratten vollständig anästhesieren Sie mit einem Anästhetikum Ihrer Wahl auf der Grundlage institutioneller Richtlinien. Eine Option ist Ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg, i.m.). Stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig betäubt ist, indem Sie prüfen, ob kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
VORSICHT: Ketamin ist eine kontrollierte Substanz, die gemäß den institutionellen Richtlinien gehandhabt werden muss.
HINWEIS: Die intramuskuläre Injektion von Anästhetika wird in dieser Studie verwendet, da sie eine schnellere und zuverlässigere Anästhesieinduktion als die intraperitoneale Injektion bewirkt. Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung und Reaktionsfähigkeit der Ratte und bieten Sie während der gesamten Operation thermische Unterstützung. - Rasieren Sie einen großen Bereich des Rückens der Ratte (oberer Rücken von knapp über den Schulterblättern bis zur Mitte des Rückens) sowie den Bereich des Halses unter dem rechten Vorderbein und die Kopfhaut.
- Legen Sie die Ratte in den Operationsbereich und tragen Sie Puralube (künstliche Tränen) auf die Augen auf. Injizieren Sie ein Körpergewichtsvolumen von Carprofen (Analgetikum) subkutan (s.c.) durch die Haut des oberen Rückens und injizieren Sie dann 5 ml Lactated Ringer's Lösung s.c. durch die Haut des unteren Rückens.
- Desinfizieren Sie alle Operationsstellen, indem Sie ein Stück sterile Gaze mit Betadin benetzen und mit kreisenden Bewegungen über den rasierten Operationsbereich wischen. Dann wiederholen Sie den Vorgang mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen abwechselnden Zyklus dreimal.
- Ratten vollständig anästhesieren Sie mit einem Anästhetikum Ihrer Wahl auf der Grundlage institutioneller Richtlinien. Eine Option ist Ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg, i.m.). Stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig betäubt ist, indem Sie prüfen, ob kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
- Führen Sie eine intravenöse Katheterimplantation gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen 4,10 durch.
HINWEIS: Während dieser Operation wird kein chirurgischer Tuch verwendet, um Reizungen während der Katheterimplantation zu vermeiden. Sterilisieren Sie alle Instrumente und Geräte vor dem Gebrauch. Verwenden Sie sterile Handschuhe und wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine nicht sterile Oberfläche berührt wird. - Unmittelbar nach der Katheterimplantation wird die Ratte in einem stereotaktischen Rahmen gesichert, um AAV-Injektionen durchzuführen.
- Verabreichen Sie eine subkutane (s.c) Injektion von 2% Lidocain (0,2-0,3 ml) als Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut.
HINWEIS: Während der intravenösen Katheterimplantation wird kein Lokalanästhetikum verwendet, um Veränderungen der Operationsergebnisse zu vermeiden. - Schließen Sie eine 26-Gauge-Injektionskanüle aus Edelstahl an eine Hamilton-Spritze an, die mit 1 μl konzentrierter AAV-Lösung gefüllt ist: entweder AAV5-hSyn-tdTomato oder AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
HINWEIS: oChIEF ist eine Variante des blaulichtempfindlichen Opsin-Kanalrhodopsins (ChR2), das auf einen weiten Frequenzbereich 8,11 reagieren kann und daher für die in diesem Protokoll diskutierten niederfrequenten LTD-Experimente, aber auch für hochfrequente LTP-Experimente (hier nicht diskutiert) nützlich ist. Das oChIEF-Konstrukt wurde von Dr. Roger Tsien gespendet und vom Duke Viral Vector Core für die Verpackung und Aufreinigung aufbereitet. Zwischen dem Tag der Injektion und dem Tag der LTD-Induktion sind mindestens 3-4 Wochen erforderlich, um eine optimale Virusexpression in den MGN-Axon-Terminals zu ermöglichen.
VORSICHT: Im Allgemeinen wird AAV als Organismus der Biosicherheitsstufe 1 (BSL-1) mit geringem Risiko einer Selbstinfektion angesehen, es sei denn, es wird ein Helfervirus bei seiner Herstellung verwendet. Seine Verwendung erfordert die IACUC-Zulassung, und es muss jederzeit eine geeignete PSA in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verwendet werden, um unnötige Exposition zu begrenzen. - Machen Sie mit einem Skalpell einen 0,5 mm langen Schnitt von der Vorderseite zur Rückseite des Schädels und entfernen Sie das darüber liegende Gewebe, um die Oberfläche des Schädels freizulegen.
- Nivellieren Sie den Kopf der Ratte in der vorderen / hinteren Achse und null stereotaktische Koordinaten zu Bregma.
- Bohren Sie drei kleine Löcher durch den Schädel mit einem Dremel-Werkzeug, das mit einem kleinen Bohrer ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Schraubendreher, um Edelstahlschrauben (M2x4 965-A2) fest zu montieren.
HINWEIS: Schrauben sind notwendig, um Zahnzement richtig zu binden und stabile, langlebige Kopfkappen zu schaffen. Die Position der Schrauben sollte über die vorder-hintere Achse des Schädels und weg von der AAV-Injektionsstelle verteilt sein. - Bilaterale Löcher für die Injektion von AAV auf der Grundlage der Koordinaten aus dem Ratten-Hirnatlas (Watson und Paxinos)12 für den medialen Teil des medialen Genikulatkerns (MGN) bohren; in mm von bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6,6. Senken Sie die Injektionskanülen langsam ab (4 mm/min), bis sie im MGN positioniert sind. Injizieren Sie konzentrierte AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μl/min.
- Lassen Sie die Injektionskanüle nach Abschluss der Infusionen 5 Minuten an Ort und Stelle, um eine Diffusion von der Kanüle weg zu ermöglichen, und ziehen Sie die Kanüle dann langsam aus dem Gehirn heraus.
- Verabreichen Sie eine subkutane (s.c) Injektion von 2% Lidocain (0,2-0,3 ml) als Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut.
- Unmittelbar nach der Virusinjektion werden weiterhin Glasfasern4,9 implantiert, die auf MGN-LA-Terminals abzielen.
- Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, um bilaterale Löcher für Glasfaserimplantate zu bohren, die auf die laterale Amygdala abzielen (in mm von bregma, AP: -3,0; ML ±5.1).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Ferrule des Glasfaserimplantats zu greifen und an den stereotaktischen Adaptern zu befestigen, so dass sie sicher an Ort und Stelle gehalten werden.
- Senken Sie die Fasern langsam mit einer Geschwindigkeit von 2 mm / min, bis die Spitze der Faser im dorsalen Teil des LA sitzt (DV: -7,9 mm).
- Befestigen Sie den Schädel zuerst mit einer dünnen Schicht Loctite-Sofortkleber, gefolgt von Zahnzement und decken Sie Aderendhülsen mit einem Durchmesser von 1,25 mm und Staubabdeckungen ab.
HINWEIS: Die Wahl des Klebstoffs zur Befestigung der Aderendhülsen am Schädel sollte vom örtlichen oder institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt werden. Loctite wird für diese Studie verwendet, um die Aderendhülsen nach Versuch und Irrtum mit mehreren Klebstoffen zuverlässig am Schädel zu befestigen. Es können jedoch verfügbare Alternativen in Betracht gezogen werden.
- Nach chirurgischen Eingriffen beherbergen Sie Ratten einzeln und bieten freien Zugang zu Futter und Wasser. Bereitstellung einer postoperativen Versorgung im Einklang mit den institutionellen Richtlinien. Spülen Sie die Katheter täglich mit Kochsalzlösung, die Gentamicin (5 mg / ml) und Heparin (30 USP / ml) enthält, um die Durchgängigkeit zu erhalten. Mindestens 5 Tage nach der Operation und 24 Stunden vor Beginn der Verhaltensexperimente beschränken die Nahrungsmittel Ratten auf ~ 90% ihres freien Fütterungsgewichts.
3. Selbstverabreichung von Kokain bei Nagetieren und Aussterben des instrumentellen Hebels
HINWEIS: Alle Verhaltensverfahren werden in Standard-OPANT-Konditionierungskammern durchgeführt, die mit zwei versenkbaren Hebeln an einer Wand, einem Reizlicht über jedem Hebel, einem Tongenerator, einem Hauslicht und einer Infusionspumpe ausgestattet sind.
- Ratten wurden täglich 1 Stunde Kokain (2 mg/ml) Selbstverabreichungstrainings im Rahmen eines FR1-Verstärkungsplans unterzogen.
- Legen Sie die Ratten jeden Tag in die Operationskammer und lassen Sie die Ratten die Presse hebeln. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "aktiven Hebel" (ausgeglichen über linke und rechte Hebel) führt zu einer Kokaininfusion (1,0 mg/kg/Infusion) und einer 10-s-Präsentation eines zusammengesetzten Licht- und Tonsignals. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "inaktiven Hebel" hat keine programmierten Effekte.
- Setzen Sie die Selbstverabreichungsexperimente für mindestens 10 Tage fort und bis die Ratten mindestens 8 Infusionen pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen erfolgreich erhalten haben. Das Nichterreichen der Akquisitionskriterien bis zum 20. Tag führt zum Ausschluss von der Studie.
- Nachdem die Aufnahmekriterien erfolgreich erfüllt wurden, werden die Ratten 6-10 Tage lang einer 1-stündigen instrumentellen Extinktionssitzung unterzogen.
- Platzieren Sie Ratten in operanten Kammern und lassen Sie Ratten frei hebeln. Reaktionen sowohl auf die aktiven als auch auf die inaktiven Hebel haben jedoch keine programmierten Konsequenzen.
- Lassen Sie Ratten das instrumentelle Aussterben täglich fortsetzen, bis durchschnittlich < 25 Hebeldrücke an zwei aufeinanderfolgenden Tagen auftreten.
4. In vivo Optogenetische Induktion von LTD
HINWEIS: Optogenetische Inhibitionsexperimente finden 24 Stunden nach dem letzten Tag der instrumentellen Extinktion statt.
- Verbinden Sie Patchkabel mit einer blauen 473-nm-Laserdiode über ein Drehgelenk, das über einem sauberen Standard-Nagetierkäfig aufgehängt ist, wobei die Abdeckung entfernt wird. Dieser Aufbau ermöglicht es Nagetieren, sich während der optogenetischen Stimulation frei im Käfig zu bewegen.
- Schalten Sie die Laserdiode gemäß Bedienungsanleitung ein und schließen Sie sie an einen Impulsgeber an. Passen Sie die Einstellungen so an, dass die Ratte beim Einschalten 900 2-ms-Lichtimpulse bei 1 Hz empfängt.
VORSICHT: Während des Betriebs des Lasers muss immer ein geeigneter Augenschutz verwendet werden. - Messen Sie die Lichtintensität durch das Patchkabel mit einem Lichtsensor. Stellen Sie die Intensität des Lasers so ein, dass die Lichtleistung durch das Patchkabel ~ 5-7 mW beträgt.
- Legen Sie Ratten in einen sauberen Käfig. Entfernen Sie Staubschutzabdeckungen und Aderendhülsen und legen Sie die Aderendhülsen frei. Verbinden Sie Patchkabel bilateral mit den Glasfaserimplantaten. Lassen Sie Ratten vor der LTD-Induktion 3 Minuten lang die Umgebung erkunden.
- Schalten Sie den Pulsgenerator ein, um die optogenetische Stimulation einzuleiten.
HINWEIS: Obwohl es unwahrscheinlich ist, wird das Experiment sofort beendet, wenn bei der Ratte Nebenwirkungen auf die Stimulation auftreten, und die Ratten werden auf der Grundlage der institutionellen Richtlinien ordnungsgemäß eingeschläfert. - Nach der LTD-Induktion halten Sie die Ratten für 3 Minuten im Käfig und setzen Sie sie dann wieder in ihre Heimatkäfige ein.
- Für Kontrollexperimente verwenden Sie das gleiche Stimulationsverfahren bei Ratten, die das AAV5-tdTomato-Kontrollvirus exprimieren. Für Scheinexperimente befestigen Sie ein Patchkabel an der Glasfaser von Ratten, die das AAV5-oChIEF-Virus exprimieren, aber während einer 15-minütigen Sitzung wird keine Stimulation abgegeben.
5. Testen Sie die Wirkung der optogenetischen Stimulation auf die Cue-induzierte Kokainsuche
- 24 Stunden nach der optogenetischen In-vivo-Stimulation werden die Ratten wieder in operante Konditionierungskammern gebracht. Ratten werden einer 1-stündigen Standard-Cue-induzierten Wiedereinsetzungssitzung unterzogen, um das Kokain-Suchverhalten zu beurteilen.
ANMERKUNG: Während der Reiz-induzierten Wiedereinsetzung führt eine Reaktion auf den aktiven Hebel zu einer 10-s-Präsentation des Kokain-assoziierten Reizes, aber zu keinen Kokain-Infusionen. - Führen Sie mindestens 1 Woche nach dem ersten Test einen zweiten Wiedereinsetzungstest durch, um festzustellen, ob die optogenetische LTD-Induktion zu einer langfristigen Unterdrückung der Kokainsuche führt
6. Färbung, Fluoreszenz und Bildgebung zur histologischen Überprüfung der Virusexpression und der Platzierung von Glasfasern
- Stellen Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 4% Paraformaldehyd (PFA) her. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis. Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der Ratten in der Studie ab (~ 100 ml PBS und 200 ml PFA werden pro Ratte verwendet).
VORSICHT: PFA ist eine giftige Chemikalie und bekanntermaßen krebserregend. Achten Sie darauf, sowohl das Einatmen als auch den Kontakt mit der Haut zu vermeiden. Die Verwendung und Entsorgung sollte im Einklang mit den institutionellen Leitlinien erfolgen, einschließlich der Verwendung geeigneter PSA und einer Dunstabzugshaube. - Stellen Sie die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von 20 ml/min ein. Füllen Sie den Schlauch der Pumpe mit 1x PBS. Befestigen Sie eine abgestumpfte 20-Gauge-Nadel am Ende des Schlauchs.
- Ratten werden mit Natrium-Pentobarbital (100 mg/kg, i.p.) tief betäubt. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch fehlende Reaktion auf Zehenkneifen, bevor Sie fortfahren.
HINWEIS: Natrium-Pentobarbital wird verwendet, da die Perfusion ein terminales Verfahren ist. - Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Bauchhöhle der Ratte unter dem Zwerchfell aufzuschneiden. Schneiden Sie den Brustkorb rostral entlang der seitlichen Ränder durch, um das Herz der Ratte freizulegen. Verwenden Sie Hämostat, um den rostralen Teil des Brustkorbs vom Herzen weg zu klemmen. Schneiden Sie das darüber liegende Fettgewebe ab, das das Herz umgibt.
- Führen Sie die stumpfe Nadel durch den linken Ventrikel und bis in die Aorta ein. Schneiden Sie ein kleines Loch in den rechten Vorhof, um die Lösung abzulassen, wenn sie zum Herzen zurückkehrt.
- Perfundiert Sie jede Ratte mit 1x PBS für 5 min, gefolgt von 4% PFA, pH 7,4 für 10 min.
- Enthaupten Sie die Ratte, extrahieren Sie das Gehirn und fixieren Sie es in 4% PFA für 24 Stunden. Dann übertragen Sie das Gehirn auf 30% ige Saccharoselösung für 2-3 d.
- Schneiden Sie Gehirne bei 50 μm mit einem Kryostaten.
- Montieren Sie alle Scheiben, die den LA oder MGN enthalten, auf Objektträger und Deckglas.
- Bildschnitte mit einem Epifluoreszenzmikroskop zur Überprüfung der AAV-oChIEF-tdTomato-Expression im MGN und seiner Projektionen auf den LA sowie die Platzierung der optischen Faser über dem LA.
7. Perfusion und akute Hirnschnittvorbereitung für elektrophysiologische Experimente
HINWEIS: Elektrophysiologische Experimente werden an einer Teilmenge von Tieren durchgeführt, um den Erfolg von in vivo LTD zu validieren.
- Mit den in den Tabellen 1-3 4,13 aufgeführten Reagenzien werden elektrophysiologische Lösungen hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert aller Lösungen mit HCl auf 7,4 ein und stellen Sie die Osmolarität auf 300-310 mOsm/kgH2Oein. Sättigen Sie alle Lösungen während des Gebrauchs immer mit Carbogen (95% O 2 / 5% CO2).
- Verwenden Sie Isofluran gemäß den lokalen oder institutionellen Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien, betäuben Sie die Ratte in einer geschlossenen Euthanasiekammer. Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie den Zehenklemmreflex anwenden.
- Füllen Sie ein kleines Becherglas mit 50 ml eiskalter Schneidlösung. Füllen Sie den Schlauch der Schlauchpumpe mit Lösung und stellen Sie die Durchflussrate auf 20 ml / min ein. Befestigen Sie eine abgestumpfte 20-Gauge-Nadel am Ende des Schlauchs.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle (siehe Schritte 6.4 und 6.5) und perfundierten Sie die Ratte kurz mit Schneidelösung (maximal 1-2 min).
- Nach der Perfusion sofort Ratte enthaupten. Das Gehirn wird entnommen und für 30 s-1 min in ein kleines Becherglas gegeben, das mit 4 °C Schneidlösung gefüllt ist.
- Übertragen Sie Gehirne mit einem Spatel und fixieren Sie sie schnell in der Kammer eines Vibratoms. Entfernen Sie die Pia mit einer feinen Pinzette. Die Kammer wird mit 4 °C Schneidlösung gefüllt und mit einer Geschwindigkeit von 0,37 mm/s und einer Frequenz von 70 Hz akute koronale Schnitte (250 μm dick) der Amygdala hergestellt.
- Nach der Gewinnung der Scheiben wird jede Schicht in eine mit Schneidlösung gefüllte Haltekammer gegeben und bei 37 °C für 10-12 min inkubiert. Pro Tier können etwa 5-7 Scheiben mit LA erhalten werden.
- Die Scheiben werden in ein Becherglas mit einer Lösung bei Raumtemperatur (RT) gegeben und vor dem Versuch >30 Minuten lang zurückgestellt.
HINWEIS: Die Scheiben bleiben in der Regel gesund, während sie 4-6 Stunden in Haltelösung gehalten werden. Aufgrund der fluoreszierenden Natur des AAV werden die Scheiben bei schlechten Lichtverhältnissen aufbewahrt.
8. Ex vivo Elektrophysiologische Messungen
- Intrazelluläre Lösungen werden unter Verwendung der in den Tabellen 4-5 aufgeführten Reagenzien hergestellt.
HINWEIS: Intrazelluläre Lösungen sollten vor den Experimenten hergestellt werden und können langfristig (3-12 Monate) bei -80 °C oder kurzfristig (1-2 Monate) bei -20 °C gelagert werden. Die Lösungen werden auf 7,3 pH-Wert eingestellt (mit CsOH für Cs-basierte intrazelluläre Lösung und mit KOH für K-basierte intrazelluläre Lösung). Stellen Sie sich auf eine Endosmolarität von 290-300 mOsm/kgH2Oein. - 500 mM Picrotoxin-Stammlösung, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), werden hergestellt.
HINWEIS: Picrotoxinvorräte werden aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Am Tag der Anwendung werden Aliquots aufgetaut und bis zu einer Endkonzentration von 100 μM in die Aufnahmelösung gegeben.
VORSICHT: Picrotoxin ist ein nicht-kompetitiver Antagonist von GABA-A-Rezeptoren, so dass die Infusion von Picrotoxin eine stimulierende Wirkung hat. Es ist stark toxisch durch orale Einnahme oder Hautresorption. Bei der Arbeit mit Picrotoxin muss immer eine geeignete PSA verwendet werden. - Übertragen Sie Schnitte auf ein aufrechtes Mikroskop, das für elektrophysiologische Experimente entwickelt wurde.
- Während der Experimente werden die Perfusionsscheiben kontinuierlich mit einer auf 31-33 °C erhitzten Aufnahmelösung gebadet.
- Vergrößern Sie den LA mit einem 4-fachen Objektiv. Identifizieren Sie die wichtigsten Neuronen anhand der Morphologie mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse.
- Verwenden Sie eine Glaspipette (3-5 MΩ), die entweder mit einer Cs-basierten intrazellulären Lösung (für Spannungsklemmenexperimente) oder einer K-basierten intrazellulären Lösung (für Stromklemmenexperimente) gefüllt ist, um Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen zu erhalten.
- Identifizieren Sie AAV-infizierte MGN-axonale Projektionen unter Fluoreszenz (mit einem RFP-Filter). Stimulieren Sie Projektionen mit einem DPSS-Laser mit blauem Licht (473 nm), der an einen Pulsgenerator angeschlossen ist.
VORSICHT: Um die Laserbelichtung zu begrenzen, wird kollimiertes Laserlicht an einen Fluoreszenzanschluss am Mikroskop gekoppelt und durch das Objektiv auf die Scheibe fokussiert.
HINWEIS: Im Spannungsklemmenmodus werden exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) optisch bei 0,1 Hz evoziert. Neuronen, die Eingaben von AAV-infizierten MGN-Neuronen erhalten, weisen zuverlässige EPSCs auf. - Um ex vivo LTD zu induzieren, wird im Stromklemmmodus eine stabile Baseline der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) für mindestens 10 Minuten aufgezeichnet. Als nächstes liefern Sie 900 2-ms-Impulse von 473-nm-Licht mit einer Frequenz von 1 Hz (Gesamtzeit = 15 Minuten). Dann nehmen Sie EPSPs kontinuierlich bei 0,1 Hz für ≥60 min auf.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste mit der Reihenfolge der Experimente. In Verhaltensexperimenten dient die Anzahl der Kokaininfusionen sowie die Anzahl der Reaktionen auf den aktiven Hebel als Maß für die Intensität des Kokainsuchverhaltens. In den ersten Tagen der Selbstverabreichung von Kokain sollte die Anzahl der aktiven Reaktionen an jedem Erwerbstag allmählich zunehmen, bevor sie sich in der zweiten Woche stabilisiert. Umgekehrt sollten die inaktiven Hebelreaktionen während des gesamten Experiments niedrig bleiben (Abbildung 2A). Am ersten Tag der instrumentellen Extinktion kommt es typischerweise zu einer Zunahme der Anzahl aktiver Hebelreaktionen, da das unerwartete Fehlen von Kokain zu einer Eskalation des Kokainsuchverhaltens führt. Diese Reaktion wird jedoch mit den nachfolgenden Sitzungen allmählich abnehmen, wenn die Ratten die neue Kontingenz erlernen, was zu einer niedrigen und stabilen Anzahl aktiver Hebelreaktionen innerhalb von 6-10 Tagen führt (Abbildung 2B). Ratten, die die spezifizierten Erwerbskriterien weder in der Selbstverabreichungs- noch in der instrumentellen Extinktionsphase des Experiments erreichen, werden aus der Studie entfernt, und die Daten werden nicht in die Endanalyse einbezogen.
Nach der instrumentellen Extinktion stellt die erneute Exposition gegenüber Kokain-assoziierten Signalen das Kokain-Suchverhalten wieder her, was zu einer Zunahme der Anzahl aktiver Hebelreaktionen führt. Dieser Anstieg wurde in beiden Gruppen von Kontrollexperimenten beobachtet: Ratten, denen Viren ohne oChIEF (AAV-Kontrolle) injiziert wurden, und Ratten, die keine Laserstimulation erhielten (SHAM-Kontrolle; Abbildung 3A) Diei-vivo-optogenetische LTD von MGN-LA-Terminals verursachte jedoch eine Verringerung der nachfolgenden Cue-induzierten Kokainsuche. 24 Stunden nach der optogenetischen LTD-Induktion war die Anzahl der aktiven Hebelpressen sowohl im Vergleich zu AAV-Kontrollen als auch zu SHAM-Kontrollen signifikant reduziert (Abbildung 3A). Dieses niedrige Ansprechen wurde während eines anschließenden Wiedereinsetzungstests 7 Tage später (durchgeführt an einer Untergruppe von Ratten) beibehalten (Abbildung 3B), was auf eine anhaltende Verringerung der Cue-motivierten Kokainsuche über mehrere Wiedereinsetzungstests hindeutet.
Ex-vivo-elektrophysiologische Aufzeichnungen von Tieren, die einer optischen Stimulation ausgesetzt waren, bestätigten, dass die Abschwächung bei der Wiedereinsetzung tatsächlich zumindest teilweise auf eine Modulation der synaptischen Plastizität von MGN-LA zurückzuführen war. Dies wurde durch eine Abnahme der optisch evozierten EPSC-Amplitude in LA-Neuronen nach Exposition bei optischer LTD nachgewiesen (Abbildung 4A). Diese Dämpfung der EPSC-Amplitude war spezifisch für Neuronen, die eine optische Stimulation erhielten, da die EPSC-Amplitude bei SHAM-Kontrollen unverändert blieb. Darüber hinaus konnte LTD nicht in Schnitten von Ratten erzeugt werden, die bereits eine optische In-vivo-Stimulation erhalten hatten, wurde aber in Neuronen von Ratten, die einer SHAM-Stimulation unterzogen wurden, zuverlässig evoziert, was durch eine anhaltende Verringerung der EPSP-Anstiegssteigung belegt wurde (Abbildung 4B). Somit scheint die optische Induktion in vivo eine weitere LTD-Induktion in der Scheibe zu verdecken. Während der Aufzeichnung ist es wichtig, den Serienwiderstand über die Dauer der Aufzeichnung zu messen, um sicherzustellen, dass der Zustand des Patches erhalten bleibt. Zellen mit einer Änderung des Serienwiderstands von mehr als 20% werden nicht für die Datenanalyse akzeptiert. Dies ist besonders wichtig für LTD-Experimente, die >60 Minuten dauern, da Änderungen des Serienwiderstands die Rezeptor- und Kanaldynamik beeinflussen können. Um sicherzustellen, dass die Afferenzen, die während der elektrophysiologischen Messungen stimuliert werden, ihren Ursprung im MGN haben, ist es wichtig, Schnitte durch die Ausdehnung des Thalamus zu sammeln. Dies dient als Bestätigung, dass die Zellkörper des MGN tatsächlich AAV fluoreszierend exprimieren. Neben der visuellen Bestätigung ist auch eine funktionale Validierung notwendig. Unter Stromklemmbedingungen feuern AAV-oChIEF-infizierte MGN-Neuronen Aktionspotentiale als Reaktion auf hohe und niedrige Frequenzen der 473-nm-Lichtstimulation ab (Abbildung 4C).
Alle Verhaltensergebnisse wurden als vorläufig betrachtet, bis die Virusexpression und die Glasfaserimplantate histologisch verifiziert waren und die korrekte Platzierung bestätigt wurde (Abbildung 5). Das Fehlen einer AAV-Expression in der MGN oder LA und/oder solche, bei denen die optischen Fasern nicht korrekt in der dorsalen LA positioniert waren, wurden von der experimentellen Analyse ausgeschlossen, können aber in einigen Fällen als negative anatomische Kontrolle einbezogen werden.
Abbildung 1: Zeitleiste des experimentellen Ablaufs. Eine Übersicht über die kritischen Schritte des Protokolls, einschließlich des sequenziellen Zeitverlaufs und der Dauer jeder experimentellen Phase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Erwerb und Aussterben der Kokain-Selbstverabreichung. (A) Die Tiere zeigen eine zunehmende Anzahl von Kokaininfusionen und aktiven Hebelreaktionen während des Erwerbs und ein geringes Maß an inaktiven Hebelreaktionen. (B) Nach einem anfänglichen Schub beim Hebeldrücken am Tag 1 des Aussterbens nehmen die Tiere die Reaktion sowohl auf aktive als auch auf inaktive Hebel auf ein niedriges, stabiles Niveau ab. Fehlerbalken, Mittelwert ±SEM. Diese Zahl wurde von Rich et al. 20194 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: In vivo optogenetische LTD dämpft die Cue-induzierte Wiedereinsetzung. (A) Optical LTD bewirkt eine signifikante Verringerung der aktiven Hebelbetätigungen während der Wiedereinsetzung im Vergleich zu Tieren, die eine Kontrollvirus- oder SHAM-Kontrollstimulation erhalten haben. Zwei-Wege-ANOVA, Haupteffekt der Gruppe (F(2,27) = 7,04, P = 0,004) und einer Tag x Gruppeninteraktion (F(2,27) = 8,08 , P = 0,002); Post-hoc-Analyse von Bonferroni: ***p <.001. (B) 7 Tage später unterzogen sich die Ratten einem zweiten Wiedereinsetzungstest, der eine signifikante Verringerung des aktiven Hebeldrückens bei Tieren zeigte, die zuvor MGN-LA LTD im Vergleich zu SHAM-Kontrollen unterzogen hatten. Zwei-Wege-ANOVA, Haupteffekt der Gruppe (F(1,32) = 5,04, P = 0,032), signifikante Wechselwirkung (F(1,32) = 7,69 , P = 0,009); Post-hoc-Analyse von Bonferroni, **p <.01. Fehlerbalken, Mittelwert ±SEM, n in Balken, Anzahl der Ratten. Diese Zahl wurde von Rich et al. 20194 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Funktionelle Validierung der in vivo niederfrequenten optogenetischen Stimulation (A) In vivo duale Hemisphäre LTD von MGN-LA-Synapsen dämpft die EPSC-Amplitude relativ zu SHAM-Kontrollen (ungepaarter t-Test, t(10) = 2,73, *P = 0,021). Einschub: Durchschnittliche EPSC-Spuren der Probe, hervorgerufen bei E rev-70 mV. Maßstabsbalken: 50 ms, 200 pA, n in Balken, Anzahl der Ratten (Neuronen). (B) In-vivo-optische LTD-Induktion schließt ex vivo LTD. 24 Stunden nach der In-vivo-LTD-Induktion wurden Amygdala-Schnitte hergestellt und das gleiche Stimulationsprotokoll angewendet. Die EPSP-Steigungssteigung an MGN-LA-Terminals wurde durch optische Ex-vivo-Stimulation in Neuronen von Tieren, die in vivo SHAM-Stimulation erhalten hatten, reduziert, nicht jedoch in Neuronen von Tieren, die in vivo optische LTD erhalten hatten. n kursiv gedruckt, Anzahl der Neuronen. (C) Probe von Stromklemmenaufnahmen von AAV-oChIEF-infizierten MGN-Neuronen. Aktionspotentiale wurden durch Blaulichtstimulation (5-100 Hz) hervorgerufen. Maßstabsbalken: 100 ms, 40 mV. Fehlerbalken, Mittelwert ±SEM. Diese Zahl wurde von Rich et al. 20194 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Histologische Verifizierung der Virusexpression und der Platzierung von Glasfasern. (A) Repräsentative mikroskopische Bilder, die die DAPI- und AAV-oChIEF-tdTomato-Expression in LA (links) und MGN (rechts) zeigen. Maßstabsbalken: 2 mm. (B) Schematische Darstellung der Injektion von AAV-oChIEF-tdTomato und der gesamten vorderen und hinteren Ausdehnung der LA (links) und MGN (rechts) sowie der Platzierung von Glasfasern in der LA. Die dunkelrote Schattierung zeigt die Darstellung der kleinsten akzeptablen Virusverbreitung, und die hellrosa Schattierung zeigt die Darstellung der größten akzeptablen Ausbreitung. Blaue Kreise entsprechen der erfolgreichen Platzierung von Glasfasern in beiden Hemisphären. Schwarze Kreise entsprechen der erfolgreichen Platzierung von Glasfasern in nur einer Hemisphäre. Schwarzes "X" entspricht einer erfolglosen Faserplatzierung. Um in die endgültige Analyse einbezogen zu werden, benötigten Ratten eine virale duale Hemisphärenexpression in der LA sowie eine erfolgreiche Platzierung der Fasern. Die Koordinaten sind in mm, posterior von bregma. Diese Zahl wurde von Rich et al. 20194 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-Methyl-D-glukamin | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-Glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thioharnstoff | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 10 | Verwenden Sie 5,0 ml von 2,0 M Brühe | |
| Calciumchlorid | 0.5 | Verwenden Sie 250 μL 2,0 M Material | |
| 1. Für 1 l Lösung Salze in der angegebenen Reihenfolge zu 850 ml ddH2O hinzufügen | |||
| 2. pH-Wert mit konzentriertem HCl bis 7,3-7,4 (NMDG stellt eine basische Lösung her) | |||
| 3. 5-10 min mit Sauerstoff versorgen, dannMgSO4 undCaCl2 hinzufügen | |||
| 4. Bringen Sie die Endvolutme mit ddH2O auf 1 L und überprüfen Sie den endgültigen pH-Wert | |||
| 5. Osmolarität mit Osmometer prüfen und auf 300-310 mOsm/kgH2Oeinstellen | |||
Tabelle 1: Liste der Bestandteile der extrazellulären Schneidlösung. Zutaten und Anweisungen für die Herstellung der NMDG-basierten extrazellulären Schneidlösung.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-Methyl-D-glukamin | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-Glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thioharnstoff | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Verwenden Sie 500 μL 2,0 M Material | |
| Calciumchlorid | 2 | Verwenden Sie 1000 μL von 2,0 M Material | |
| 1. Für 1 l Lösung Salze in der angegebenen Reihenfolge zu 850 ml ddH2O hinzufügen | |||
| 2. pH-Wert mit 1 N HCl oder KOH bis 7,3-7,4 | |||
| 3. 5-10 min mit Sauerstoff versorgen, dannMgSO4 undCaCl2 hinzufügen | |||
| 4. Bringen Sie die Endvolutme mit ddH2O auf 1 L und überprüfen Sie den endgültigen pH-Wert | |||
| 5. Osmolarität mit Osmometer prüfen und auf 300-310 mOsm/kgH2Oeinstellen | |||
Tabelle 2: Liste der sonstigen Bestandteile der extrazellulären Haltelösung. Bestandteile und Anweisungen für die Herstellung der extrazellulären Haltelösung.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-Methyl-D-glukamin | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumphosphat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonat | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-Glukose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Verwenden Sie 500 μL 2,0 M Material | |
| Calciumchlorid | 2 | Verwenden Sie 1000 μL von 2,0 M Material | |
| 1. Für 1 l Lösung Salze in der angegebenen Reihenfolge zu 850 ml ddH2O hinzufügen | |||
| 2. pH-Wert mit 1 N HCl oder KOH bis 7,3-7,4 | |||
| 3. 5-10 min mit Sauerstoff versorgen, dannMgSO4 undCaCl2 hinzufügen | |||
| 4. Bringen Sie die Endvolutme mit ddH2O auf 1 L und überprüfen Sie den endgültigen pH-Wert | |||
| 5. Osmolarität mit Osmometer prüfen und auf 300-310 mOsm/kgH2Oeinstellen | |||
Tabelle 3: Liste der Bestandteile der extrazellulären Aufzeichnungslösung. Bestandteile und Anweisungen für die Herstellung der extrazellulären Aufzeichnungslösung.
| Chemisch | Mm | MW | mg/50 ml |
| Cäsiummethalufonat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cäsiumchlorid | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cäsium-EGTA | 0.4 | 80 μL 250 mM Cs-EGTA zugeben | |
| TEA-Chlorid | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-BR | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-Glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumphosphokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Beginnen Sie mit 40-45 ml HPLC-QualitätH2O | |||
| 2. Halten Sie Phosphokreatin, ATP und GTP immer auf Eis. | |||
| 3. Fügen Sie die Zutaten in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge hinzu | |||
| 4. pH bis 7,3 mit CsOH (ca. 200 μL von 2 M CsOH) | |||
| 5. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen. | |||
| 6. Fügen Sie H2O in HPLC-Qualität zu einer Endosmolarität von etwa 285-290 mOsm/kgH2Ohinzu | |||
| 7. 500-1000 μL Aliquots vorbereiten und bei -80 °C oder -20 °C lagern | |||
Tabelle 4: Liste der sonstigen Bestandteile von Cäsiummethansulfonat Intrazelluläre Elektrophysiologie-Lösung. Bestandteile und Anweisungen für die Herstellung von Cäsiummethansulfonat intrazelluläre Lösung.
| Chemisch | Mm | MW | mg/50 ml |
| Kaliumgluconat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Kaliumchlorid | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Natriumchlorid | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | 80 μL K-BAPTA zugeben | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-Glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumphosphokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Beginnen Sie mit 40-45 ml HPLC-QualitätH2O | |||
| 2. Halten Sie Phosphokreatin, ATP und GTP immer auf Eis. | |||
| 3. Fügen Sie die Zutaten in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge hinzu | |||
| 4. pH-Wert bis 7,3 mit KOH (ca. 200 μL von 2 M KOH) | |||
| 5. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen. | |||
| 6. Fügen Sie H2O in HPLC-Qualität zu einer Endosmolarität von etwa 285-290 mOsm/kgH2Ohinzu | |||
| 7. 500-1000 μL Aliquots vorbereiten und bei -80 °C oder -20 °C lagern | |||
Tabelle 5: Liste der sonstigen Bestandteile von Kaliumgluconat Intrazelluläre Elektrophysiologie-Lösung. Bestandteile und Anweisungen für die Herstellung von Kaliumgluconat-intrazellulärer Lösung.
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Discussion
Wie oben beschrieben, gibt es mehrere kritische Schritte, die wichtig sind, um die richtigen experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Das Protokoll wird wahrscheinlich nur bei Tieren wirksam sein, die eine ordnungsgemäße Selbstverabreichung von Kokain erhalten, und bisher wurde es nur mit den oben genannten Parametern getestet. Es ist möglich, dass die Kokaindosis, das Verstärkungsschema und die Cue-Parameter mit wahrscheinlich geringen Auswirkungen auf die Verhaltensergebnisse modifiziert werden können, mit der Ausnahme, dass ein Verstärkungsschema zweiter Ordnung zu einer Amygdala-unabhängigen Kokainsuche führen kann, die die Wirksamkeit des Verfahrens verringern könnte, obwohl dies nicht direkt getestet wurde14 . Es gibt mehrere Punkte im gesamten Protokoll, an denen die Validierung der ordnungsgemäßen Konstruktion und Funktion von Glasfasern dazu beiträgt, eine erfolgreiche optische Stimulation sicherzustellen. Es ist notwendig, die Aderendhülsen richtig zu ritzen, um den Verlust der Kopfkappe zu verhindern, und die Glasfasern zu polieren und zu testen, dass der Verlust der Lichtleistung durch die Implantate 30% nicht überschreitet9. Darüber hinaus sind die Parameter der Laserstimulation wichtige Überlegungen. Der Laser sollte mit relativ geringer Leistung (5-7 mW) betrieben werden. Eine anhaltende, niederfrequente Stimulation wird verwendet, um LTD zu induzieren, und dies kann funktionell validiert werden, indem die synaptische Stärke von MGN-LA mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen gemessen wird. Schließlich zeigten die Ergebnisse eine signifikante Verringerung der Cue-induzierten Wiedereinsetzung mit einem endgültigen n von 10 Tieren pro Gruppe, jedoch sollten die Experimentatoren damit rechnen, mit einem größeren n zu beginnen, da es wahrscheinlich ist, dass einige Tiere von der endgültigen Analyse ausgeschlossen werden müssen. Es ist von entscheidender Bedeutung, die korrekte anatomische Platzierung und Expression von Viren und optischen Fasern zu überprüfen und nur Daten von Tieren zu verwenden, bei denen die Histologie nachgewiesen wurde.
Trotz des robusten Verhaltenseffekts auf die Kokainsuche, der mit diesem Protokoll beobachtet wurde, gibt es mehrere Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Zum einen wurde die Methode nur an Ratten getestet, die mit einem einzigen audiovisuellen Hinweis in Kombination mit Kokain trainiert wurden. Es ist nicht klar, was in einem Szenario passieren würde, in dem mehrere verschiedene Hinweise konditioniert würden, was eine genauere Darstellung der menschlichen Sucht wäre, wobei mehrere Umweltreize stark mit dem Drogenkonsum in Verbindung gebracht werden15,16,17. Erkenntnisse aus unserem Labor deuten darauf hin, dass die Fähigkeit der optogenetischen LTD, die Drogensuche zu reduzieren, auf eine Abnahme der synaptischen Stärke zurückzuführen ist, die das mit Drogenreizen assoziierte Gedächtnis schwächt. Es ist jedoch nicht klar, inwieweit neutrale oder Erinnerungen, die nicht mit der Selbstverabreichung von Kokain in Verbindung gebracht werden, durch dieses Protokoll beeinflusst werden könnten. Während die Methode nur die synaptische Stärke an einem Schaltkreis beeinflusst, können andere Schaltkreise auch für die Kodierung des Gedächtnisses und/oder das Kokainsuchverhalten wichtig sein18,19,20. Schließlich sollte beachtet werden, dass LTD nur an Synapsen induziert werden kann, bei denen das Virus ausreichend exprimiert wird, wobei wahrscheinlich einige synaptische Verbindungen vom Stimulationsprotokoll unberührt bleiben, was möglicherweise die Auswirkungen auf das Verhalten einschränkt. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass nur kleine Ensembles von Neuronen und Synapsen an der Kodierung eines bestimmten Gedächtnisses beteiligt sind, was die Idee bestätigt, dass die LTD-Induktion innerhalb einer gesamten Gehirnregion nicht die beste Strategie ist, um Verhaltensänderungen herbeizuführen, während andere Ansätze existieren, um spezifisch auf Cue- oder kontextuell aktive Populationen von Neuronen abzuzielen21. 22. Auflage. Trotzdem ist das Protokoll wirksam bei der Abschwächung der durch Hinweise motivierten Drogensuche, wahrscheinlich weil die niederfrequente optische Stimulation die LTD-Induktion auf Synapsen beschränkt, die zuvor durch wiederholte Kokain-Cue-Paarungen potenziert wurden4.
Dieses Protokoll stellt einen signifikanten Fortschritt gegenüber häufiger verwendeten optogenetischen Verhaltensstudien dar, bei denen die Aktivität von Neuronen aktiviert oder gehemmt wird, während das Tier das Verhalten in Echtzeit ausführt 19,23. Stattdessen wird hier die Optogenetik als neuromodulatorisches Werkzeug eingesetzt, um die Kokain-induzierte Plastizität umzukehren. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die optogenetische Manipulation unabhängig vom Verhaltenstest ist, so dass mögliche Störeffekte der Optogenetik (z.B. lokale Schaltkreiseffekte, Refraktärzeit nach Lichtstimulation, antidrome Stimulationseffekte, etc. 24 sollte die Ergebnisse nicht beeinflussen, wodurch das Vertrauen erhöht wird, dass der hypothetische neuronale Mechanismus Verhaltensänderungen vermittelt. Diese Methode kann daher in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt werden, um zu untersuchen, wie die synaptische Plastizität, insbesondere eine Erhöhung der synaptischen Stärke, wie sie bei LTP auftritt, mit Verhaltensänderungen zusammenhängt. Ähnliche Ansätze könnten auch für die klinische Anwendung von neuronalen Stimulationstechnologien relevant sein, bei denen abnormale Verbindungen im Gehirn, die dysfunktionales Verhalten antreiben, herunterreguliert werden können. Da das oChIEF-Viruskonstrukt sowohl auf nieder- als auch auf hochfrequente Stimulationen anspricht, gibt es potenzielle Anwendungen für diese Methoden, die über den Rahmen der beschriebenen Experimente hinausgehen. Zum Beispiel kann die optogenetisch induzierte LTP vorteilhaft sein, um Plastizitätsdefizite umzukehren, die bei einer Vielzahl von neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen auftreten25. Darüber hinaus wurde die bidirektionale Plastizität an MGN-LA-Synapsen auch direkt mit der Regulation von Verhaltensweisen in Verbindung gebracht, die für angstassoziierte Störungen relevant sind8.
Die Modulation der spezifischen neuronalen Schaltkreise, die drogenmotivierte Verhaltensweisen unterstützen, ist für die langfristige Abstinenz vom Drogenkonsum unerlässlich. Dieses Protokoll nutzt neuartige Fortschritte in der In-vivo-Optogenetik, um die Plastizität eines präzisen neuronalen Schaltkreises umzukehren, der durch wiederholte Kokain-Selbstverabreichung in Gegenwart von Umweltreizen verstärkt wird. Das Ergebnis dieser spezifischen Neuromodulation ist eine verringerte Wahrscheinlichkeit, dass nachfolgende Re-Cue-Expositionen eine Kokain-suchende Reaktion auslösen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung zukünftiger Therapien für Substanzstörungen haben kann.
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Disclosures
Nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den USPHS-Zuschüssen K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) und dem Pennsylvania Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
