Summary
Burada açıklanan yöntemler, sıçanlarda davranışsal olarak ilgili bir devrede kokain kaynaklı plastisiteyi optogenetik olarak tersine çevirmek için kullanılan bir prosedürü özetlemektedir. Talamo-amigdala sinapslarının sürekli düşük frekanslı optik stimülasyonu uzun süreli depresyona (LTD) neden olur. Kokain deneyimli sıçanlarda in vivo optogenetik olarak indüklenen LTD, ipucu güdümlü uyuşturucu arayışının daha sonra zayıflamasına neden oldu.
Abstract
Bu protokol, sıçanda sonraki kokain arama davranışlarını azaltmak için talamo-amigdala devrelerinde kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için optogenetik araçları kullanmak için gereken adımları göstermektedir. Araştırmamızda, sıçanlar görsel-işitsel bir ipucu ile eşleştirilmiş intravenöz kokaini kendi kendine uyguladıklarında, talamusun (MGN) medial genikülat çekirdeğinden lateral amigdala'nın (LA) ana nöronlarına yapılan girdilerde oluşan sinapsların, ipucu-kokain ilişkisi öğrenildikçe güçlendiğini bulmuştuk. Bu sinapslarda kokain kaynaklı plastisitenin tersine çevrilmesinin, ipucu motivasyonlu kokain arama davranışını azaltacağını varsaydık. Bu tip nöromodülasyonu in vivo olarak gerçekleştirmek için, MGN-LA sinapslarının gücünü azaltan sinaptik uzun süreli depresyonu (LTD) indüklemek istedik. Bu amaçla, ışık kullanarak beyin devrelerinin nöromodülasyonuna izin veren optogenetiği kullandık. Uyarıcı opsin oChiEF, LA'daki presinaptik MGN terminallerinde, MGN'ye oChiEF içeren bir AAV infüze edilerek eksprese edildi. Optik fiberler daha sonra LA'ya implante edildi ve 473 nm lazer ışığı, LTD'yi indüklemek ve kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için 15 dakika boyunca 1 Hz frekansında darbelendi. Bu manipülasyon, kokain ile ilişkili ipuçlarının uyuşturucu arama eylemlerini tetikleme yeteneğinde uzun süreli bir azalma sağlar.
Introduction
Madde bağımlılığı, ABD'de ve dünya çapında çok ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Onlarca yıllık yoğun araştırmalara rağmen, çok az sayıda etkili terapötik seçenek vardır 1,2. Tedavideki önemli bir gerileme, kronik uyuşturucu kullanımının çevresel ipuçları ile ilacın kendisi arasında uzun süreli ilişkisel anılar oluşturmasıdır. İlaçla ilgili ipuçlarına yeniden maruz kalmak, devam eden uyuşturucu kullanımını ve nüksetmeyi motive eden fizyolojik ve davranışsal tepkileri yönlendirir3. Yeni bir terapötik strateji, ilaç-ipucu ilişkilerinin düzenlenmesinde yer alan devreleri manipüle etmeyi amaçlayan hafıza tabanlı tedavileri yürürlüğe koymaktır. Son zamanlarda, lateral amigdaladaki (LA) sinapsların, özellikle talamusun medial genikülat çekirdeğinden (MGN) kaynaklananların, tekrarlanan ipucu ile ilişkili kokain kendi kendine yönetimi ile güçlendirildiği ve bu potansiyelin kokain arama davranışını destekleyebileceği gözlenmiştir 4,5. Bu nedenle, MGN-LA sinapslarında plastisiteyi tersine çevirerek ipucu kaynaklı eski haline getirmenin zayıflatılabileceği önerilmiştir.
Belirli bir beyin devresinin sinaptik plastisitesini tam olarak hedefleme yeteneği, alan için büyük bir zorluk olmuştur. Geleneksel farmakolojik araçlar, nüks davranışlarını azaltmada bazı başarılara sahiptir, ancak bireysel sinapsları manipüle edememe ile sınırlıdır. Bununla birlikte, in vivo optogenetiğin son zamanlardaki gelişimi, bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve nöral yolları zamansal ve mekansal hassasiyetle kontrol etmek için gereken araçları sağlamıştır 6,7,8. Belirli bir beyin devresinde ışığa duyarlı opsinleri ifade ederek, lazer ışığı daha sonra devreyi aktive etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir. Frekansa bağlı optik stimülasyon, davranan bir hayvanda devrenin sinaptik plastisitesini spesifik olarak manipüle etmek için kullanılabilir.
Bu makale, in vivo optogenetik kullanarak davranışsal olarak ilgili MGN-LA devresini manipüle etmek için alınan prosedürü özetlemektedir. İlk olarak, uyarıcı opsin oChIEF MGN'de eksprese edildi ve optik fiberler LA'ya iki taraflı olarak implante edildi. Hayvanlar daha sonra MGN-LA yolunu güçlendiren ipucuna bağımlı bir şekilde kokaini kendi kendine yönetmek için eğitildi. Daha sonra, 473 nm lazer ışığı ile sürekli, düşük frekanslı stimülasyon, devreye özgü LTD üretmek için kullanıldı. kokain kullanımının neden olduğu plastisiteyi tersine çevirmek, uyuşturucu arama davranışı ile ilişkili eylemleri tetiklemek için ipuçlarının kapasitesinde uzun süreli bir azalma yarattı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından ortaya konan kılavuzlarla tutarlıydı ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler, varışta 275-325 g ağırlığındaki yetişkin, naif Sprague-Dawley sıçanları kullanılarak gerçekleştirildi.
1. Optik Fiber İmplantların ve Patch Kabloların Yapımı
- Daha önce yayınlanmış protokolleri izleyerek optik fiber implantlar hazırlayın9. Bu protokolde açıklanan deneylerde 200 μm çekirdek fiber (0.5 NA) ve Ø1.25 mm Çok Modlu LC/PC Seramik yüksük, Ø230 μm delik boyutu kullanılmıştır.
- Bir yüksüğün alt üçte birini (yüksüğün düz ucuna en yakın) puanlamak için bir Dremel aracı kullanın. Yüksüklerin puanlanması, diş çimentosuna bağlı kalmalarına yardımcı olur ve tüm deney boyunca güvende kalma olasılıklarını artırır.
- ~ 35 mm elyaf kesmek için tel kesiciler kullanın. ~ 25 mm elyafı sıyırmak için fiber sıyırma aletini kullanın ve 10 mm'yi maruz kalmadan bırakın.
- Üreticinin talimatlarına göre ısıl kürlenebilir epoksi hazırlayın. 1 g reçine tozunu 100 mg sertleştirici bileşiğinde çözün. 1 mL'lik bir şırıngaya körelmiş 25 gauge iğne takın. Şırıngayı epoksi ile doldurun ve körelmiş 25 gauge iğne ucu takın.
- Yüksüğü düz tarafı yukarıya, dışbükey tarafı aşağıya bakacak şekilde güvenli bir şekilde tutmak için bir mengene veya kelepçe kullanın. Epoksi dolu şırınga ile, yüksüğün kenarlarından fazla epoksiyi silmek için dikkatli davranarak yüksüğün düz tarafına bir damla epoksi ekleyin.
- Elyafın soyulmuş kısmını, fazladan 5 mm soyulmuş lifin açığa çıkmasına izin veren yüksüğün içinden yerleştirin. LA implantları durumunda, lif bregmaya 7.9 mm ventral olarak implante edilecektir, bu nedenle soyulmamış lifin maruz kalan uzunluğu ~ 13 mm olmalıdır.
- Epoksiyi siyah / kehribar rengine dönene kadar yaklaşık 30-40 s ısı tabancasıyla kürleyin.
- Fiberi doğrudan yüksüğün dışbükey ucunun arayüzünde elmas bıçakla puanlayın ve elyafa hafifçe dokunmak için parmağınızı kullanın.
- Yüksüğün dışbükey ucunu bir hemostatla tutarak, eşit basınç uyguladığınızdan emin olarak ve bir dizi parlatma kağıdı üzerinde her biri 20 dairesel dönüş yaparak (yüksek dereceden düşük dereceye; 5, 3, 1, 0.3 μm) cilalayın.
- Şeritsiz elyafı bant kullanarak masaya sabitleyin ve soyulmuş lifi puanlayın, ventral koordinatın ötesinde fazladan 2 mm bırakın (LA implantları için, lifin son uzunluğu ~ 10 mm'dir). Yüksüğü çekmek için bir hemostat kullanın ve lifi puanlandığı yerde eşit şekilde kırın. Puanlama sırasında lifi tamamen kesmemeye dikkat edin, aksi takdirde lifin çekirdeği zarar görür.
- Optik fiber implantlarla uyumlu yamalı kablolar oluşturun. Özel tasarım yamalı kablolar satın alınmıştır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Alternatif olarak, yama kabloları daha önce yayınlanmış protokoller9 izlenerek oluşturulabilir.
NOT: Yüksük lifi ve yama kablosu fiberinin çapı ve NA'sı, aşırı ışık kaybını önlemek için bağlantı noktasında eşleşmelidir, bu da nöral aktivitenin yeterince uyarılmamasına neden olabilir. - Yama kablosu/optik fiberi uygun bir lazer ışık kaynağına (473 nm, 1 mW çıkış) takarak ve bir ışık sensörü ile çıkışı ölçerek patch kablo ve optik fiber implantlar aracılığıyla ışık çıkışını ölçün. Başarılı bir şekilde inşa edilmiş bir fiber, eşmerkezli bir ışık çemberi yayar ve% 30'dan fazla ışık kaybına sahip olmaz.
2. Kemirgen İntravenöz Kateterizasyon, Virüs Dağıtımı ve Optik Fiber İmplantasyonu
- Hayvanı ameliyat için hazırlayın.
- Kurumsal kılavuzlara dayanarak tercih edilen anestezi ile sıçanları tamamen anestezi altına alın. Bir seçenek ketamin hidroklorür (87.5-100 mg / kg, i.m.) ve ksilazin hidroklorürdür (5 mg / kg, i.m.). Ayak parmağı sıkışma refleksinin eksikliğini kontrol ederek sıçanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
DİKKAT: Ketamin, kurumsal yönergelere göre ele alınması gereken kontrollü bir maddedir.
NOT: Bu çalışmada intramüsküler anestezik enjeksiyonu, intraperitoneal enjeksiyondan daha hızlı ve güvenilir bir anestezi indüksiyonu sağladığı için kullanılmıştır. Sıçanın solunumunu ve duyarlılığını sürekli izleyin ve ameliyat boyunca termal destek sağlayın. - Sıçanın sırtının geniş bir alanını (üst sırttan omuz bıçaklarının hemen üstünden sırtın ortasına kadar) ve ayrıca sağ ön ayağın altındaki boynun alanını ve kafa derisini tıraş edin.
- Sıçanı cerrahi bölgeye yerleştirin ve gözlere puralube (yapay gözyaşı) uygulayın. Üst sırtın derisinden deri altından (s.c.) bir vücut ağırlığı karprofen (analjezik) hacmi enjekte edin, ardından alt sırtın derisinden 5 mL Laktasyonlu Ringer çözeltisi sc'yi enjekte edin.
- Bir parça steril gazlı bezi betadin ile ıslatarak ve dairesel bir hareket kullanarak tıraş edilmiş cerrahi alanı silerek tüm cerrahi bölgeleri sterilize edin. Ardından% 70 etanol ile işlemi tekrarlayın. Bu alternatif döngüyü üç kez tekrarlayın.
- Kurumsal kılavuzlara dayanarak tercih edilen anestezi ile sıçanları tamamen anestezi altına alın. Bir seçenek ketamin hidroklorür (87.5-100 mg / kg, i.m.) ve ksilazin hidroklorürdür (5 mg / kg, i.m.). Ayak parmağı sıkışma refleksinin eksikliğini kontrol ederek sıçanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- İntravenöz kateter implantasyonunu daha önce yayınlanmış protokollere göreyapın 4,10.
NOT: Kateter implantasyonu sırasında tahrişi önlemek için bu ameliyat sırasında cerrahi bir örtü kullanılmaz. Kullanmadan önce tüm aletleri ve ekipmanları sterilize edin. Steril eldivenler kullanın ve steril olmayan herhangi bir yüzeye temas edilirse eldivenleri değiştirin. - Kateter implantasyonlarının hemen ardından, AAV enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için sıçanı stereotaksik bir çerçevede sabitleyin.
- Lokal anestezik olarak kafa derisine% 2 lidokain (0.2-0.3 mL) subkutan (s.c) enjeksiyonu yapın.
NOT: İntravenöz kateter implantasyonu sırasında cerrahi sonuçlarda değişiklik olmasını önlemek için lokal anestezik kullanılmaz. - 26 gauge paslanmaz çelik enjeksiyon kanülünü, 1 μL konsantre AAV çözeltisi ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngasına bağlayın: AAV5-hSyn-tdDomates veya AAV5-hSyn-oChIEF-tdDomates
NOT: oChIEF, çok çeşitli frekanslara 8,11 yanıt verebilen mavi ışığa duyarlı opsin channelrhodopsin (ChR2) bir varyantıdır ve bu nedenle bu protokolde tartışılan düşük frekanslı LTD deneyleri için değil, aynı zamanda yüksek frekanslı LTP deneyleri için de faydalıdır (burada tartışılmamıştır). oChIEF yapısı Dr. Roger Tsien tarafından bağışlandı ve Duke Viral Vector Core tarafından paketleme ve saflaştırma için işlendi. MGN akson terminallerinde optimal virüs ekspresyonuna izin vermek için enjeksiyon günü ile LTD indüksiyonu günü arasında en az 3-4 hafta gereklidir.
DİKKAT: Genel olarak, AAV, üretiminde yardımcı bir virüs kullanılmadığı sürece kendi kendine enfeksiyon riski düşük olan bir Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) organizması olarak kabul edilir. Kullanımı IACUC onayını gerektirir ve gereksiz maruziyeti sınırlamak için kurumsal yönergelere uygun olarak her zaman uygun KKD kullanılmalıdır. - Bir neşter kullanarak, kafatasının önünden arkasına 0,5 mm'lik bir kesi yapın ve kafatasının yüzeyini ortaya çıkarmak için üstteki dokuyu çıkarın.
- Sıçanın kafasını anterior / posterior eksende düzleştirin ve bregma'ya sıfır stereotaksik koordinat verin.
- Küçük bir matkap ucuyla donatılmış bir Dremel aleti kullanarak kafatasından üç küçük delik açın. Paslanmaz çelik vidaları (M2x4 965-A2) yerine sıkıca monte etmek için tornavida kullanın.
NOT: Vidalar, diş çimentosunun uygun şekilde bağlanması ve sağlam, uzun ömürlü kafa kapaklarının oluşturulması için gereklidir. Vidaların pozisyonu, kafatasının ön-arka ekseni boyunca ve AAV enjeksiyon bölgesinden uzağa yayılmalıdır. - Medial genikülat çekirdeğin (MGN) medial kısmı için Sıçan Beyin Atlası'ndan (Watson ve Paxinos)12 koordinatlarına dayanarak AAV enjeksiyonu için iki taraflı delikler açın; bregma'dan mm cinsinden, AP: -5.4; ML: ±3.0; DV: -6.6. MGN'ye yerleştirilene kadar enjeksiyon kanüllerini (4 mm / dak) yavaşça indirin. Konsantre AAV çözeltisini 0,1 μL/dak oranında enjekte edin.
- İnfüzyonlar tamamlandıktan sonra enjeksiyon kanülünü kanülden uzağa difüzyona izin vermek için 5 dakika boyunca yerinde bırakın ve ardından kanülü beyinden yavaşça çekin.
- Lokal anestezik olarak kafa derisine% 2 lidokain (0.2-0.3 mL) subkutan (s.c) enjeksiyonu yapın.
- Virüs enjeksiyonlarının hemen ardından, MGN-LA terminallerini hedefleyen optik fiberler 4,9'u implante etmeye devam edin.
- Lateral amigdala'yı hedefleyen optik fiber implantlar için iki taraflı delikler açmak için bir Dremel aleti kullanın (bregma'dan mm cinsinden, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Optik fiber implantın yüksüğünü tutmak için forseps kullanın ve stereotaksik adaptörlere sabitleyin, böylece güvenli bir şekilde yerinde tutulurlar.
- Liflerin ucu LA'nın dorsal kısmına oturana kadar lifleri 2 mm / dak hızında yavaşça indirin (DV: -7.9 mm).
- Yüksükleri önce ince bir Loctite anlık yapıştırıcı tabakası kullanarak kafatasına sabitleyin, ardından diş çimentosu ve 1.25 mm çapında yüksük manşonları ve toz kapakları ile örtü yüksüklerini örtün.
NOT: Yüksükleri kafatasına sabitlemek için yapıştırıcı seçimi, yerel veya kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmalıdır. Loctite, bu çalışmada, birden fazla yapıştırıcı ile deneme yanılma sonrası yüksükleri kafatasına güvenilir bir şekilde sabitlemek için kullanılır; ancak, mevcut alternatifler düşünülebilir.
- Cerrahi prosedürleri takiben, fareleri ayrı ayrı barındırır ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar. Kurumsal yönergelere uygun postoperatif bakım sağlayın. Açıklığı korumak için kateterleri günlük olarak gentamisin (5 mg / mL) ve heparin (30 USP / mL) içeren salin ile yıkayın. Ameliyattan en az 5 gün sonra ve davranışsal deneylerin başlamasından 24 saat önce, yiyecekler sıçanları serbest beslenme ağırlıklarının ~% 90'ı ile sınırlar.
3. Kemirgen Kokain Öz Yönetimi ve Enstrümantal Kol Neslinin Tükenmesi
NOT: Tüm davranışsal prosedürler, bir duvarda iki geri çekilebilir kol, her kolun üzerinde bir uyaran ışığı, bir ton jeneratörü, bir ev ışığı ve bir infüzyon pompası ile donatılmış standart çalışma koşullandırma odalarında gerçekleştirilir.
- Sıçanları, FR1 takviye programı kapsamında günlük 1 saatlik kokain (2 mg / mL) kendi kendini yönetme eğitim oturumlarına maruz bırakın.
- Sıçanları her gün operant odasına yerleştirin ve sıçanların kol basmasına izin verin. Belirlenen 'aktif kol' üzerindeki bir baskı (sol ve sağ kollar arasında dengelenmiş), bir kokain infüzyonu (1.0 mg / kg / infüzyon) ve bir bileşik ışık ve ton ipucunun 10 s sunumu ile sonuçlanır. Belirlenen 'etkin olmayan kol' üzerindeki bir presin programlanmış bir etkisi yoktur.
- En az 10 d boyunca kendi kendine yönetim deneylerine devam edin ve sıçanlar art arda 3 gün boyunca en az 8 infüzyon / gün başarılı bir şekilde kazanana kadar. 20. güne kadar edinme kriterlerine ulaşılamaması çalışmadan dışlanma ile sonuçlanır.
- Edinme kriterleri başarıyla karşılandıktan sonra, sıçanları 6-10 d için 1 saatlik enstrümantal yok olma seanslarına tabi tutar.
- Sıçanları operant odalara yerleştirin ve sıçanların serbestçe basmalarına izin verin. Bununla birlikte, hem aktif hem de aktif olmayan kaldıraçlardaki tepkilerin programlanmış sonuçları yoktur.
- Sıçanlar, art arda iki gün boyunca ortalama < 25 kol presi gerçekleşene kadar günlük olarak enstrümantal yok olmaya devam etmelerini sağlayın.
4. LTD'nin İnvivo Optogenetik İndüksiyonu
NOT: Optogenetik inhibisyon deneyleri, enstrümantal yok oluşun son gününden 24 saat sonra gerçekleşir.
- Yama kablolarını, kapağı çıkarılmış temiz, standart bir kemirgen muhafaza kafesinin üzerine asılı bir döner mafsal aracılığıyla 473 nm mavi lazer diyota bağlayın. Bu kurulum, kemirgenlerin optogenetik stimülasyon sırasında kafesin etrafında serbestçe hareket etmelerini sağlar.
- Lazer diyotu kullanım talimatlarına göre açın ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. Ayarları, sıçan açıldığında 1 Hz'de 900 2 ms ışık darbesi alacak şekilde ayarlayın.
DİKKAT: Lazeri kullanırken her zaman uygun göz koruması kullanılmalıdır. - Bir ışık sensörü kullanarak yama kablosundan ışık yoğunluğunu ölçün. Lazerin yoğunluğunu, yama kablosundan ışık çıkışı ~ 5-7 mW olacak şekilde ayarlayın.
- Sıçanları temiz bir muhafaza kafesine yerleştirin. Toz kapaklarını ve yüksük manşonlarını çıkarın ve yüksükleri açığa çıkarın. Yama kablolarını optik fiber implantlara iki taraflı olarak bağlayın. Sıçanların LTD indüksiyonundan önce 3 dakika boyunca çevreyi keşfetmelerine izin verin.
- Optogenetik stimülasyonu başlatmak için nabız jeneratörünü açın.
NOT: Her ne kadar olası olmasa da, sıçan stimülasyona karşı herhangi bir olumsuz reaksiyon yaşarsa, deney derhal sonlandırılır ve sıçanlar kurumsal yönergelere dayanarak uygun şekilde ötenazi yapılır. - LTD indüksiyonunu takiben, fareleri kafeste 3 dakika tutun ve ardından ev kafeslerine geri yerleştirin.
- Kontrol deneyleri için, AAV5-tdDomates kontrol virüsünü eksprese eden sıçanlarda aynı stimülasyon prosedürünü kullanın. Sahte deneyler için, AAV5-oChIEF virüsünü ifade eden sıçanların optik fiberine bir yama kablosu takın, ancak 15 dakikalık bir seans sırasında hiçbir stimülasyon yapılmaz.
5. Optogenetik Stimülasyonun İşaret Kaynaklı Kokain Arayışı Üzerindeki Etkisini Test Edin
- İn vivo optogenetik stimülasyonlardan 24 saat sonra, fareleri operant koşullandırma odalarına geri yerleştirin. Sıçanlar, kokain arama davranışını değerlendirmek için 1 saatlik standart ipucu kaynaklı eski haline getirme oturumuna tabi tutulur.
NOT: İşaret kaynaklı eski haline getirme sırasında, aktif koldaki bir yanıt, kokainle ilişkili ipucunun 10 saniyelik bir sunumunu verir, ancak kokain infüzyonu yoktur. - Optogenetik LTD indüksiyonunun kokain arayışının uzun süreli baskılanmasıyla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için ilk testten en az 1 hafta sonra ikinci bir eski haline getirme testi yapın
6. Viral ekspresyonun histolojik doğrulaması ve optik fiber yerleşimi için boyama, floresan ve görüntüleme
- 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 4 paraformaldehit (PFA) yapın. Her iki çözümü de buz üzerinde saklayın. Toplam hacim, çalışmadaki sıçan sayısına bağlı olacaktır (sıçan başına ~ 100 mL PBS ve 200 mL PFA kullanılacaktır).
DİKKAT: PFA toksik bir kimyasaldır ve kanserojen olarak bilinir. Solunmasını ve ciltle temasını önlemek için uygun özen gösterin. Kullanımı ve bertarafı, uygun KKD ve kimyasal akış başlığı kullanımı da dahil olmak üzere kurumsal yönergelere uygun olmalıdır. - Peristaltik pompayı 20 mL/dak debide kurun. Pompanın borusunu 1x PBS ile doldurun. Borunun ucuna körelmiş 20 gauge iğne takın.
- Sıçanları sodyum pentobarbital (100 mg / kg, i.p.) ile derinlemesine uyuşturun. Daha fazla ilerlemeden önce ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek anestezi derinliğini onaylayın.
NOT: Perfüzyon bir terminal prosedürü olduğu için sodyum pentobarbital kullanılır. - Sıçanın karın boşluğunu diyaframın altında kesmek için cerrahi makas kullanın. Sıçanın kalbini açığa çıkarmak için göğüs kafesini yanal kenarlar boyunca rostral olarak kesin. Göğüs kafesinin rostral kısmını kalpten uzağa sıkıştırmak için hemostat kullanın. Kalbi çevreleyen üstteki yağ dokusunu kesin.
- Körelmiş iğneyi sol ventrikülden ve yukarı doğru aortun içine yerleştirin. Kalbe geri dönerken çözeltiyi boşaltmak için sağ atriyumda küçük bir delik açın.
- Her sıçanı 5 dakika boyunca 1x PBS ile perfüze edin, ardından 10 dakika boyunca% 4 PFA, pH 7.4 ile.
- Sıçanın kafasını kes, beyni çıkar ve 24 saat boyunca% 4 PFA'ya sabitle. Daha sonra beyni 2-3 d için% 30 sakkaroz çözeltisine aktarın.
- Bir kriyostat kullanarak 50 μm'de kesit beyinleri.
- LA veya MGN içeren tüm dilimleri cam slaytlara ve kapak kaymasına monte edin.
- MGN'deki AAV-oChIEF-tdDomates ekspresyonunu ve LA'ya projeksiyonlarını doğrulamak için bir epifloresan mikroskop kullanarak görüntü dilimleri ve ayrıca optik fiberin LA'nın üzerine yerleştirilmesi.
7. Elektrofizyoloji Deneyleri için Perfüzyon ve Akut Beyin Dilimi Hazırlığı
NOT: Elektrofizyolojik deneyler, in vivo LTD'nin başarısını doğrulamak için hayvanların bir alt kümesi üzerinde gerçekleştirilir.
- Tablo 1-3 4,13'te listelenen reaktifleri kullanarak elektrofizyoloji çözeltileri hazırlayın. HCl ile tüm çözeltilerin pH'ını 7,4'e ayarlayın ve ozmolariteyi 300-310 mOsm/kgH2O'ya ayarlayın. Kullanım sırasında tüm çözeltileri her zaman karbojenle (%95 O 2/%5 CO2) doyurun.
- Yerel veya kurumsal hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına göre izofluran kullanarak, sıçanı kapalı bir ötenazi odasında derinlemesine anestezi altına alın. Hayvanın ayak parmağını sıkıştırma refleksi ile tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın.
- Küçük bir beheri 50 mL buz gibi soğuk kesme çözeltisi ile doldurun. Peristaltik pompanın borusunu çözelti ile doldurun ve akış hızını 20 mL / dak'ya ayarlayın. Borunun ucuna körelmiş 20 gauge iğne takın.
- Karın boşluğunu açın (Bkz. adım 6.4 ve 6.5) ve sıçanı kesme çözeltisi ile kısaca perfüze edin (maksimum 1-2 dakika).
- Perfüzyonu takiben, hemen sıçanın kafasını keser. Beyni çıkarın ve 30 s-1 dakika boyunca 4 °C kesme çözeltisi ile doldurulmuş küçük bir beherin içine yerleştirin.
- Beyinleri bir spatula ile aktarın ve hızlı bir şekilde bir vibratomun odasına sabitleyin. İnce forseps kullanarak piayı çıkarın. Odayı 4 °C kesme çözeltisi ile doldurun ve 0,37 mm / sn hızında ve 70 Hz frekansında amigdala'nın akut koronal dilimlerini (250 μm kalınlığında) hazırlayın.
- Dilimler elde edilirken, her birini kesme çözeltisi ile doldurulmuş bir tutma odasına yerleştirin ve 10-12 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hayvan başına LA içeren yaklaşık 5-7 dilim elde edilebilir.
- Dilimleri oda sıcaklığı (RT) tutma çözeltisinin bir kabına aktarın ve denemeden önce >30 dakika boyunca iyileşmeye izin verin.
NOT: Dilimler genellikle 4-6 saat boyunca tutma solüsyonunda tutulurken sağlıklı kalır. AAV'nin floresan doğası nedeniyle, dilimler düşük ışık koşullarında tutulur.
8. Ex vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar
- Tablo 4-5'te listelenen reaktifleri kullanarak hücre içi çözeltiler hazırlayın.
NOT: Hücre içi çözeltiler deneylerden önce yapılmalı ve -80 °C'de uzun süreli (3-12 ay) veya -20 °C'de kısa süreli (1-2 ay) saklanabilir. Çözeltiler pH 7.3'e ayarlanır (Cs bazlı hücre içi çözelti için CsOH ve K bazlı hücre içi çözelti için KOH ile). Son ozmolaritesi 290-300 mOsm/kg H2O olarak ayarlayın. - Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 500 mM pikrotoksin stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: Picrotoxin stokları aliquoted edilir ve -20 °C'de saklanır. Kullanım günü, alikotlar çözülür ve 100 μM'lik son konsantrasyona kayıt çözeltisine eklenir.
DİKKAT: Pikrotoksin, GABA A reseptörlerinin rekabetçi olmayan bir antagonistidir, bu nedenle pikrotoksin infüzyonu uyarıcıbir etkiye sahiptir. Oral alım veya cilt emilimi ile ciddi şekilde toksiktir. Pikrotoksin ile çalışırken her zaman uygun KKD kullanılmalıdır. - Dilimleri elektrofizyoloji deneyleri için tasarlanmış dik bir mikroskopa aktarın.
- Deneyler sırasında, 31-33 ° C'ye ısıtılan kayıt çözeltisi ile sürekli banyo perfüze dilimleri.
- 4x hedefi kullanarak LA'yı büyütün. Ana nöronları 40x su daldırma lensi ile morfoloji ile tanımlayın.
- Tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını elde etmek için Cs tabanlı hücre içi çözelti (voltaj kelepçesi deneyleri için) veya K tabanlı hücre içi çözelti (mevcut kelepçe deneyleri için) ile doldurulmuş bir cam pipet (3-5 MΩ) kullanın.
- Floresan altında AAV ile enfekte MGN aksonal projeksiyonlarını tanımlayın (bir RFP filtresi kullanarak). Bir darbe jeneratörüne bağlı mavi ışık (473 nm) DPSS lazer kullanarak projeksiyonları uyarın.
DİKKAT: Lazere maruz kalmayı sınırlamak için, kolimasyonlu lazer ışığı mikroskop üzerindeki bir floresan portuna bağlanır ve objektif yoluyla dilime odaklanır.
NOT: Voltaj kelepçesi modunda, uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC'ler) optik olarak 0.1 Hz'de uyarılır. - Ex vivo LTD'yi indüklemek için, mevcut kelepçe modunda, en az 10 dakika boyunca uyarıcı postsinaptik potansiyellerin (EPSP'ler) sabit bir taban çizgisini kaydedin. Ardından, 1 Hz frekansında 900 adet 2 ms'lik 473 nm ışık darbesi gönderin (toplam süre = 15 dakika). Ardından EPSP'leri ≥60 dakika boyunca 0,1 Hz'de sürekli olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerin sırasını özetleyen bir zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Davranışsal deneyler boyunca, kokain infüzyonlarının sayısı ve aktif kolda verilen tepkilerin sayısı, kokain arama davranışının yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder. Kokainin kendi kendini yönetmesinin ilk günlerinde, ikinci hafta boyunca istikrara kavuşmadan önce, aktif yanıtların sayısı her edinim günü boyunca kademeli olarak artmalıdır. Tersine, inaktif kol yanıtları deneyin tamamı boyunca düşük kalmalıdır (Şekil 2A). Araçsal yok oluşun ilk gününde, kokainin beklenmedik yokluğu kokain arama davranışının artmasına neden olduğundan, aktif kol tepkilerinin sayısında tipik olarak bir artış vardır. Bununla birlikte, sıçanlar yeni olasılıkları öğrendikçe bu yanıt sonraki seanslarla kademeli olarak azalacak ve 6-10 d içinde düşük ve kararlı sayıda aktif kol yanıtı ile sonuçlanacaktır (Şekil 2B). Deneyin kendi kendini yönetme veya araçsal yok olma aşamalarında belirtilen edinim kriterlerine ulaşamayan sıçanlar çalışmadan çıkarılır ve veriler son analize dahil edilmez.
Araçsal yok oluşun ardından, kokainle ilişkili ipuçlarına yeniden maruz kalmak, kokain arama davranışını eski haline getirir ve aktif kol yanıtlarının sayısında bir artışa neden olur. Bu artış her iki kontrol deneyi grubunda da gözlenmiştir: oChIEF (AAV kontrolü) olmayan virüs enjekte edilen sıçanlar ve lazer stimülasyonu almayan sıçanlar (SHAM kontrolü; Şekil 3A) Bununla birlikte, MGN-LA terminallerinin in vivo optogenetik LTD'si, sonraki ipucu kaynaklı kokain arayışında bir azalmaya neden olmuştur. Optogenetik LTD indüksiyonunu 24 saat sonra, aktif kollu preslerin sayısı hem AAV kontrollerine hem de SHAM kontrollerine göre anlamlı olarak azalmıştır (Şekil 3A). Bu düşük yanıt seviyesi, 7 gün sonra (bir sıçan alt kümesinde yürütülen) sonraki bir eski haline getirme testi sırasında korunmuştur (Şekil 3B), bu da birden fazla eski haline getirme testinde ipucu motivasyonlu kokain arayışında kalıcı bir azalma olduğunu göstermektedir.
Optik stimülasyona maruz kalan hayvanlardan elde edilen Ex vivo elektrofizyolojik kayıtlar, eski haline getirmedeki zayıflamanın gerçekten de en azından kısmen MGN-LA sinaptik plastisitesinin modülasyonundan kaynaklandığını doğruladı. Bu, optik LTD'ye maruz kaldıktan sonra LA nöronlarında optik olarak uyarılmış EPSC genliğinde bir azalma ile kanıtlanmıştır (Şekil 4A). EPSC genliğindeki bu zayıflama, optik stimülasyon alan nöronlara özgüydü, çünkü EPSC genliği SHAM kontrollerinde değişmeden kaldı. Ek olarak, LTD, zaten in vivo optik stimülasyon almış olan sıçanlardan dilimler halinde üretilemedi, ancak EPSP yükselme eğiminde sürekli bir azalma ile kanıtlandığı gibi, SHAM stimülasyonu geçiren sıçanlardan gelen nöronlarda güvenilir bir şekilde uyarıldı (Şekil 4B). Bu nedenle, in vivo optik stimülasyon, dilim halinde daha fazla LTD indüksiyonunu engelliyor gibi görünmektedir. Kayıt sırasında, yamanın sağlığının korunmasını sağlamak için kayıt süresi boyunca seri direnci ölçmek önemlidir. Seri direncinde %20'nin üzerinde değişiklik olan hücreler veri analizi için kabul edilmez. Bu, özellikle >60 dakika süren LTD deneyleri için önemlidir, çünkü seri direncindeki değişiklikler reseptör ve kanal dinamiklerini etkileyebilir. Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında uyarılan afferentlerin MGN'den kaynaklandığından emin olmak için, talamusun boyutundan dilimler toplamak önemlidir. Bu, MGN'nin hücre gövdelerinin gerçekten floresan olarak AAV'yi eksprese ettiğini doğrulamak için hizmet eder. Görsel onaya ek olarak, fonksiyonel doğrulama da gereklidir. Mevcut kelepçe koşulları altında, AAV-oChIEF-enfekte MGN nöronları, 473-nm-ışık stimülasyonunun hem yüksek hem de düşük frekanslarına yanıt olarak aksiyon potansiyellerini ateşler (Şekil 4C).
Viral ekspresyon ve optik fiber implantlar histolojik olarak doğrulanana ve uygun yerleştirme doğrulanana kadar tüm davranışsal sonuçlar geçici olarak kabul edildi (Şekil 5). MGN veya LA'da AAV ekspresyonu eksikliği ve / veya optik fiberlerin dorsal LA içinde doğru şekilde yerleştirilmediği durumlar deneysel analizin dışında bırakıldı, ancak bazı durumlarda negatif anatomik kontrol olarak dahil edilebilir.
Şekil 1: Deneysel prosedürün zaman çizelgesi. Sıralı zaman seyri ve her deneysel aşamanın süresi de dahil olmak üzere protokolün kritik adımlarının bir taslağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kokainin kendi kendini yönetmesinin edinilmesi ve yok edilmesi. (A) Hayvanlar, edinim boyunca artan sayıda kokain infüzyonu ve aktif kol tepkisi ve düşük düzeyde aktif olmayan kol yanıtları sergiler. (B) Neslinin tükenmesinin 1. gününde kol baskısındaki ilk artışın ardından, hayvanlar hem aktif hem de aktif olmayan kollarda tepki vermeyi düşük, istikrarlı bir seviyeye düşürür. Hata çubukları, ortalama ±SEM. Bu rakam Rich et al. 20194'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: In vivo optogenetik LTD, ipucu kaynaklı eski haline getirmeyi zayıflatır. (A) Optik LTD, kontrol virüsü veya SHAM kontrol stimülasyonu alan hayvanlara göre eski haline getirme sırasında aktif kol preslerinde önemli bir azalmaya neden olur. İki yönlü ANOVA, grubun ana etkisi (F(2,27) = 7.04, P = .004) ve bir gün x grup etkileşimi (F(2,27) = 8.08, P = .002 ); Bonferroni'nin post hoc analizi: ***p < .001. (B) 7 gün sonra, sıçanlar ikinci bir eski haline getirme testine tabi tutuldu ve SHAM kontrollerine göre daha önce MGN-LA LTD uygulanan hayvanlarda aktif kol preslemesinde önemli bir azalma olduğunu ortaya koydu. İki yönlü ANOVA, grubun ana etkisi (F(1,32) = 5.04, P = .032), anlamlı etkileşim (F(1,32) = 7.69, P = .009); Bonferroni'nin post hoc analizi, **p < .01. Hata çubukları, ortalama ±SEM, çubuklarda n, sıçan sayısı. Bu rakam Rich et al. 20194'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İn vivo düşük frekanslı optogenetik stimülasyonun fonksiyonel validasyonu (A ) MGN-LA sinapslarının in vivo dual hemisfer LTD'si, SHAM-kontrollerine göre EPSC genliğini zayıflatır (Eşlenmemiş t-testi, t(10) = 2.73, *P = .021). Giriş: E rev-70 mV'de uyarılan örnek ortalama EPSC izleri. Ölçek çubukları: 50 ms, 200 pA, çubuklarda n, sıçan sayısı (nöronlar). (B) In vivo optik LTD indüksiyon blokajları ex vivo LTD. İn vivo LTD indüksiyonundan 24 saat sonra, amigdala dilimleri hazırlanmış ve aynı stimülasyon protokolü uygulanmıştır. MGN-LA terminallerindeki EPSP yükselme eğimi, in vivo SHAM stimülasyonu almış hayvanlardan gelen nöronlarda ex vivo optik stimülasyon ile azaltıldı, ancak in vivo optik LTD almış hayvanlardan alınan nöronlarda değil, italik olarak, nöron sayısı. (C) AAV-oChIEF ile enfekte MGN nöronlarından örnek akım kelepçesi kayıtları. Aksiyon potansiyelleri mavi ışık stimülasyonu (5-100 Hz) ile ortaya çıkarıldı. Ölçek çubukları: 100 ms, 40 mV. Hata çubukları, ortalama ±SEM. Bu rakam Rich et al. 20194'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Viral ekspresyon ve optik fiber yerleşimlerinin histolojik olarak doğrulanması. (A) LA (Sol) ve MGN'de (Sağda) DAPI ve AAV-oChIEF-tdDomates ekspresyonunu gösteren temsili mikroskobik görüntüler. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) AAV-oChIEF-tdDomates enjeksiyonunu ve LA (Sol) ve MGN'nin (Sağ) anterior-posterior derecesi boyunca enjeksiyonunu ve LA'daki optik fiber yerleşimlerini gösteren şema. Koyu kırmızı gölgelendirme kabul edilebilir en küçük virüs yayılımının temsilini, açık pembe gölgelendirme ise kabul edilebilir en büyük yayılmanın temsilini gösterir. Mavi daireler, her iki yarımkürede de başarılı optik fiber yerleşimine karşılık gelir. Siyah daireler, yalnızca bir yarımkürede başarılı optik fiber yerleşimine karşılık gelir. Siyah "X", başarısız lif yerleşimine karşılık gelir. Son analize dahil edilmek üzere, sıçanlar LA'da viral çift yarımküre ekspresyonuna ve liflerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesine ihtiyaç duyuyorlardı. Koordinatlar mm cinsinden, bregma'nın arkasındadır. Bu rakam Rich et al. 20194'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kimyasal | Mm | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glukamin | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Potasyum Klorür | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodyum Fosfat Monobazik | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodyum Bikarbonat | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glikoz | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Sodyum Askorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiyoüre | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Sodyum Piruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnezyum Sülfat | 10 | 5,0 mL'lik 2,0 M Stok kullanın | |
| Kalsiyum Klorür | 0.5 | 250 μL 2,0 M Stok kullanın | |
| 1. 1 L çözelti için, 850 mL ddH2O'ya listelenen sırayla tuzlar ekleyin | |||
| 2. 7.3-7.4'e kadar konsantre HCl ile pH (NMDG temel bir çözelti yapar) | |||
| 3. 5-10 dakika oksijenat alın, ardından MgSO4 ve CaCl2 ekleyin | |||
| 4. Son volutme'u ddH2O ile 1 L'ye getirin ve nihai pH'ı iki kez kontrol edin | |||
| 5. Ozmolariteyi ozmometre ile kontrol edin ve 300-310 mOsm / kg H2O'ya ayarlayın | |||
Tablo 1: Hücre Dışı Kesme Çözeltisi için Bileşenlerin Listesi. NMDG bazlı hücre dışı kesme çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve talimatlar.
| Kimyasal | Mm | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glukamin | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Potasyum Klorür | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodyum Fosfat Monobazik | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodyum Bikarbonat | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glikoz | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Sodyum Askorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiyoüre | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Sodyum Piruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnezyum Sülfat | 1 | 500 μL 2,0 M Stok kullanın | |
| Kalsiyum Klorür | 2 | 1000 μL 2,0 M Stok kullanın | |
| 1. 1 L çözelti için, 850 mL ddH2O'ya listelenen sırayla tuzlar ekleyin | |||
| 2. 1 N HCl veya KOH ila 7.3-7.4 ile pH | |||
| 3. 5-10 dakika oksijenat alın, ardından MgSO4 ve CaCl2 ekleyin | |||
| 4. Son volutme'u ddH2O ile 1 L'ye getirin ve nihai pH'ı iki kez kontrol edin | |||
| 5. Ozmolariteyi ozmometre ile kontrol edin ve 300-310 mOsm / kg H2O'ya ayarlayın | |||
Tablo 2: Hücre Dışı Tutma Çözeltisi için Bileşenlerin Listesi. Hücre dışı tutma çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve talimatlar.
| Kimyasal | Mm | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glukamin | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Potasyum Klorür | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodyum Fosfat Monobazik | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodyum Bikarbonat | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glikoz | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnezyum Sülfat | 1 | 500 μL 2,0 M Stok kullanın | |
| Kalsiyum Klorür | 2 | 1000 μL 2,0 M Stok kullanın | |
| 1. 1 L çözelti için, 850 mL ddH2O'ya listelenen sırayla tuzlar ekleyin | |||
| 2. 1 N HCl veya KOH ila 7.3-7.4 ile pH | |||
| 3. 5-10 dakika oksijenat alın, ardından MgSO4 ve CaCl2 ekleyin | |||
| 4. Son volutme'u ddH2O ile 1 L'ye getirin ve nihai pH'ı iki kez kontrol edin | |||
| 5. Ozmolariteyi ozmometre ile kontrol edin ve 300-310 mOsm / kg H2O'ya ayarlayın | |||
Tablo 3: Hücre Dışı Kayıt Çözümü için Bileşenlerin Listesi. Hücre dışı kayıt çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve talimatlar.
| Kimyasal | Mm | MW | mg/50 mL |
| Sezyum Metansülfonat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Sezyum Klorür | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Sezyum-EGTA | 0.4 | 80 μL 250 mM Cs-EGTA ekleyin | |
| TEA-Klorür | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutatyon | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Sodyum Fosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. 40-45 mL HPLC sınıfı H2O ile başlayın | |||
| 2. Fosfokreatin, ATP ve GTP'yi her zaman buz üzerinde tutun. | |||
| 3. Malzemeleri tabloda listelenen sırayla ekleyin | |||
| 4. CsOH ile pH ila 7.3 (2 M CsOH'nin yaklaşık 200 μL'si) | |||
| 5. Ozmolariteyi kontrol etmek için ozmometre kullanın. | |||
| 6. HPLC sınıfı H2O'yu yaklaşık 285-290 mOsm /kg H 2O'luk son ozmolariteye ekleyin | |||
| 7. 500-1000 μL alikotlar hazırlayın ve -80 °C veya -20 °C'de saklayın | |||
Tablo 4: Sezyum Metansülfonat Hücre İçi Elektrofizyoloji Solüsyonu için Bileşenlerin Listesi. Sezyum metansülfonat hücre içi çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve talimatlar.
| Kimyasal | Mm | MW | mg/50 mL |
| Potasyum Glukonat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Potasyum Klorür | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Sodyum Klorür | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | 80 μL K-BAPTA ekleyin | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutatyon | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Sodyum Fosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. 40-45 mL HPLC sınıfı H2O ile başlayın | |||
| 2. Fosfokreatin, ATP ve GTP'yi her zaman buz üzerinde tutun. | |||
| 3. Malzemeleri tabloda listelenen sırayla ekleyin | |||
| 4. KOH ile pH ila 7.3 (2 M KOH'un yaklaşık 200 μL'si) | |||
| 5. Ozmolariteyi kontrol etmek için ozmometre kullanın. | |||
| 6. HPLC sınıfı H2O'yu yaklaşık 285-290 mOsm /kg H 2O'luk son ozmolariteye ekleyin | |||
| 7. 500-1000 μL alikotlar hazırlayın ve -80 °C veya -20 °C'de saklayın | |||
Tablo 5: Potasyum Glukonat Hücre İçi Elektrofizyoloji Çözeltisi için Bileşenlerin Listesi. Potasyum glukonat hücre içi çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve talimatlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklandığı gibi, uygun deneysel sonuçlara ulaşmak için önemli olan birkaç kritik adım vardır. Protokol muhtemelen yalnızca kokainin kendi kendini yönetmesini uygun şekilde elde eden hayvanlarda etkili olacaktır ve bugüne kadar yalnızca yukarıda belirtilen parametreler kullanılarak test edilmiştir. Kokain dozu, takviye programı ve işaret parametrelerinin, davranışsal sonuçlar üzerinde muhtemelen çok az etkisi olacak şekilde değiştirilmesi mümkündür, ancak ikinci dereceden bir takviye programı, prosedürün etkinliğini azaltabilecek amigdaladan bağımsız kokain arayışına yol açabilir, ancak bu doğrudan test edilmemiştir14 . Protokol boyunca, optik fiberlerin uygun şekilde yapılandırılmasının ve işleyişinin doğrulanmasının, başarılı optik stimülasyonun sağlanmasına yardımcı olacağı birkaç nokta vardır. Kafa kapağından kaynaklanan kaybı önlemek ve optik fiberleri parlatmak için yüksükleri uygun şekilde puanlamak ve implantlardan ışık çıkışı kaybının %30'u geçmediğini test etmek gerekir9. Ek olarak, lazer stimülasyon parametreleri önemli hususlardır. Lazer nispeten düşük güçte (5-7 mW) çalıştırılmalıdır. LTD'yi indüklemek için sürekli, düşük frekanslı stimülasyon kullanılır ve bu, MGN-LA sinaptik gücünü elektrofizyolojik kayıtlarla ölçerek işlevsel olarak doğrulanabilir. Son olarak, sonuçlar, grup başına 10 hayvanın son n'si ile ipucu kaynaklı eski haline getirmede önemli bir azalma olduğunu göstermiştir, ancak deneyciler, bazı hayvanların son analizden dışlanması gerekeceğinden, daha büyük bir n ile başlamayı beklemelidir. Virüs ve optik fiberlerin uygun anatomik yerleşimini ve ekspresyonunu doğrulamak ve yalnızca histolojinin doğrulandığı hayvanlardan gelen verileri kullanmak çok önemlidir.
Bu protokolle gözlemlenen kokain arama üzerindeki güçlü davranışsal etkiye rağmen, dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. Birincisi, yöntem sadece kokain ile eşleştirilmiş tek bir görsel-işitsel ipucu ile eğitilmiş sıçanlarda test edilmiştir. Birden fazla farklı ipucunun şartlandırıldığı bir senaryoda ne olacağı açık değildir, bu da insan bağımlılığının daha doğru bir temsili olacaktır, bu sayede çoklu çevresel uyaranlar uyuşturucu kullanımı ile yüksek oranda ilişkilendirilir15,16,17. Laboratuvarımızdan elde edilen kanıtlar, optogenetik LTD'nin ilaç aramayı azaltma yeteneğinin, ilaçla ilişkili anıları zayıflatan sinaptik güçteki azalmadan kaynaklandığını göstermektedir. Bununla birlikte, nötr veya kokain öz yönetimi ile ilişkili olmayan anıların bu protokolden ne ölçüde etkilenebileceği açık değildir. Ayrıca, yöntem sadece bir devredeki sinaptik gücü etkilerken, diğer devreler de hafızayı kodlamak ve / veya kokain arama davranışını sürmek için önemli olabilir18,19,20. Son olarak, LTD'nin yalnızca virüsün yeterince ifade edildiği sinapslarda indüklenebileceği, muhtemelen davranışsal etkiyi potansiyel olarak sınırlayan stimülasyon protokolünden etkilenmeyen bazı sinaptik bağlantılar bıraktığı belirtilmelidir. Dahası, kanıtlar, belirli bir hafızanın kodlanmasında yalnızca küçük nöron ve sinaps topluluklarının yer aldığını, tüm beyin bölgesindeki LTD indüksiyonunun davranış değişikliğini etkilemek için en iyi strateji olmadığı fikrine güven verdiğini, oysa diğer yaklaşımların özellikle işaret veya bağlamsal olarak aktif nöron popülasyonlarını hedeflemek için var olduğunu göstermektedir21, 22. Buna rağmen, protokol ipucu güdümlü ilaç arayışını zayıflatmada etkilidir, çünkü düşük frekanslı optik stimülasyon, LTD indüksiyonunu daha önce tekrarlanan kokain-işaret eşleşmeleri ile güçlendirilmiş olan sinapslara sınırlar4.
Bu protokol, hayvan davranışı gerçek zamanlı olarak gerçekleştirirken nöronların aktivitesinin aktive edildiği veya inhibe edildiği daha yaygın olarak kullanılan optogenetik davranışsal çalışmalara önemli bir ilerleme sağlar19,23. Bunun yerine, optogenetik burada kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için nöromodülatör bir araç olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemin bir avantajı, optogenetik manipülasyonun davranışsal testten bağımsız olmasıdır, böylece optogenetiğin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri (örneğin, lokal devre etkileri, ışık stimülasyonundan sonraki refrakter dönem, antidromik stimülasyon etkileri, vb.). 24 Sonuçları etkilememeli, böylece varsayımsal sinirsel mekanizmanın davranıştaki değişikliklere aracılık ettiğine dair güveni arttırmalıdır. Bu nedenle bu yöntem, sinaptik plastisitenin, özellikle LTP'de meydana gelen sinaptik mukavemetteki artışın, davranıştaki değişikliklerle nasıl ilişkili olduğunu araştıran bir dizi uygulamada kullanılabilir. Benzer yaklaşımlar, beyindeki işlevsiz davranışı yönlendiren anormal bağlantıların aşağı regüle edilebileceği nöral stimülasyon teknolojilerinin klinik uygulamasıyla da ilgili olabilir. Benzer şekilde, oChIEF viral yapısı hem düşük hem de yüksek frekanslı stimülasyonlara yanıt verdiğinden, bu yöntemlere açıklanan deneylerin kapsamı dışında potansiyel uygulamalar vardır. Örneğin, optogenetik olarak indüklenen LTP, çok çeşitli nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklarda bulunan plastisitedeki eksiklikleri tersine çevirmek için yararlı olabilir25. Ayrıca, MGN-LA sinapslarındaki çift yönlü plastisite, korkuyla ilişkili bozukluklarla ilgili davranışların düzenlenmesiyle de doğrudan bağlantılıdır8.
İlaç güdümlü davranışları destekleyen spesifik nöral devrelerin modüle edilmesi, uyuşturucu kullanımından uzun süreli uzak durma sağlamak için gereklidir. Bu protokol, çevresel ipuçlarının varlığında tekrarlanan kokain kendi kendine yönetimi ile güçlendirilen hassas bir nöral devrenin plastisitesini tersine çevirmek için in vivo optogenetikteki yeni ilerlemeleri kullanır. Bu spesifik nöromodülasyonun sonucu, madde kullanım bozuklukları için gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilecek kokain arayan bir yanıtı tetiklemek için sonraki ipucu yeniden maruziyetlerinin olasılığının azalmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, USPHS'nin K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ve Pennsylvania Sağlık Bakanlığı'nın desteğini kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
