Summary
この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。
Abstract
転移は複雑なプロセスであり、 インビトロ アッセイによって不完全にしかモデル化されない障壁を克服するために細胞を必要とする。メラノーマ転移における新規プレーヤーを同定するための、堅牢で再現性のある in vivo モデルおよび標準化された方法を使用して、体系的なワークフローが確立されました。このアプローチにより、特定の実験段階でのデータ推論が可能になり、転移における遺伝子の役割を正確に特徴付けることができます。モデルは、遺伝子組み換えメラノーマ細胞を心臓内、皮内、または皮下注射を介してマウスに導入し、続いて連続 インビボ イメージングでモニタリングすることによって確立される。予め確立されたエンドポイントに到達すると、原発性腫瘍および/または転移を有する器官が採取され、様々な分析のために処理される。腫瘍細胞を選別し、単一細胞RNAシーケンシングを含むいくつかの「オミックス」プラットフォームのいずれかに供することができる。臓器は、転移の全体的な負担を定量化し、その特定の解剖学的位置をマッピングするために、イメージングおよび免疫組織病理学的分析を受ける。生着、モニタリング、組織採取、処理、および分析のための標準化されたプロトコルを含むこの最適化されたパイプラインは、患者由来の短期培養物および様々な固形がんタイプの確立されたヒトおよびマウス細胞株に採用することができる。
Introduction
転移性黒色腫に関連する高い死亡率と、世界中で黒色腫の発生率の増加1(2025年までに推定7.86%増加)が相まって、新しい治療アプローチが求められています。標的発見の進歩は、非常に複雑なプロセスである転移の再現可能なモデルにかかっています。転移性カスケードのステップ全体を通して、メラノーマ細胞は、免疫系の回避および遠隔組織のコロニー形成を達成するために無数の障壁を克服しなければならない2。メラノーマ細胞の回復力と適応性は、その高い遺伝子変異負荷3および神経堤起源を含む多数の要因から生じ、重要な表現型可塑性3,4,5を付与する。各ステップにおいて、転写プログラムは、転移メラノーマ細胞が、免疫系6、細胞外環境7,8、およびそれらが接触する物理的障壁9の細胞アーキテクチャを含む微小環境とのクロストークからの手がかりに基づいて、ある状態から別の状態に切り替えることを可能にする。例えば、メラノーマ細胞は、重要な免疫プライミング腫瘍分泌因子6の発現をダウンレギュレートすることによって免疫監視を逃れる。
研究は、メラノーマ細胞がケモカインおよびサイトカインを分泌して、転移のために遠くの「標的」器官をプライミングする「転移前ニッチ」を記述している10。この新知見は、転移性黒色腫細胞の臓器指向性と、それらが遠隔組織にアクセスするためにとる解剖学的経路について重要な疑問を提起する。血管内投与後、メラノーマ細胞はリンパ管(リンパ性スプレッド)および血管(血行性スプレッド)を介して転移することが知られている2,11。ほとんどの患者は限局性疾患を呈するが、症例のごく一部は遠隔転移性疾患を呈し、リンパ管播種(陰性リンパ節関与)を示さず11、黒色腫の代替転移経路の存在を示唆している。
転移部位に定着すると、メラノーマ細胞はエピジェネティックおよび代謝適応を受ける12,13。新しいコンパートメントにアクセスして侵入するために、メラノーマ細胞はプロテアーゼ14および細胞骨格修飾11,15を採用し、それによって新しい場所を横断し、成長することができる。メラノーマ細胞を標的にすることの難しさは、そのような適応の複雑さと数にある。したがって、フィールドはできるだけ多くのステップと適応を実験的に再現する努力をする必要があります。オルガノイドおよび3D培養物16,17などのインビトロアッセイにおける多数の進歩にもかかわらず、これらのモデルは、インビボ転移カスケードを不完全にしか再現しない。
マウスモデルは、再現性、技術的実現可能性、およびヒト疾患のシミュレーションのバランスをとることによって価値を示してきた。患者由来の異種移植片または短期培養物から免疫不全またはヒト化マウスに血管内、同時および異所性に移植されたメラノーマ細胞は、転移性メラノーマにおける標的発見のバックボーンを表す。しかし、これらのシステムはしばしば転移に対する重要な生物学的制約、すなわち免疫系を欠いている。この制約を有する同系黒色腫転移モデルは、この分野では比較的希少である。これらの系は、免疫担当マウスにおいて開発された、B16−F1018、YUMMファミリーの細胞株19、SM120、D4M3 21、RIM322、またはより最近では、RMS23およびM1(Mel114433)、M3(HCmel1274)、M4(B2905)24メラノーマ細胞株を含む、メラノーマ進行における宿主免疫応答の複雑な役割の調査を容易にする。
ここでは、メラノーマ転移標的同定のためのパイプラインが提示される。メラノーマ患者コホートから生成される「オミック」データセットがますます増えるにつれて、最も臨床的に有望な研究はビッグデータ統合から生じる研究であり、細心の注意を払った機能的および機械的な尋問につながると仮定します25,26,27,28。転移過程における潜在的な標的を研究するためにマウスモデルを使用することにより、生体内特異的事象および組織相互作用を説明することができ、したがって臨床翻訳の確率を高めることができる。転移性負荷を定量化するための複数の方法が概説され、任意の所与の実験の結果に関する補完的なデータを提供する。様々な臓器の腫瘍から単一細胞単離のためのプロトコルは、単一細胞またはバルクRNAシーケンシングに先行する可能性のある転移細胞における遺伝子発現の偏りのない特性評価を支援するために記載されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注:以下のプロトコルに関連する動物手順は、ニューヨーク大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての手続きは、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって承認された施設で行われます。 図1は 、一般的な実験的アプローチを示しています。
1. 患者由来メラノーマ短期培養物(STC)
- 1mLの完全RPMI(10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1x MEM非必須アミノ酸溶液、およびペニシリン(100IU/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したRPMI 1640)を含む60mmペトリ皿に組織を置く。
注:腫瘍細胞の比率を高めるには、必要に応じて、滅菌手術器具を使用して、顕微鏡下で、ペトリ皿内の腫瘍を取り囲む組織を解剖および除去する。 - 滅菌したカミソリの刃を使って新鮮な組織を1〜2mmの立方体に細かく切ります。4 mLの完全RPMIおよびピペットを10 mL血清学的ピペットでプレートの内容物を5〜10回上下に加える。
- 細胞懸濁液を15mLポリプロピレン円錐管に移し、細胞をスピンダウン(180×g、4°Cで5分間)する。上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの新鮮な培地に再懸濁し、懸濁液を25cm2組織培養フラスコに移した。
- 組織断片が底に付着するのを助けるために、37°C、5%CO2の組織培養インキュベーターで20°-30°の角度で傾けたフラスコを20 分間セットする。
- 培地が組織を覆うようにフラスコを平らに置き、培養の状態を毎日確認する。セルが90〜100%のコンフルエントに達したら細胞を分割します。短期培養物を「低い」継代数に維持する。
注:STCは細胞単離および培養の約2ヶ月後に確立されますが、実際のタイムラインはサンプルと腫瘍タイプによって異なります。10〜14継代後、細胞株は純度100%に達し、メラノーマ細胞29のみを含む。継代数閾値は、細胞形態の変化、倍加時間、および インビボでの挙動を観察することによって経験的に決定される。親腫瘍の不均一性および他の特徴を維持するために、細胞を1:5を超えて分割しないでください。 - STCの樹立時に、そしてその後のステップで説明するように動物に注射される任意の細胞株モデルを用いて、レポーターを用いて細胞を形質導入する。
注:例えば、蛍光タグ(例えば、赤色蛍光タンパク質(RFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP))は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)による腫瘍細胞の エクスビボ 免疫蛍光イメージングおよびソーティングを可能にする。ルシフェラーゼは、 インビボ 生物発光イメージングを可能にする、実験進行をモニタリングするための有用なツールである(セクション4)。
図1:記載されたワークフローを示す概略図は、患者データ統合からマウスからのインビボデータの生成および分析までである。略語: LOF = 機能の喪失;GOF = 関数のゲイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 異種移植移植
注:ここで説明する実験手順は、適応免疫系および自然免疫系が損なわれたマウス、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスで実施される。または、T細胞欠損無胸腺/ヌード(NU/J)マウスのような獲得免疫のみを欠いているマウスにおいて。動物は男性の性別、8〜10週齢です。雌は、腫瘍細胞の心臓内注射時に生殖腺転移の発生率が高いことが多く、生存率を低下させる。
- 皮下注射および皮内注射の場合は、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に懸濁した細胞の一部と、解凍した細胞外マトリックス基質(EMS)1部とを混合して1:1細胞懸濁液を調製し、4°Cで氷上に保持する。 血管内(心臓内、頸動脈内、後眼窩、尾静脈、または脾臓)注射の場合、DPBSのみに細胞を懸濁させる。
注:皮内注射の適切な容量は、できるだけ低く抑える必要があります(30 μL)。皮下注射の場合、注射量は最大150μL、血管内注射では最大250μL(動物の体重に基づく)までです。注射された量およびスリップチップ内の死量および針のそれを説明するために使用されるシリンジに基づいて、注射液の10〜30%の余分な量を最終的な細胞懸濁液に加える(例えば、30G、25mm針の100μLの死容量を有する1mLツベルクリンジ)。 - 使用中の細胞株の挙動および インビボでの腫瘍進行のタイムラインを特徴付けるためにパイロットを実施する。皮内注射の場合は、まず1,000~50,000細胞/30 μLを注射します。皮下注射の場合は、まず10,000個から2個×106 個/150 μLまで注射します。血管内(心臓内、頸動脈内、眼窩後、脾臓)注射の場合は、まず50,000細胞/150 μLを注射します。
注:血管内注射は、循環器系に空気を導入するか、または小血管を閉塞する過剰な数の細胞を使用することによって、動物を塞栓事象の素因とする。凝集を避けるために細胞懸濁液をよく混合する。細胞懸濁液を装填する前にシリンジをプライミングする。シリンジ内の気泡を取り除きます。細胞懸濁液/注射器を、装填および注入時間まで氷上に保管する。 - 吸入による麻酔を投与する。酸素レベルレギュレーターを1~2 L/minに設定します。誘導のために2.5-5%、維持のために1.5-3%に設定されたイソフルラン気化器で誘導チャンバーに動物を置きます。
注:麻酔導入期に動物の呼吸と心拍数を監視します。動物を放置 しないでください 。同時に複数の動物を監視し ないでください 。麻酔 の量を動物の 体重に合わせる。 - 動物を誘導室から鼻錐形に移動します。処置中の角膜乾燥を防ぐために、動物の目に滅菌ワセリン眼軟膏を塗布する。
- まっすぐなカミソリの刃を30°の角度で傾けて処置部位を剃ります。70%イソプロピルアルコール綿棒で処置領域の皮膚をきれいにする。さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。
- 皮内注射の場合は、バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持します。
- 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
- 針刺しの軌道に対して皮膚を後方につかんで引っ込めます。鋭角に保持された長さ6mmの31Gインスリン注射針を使用して、ベベルを上に向けて皮膚を優しく穿刺する。
- 針の先端で圧力解放を感じてください。皮内区画内にとどまり、皮膚の深さ全体を表皮下腔に通過しないように静かに進めてください。 重要:皮下腔に滑り込んだ場合は、針を外し、注射領域を変更して針を再挿入します。ドーム状の疣贅が観察されるまで、細胞懸濁液の全容量(30μL)をゆっくりと注入する。
注: 注入量が少ないと、スキン層の解剖が少なくなり、アーキテクチャの歪みが少なくなります。 - 針を入れたままにして、5まで数えます。
注:EMSは体温で粘性になり、針の穿刺傷を通る逆流を避けるのに役立ちます。 - 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
注:このプロトコルに記載されているすべての手順の間、動物を継続的に監視してください。動物を放置したり、複数の動物を同時に監視したり しないでください 。 - 腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態の進行を、動物が体重を減らし始めた後、動物が体重を減らし始めた後、獣医スタッフと共同で毎日毎日監視します。これらのモニタリングセッション中:動物の体重を量り、体重減少を監視するためのチャートをプロットし、腫瘍潰瘍化、神経学的、自発運動、および/または行動徴候(嗜眠、グルーミングの欠如、食物または水分摂取量の減少)の徴候をチェックする。
注:進行した疾患(20%以上の体重減少、<2の体調スコア、極端に低下した活動レベル、麻痺、または発作)の徴候を観察した直後に動物を安楽死させる。施設のIACUCによって承認された安楽死方法を使用する(例えば、自動卓上CO2チャンバーを使用して動物をCO2に15分間曝露し、続いて子宮頸部脱臼、断頭、または胸郭を切開することによって両側に誘導された気胸のいずれかの二次的安楽死方法)。 - ノギスで測定を行い、腫瘍の長さ(L)と幅(W)の寸法を使用して、次の式で体積(V)を計算します。
- 皮下注射の場合:
- バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持する26,27.
- 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
- 28G〜31Gのインスリン注射針(長さ6mm)を鋭角に保持して、斜めを上に向けて皮膚を優しく穿刺する。表皮、真皮、および下皮を通過しながら、針の先端で圧力解放を 2回 感じてください。
注:針の先端に圧力解放が2回目に感じられたときは、皮下コンパートメントに到達したことを示します。 - 細胞懸濁液の全容量(30〜150μL)を、細長い楕円状の疱疹が観察されるまでゆっくりと注入する。針を入れたままにして、5まで数えます。容量が大きい場合(50 μL以上)は10にカウントします。
注:EMSは体温で粘性になり、針の穿刺傷を通る逆流を避けるのに役立ちます。 - 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
メモ:手続き後のモニタリング中は、合併症(低呼吸数、出血、回復の遅さ)の兆候がないか観察し、適切に対処してください。改善が観察されない場合は、ステップ2.6.6の注に記載されている人道的安楽死手順に進みます。 - 腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について、ステップ2.6.6-2.6.7で説明されているように動物を監視する。
- 心臓内注射の場合:
- バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態26,30を維持します。
- 手順2.3-2.4で説明されているように動物を麻酔します。
- 動物を超音波装置の加熱されたプラットフォームに移し、低アレルギー性テープで鼻錐に固定する。
- 30°の角度で傾けたまっすぐなカミソリの刃で胸部を剃ります。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにする。
- さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。手順部位に超音波ゲルを塗布する。
- 超音波プローブで心臓窓をキャプチャします。超音波プローブを動物の左側に胸郭の中央に配置し、水平窓を撮像して左心室の断面図(短軸)を得た。プローブの長軸が上を向いていることを確認し、プローブを50°の角度で固定し、加熱されたプラットフォームを20°の角度で固定します。プローブとサポートフレームを所定の位置にロックします。
- バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、30G、25mmの針を備えたツベルクリン1mLシリンジで細胞懸濁液を引き出します。シリンジ内の気泡を取り除きます。
注:細胞が処理および注入されている間、単一細胞懸濁液を作成し、維持することが重要です。気泡を除去することは、空気塞栓症を回避するための重要なステップである。十分にプライミングされた注射針システムは、実験群における回避可能な死を防ぐであろう。注射するよりも多くのボリュームをシリンジに常に引き込む。余分な容量は、細胞懸濁液の一部を1.5mLチューブに戻すことによって空気を除去するのに役立ちます。 - シリンジを定位インジェクターにロックします。超音波ガイダンスの下で、針を胸壁を通って心臓の左心室に進める。細胞懸濁液の全容量(100〜250μL)をゆっくりと注入する。
- 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。ステップ2.6.6で説明したように、腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について動物を監視します。
- 頸動脈内注射の場合:
- 無菌状態30を維持するために、適切に消毒された表面上で手順全体を実行します。
- ケタミン(100mg / kg)およびキシラジン(10mg / kg)カクテルで、インスリン注射器、28G針による腹腔内注射によって動物を麻酔する。処置中の角膜乾燥を防ぐために、動物の目に滅菌ワセリン眼軟膏を塗布する。
- まっすぐなカミソリの刃を30°の角度で傾けて手順領域を剃ります。さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。
- 動物を温暖化パッド上の実体顕微鏡の下に置きます。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにする。
- 滅菌個人用保護具(PPE)と滅菌手袋を着用してください。動物の体の上に滅菌ドレープを敷くことによって滅菌フィールドを準備する。
注:滅菌ドレープに切開部のサイズと位置に適した穴がない場合は、ドレープを半分に折り、メッツェンバウムハサミを使用して滅菌ドレープの中央にある適切なサイズの穴を切ります。 - メスまたはアイリスハサミを使用して、首の半分から胸骨までの皮膚を切開します。2つの微小手術鉗子を用いて、正中線平面上の2つの顎下唾液腺を鈍く解剖する。必要に応じて、止血のために電気焼灼を使用してください。
- 総頚動脈(CCA)を取り囲む筋膜をマヌブリウムから分岐部に向かって解剖し、内側に続けて外頸動脈の後壁を解放する。注射する前に外頸動脈(ECA)を一時的にクリップします。
注:CCAの周囲を解剖するときは、迷走神経(動脈の外側にある)を損傷しないように注意する必要があります。 - 細胞懸濁液を33G、15mm針で1mLシリンジにロードする。
- CCA の下に 2 つの 7-0 合字を渡し、2 つの合字のそれぞれに対して緩いインストゥルメント ノットを実行します。5 mm、10 Gの圧力容器クリップを使用し、ECAを一時的にクリップします。近位合字を結ぶ。次に、遠位合字をゆるやかに結びます(CCAの分岐部の隣)。遠位ループを後で使用して、注射後の出血を制御します。
- 33 G、15 mmの針が付いたシリンジを使用して、針のベベルを上向きに鋭角にしてCCAを静かに穿刺します。細胞懸濁液の全容量(50〜150μL)をゆっくりと注入する。
- 遠位ループを鉗子で把持し、針を外しながら持ち上げてCCAの内腔を塞ぎ、出血を止めます。シリンジを#7ジュエラー鉗子と交換し、遠位ループを結びます。
- 遠位合字に別の器具の結び目を投げ、ECAから容器クリップを取り外します。出血のために手術野を制御し、閉鎖前に出血血管を焼灼する。9mmのホチキス止め装置を使用して動物の皮膚を閉じ、動物を暖かいパッドの上に置き、回復させます。
注:術後7〜10日でホッチキスを取り除いてください。 - 鎮痛薬 - ブプレノルフィン(0.3mg / mL)を0.1mg / kgの濃度で術後72時間、12時間ごとに皮下に投与する。
注:あるいは、72時間ごとに1回投与する必要がある徐放性鎮痛薬の使用を検討してください。 - 意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。手術部位の感染や痛み、一般的な健康状態、合併症の兆候がないか、術後に毎日動物を監視します。
注:生存手術からうまく回復しない動物には、追加の鎮痛剤が投与され、手術後72時間以内に完全に回復しない場合、人道的に安楽死させられます。 - ステップ2.6.6で説明したように、腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について動物を監視します。
- 眼窩後注射の場合:
注:このテクニックは、オペレーターがこのテクニックで訓練され、熟練している場合、および強い科学的正当性がある場合に、尾静脈注射の代替として使用します。この経路を介して送達される細胞懸濁液は、後眼窩空間における腫瘍増殖を誘導することができる。したがって、この手法を選択する際には、リスクと利点を慎重に考慮する必要があります。例えば、吻合を介した眼窩後静脈洞と脳内静脈との直接循環接続を利用するには、脳腫瘍形成が他の注射経路を使用して失敗した場合にこの方法を選択する。- バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持します。滅菌PPEと手袋を着用してください。
- 手順2.3-2.4で説明されているように動物を麻酔します。
注:この手順では、注射を妨げるため、滅菌ワセリン眼科軟膏を動物の目に塗布しないでください。局所麻酔薬のみを適用する。 - 細胞懸濁液をインスリン注射器に28〜31G、6mmの針でロードする。
- 動物を臆病な姿勢にして、目が突き出るまでまぶたを引っ込めます。局所麻酔薬1滴を処置を受けている側の眼に塗布する。
- 目と内側のエピカンサスの間に30〜45°の角度で針を挿入し、ベベルを下に向けて挿入します。細胞懸濁液(10-150 μL)をゆっくりと注入する。
注:動きが遅いほど、眼の損傷や注射液の逆流を防ぐことができます。 - 2.7.5-2.7.6 で説明されている手順を実行します。
- 脾臓注射の場合:
- バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態31を維持する。滅菌PPEと滅菌手袋を着用してください。
- 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
- 動物を右横横臥位に置きます。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにし、ステップ2.9.5で説明されているように手術野を準備します。
- メッツェンバウムはさみまたはメスを使用して、腹壁の左脇腹に1cmの切開を行い、続いて腹膜に切開する。
注:脾臓は、皮膚切開を行った後、半透明の腹壁を通して見られます。腹膜切開をこの部位で正確に行う。 - 切開部を通して脾臓および脾臓丘疹を露出させる。長さ6mmの28〜31Gインスリン注射針を使用して、針の斜めを上向きに鋭角にして脾臓を静かに穿刺する。
注:穿刺傷が出血した場合は、出血と逆流を制限するために部位を焼灼してください。 - 細胞懸濁液の全容量(50〜100μL)をゆっくりと注入する。針を外します。脾臓に小さなガーゼを置き、鉗子で圧力をかけます。細かい蚊の鉗子を使ってガーゼの間に脾臓を軽く締め付け、15分間待ちます。
- 脾臓丘疹を3-0または4-0の絹縫合糸で結び、必要に応じて血管を焼灼することによって脾臓摘出術を行う。5-0ポリジオキサノン(PDS)またはポリグリコール酸吸収性縫合糸で腹膜を閉じる。
- ステップ 2.7.5-2.7.6 で説明されているステップを実行します。
注:出血合併症を呈する動物、または手術後72時間完全に回復していない動物は、人道的に安楽死させるべきです。マウスの幸福は常に優先事項であることを忘れないでください。
3. 段階的生存手術(SSS)
- ステップ2.2からの実験的結論に基づいて、生存手術までの適切な時間を決定する。細胞株および実験仮説に応じて、腫瘍切除のためのより早い時点(腫瘍体積= 150mm3)またはそれより後の時点(腫瘍体積= 500mm3)を選択する26。
注:腫瘍体積限界は、腫瘍量が動物の幸福に有害であり、合併症の素因となるほど十分に高い場合、1,500mm3である。 - 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
注:手順全体はバイオセーフティキャビネット内で実行されます。 - イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにし、ステップ2.9.5で説明されているように手術野を準備します。
- アイリスハサミまたはメスを使用して皮膚を切開し、腫瘍の端から5〜7mmの切除マージンを維持する。
注:切除のマージンは、腫瘍が局所的に広がる能力に依存する。攻撃的な腫瘍の場合は、切除マージンを増やしながら、創傷閉鎖を行うのに十分な皮膚が残っていることを確認してください。 - 皮内腫瘍の場合、周囲皮膚とともに腫瘍を切除する。
- 皮下腫瘍の場合は、皮膚下の腫瘍を解剖して除去する。
注:腫瘍が腹膜および/または皮膚に浸潤した場合は、腫瘍と 一括 して切除し、5-0/4-0 PDSまたはポリグリコール酸吸収性縫合糸で腹膜を閉じる。 - 9mmのホチキス止め装置で傷口を閉じます。
注:術後7〜10日でホッチキスを取り除いてください。鎮痛薬を投与し、動物を暖かいパッドの上に置き、回復させる。鎮痛薬を術後72時間、ステップ2.9.13に従って12時間に1回投与し続ける。出血合併症のある動物や、手術後に完全意識を取り戻していない動物は、人道的に安楽死させられるべきです。 - 動物をケージに入れ、暖かいパッドに集めて回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
- 手術後の動物の局所再発、体重減少、神経学的、運動力、および/または行動徴候(嗜眠、グルーミングの欠如、食物または水分摂取量の少なさ)および全体的な健康状態について、引き続き監視する。
インビボイメージング(図2A)
- D-ルシフェリン基質(150mg/kg)を1mLインスリン注射器、28G針による腹腔内注射により動物に投与する。
注:腫瘍細胞は、ルシフェラーゼcDNAで安定に形質導入されなければならない。 - ステップ2.3〜2.4に記載されているように麻酔を誘導し、D-ルシフェリン基質注射の6分後に投与する。
- 生物発光イメージング(BLI)スキャナ(in vivo イメージングシステム)26を用いてイメージングを行う。
- 動物をイメージングチャンバー内およびノーズコーン内に移動します。イメージングシステムの容量に応じて、最大5匹の動物を同時に画像化します。
- 初期化を押して計測器を起動します。露出時間設定を自動(1~120秒)に設定します。
- 必要に応じて、空白の画像をキャプチャして背景を減算します。「取得」をクリックし、 取得 シーケンスの完了後に画像を保存します。
- 動物をケージに戻し、ケージにベース表面積の50%を温めパッドの上に置き、麻酔から回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
- 画像を撮影したのと同じ in vivo イメージングソフトウェアでデータ解析を行う場合は、画像が保存されているフォルダに移動し、実験に関連するすべてのマウスの画像を一度に開きます。
メモ: 一度に 1 つの画像を分析しても、グループ間で正規化することはできません。 - 単位を放射輝度 (カウントではない) に設定します。個人を示すチェックボックスがオフになっていることを確認します。これは、グループ間でのシグナルの正規化を妨げるためです。
- 関心領域 (ROI) 描画ツールを使用して、脳領域の円形 ROI と身体の長方形の ROI を描画します。耳と鼻は不特定の発光を発する傾向があるため、脳ROIから耳と鼻を除外するように注意してください。このプロセスでのバイアスを最小限に抑えるために、発光信号が重なることなく、マウスの写真にのみROIを描画します。
- [ROIの測定]を選択して信号を定量化し、データをスプレッドシートにエクスポートします。対象となる身体領域の総発光フラックス(p/sec/cm2/sr)をプロットして、グループ間の差を分析します。
注:脳指向性における群間の差を具体的に評価するには、各マウスの脳信号と身体信号の比を計算する。これは、全体的な腫瘍量におけるマウス間変動および実験群間のルシフェラーゼ発現レベルの差について対照する。
5. 生体外 磁気共鳴イメージング
- 安楽死直後に エクスビボ MRIを行う。あるいは、目的の器官を採取し、ホルマリンで最大72時間固定し、後の時点でイメージングを行う。
- NMRコンソールとゼロボイルオフ、水平ボアマグネットまたは同様の機器を備えた7テスラ(7-T)(300MHz)マイクロMRIシステムで画像を取得します。
メモ:性能の正しいトレードオフを備えたアクティブシールド勾配コイルインサートの必要性は非常に重要です。少なくとも 50 mm の動的球面体積 (DSV) の勾配直線性を提供して、幾何学的歪みなしで同時に検査されるサンプルのセットをカバーする必要があります。勾配強度(440~750mT/mの範囲)とデューティサイクルの組み合わせにより、3 x 30 A~3 x 87Aの範囲の最大同時DC電流が可能になり、適切なイメージング性能が得られます。使用されるグラジエントコイルインサート( 材料表を参照)は、660mT/m、130μsの立ち上がり時間、3 x 87A、DSV = 80mmの性能を実現します。 - 市販の送受信円偏波マウス全身無線周波コイル(OD = 59 mm、ID = 38mm、L = 40 mm)でスキャンを実行し、 1 H陽子Larmor周波数を300.16 MHzにチューニングします。
注:このrfプローブは、8-12時間にわたる一晩のスキャン中に、サブミリメートル等方性分解能(<150μm)の3Dデータセットの取得を可能にします。 - 複数の配列30を用いて腫瘍量を検出する。
注:再集束エコー(RARE)配列によるT2強調ラピッドイメージングによって検出された超強烈なシグナルは、腫瘍周囲の浮腫を認識する。 - 次の取得パラメータで3D RAREシーケンスを実行します:[120 μm]3等 方性分解能;取得時間5時間27分。繰り返し時間 (TR) = 500 ミリ秒;エコー間隔 (ES) = 12.7 分;ターボ係数TFx = 12;実効エコー時間(TEeff) = 76.2 ミリ秒;帯域幅 (BW) = 75 KHz;行列サイズ = 2843;視野 (FOV) = [4.0 mm]3;平均数 (Nav) = 6。
- 次のパラメータを使用して転移を検出します。
- シグナルを明るくする色素沈着転移の場合、次のパラメータを持つT1強調3Dグラジエントエコーシーケンスを使用します:[120μm]3 等方性分解能;取得時間2時間、41分。TR = 20 ミリ秒;エコー時間 (TE) = 4.0 ミリ秒;フリップ角(FA) = 18°;BW = 75 KHz;行列サイズ = 2843;視野 = [34.0 ミリメートル]3;ナビゲーション = 6。
- 色素沈着および/または出血性転移の場合、T2*加重マルチグラジエントエコー(MGE)シーケンス(3D MGE、[120μm]3等方性分解能;取得時間3 時間35分;TR = 40 ミリ秒;TE = 3.6 ミリ秒;ES = 3.2 ミリ秒;4エコー;FA = 20°;BW = 100 kHz;行列サイズ = 2843;視野 = (34.0 ミリメートル)3;ナビゲーション = 4。
- 腫瘍量を定量するために3つの配列すべてを使用する。
- 解析中に同定された腫瘍領域を組織学的切片と相互参照して、精度を確保します。セクション 7 および 8 を参照してください。
6. 単一細胞またはバルクRNAシーケンシングのための組織プロセシング
- 施設のIACUCによって承認された方法を使用して動物を安楽死させる。ステップ 2.6.6 の注で説明されている手順の 1 つを参照してください。
- 目的の臓器を解剖し、氷上のハンクスバランスソルト溶液(HBSS)を含むプレートの別々のウェルに入れます。迅速に作業し、細胞生存率を最大化するために、常に氷の上に組織を維持します。
注: 次の手順は、脳の処理に固有のものです。必要に応じて、コラゲナーゼの種類を特定の組織に合わせて調整します。 - 各ウェルに3mLのHBSSを含む6ウェルプレートを調製する。
- 解剖を視覚化し、さらにガイドするには、蛍光顕微鏡を使用して標識された領域を特定します。
- 蛍光領域を解剖し、組織断片を6ウェルプレート(個々の転移病巣を分析する場合は1ウェルあたり1断片、同じ器官内の複数の転移を分析する場合は1つの器官からの複数の断片)に配置する。滅菌カミソリの刃を使用して、組織をできるだけ小さな断片に細かく刻みます(サンプルごとにこのステップに1〜2分以上費やす必要はありません)。
注:腫瘍の処理時間を制限することは、細胞生存率を維持するのに役立ちます。 - 各ウェルの内容物を吸引し、15mLの円錐管に移す。
注: 1,000 μL のピペットチップの先端を切断して、より大きなフラグメントの移送を容易にします。 - 1 mL の HBSS をウェルに追加し、残りの組織断片/細胞が 4 mL の最終容量を含む 15 mL チューブに移されることを確認します。各チューブに50 μLのコラゲナーゼタイプI(40 mg/mL)および12.5 μLのDNase I(2,000 units/mL)を加える。
- 円錐管を37°Cで45分間加熱した水浴中に置く。円錐形のチューブを5分ごとに簡単に渦巻きます。
- 70μmのストレーナーをHBSSでプリウェットします。滅菌された微量遠心管の蓋付き端部またはシリンジプランジャーのプラスチック部分を使用し、70μmのストレーナーを介して組織ホモジネートを新しい50mL円錐管に粉砕する。
メモ: HBSS または FACS バッファでストレーナーをプリウェットすると、ひずみがしやすくなります。 - ストレーナーを1 mLのHBSSで洗ってください。40μmのストレーナーをHBSSでプリウェットします。各サンプルを40μmのストレーナーを通して新しい50mL円錐管に再度ろ過します。40 μm のストレーナーに FBS 1 mL を加えて洗浄します。円錐形のチューブを常に氷の上に置いてください。
- 円錐形のチューブを氷冷DPBSで50mLまで満たします。セルをスピンダウンします(180× g を4°Cで10分間)。上清を捨て、細胞ペレットを失わないように注意する。
注: 脳サンプルの場合、細胞を2.5mLの38%密度分離溶液(HBSSで希釈し、室温(RT)で保存)に再懸濁する。5 mL FACS チューブに移します。800 × gで20分間スピンします。1,000 μLのピペットチップの先端を切り取り、上部の脂肪層を除去します。チューブの壁に脂肪を残さないでください。脂肪が残っている場合は、もう一度スピンダウンしてプロセスを繰り返します。これは 重要な ステップです。残りの液相を除去します(ペレットは半透明で視覚化しにくい)。 - 細胞を1 mLの赤血球(RBC)溶解バッファーに再懸濁し、RTで60秒間インキュベートします。
- 細胞を180 × g で4°Cで10分間スピンダウンします。 上清を除去し、細胞を2mLのFACS緩衝液(DPBS中の5%FBS)に再懸濁した。
- 標識細胞の選別および/またはバルクまたは単一細胞RNAシーケンシングのためのライブラリー調製を続行します。
注: 細胞は、バルク RNA-seq の RNA 単離の前に、スピンダウンし、スナップ凍結し、-80 °C で保存することができます。
7. 動物組織灌流と免疫組織学的解析の準備
- インスリン注射器と28G針による腹腔内注射により、ケタミン(300mg / kg)およびキシラジン(30mg / kg)カクテルの過剰摂取で動物を麻酔する。
- 肉眼解剖によって心臓を露出させ、右心房に切開を行う。長く湾曲した鉗子を前に向けて、心臓をそっと所定の位置に保持します。
注:ホルマリンとパラホルムアルデヒド(PFA)は発癌物質です。安全データシート(SDS)を読み、煙に曝されないようにし、適切なPPEを着用してください。 - 22 G、22 mm針を備えた10 mLシリンジを使用して、10 mLのDPBSに続いて10 mLの4%PFAを左心室に注入する。
- 臓器を収穫し、事前にラベル付けされた組織学的カセットにロードする。組織を覆うのに十分な固定液(ホルマリン)を収容する適切なサイズの容器にカセットを置く。
注:理想的には、固定液の体積は組織の体積の5〜10倍でなければなりません。 - 組織学的カセット内の器官を10%ホルマリンで48〜72時間固定する。10%ホルマリンを捨て、1x DPBSでカセットを2回洗ってください。
- カセットを70%エタノールに2時間浸漬して脱水プロセスを開始する。カセットをエタノール濃度の増加に連続して浸漬し続ける:80%、95%、100%をそれぞれ1時間。1.5時間後に100%溶液を2回交換する。カセットをキシレンに1.5時間浸漬し、溶液の3つの変化を行う。
- 58-60°Cでパラフィンワックスにカセットを埋め込む。 パラフィンブロックを断面化します。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)または免疫組織化学染色に進む。
- メラノーマ細胞を同定するには、これらのマーカーまたはパネルのいずれかを使用します:S100、Melan-A、HMB-45、チロシナーゼ、MITFです。可能であれば、核有糸分裂装置タンパク質(NuMA)染色は、高度に特異的なヒト細胞マーカーであるため、使用してください。
注:NuMA染色は、宿主(マウス)と生着細胞(ヒト)の間の鮮明な描写を提供し、画像処理およびその後の腫瘍定量化段階を助ける。
図2:BLI、明視野、 エキソビボ 蛍光、およびH&E染色画像の例は、メラノーマ転移における候補遺伝子の効果を分析するための多面的アプローチを示す。 (A)BLI、(B)BF、(C) エキソビボ 蛍光、および(D)H&E染色画像。例示のために使用した画像は、非標的対照shRNA(shNTC)またはFUT8を標的とするshRNAで形質導入された131/6-4Lメラノーマ細胞を免疫不全(NSG)マウスに注射した実験に対応する。FUT8サイレンシングは、メラノーマ細胞の転移性播種を障害した。スケールバーとカラーバー = p/sec/cm2/sr × 106 (A)、100 mm (B, C)、100 μm (D) です。略語: BLI = 生物発光イメージング;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジン;shRNA = 短いヘアピン型RNA;shNTC = 非標的対照 shRNA;NSG = 非肥満糖尿病重症複合免疫不全ガンマ;FUT8 = フコシルトランスフェラーゼ8;BF = 明視野。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
8. 核有糸分裂装置タンパク質(NuMA)染色(図3)
- 抗NuMA抗体を高度にヒト特異的な有糸分裂紡錘体マーカーとして使用し、組織切片における転移性負荷の同定および定量化を行う。8.1.メラノーマ細胞の高度に特異的で高感度な同定が達成される。
- NuMAの発色免疫組織化学が自動免疫染色装置で実行される場合、32に記載されているように次の手順に従います。
- 切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノール濃度を順次下げて再水和する。スライドをキシレンに15分間沈めたままにし、さらに15分間100%エタノールに移します。
注:エタノール再水和ステップの残りの部分(95%、80%、75%)は、それぞれ3〜5分間続きます。 - スライドを脱イオン水ですすいでください。
- 10mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)の容器(例えば、 コプリン染色瓶)中のスライドを1200ワットの電子レンジ中で100%電力で10分間浸漬することによってエピトープ検索を行う。
- 標識のためにコンジュゲートされていないポリクローナルウサギ抗ヒトNuMA抗体を使用し、トリスウシ血清アルブミン(BSA)で1:7,000に希釈した(25mM Tris、15mM NaCl、1% BSA、pH 7.2)。適切な陽性対照と陰性対照を研究セクションと並行して実行します。
- スライドを一次抗体と共に12時間インキュベートする。ヤギ抗ウサギHRP結合多量体で一次抗体を検出し、3,3-ジアミノベンジジンと硫酸銅エンハンサーとの複合体を可視化します。
- スライドを蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、永久媒体でマウントします。
メモ: 脱水手順は、手順 8.3 で説明されている水分補給手順の逆です。使用可能なスキャナーでスライドを 20 倍または 40 倍の倍率でスキャンし、データベースにアップロードします。 - ソフトウェアを使用して、ROIを描画して、他の臓器実質および空のスペースを除く、臓器組織内のすべてのNuMA染色細胞を含む。
- 各臓器に適切な陽性および陰性対照を使用しながら、NuMA陽性およびNuMA陰性細胞を分類するように設定を調整します。確立されたソフトウェアアルゴリズムを使用して、各サンプルのNuMA陽性細胞の総数/割合を定量化します。
9. 組織スライス免疫蛍光
特定の遺伝子候補が必要な転移段階(例えば、 溢血対播種後の生存)を同定するために、異なる時点での組織スライス免疫蛍光を決定して、注射から遠隔臓器への腫瘍細胞の進行、播種、および増殖を追跡することができる。このアプローチは、隣接する細胞が溢血事象および周囲の腫瘍微小環境変化を捕捉するためのマーカーの追加を可能にする33。
- ステップ7.1で説明したように動物を麻酔する。
- 灌流の3分前に、100μgのフルオロフォア結合リコペルシコン・エスキュレンタム(トマト)レクチンを各動物の左心室に注入し、血管内皮を描く。
注:トマトレクチンがシステム全体で再循環するまで時間をかけてください。 - 手順7.2-7.3の説明に従って動物を灌流します。目的の臓器を採取し、4%PFAで満たされたラベルの付いた容器に移します。組織を24〜48時間固定する。ビブラートームを用いて組織を30〜50μmの厚さのスライスに切開する。
メモ: 厚さを最適化する必要があります。厚さ 30 μm ~ 50 μm のスライスは、特に z スタックイメージングを実行する場合に推奨されます。 - スライスをブロッキングバッファー(10%ノーマルヤギ血清、2%BSA、0.25%Triton X-100 DPBS中)中でRTで2時間インキュベートする。
- 染色の最適化実験を実行します。
注:抗原賦活化時間、抗原賦活化に使用する緩衝液、温度、異なる抗体/異なるロット、および組織の種類が染色に影響を与えるため、最適化実験が必要です。 - 最適化された希釈で一次抗体を追加し、最適化された温度で最適化された時間インキュベートします( 表1の例を参照)。
注: 一次/二次抗体および染色されていない組織サンプルには、適切なコントロールを使用してください。 - 組織スライスをDPBS中の0.25%Triton X-100で5分間3回洗浄する。
- 組織スライスをブロッキング溶液で希釈した二次抗体中で所望の時間インキュベートする(表1)。
- 組織スライスをDPBS中の0.25%Triton X-100で5分間3回洗浄する。
- DPBSまたはブロッキングバッファーで1:1,000に希釈した4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で核を5分間染色する。
- 2滴の退色防止蛍光マウント培地をカバースリップに加え、組織をスライドガラスにマウントし、スライスがマウントメディアによって完全に覆われていることを確認します。
メモ:顕微鏡がゆがむため、スライスに直接気泡がないことを確認してください。 - 60倍の油浸対物レンズを使用して、利用可能な顕微鏡で共焦点画像をキャプチャします。
メモ: 共焦点画像を取得するときは、実験内のすべての画像に同じ設定パラメータ(電圧、風通しの良い単位、ゲイン)を適用します。 - 顕微鏡を使用して、10倍、20倍、または40倍で非共焦点画像をキャプチャします。
- 画像を画像解析ソフトウェアにアップロードし、選択したパラメータ(面積、数、マーカーの強度、隣接するセルとの接触など )を比較して分析します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下の図は、記載されたワークフローがメラノーマ転移の新規ドライバーの同定にどのように適用されたかを示す。 図2 は、 in vivo メラノーマ転移におけるフコシルトランスフェラーゼFUT8のサイレンシングの効果が研究された公表された研究の結果をまとめたものである26。簡単に言えば、ヒト患者のグリコミックデータ(レクチンアレイによって得られた)およびトランスクリプトームプロファイリングの分析は、原発性黒色腫から転移性黒色腫への進行に関連するα−1,6−フコースのレベルの増加を明らかにし、対応するフコシルトランスフェラーゼ(FUT8)の増加と一致した。
FUT8 shRNAまたは対応する非標的コントロール(shNTC)を担持するレンチウイルスで形質導入された113/6-4Lメラノーマ細胞を、上述のように、超音波誘導心臓内注射によって免疫不全マウス(NSG)に導入した(セクション2.9)。マウスを、 in vivo BLIによる転移性播種についてモニターした。実験の終了時にマウスを安楽死させ、器官を エクスビボ 蛍光について調べ、組織学的分析のために処理した。H&Eに加えて、マウス組織中のヒト細胞を特異的に同定するためにNuMA染色を実施した。 図3に例示されるように、NuMA染色切片をデジタル画像化によって処理し、複数の切片および実験群にわたる転移性負担を定量化した。同様のワークフローを適用して、メラノーマ転移に対する他の候補遺伝子の寄与を評価することができる。
(A)左図、グループI(コントロールレンチウイルスに感染したメラノーマ細胞)およびグループII(転移抑制発現レンチウイルスに感染したメラノーマ細胞)からのNuMA染色肺切片の代表的な画像。スケールバー = 1,000 μm。インセットは、ソフトウェアを使用して定量化できる転移病巣(中央)を表示します。右、転移性黒色腫細胞は緑色にラベル付けされ、臓器領域は緑色の斜線で描かれている。NuMA陰性細胞は青色で標識されている。(B)NuMA染色肺切片における微小転移の例は、少数の細胞を検出する際のソフトウェアの感度を示す。スケールバー = 100 μm. 略語: NuMA = 核有糸分裂装置タンパク質.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗体 | 生産者 | カタログ番号 | 宿主種 | 反応 | 蛍光色素分子 | 希釈 | インキュベーション時間 | インキュベーション温度 |
| 反GFP | アブカム | ab6556 · | 兎 | 鼠 | 非共役 | 1:1000 | 24 時間 | 4°C |
| アンチGFAP | アベスラボ | ティッカー | 鶏 | 鼠 | 非共役 | 1:2000 | 24 時間 | 4°C |
| 付帯 | インビトロジェン | a11041 · | 山羊 | 鶏 | A568 · | 1:500 | 2 時間 | 室温 |
| 付帯 | インビトロジェン | a32731 · | 山羊 | 兎 | A488型機 | 1:500 | 2 時間 | 室温 |
表1:脳スライス免疫蛍光のための抗体およびインキュベーション条件の例。
| 細胞株 | 種類 | 安楽死の時 | マウスの性別 | マウスの遺伝的背景 | 注入経路 | # 注入された細胞 | 転移部位 | |
| 12-273 BM+ | ヒトメラノーマSTC | 4-5週間 | M | ティッカー | 心臓内 | 100K | 脳実質、レプトメニンゲ、肝臓、腎臓、副腎 | |
| 131/4-5B1* | ヒトメラノーマ | 4-6週間 | M | 無胸腺ヌードまたはNSG | 心臓内 | 50-200K | 脳実質、肝臓、肺 | |
| 113/6-4L* | ヒトメラノーマ | 5-7週間 | M | 無胸腺ヌードまたはNSG | 心臓内 | 50-100K | 脳実質(少数)、肝臓、肺 | |
| WM 4265-2** | ヒトメラノーマSTC | 11週間 | M | 無胸腺ヌードまたはNSG | 心臓内 | 200K | 脳実質 | |
| WM 4257-1** | ヒトメラノーマSTC | 10-13週間 | M | 無胸のヌード | 心臓内 | 100K | 脳実質(少数) | |
| WM 4257-2** | ヒトメラノーマSTC | 10-13週間 | M | 無胸のヌード | 心臓内 | 100K | 脳実質 | |
| 10-230 BM+ | ヒトメラノーマSTC | 8-9週間 | M | 無胸のヌード | 心臓内 | 100K | 脳実質、レプトメニンゲ、肝臓(少数) | |
表2:記載されたプロトコールに従った様々なヒトメラノーマ細胞株および短期培養物の代表的な インビボ 実験からの結果の内訳。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このテクニカルレポートの目的は、メラノーマ転移における潜在的なアクターの調査のための標準化されたトップツーボトムのワークフローを提供することです。 in vivo 実験はコストと時間がかかる可能性があるため、効率を最大化し、得られる情報の価値を高める戦略が最優先事項です。
同じ実験内で調査結果をクロスバリデーションするために、全体を通して補完的なアプローチを使用することが不可欠です。例えば、NuMA免疫組織化学染色およびBLIはいずれも包括的ではないため、転移性負荷を定量する相補的な方法である。BLIは、 インビボでの腫瘍進行を追跡する非常に貴重で非侵襲的な方法ですが、これらのデータは本質的に低分解能です。NuMA染色は、固定臓器における転移性負荷の詳細な分析を可能にする。しかし、組織全体の厚さを網羅した切片化は実用的ではありません。そのため、各臓器のサンプルのみを染色することができます。実際、著者らの経験では、BLIの結果は、組織病理学的解析で明らかな腫瘍量に必ずしも正比例するわけではない。これは、部分的には、経頭蓋減衰34のために、この方法の限られた感度、特に脳における制限によるものである。加えて、これらのデータは、不完全なルシフェリン取り込みおよび/または可変ルシフェラーゼ発現によって影響され得る。したがって、BLIは 、エキソビボ イメージングおよび病理組織学的研究と併せて解釈されるべきである。
H&Eなどの一般的な染色で処理された組織サンプルの組織学的評価は、専門的な解剖学的病理学トレーニングを必要とし、しばしば低スループットであり、観察者間のばらつきが生じやすい。著者らは現在、バイオインフォマティクスの同僚と協力して、病理組織学的画像における臓器組織切片の割合としての転移性負荷の自動的かつ信頼性の高い定量化のための機械学習アルゴリズムを開発することにより、実験データ解析を標準化および加速している。これらのツールやその他のツールは、特に転移性微小環境の役割がより細かい解像度(例えば、空間トランスクリプトミクス)で焦点を当てるにつれて、この分野にとって重要になります。それにもかかわらず、組織の専門家による病理学的組織学的評価は不可欠であり、特に生物学的に異なるサブタイプであるレプトメニンゲールなどの脳転移のサブタイプでは、BLIのみを介した実質脳転移と誤解されやすい。NuMA染色(セクション8)は、転移性負荷の組織病理学的評価を促進し、マウス器官におけるヒト細胞の偏りのない同定および定量を可能にする。しかし、脳実質とレプトメニンゲなどのNuMA染色切片の解剖学的区画の区別は、さらなる生物学的洞察を得るために重要である。
本明細書に記載の技術は、メラノーマ転移カスケードに対する関心のある遺伝子の機能的関連性を調査するために使用され得る。問題の研究に適した再現可能な表現型を持つモデルを選択することが重要です。例えば、転移のヒト患者サンプルにおいてアップレギュレートされた遺伝子を「ノックダウン」して、これが対照群と比較して転移性負担を減少させるかどうかを評価することができる。このアプローチは、a)目的の遺伝子の高発現およびb)マウスに注射されたときに信頼性の高い動態を伴う重大な転移性負担を生じるモデル細胞株または短期培養において最もよく実施され、転移能の低下が顕著であり、試験される遺伝的摂動に割り当てられるであろう。
また、実験計画において重要なのは、調査中の転移の段階に最も適した注射様式の選択である。転移性カスケードの各段階は、メラノーマ細胞に対する明確な生物学的および物理的障壁を提示する。転移の初期段階、すなわち浸潤および溢血に関する質問に答えようとする研究者は、それぞれ皮内注射および皮下注射についてセクション2に概説した技術を使用し、その後生存手術(セクション3)を行うべきである。重要なことに、これらの手順は、原発性黒色腫がヒトにおいて切除されるプロセスを模倣し、その後、患者は転移を呈する場合と示さない場合がある。皮下注射よりも技術的には繊細ですが、皮内経路は、ヒト患者で黒色腫が発症する解剖学的区画に腫瘍細胞を植え付けます。これは、皮膚が免疫集団をパトロールするユニークな生態系を有するため、黒色腫の免疫サーベイランスの研究において特に重要である35。
しかし、検証されている仮説が動脈循環からの溢血などの転移の後期段階を中心としている場合、心臓内、頸動脈内、および眼窩後注射などの方法が有利である。これらの技術は、「原発性」腫瘍を含むものよりもはるかに短い期間でより大きなスケールで転移をもたらす。特に脳転移の研究では、脳実質に腫瘍を確実に産生するモデルを確立することは困難です。これらの場合、頸動脈内および眼窩後注射は、心臓内経路を介して注射されたマウスにおいて早期死亡を引き起こす可能性がある肝臓および腎臓などのより低い「侵入障壁」を有する器官をバイパスする方法を表す。
異種移植または同種移植に選択されるマウスの遺伝的背景は、細胞の供給源(ヒト、マウス)に依存し、時には免疫拒絶反応を誘発する可能性のある移植細胞の遺伝子改変に依存する。ヒト異種移植片モデルを含む実験は、通常、適応免疫系および自然免疫系が障害されたマウス、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスにおいて実施される。またはT細胞欠損無胸腺/ヌード(NU/J)マウスなどの獲得免疫を欠くマウス。頻繁に使用される別の免疫不全モデルは、B細胞およびT細胞を欠損し、機能的なナチュラルキラー細胞集団を保持するRAG2ノックアウト(KO)モデルである。これらの免疫不全マウスモデルは、それぞれが固有の免疫不全に関連するいくつかの欠点を犠牲にして利点を有するため、戦略的に展開されなければならない。著者らの経験では、同じ細胞株または患者由来のSTCは、注射経路(例えば、皮下対心臓内)および/またはレシピエントマウス株(例えば、NSG対無胸腺/ヌード)に基づいて異なる器官指向性を示す( 表2参照)。
メラノーマ細胞が移植される宿主(例えば、免疫応答、微生物叢)に関する実験的変動性を緩和し、「オンターゲット」および再現性のある所見を最大化するために、以下のことが推奨される:i)グループ当たりの実験動物の数を増加させる(検出力計算を使用して効果サイズに基づいて最適な数に達する)、ii)直交法を使用して遺伝子候補を操作する(すなわち、 CRISPR/Cas9、CRISPRi、shRNA)、および「付加バック」実験(すなわち、 目的遺伝子のCas9またはshRNA耐性cDNAの付随する異所性発現)。これらの補完的な技術は、オフターゲット効果の可能性および/または生物学的および実験的変動を低減する。
このプロトコルは、転移の候補ドライバーまたはサプレッサーの仮説主導型検証に確かに適用できますが、これらの方法は、偏りのない探索的研究にも有用であり得る。例えば、プールされたCRISPR/cas9、CRISPR-KRAB-dCas9(CRISPRi)、およびshRNAベースのスクリーニングは、ダーウィン選択のプロセスを in vivo36で展開することを可能にする。このような研究の概念的根拠は、以下の通りである:目的の表現型(例えば、腫瘍増殖)に不可欠な遺伝子がノックアウトされた細胞は、配列決定されたライブラリーにおけるその表現がベースラインに対して減少するように、死滅するか、または増殖に失敗する。ここで説明する手順は、適切な最適化37、38を伴うそのようなアプローチに適用され得る。
候補遺伝子の選択に関しては、複数の供給源をマイニングすることができる。メラノーマ患者のトランスクリプトミクスおよびプロテオミクスデータセットは、NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)39、European Genome-Phenome Archive40、cBioPortal 41(The Cancer Genome Atlas、またはTCGA42をホスト)、およびその他のホスティングサイトを通じて公開されています。生データの再分析は、品質管理対策が公開データベース間で大きく異なり、結果に影響を与える可能性があるため、推奨されます。生のデータセットを調査する場合、ここで説明するワークフローへの適用に適した候補遺伝子選択に適した質問には、原発性黒色腫サンプルまたはメラニン球性母斑と比較して、転移性サンプルにおいてどの遺伝子が調節不全であるか?どの遺伝子が転移の特定の部位で調節不全であるか?候補遺伝子の調節不全発現は、患者の生存率の改善と関連しているか?この遺伝子は、一般的に調節不全に陥っているより大きな遺伝子発現プログラムの一部ですか?遺伝子産物の相互作用は十分に特徴付けられているか、不明であるか?;遺伝子産物は薬効があり、もしそうなら、標的化ツールは利用可能ですか?そして非常に重要なことに、この遺伝子は、臨床現場でのその活性への干渉が有毒であると証明されるように、すべてのヒト細胞、または多くの組織に不可欠ですか?
関心のある遺伝子を操作するための適切な戦略は、テストする仮説に依存する。例えば、転移においてアップレギュレートされた遺伝子をノックダウンして、対応するマウスが対照群と比較して転移性負担の減少を示すかどうかを評価することができる。このアプローチは、モデル細胞株または短期培養において最もよく実施され、a)目的の遺伝子の高発現およびb)再現性のある動態を有するマウスに注射した場合にかなりの転移性負担を生じる。ノックダウンアプローチには、shRNAおよびCRISPR/Cas9ベースの方法が含まれ、どちらもメラノーマ細胞のレンチウイルス感染を介して操作され、誘導的または構成的な方法で展開することができる。誘導性発現の利点の1つ( 材料表のpLKO Tet-Onを参照)は、ノックダウンの時間的調節であり、 これはin vivo 実験において活用することができる。したがって、誘導性shRNA/sgRNAは、確立された腫瘍細胞が候補遺伝子ノックダウンを受ける「治療的設定」をモデル化するために使用することができる。しかしながら、誘導剤、例えば、ドキシ サイクリンへの曝露は、特定の黒色腫細胞の挙動に結果をもたらし得る。そのため、スクランブルされたshRNAで形質導入されたコントロール細胞を含めることは、この治療も経験することが極めて重要です。
shRNAはしばしば遺伝子発現の部分的なノックダウンをもたらすのに対し、CRISPR/Cas9ベースのシステムはDNAレベルで遺伝子を編集し、理論的には完全な「ノックアウト」(KO)を誘発する。それらの使用は、長所と短所の両方を提示する。遺伝子がメラノーマ細胞の生存率に必須である場合、完全なKOを有する細胞は、インビトロおよび後でインビボで負に選択されるであろう。この問題は、単一細胞クローンを選択することによって部分的に緩和され得るが、メラノーマ細胞は単一細胞から増殖するのに苦労し、予測不可能でしばしば異なる適応をもたらす。したがって、複数のKOクローンを試験して、クローン間表現型変異を制御する必要があります。さらに、特に患者由来のSTCの場合、メラノーマ細胞が曝露されるレンチウイルス感染の数は、インビトロ増殖およびインビボ転移挙動に大きく影響し得る。したがって、Cas9とsgRNAを組み込んだ単一ベクターの単一感染アプローチ(材料表のlentiCRISPRv2を参照)が推奨されます。他の系では、転写抑制を惹起するために「死んだ」Cas9(材料表のdCas9-KRAB)を利用している。
機能獲得アプローチは、目的の遺伝子が転移促進遺伝子であると仮定される場合に適切であり得る。この場合、マウスへの注射時に転移をほとんど生じず、目的遺伝子の基礎発現が低いメラノーマ株の選択が鍵となる。過剰発現構築物(特にCMVプロモーターによって駆動されるもの)は、しばしば超生理学的発現レベルをもたらし、タンパク質毒性ストレスを引き起こす。したがって、目的の遺伝子の生理学的発現を可能にするレンチウイルスベクターを選択することが推奨される。
アプローチが選択されたら、細胞の生着 前に 以下の実験を行うことが重要です。レンチウイルス感染手順は実験室によって異なり、各細胞株およびノックダウンシステムの最適化が必要になります。しかしながら、普遍的な考慮事項には、遺伝子ノックダウンを特徴とする細胞の完全な正または負の選択(例えば、蛍光レポーターのためのFACS /細胞選別または抗生物質耐性選択(該当する場合))に続いて、RT-qPCRおよび適切な対照によるウェスタンブロットが含まれ、目的遺伝子の再現性および堅牢なノックダウンまたは過剰発現を実証する。 インビトロ 増殖アッセイを実施して、目的の遺伝子への干渉が細胞生存率に影響を与えるかどうかを決定する必要があります。このステップは、信頼性の高い細胞特性評価と、 in vivo 結果の正しい解釈のために重要です。遺伝子ノックダウンが インビトロで劇的な増殖欠陥をもたらす場合、転移性カスケードに対するこの遺伝子の特定の寄与を正確に評価できないため、転移性負担の減少の解釈を混乱させる。増殖アッセイの様々な様式には、市販のキット、生細胞イメージングシステム、または従来の細胞培養ベースのアッセイ、例えば、クリスタルバイオレット、トリパンブルー排除が含まれる。
メラノーマにおけるメディエーターを発見する際のこのプラットフォームの主な制限の1つは、提案されたワークフローが腫瘍細胞内因性遺伝子候補のみを調査し、腫瘍細胞の適応および遠位器官の播種の主要なモジュレーターである異なる転移段階で周囲の微小環境の細胞によって発現される遺伝子を調査することではないことである。考慮すべきもう1つの重要な要素は、生着経路に基づく異なる転移性挙動である。提示された技術のいくつかに固有の実験室間およびオペレータ間の変動性は、転移研究分野全体にわたる標準化によって対処することができる。現在、標準化のための最も適したプロトコルは、超音波ガイダンスおよび静的注入装置による心臓内注射であり、オペレータ間の変動性を低減する。このプロトコルは、メラノーマ転移の新規メディエーターの同定に取り組んでいる研究室全体で使用される方法の均一性、再現性、および徹底的な文書化の方向への多数のステップの1つを表しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
我々は、NYU Langone Healthの先端研究技術部門(DART)、特に、Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087によって部分的に支援されている実験病理学研究所、ゲノム技術センター、サイトメトリーおよび細胞選別研究所、前臨床イメージングコアに感謝する。我々は、IRBが承認したプロトコール(ユニバーサル・コンセント研究#s16-00122および学際的メラノーマ協同組合グループ研究#10362)を通じて得られた患者由来のメラノーマ短期培養物+ (10-230BMおよび12-273BM)へのアクセスを提供してくれたNYU学際的メラノーマ協同組合グループ(PI:Dr. Iman Osman)に感謝する。113/6-4Lおよび131/4-5B1メラノーマ細胞株*を提供してくれたロバート・カーベル博士(トロント大学)と、WM 4265-2、WM 4257s-1、WM 4257-2メラノーマ短期培養**を提供してくれたMeenhard Heryn博士(Wistar Institute)に感謝します。E.H.は、NIH/NCI R01CA243446、P01CA206980、米国癌協会-メラノーマ研究同盟チームサイエンス賞、およびNIHメラノーマSPORE(NCI P50 CA225450;パイ:I.O.)。 図 1 は、 Biorender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G - 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G - 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
- Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
- Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
- Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
- Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
- Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
- Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
- Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).
- Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
- Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
- Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
- Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
- Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
- Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
- Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
- Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
- Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
- Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
- de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
- Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
- Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
- Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
- Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
- Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
- Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
- Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).
