Developmental Biology

ड्रोसोफिला भ्रूण में लिपिड युक्त ऑर्गेनेल की साइटोस्केलेटन-निर्भर तस्करी की कल्पना करना

Published: December 13, 2021 doi: 10.3791/63291

¹Department of Biology, University of Rochester

Summary

प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में, कई ऑर्गेनेल गतिशील होते हैं। सिद्धांत रूप में, उन्हें विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच के माध्यम से लाइव चित्रित किया जा सकता है, लेकिन एगशेल भ्रूण के लिए सीधे आवेदन को रोकता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से इस तरह की जांच को कैसे पेश किया जाए, और फिर कण छवि वेलोसिमेट्री के माध्यम से थोक ऑर्गेनेल गति का विश्लेषण करें।

Abstract

प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण बड़ी कोशिकाएं होती हैं जिनमें पारंपरिक और भ्रूण-विशिष्ट ऑर्गेनेल की एक विशाल सरणी होती है। भ्रूणजनन के पहले तीन घंटों के दौरान, ये ऑर्गेनेल एक्टिन-आधारित साइटोप्लाज्मिक स्ट्रीमिंग और सूक्ष्मनलिकाएं के साथ मोटर-संचालित तस्करी द्वारा संचालित नाटकीय आंदोलनों से गुजरते हैं। छोटे, ऑर्गेनेल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच (एफपी) की एक भीड़ का विकास किसी भी जीनोटाइप में विभिन्न लिपिड युक्त संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की कल्पना करना संभव बनाता है, जिससे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोर की आवश्यकता के बिना लाइव इमेजिंग की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि लाइव इमेजिंग द्वारा विशिष्ट ऑर्गेनेल की तस्करी की निगरानी करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण में महत्वपूर्ण रंजक और आणविक जांच को कैसे इंजेक्ट किया जाए। इस दृष्टिकोण को लिपिड बूंदों (एलडी) को लेबल करके और कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) द्वारा उनके थोक आंदोलन के बाद प्रदर्शित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल लाइसोसोम, माइटोकॉन्ड्रिया, जर्दी पुटिकाओं और ईआर सहित अन्य ऑर्गेनेल के अध्ययन के लिए एक रणनीति प्रदान करता है, और सूक्ष्मनलिकाएं के साथ व्यक्तिगत एलडी की गति को ट्रैक करने के लिए। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों का उपयोग करने से स्पेक्ट्रम के बैंगनी / नीले और दूर-लाल क्षेत्रों में अलगाव के लाभ मिलते हैं। माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से ऑर्गेनेल और / या साइटोस्केलेटल तत्वों के मल्टीप्लेक्स सह-लेबलिंग द्वारा, ड्रोसोफिला में सभी आनुवंशिक संसाधन फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को पेश करने की आवश्यकता के बिना तस्करी के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोरस के विपरीत, जिसमें कम क्वांटम पैदावार और ब्लीच आसानी से होती है, कई उपलब्ध रंजक उच्च फोटॉन पैदावार के साथ कई चैनलों के तेजी से और एक साथ कैप्चर करने की अनुमति देते हैं।

Introduction

महत्वपूर्ण रंजक और आणविक जांच विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं और ऑर्गेनेल की छवि के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। ड्रोसोफिला भ्रूण में, कई अलग-अलग ऑर्गेनेल साइटोस्केलेटन-संचालित स्थानीयकरण ^1,2,3,4 प्रदर्शित करते हैं, लेकिन इन छोटे अणुओं का आवेदन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि अंडकोश उनमें से कई के लिए अपारगम्य है। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनेल की बड़े पैमाने पर तस्करी का पता लगाने के लिए माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से जीवित भ्रूण में फ्लोरोसेंट जांच (एफपी) का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करता है। प्रक्रिया में इंजेक्शन समाधान की तैयारी, अंडा संग्रह और भ्रूण की तैयारी, माइक्रोइंजेक्शन, इमेजिंग और छवि विश्लेषण शामिल हैं।

ऑर्गेनेल की नाटकीय स्थानिक पुनर्व्यवस्था इन कोशिकाओं के बड़े आकार के कारण कई पशु ओसाइटों, अंडे और भ्रूण में आम है। ड्रोसोफिला भ्रूण में, उदाहरण के लिए, लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडी) और जर्दी पुटिकाएं सेलुलरीकरण से ठीक पहले भ्रूण केंद्र की ओर बढ़ जाती^हैं। यह गति सूक्ष्मनलिकाएं पर निर्भर करती है और भ्रूण की परिधि के चारों ओर एक ~ 40 μm क्षेत्र छोड़ देती है जो दो ऑर्गेनेल की कमी हो जाती है। पहले के दरार चरणों के दौरान, कई ऑर्गेनेल को साइटोप्लाज्मिक प्रवाह द्वारा ले जाया जाता है जो^{भ्रूण की सतह} पर एक्टिन-मायोसिन-आधारित संकुचन द्वारा संचालित होते हैं। यद्यपि कई प्रजातियों के भ्रूण समान पुनर्व्यवस्था प्रदर्शित करते हैं, ड्रोसोफिला भ्रूण इमेजिंग द्वारा इन प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है क्योंकि यह मानक प्रयोगशाला 'कमरे के तापमान' पर बाहरी रूप से विकसित होता है, अपेक्षाकृत पारदर्शी है, अधिकांश माइक्रोस्कोप सेटअप पर फिट होने के लिए काफी छोटा है, और शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करके हेरफेर किया जा सकता है।

कुछ ऑर्गेनेल के लिए, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन उपलब्ध हैं जो विशेष रूप से इन संरचनाओं को लेबल करते हैं। उदाहरण के लिए, एलएसडी -2 (जिसे डीपीएलआईएन 2 के रूप में भी जाना जाता है) एक प्रोटीन है जो भ्रूण में विशेष रूप से एलडी⁷ को लक्षित करता है। फ्लाई लाइनें उपलब्ध हैं जो या तो ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और एलएसडी -2⁸ या एक जीन ट्रैप के बीच एक संलयन को एन्कोडिंग करने वाले इनड्यूसिबल ट्रांसजीन ले जाती हैं जिसमें पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) को अंतर्जात एलएसडी -2 जीन ^9,10 के कोडिंग क्षेत्र में डाला जाता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाएं हैं, जिसमें यह भी शामिल है कि इन संलयन प्रोटीनों में कम क्वांटम पैदावार होती है और आसानी से ब्लीच होती है। इसके अलावा, एक साथ कई अलग-अलग संरचनाओं को लेबल करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है: कई ऑर्गेनेल के लिए, केवल एक प्रकार का फ्लोरोसेंट टैग (अक्सर जीएफपी या एमचेरी) वर्तमान में उपलब्ध है, इसलिए एक ही समय में दो ऑर्गेनेल को इमेजिंग करने के लिए नए ट्रांसजीन या सम्मिलन की आवश्यकता हो सकती है; इसके अलावा, भले ही संगत टैग उपलब्ध हों, उन्हें एक ही तनाव में पेश करने के लिए समय लेने वाले क्रॉस की आवश्यकता हो सकती है। यह कई शक्तिशाली आनुवंशिक संसाधनों का उपयोग करके कम सुविधाजनक बनाता है, उदाहरण के लिए, यदि दो ऑर्गेनेल मार्कर, एक Gal4 ड्राइवर, और एक इंड्यूसिबल आरएनएआई निर्माण सभी को एक ही मां में मौजूद होना चाहिए।

सिद्धांत रूप में, इन सीमाओं को एफपी के उपयोग के साथ दूर किया जा सकता है, जिसमें महत्वपूर्ण रंजक (उदाहरण के लिए, लाइसोसोम को चिह्नित करने के लिए लाइसोट्रैकर), आणविक जांच (उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं लेबल करने के लिए एसआईआर-ट्यूबुलिन), और फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए जैविक अणुओं (उदाहरण के लिए, फैटी^{एसिड चयापचय} 11 की जांच करने के लिए सी 12 बोडीआईपीवाई) शामिल हैं। सुसंस्कृत कोशिकाओं में उपयोग से, वे आमतौर पर सेलुलर जीव विज्ञान की जांच के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में अच्छी तरह से मान्य होते हैं। एफपी बहुमुखी हैं, बेहतर फोटो गुण हैं, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संगत हैं। एकाधिक रंगों को मिश्रित किया जा सकता है और एक साथ लागू किया जा सकता है, अक्सर स्पेक्ट्रम के बैंगनी / नीले और दूर-लाल क्षेत्रों में अलगाव के लाभों के साथ और छोटे स्टोक्स शिफ्ट, चैनल के माध्यम से खून बहने से रोकते हैं। छोटे स्टोक्स शिफ्ट कई इमेजिंग चैनलों के एक साथ कैप्चर करने की अनुमति देते हैं, जिससे एक साथ कई ऑर्गेनेल की ट्रैकिंग को सक्षम किया जा सकता है। अंत में, उन्हें समान रूप से अन्य ड्रोसोफिला प्रजातियों या यहां तक कि अन्य कीड़ों के भ्रूण में लेबलिंग ऑर्गेनेल पर लागू किया जा सकता है जहां कोई फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन उपलब्ध नहीं हो सकते हैं।

हालांकि, इनमें से अधिकांश एफपी ड्रोसोफिला भ्रूण के विस्तृत अंडे को पार नहीं कर सकते हैं। इसमें पांच परतें होती हैं: तीन बाहरी कोरियोनिक परतें (कोरियोन) जो यांत्रिक क्षति को रोकती हैं और साथ ही विटेललाइन झिल्ली के चारों ओर एक मोमी परत जो एक रासायनिक बाधा¹² बनाती है। सादगी के लिए, मोमी परत और vitelline झिल्ली के संयोजन को नीचे "vitelline झिल्ली" के रूप में संदर्भित किया जाएगा। अंडे के गोले को बाईपास करने के लिए, यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूण में एफपी पेश करने के लिए एक स्थापित भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण को अनुकूलित करता है। प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि क्लीवेज चरण भ्रूण में एलडी के साइटोप्लाज्मिक प्रवाह की निगरानी कैसे करें। इसमें इंजेक्शन सुइयों और अंडे संग्रह पिंजरों की तैयारी, अंडे के संग्रह की प्रक्रिया, और चोरियन को यांत्रिक रूप से हटाने शामिल है। यह कैसे microinject और भ्रूण छवि और कण छवि velocimetry (PIV,⁶ से अनुकूलित) का उपयोग कर एलडी के थोक प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए पर चला जाता है। यह भ्रूण अस्तित्व सुनिश्चित करने और इमेजिंग के लिए सबसे अच्छी प्रणाली बनाने के लिए समस्या निवारण पर सलाह प्रदान करता है। यह भी चर्चा की गई है कि प्रोटोकॉल को एक साथ एलडी और सूक्ष्मनलिकाएं की छवि बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है या इसे लाइसोसोम, माइटोकॉन्ड्रिया, जर्दी पुटिकाओं और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) सहित अन्य ऑर्गेनेल के अध्ययन पर लागू करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Protocol

1. आवश्यक सामग्री तैयार करें

नोट: ये तैयारी समय से पहले दिन या सप्ताह में सबसे अच्छी तरह से की जाती हैं।

इंजेक्शन सुई तैयार करें।
नोट: सुइयों को एक कवर कंटेनर में अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। सुइयों को ~ 700 fL देने के लिए पर्याप्त ठीक होना चाहिए, जबकि vitelline झिल्ली को छेदने के लिए पर्याप्त मजबूत होना चाहिए।
1. सुई खींचने पर केशिका धारक में एक केशिका रखें। विंगनट्स के साथ केशिका को सुरक्षित करें। केशिका के केंद्र को हीटिंग तत्व के साथ संरेखित करें ताकि दो सममित सुइयों को उत्पन्न किया जा सके।
2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सुई खींचने पर उपयुक्त सेटिंग्स चुनें।
3. एक विच्छेदन क्षेत्र का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें।
  नोट: सुई युक्तियाँ के रूप में संभव के रूप में ठीक होना चाहिए. फटा हुआ, जकड़ा हुआ, या बड़े बोर सुई युक्तियों को छोड़ दिया जाता है।
4. एक समय में 10 सुइयों (5 केशिकाओं के लायक) के बैच तैयार करें।
5. एक विकृत पुट्टी रखें, जिसे ढक्कन के साथ एक कंटेनर के नीचे के केंद्र में एक सिलेंडर में लुढ़काया गया है। सुइयों को पुट्टी में ध्यान से दबाएं जैसे कि यह क्षति को रोकने के लिए हवा में सुरक्षित रूप से निलंबित सुई युक्तियों के साथ क्षैतिज रूप से उन्हें रखता है। ढक्कन के साथ कवर करें, और उपयोग करने तक स्टोर करें।
अंडे संग्रह प्लेट तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: अंडा संग्रह प्लेटें अंडे देने को प्रोत्साहित करने के लिए फलों के रस के साथ पूरक छोटी आगर प्लेटें हैं। उन्हें कैसे तैयार किया जाए, कई प्रोटोकॉल में वर्णित है, जिसमें¹³ भी शामिल हैं।
हेप्टेन गोंद तैयार करें।
नोट: इस गोंद को डबल-साइडेड टेप से निकाला जाता है और इसका उपयोग भ्रूण को कवरस्लिप में सुरक्षित रूप से संलग्न करने के लिए किया जाता है। यह इंजेक्शन और इमेजिंग के दौरान भ्रूण को फोकस से बाहर निकलने से रोकता है। गोंद को समय से पहले दिन या सप्ताह तैयार किया जा सकता है।
1. एक गोल्फ गेंद से बड़ा आकार करने के लिए डबल-साइडेड टेप को बॉल करें और इसे कसकर सीलिंग ढक्कन के साथ ~ 50 एमएल ग्लास कंटेनर के नीचे रखें। पैक टेप कसकर तो पर्याप्त चिपकने वाला मौजूद हो जाएगा.
2. एक धुएं हुड में, सभी टेप को कवर करने के लिए हेप्टेन के साथ ग्लास कंटेनर को भरें। उपयोग में नहीं होने पर कंटेनर को कसकर बंद रखें।
  सावधानी: हेप्टेन एक तरल और वाष्प के रूप में ज्वलनशील है। यह आंख, त्वचा और श्वसन पथ में जलन पैदा कर सकता है। श्वास वाष्प उनींदापन, चक्कर आना और फेफड़ों की क्षति का कारण बन सकते हैं। हेप्टेन को इग्निशन के स्रोतों से दूर रखें और इसे एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में संग्रहीत करें जो ज्वलनशील के लिए और असंगत पदार्थों से दूर है।
3. हेप्टेन गोंद को रात भर या उससे अधिक समय तक बैठने दें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, चिपकने वाले को भंग करने में मदद करने के लिए कंटेनर को एक शेकर या किसी अन्य आंदोलनकारी पर रात भर रखें।
  नोट: टेप ही रहेगा, लेकिन चिपकने वाला हेप्टेन में भंग कर दिया जाएगा। चरण 5.1.2 में, गोंद को एक कवरस्लिप पर लागू किया जाता है; हेप्टेन वाष्पित हो जाता है, गोंद को पीछे छोड़ देता है।
4. एक ग्लास स्लाइड पर इसकी एक बूंद रखकर हेप्टेन गोंद की तैयारी का परीक्षण करें और यह सुनिश्चित करें कि हेप्टेन के वाष्पित होने के बाद एक चिपचिपा अवशेष बना रहता है। यदि चिपकने वाला अवशेष बाद में दिखाई नहीं देता है, तो कांच के कंटेनर में अधिक टेप जोड़ें और पिछले चरण को दोहराएं।
  नोट: एक बार तैयार होने के बाद, गोंद का उपयोग महीनों या वर्षों तक किया जा सकता है।
शुद्ध निर्जल DMSO में व्यावसायिक रूप से प्राप्त तैयारी को पतला करके एक 1 मिलीग्राम / एमएल (3.8 mM) BODIPY493/503 स्टॉक समाधान तैयार करें। इसे प्रकाश और पानी से बचाने के लिए इसे कवर रखें। -20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पावधि के लिए अनिश्चित काल तक स्टोर करें।

2. अंडे संग्रह पिंजरों तैयार

नोट: नियोजित इंजेक्शन (ओं) से पहले कम से कम एक दिन (अधिमानतः 2 या 3 दिन) ऐसा करें।

खमीर पेस्ट तैयार करें।
नोट: खमीर पेस्ट प्रोटीन और अन्य महत्वपूर्ण पोषक तत्वों की खुराक सेब का रस प्लेटों में प्रदान नहीं किया जाता है. यह अंडा उत्पादन और अंडे देने को बढ़ावा देता है।
1. सूखी बेकर के खमीर के 2-10 ग्राम जोड़ें, और फिर एक छोटे से बीकर में 1 मिलीलीटर नल का पानी। एक स्पैटुला का उपयोग करके मिलाएं।
2. 1 एमएल वेतन वृद्धि में नल का पानी जोड़ते रहें जब तक कि वांछित, टूथ-पेस्ट जैसी स्थिरता तक नहीं पहुंच जाता है।
3. मिश्रण को कवर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
अंडे के संग्रह के लिए मक्खी पिंजरों की स्थापना करें।
नोट: वांछित जीनोटाइप के नर और मादा मक्खियों की आवश्यकता होती है: 2 सप्ताह से कम उम्र की 10-50 महिलाएं और पुरुषों की समान संख्या। फ्लाई पिंजरों के लिए कई अलग-अलग विकल्प उपलब्ध हैं, जिनमें घर का बना विकल्प^14,13 शामिल हैं। यह महत्वपूर्ण है कि सेब के रस की प्लेटों का आकार मक्खी के पिंजरों के आकार से मेल खाता है।
1. एक सेब के रस की प्लेट पर खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा रखें। इसे कवर रखें और इसे कमरे के तापमान पर आने दें क्योंकि मक्खियां प्लेट पर अंडे नहीं देंगी यदि यह बहुत ठंडा है।
2. एक भ्रूण संग्रह पिंजरे के लिए मक्खियों स्थानांतरण, खमीर सेब का रस प्लेट के साथ सील, और भ्रूण संग्रह पिंजरे के लिए प्लेट को सुरक्षित.
3. नए स्थानांतरित मक्खियों को 1-2 दिनों के लिए पिंजरे में acclimate करने की अनुमति दें, प्लेट को दैनिक एक ताजा के साथ बदल दें। यदि सभी खमीर अगले दिन तक खाया गया है, तो भविष्य के संग्रह के लिए खमीर पेस्ट की मात्रा बढ़ाएं।
  नोट: यह अंडे की उपज बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि अच्छी तरह से खिलाया गया मादाएं अधिक अंडे देती हैं।

3. इंजेक्शन के दिन, इंजेक्शन समाधान तैयार करें और इसे सुई में लोड करें

इंजेक्शन समाधान के रूप में BODIPY 493/503 (DMSO में 3.8 mM) के स्टॉक समाधान का उपयोग करें।
सुई लोड िंग युक्तियों का उपयोग कर इंजेक्शन समाधान के 1 μL के साथ एक एकल सुई लोड करें।
नोट: हवा के बुलबुले फँसाने के बिना टिप के लिए सभी तरह से तरल प्राप्त करने का प्रयास करें। आकस्मिक टूटने के मामले में लोड की गई सुई को जल्दी से बदलने के लिए तैयार रहें।
1. एक माइक्रोपिपेट के लिए एक लोडिंग टिप संलग्न करें और टिप में इंजेक्शन समाधान के 1 μL ड्रा। दस्ताने का उपयोग करते हुए, टूटने के जोखिम को कम करने के लिए सुई को अपनी नोक के साथ एक हाथ में पकड़ें।
2. ध्यान से सुई में लोडिंग टिप डालें और इसे सुई की नोक के करीब धक्का दें। सुई की नोक के पास तरल वितरित करें। पिपेट को हटाने के बाद, सुई को इसकी नोक के साथ लंबवत रूप से पकड़ें जब तक कि तरल टिप पर प्रवाहित न हो जाए।
ऊपर के रूप में पुट्टी के साथ एक अलग कंटेनर में लोड की गई सुइयों को स्टोर करें (चरण 1.1.5 देखें)।
नोट: सुइयों को इंजेक्शन के अग्रिम (कई घंटों तक) में तैयार किया जाना चाहिए, लेकिन एक दिन से अधिक समय के बाद इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
रंगों के विरंजन को रोकने के लिए सुइयों को परिवेशी प्रकाश से बाहर रखें। सुई युक्तियों को नुकसान पहुंचाए बिना एल्यूमीनियम पन्नी के साथ भंडारण कंटेनर को कवर करें। सुनिश्चित करें कि सभी प्रकाश अस्पष्ट है।

4. इंजेक्शन के लिए भ्रूण एकत्र करना

नोट: संग्रह का समय इस बात पर निर्भर करता है कि भ्रूण के किस चरण में इंजेक्शन को निष्पादित करने की आवश्यकता है। नीचे दी गई समय योजना के साथ, इंजेक्शन की तैयारी के समय भ्रूण 0-90 मिनट पुराना होगा, जो दरार चरणों¹⁵ से मेल खाता है।

इंजेक्शन के दिन, खमीर के साथ सेब का रस प्लेटें तैयार करें, जैसा कि चरण 2.2.1 में है। यदि इंजेक्शन के एन राउंड की योजना बनाई गई है, तो एन + 2 प्लेटें तैयार करें। इन प्लेटों को कमरे के तापमान पर रखें।
नोट: इंजेक्शन के लिए भ्रूण एकत्र करने के लिए एन प्लेटों के अलावा, एक प्लेट को एक पूर्व-संग्रह प्लेट के रूप में आवश्यक है और संग्रह पूरा होने के बाद पिंजरे में मक्खियों को खिलाने के लिए एक और एक।
पिंजरे पर प्लेट को एक ताजा खमीर प्लेट (पूर्व-संग्रह प्लेट) के साथ बदलें और इसे 1-2 घंटे के लिए पिंजरे पर छोड़ दें।
पिंजरे पर प्लेट को एक ताजा प्लेट (संग्रह प्लेट) के साथ बदलें। पूर्व-संग्रह प्लेट को छोड़ दें, क्योंकि इसमें वांछित से पुराने भ्रूण होंगे। फिर, मक्खियों को 1.5 घंटे के लिए अंडे देने की अनुमति दें।
नोट: जैसा कि अच्छी तरह से खिलाया मक्खियों आमतौर पर अंडे निषेचित होने के तुरंत बाद अपने अंडे देते हैं, एक 1.5 घंटे का संग्रह समय आश्वस्त करता है कि संग्रह के अंत में, प्लेट पर अधिकांश भ्रूण 0-90 मिनट पुराने होते हैं, यानी, दरार चरणों में होते हैं। मादा मक्खियों को पिछले दिन से ताजा खमीर नहीं खिलाया गया है, वे बिछाने से पहले कुछ अनिश्चित समय के लिए निषेचित अंडे बनाए रखेंगे। इसलिए, पूर्व-संग्रह प्लेट में भ्रूण हो सकते हैं जो संग्रह की शुरुआत से पहले निषेचित थे और इस प्रकार 60 मिनट से अधिक पुराने होते हैं, कभी-कभी बहुत पुराने होते हैं।
पिंजरे पर प्लेट को एक ताजा खमीर प्लेट के साथ बदलें। संग्रह प्लेट को कवर करें ताकि आवारा मक्खियां उन पर अंडे न दें।

5. microinjection के लिए भ्रूण तैयार

आवश्यक सामग्री को इकट्ठा करें।
1. कांच की स्लाइड में डबल-साइडेड टेप का एक टुकड़ा संलग्न करें। उंगलियों के साथ टेप को छूने से बचें क्योंकि यह इसकी चिपचिपाहट को कम करता है।
  नोट:: इस स्लाइड chorion को निकालने के लिए और इमेजिंग के लिए नहीं करने के लिए उपयोग किया जाएगा।
2. एक स्थानांतरण पिपेट या एक माइक्रोपिपेट (p200 या p1000) का उपयोग करते हुए, हेप्टेन गोंद की एक छोटी बूंद (200 μL या उससे कम) को मोटे तौर पर एक आयताकार कवरस्लिप (60 x 25 मिमी) के केंद्र में रखें। हेप्टेन को वाष्पित होने दें (इसमें एक मिनट से भी कम समय लगता है)।
  नोट: इस coverslip इंजेक्शन और इमेजिंग के लिए भ्रूण माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। आयामों confocal माइक्रोस्कोप पर एक समायोज्य धातु धारक में फिट करने के लिए चुना जाता है।
3. एक desication कक्ष, एक सील कक्ष (उदाहरण के लिए, एक Tupperware सैंडविच बॉक्स) desication मोती युक्त इकट्ठा. केवल निर्जलीकरण मोतियों का उपयोग करें जो हाइड्रेटेड नहीं हैं।
  नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि भ्रूण इंजेक्शन समाधान लेते हैं, भ्रूण को आंतरिक दबाव को कम करने के लिए थोड़ा desiccated होना चाहिए। यह dechorionated, हवा उजागर भ्रूण के साथ coverslip desication कक्ष में रखकर किया जाता है.
यंत्रवत् कोरियोन को हटा दें।
1. अंडे के गोले को पारदर्शी बनाने के लिए हेलोकार्बन ऑयल 27 की एक पतली परत के साथ उचित रूप से वृद्ध भ्रूण प्लेट को कवर करें।
  नोट: भ्रूण¹⁵ सेकंड के दसियों के भीतर पारभासी हो जाते हैं। यदि यह चरण कुशलतासे नहीं होता है, तो सेब के रस की प्लेटें बहुत गीली हो सकती हैं और उपयोग से पहले सूखने की आवश्यकता हो सकती है।
2. भ्रूण के चरण की पुष्टि करने के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन (यानी, प्लेट के माध्यम से आईपीस में जाने वाला प्रकाश) के साथ एक विच्छेदन दायरे के तहत प्लेट को देखें।
3. दरार चरणों में भ्रूण का चयन करें।
  नोट: दरार चरण भ्रूण पूरी तरह से अपारदर्शी हैं; बाद के ब्लास्टोडर्म चरणों को अपारदर्शी केंद्र¹⁵ के चारों ओर पारदर्शी साइटोप्लाज्म के एक बैंड द्वारा पहचाना जा सकता है। विभिन्न भ्रूण चरणों को पहचानने के तरीके पर एक अच्छा परिचय वेबसाइट पर उपलब्ध है (संदर्भ¹⁶ में दिया गया है) विकासात्मक जीव विज्ञान के सोसायटी द्वारा बनाए रखा गया है।
4. ठीक चिमटी का उपयोग करते हुए, अपने पृष्ठीय उपांगों द्वारा वांछित चरण के एक भ्रूण को पकड़ो और इसे दो तरफा टेप के टुकड़े के साथ कवर किए गए तैयार ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें। भ्रूण को टेप पर रखें। तेल के हस्तांतरण को कम से कम करें।
5. जितना संभव हो उतना धीरे से, चिमटी की नोक के किनारे के साथ भ्रूण को धीरे से झुकाकर टेप की सतह पर भ्रूण को रोल करें। तेज चिमटी युक्तियों के साथ सीधे भ्रूण प्रहार न करें।
  नोट: यदि लागू बल बहुत कम है, तो भ्रूण रोल नहीं करेगा। यदि यह बहुत अधिक है, तो यह फट जाएगा। उपयुक्त मध्यवर्ती बल को खोजने के लिए अनुभव की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, इस चरण को पहले से ही अभ्यास किया जाना चाहिए।
6. भ्रूण को तब तक रोल करना जारी रखें जब तक कि चोरियन क्षणिक रूप से टेप और दरारों का पालन न करे।
7. एक बार जब चोरियन दरारें आ जाती हैं, तो भ्रूण को अलग करने के लिए रोलिंग करते रहें (अभी भी vitelline झिल्ली के अंदर) को चोरियन से chorion के रूप में chorion टेप से अटक रहता है।
8. पुष्टि करें कि भ्रूण से पृष्ठीय उपांगों के नुकसान को देखकर कोरियोन को पूरी तरह से हटा दिया जाता है।
9. भ्रूण को वापस चोरियन पर रोल करें, जो टेप की तुलना में कम चिपकने वाला है। धीरे चिमटी के साथ भ्रूण रगड़ जब तक यह हस्तांतरण के लिए चिमटी के लिए संलग्न करता है.
10. हेप्टेन गोंद के साथ कवरस्लिप में भ्रूण को स्थानांतरित करें और इसे गोंद के संपर्क में लाएं, जो आमतौर पर इसे चिमटी से अलग करता है।
11. coverslip पर भ्रूण के अभिविन्यास को समायोजित करें।
  1. भ्रूण की पार्श्व सतह को गोंद में एम्बेड करें।
    नोट: गोंद में एम्बेडेड भ्रूण की सतह वह है जिसे चित्रित किया जाएगा। पार्श्व सतह को एम्बेड करना सबसे सरल है, लेकिन इसे व्यक्तिगत वरीयता या जैविक प्रश्न के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  2. कवरस्लिप की लंबी धुरी के लंबवत भ्रूण की लंबी धुरी को उन्मुख करें।
  3. यदि भ्रूण पसंदीदा अभिविन्यास में नहीं रहता है, तो किसी भी तेल को हटाने के लिए चिमटी को साफ करें जो गोंद से भ्रूण को अलग करेगा। फिर, धीरे से भ्रूण को स्थिति में रोल करने का प्रयास करें।
12. ऊपर वर्णित तरीके से इंजेक्शन के लिए भ्रूण की वांछित संख्या तैयार करें।
  नोट: जैसे-जैसे कोरियन को हटाने के बाद समय बीतता है, परिवेशी हवा भ्रूण को विघटित करना शुरू कर देगी और इस प्रकार चरण 5.3 का प्रभाव कवरस्लिप पर भ्रूण के लिए असमान होगा, जो अलग-अलग समय पर डिकोरियोनेटेड थे। आमतौर पर, 1-3 भ्रूण सबसे अधिक प्रबंधनीय होते हैं।
निर्जलित भ्रूण.
1. तैयार desication कक्ष में भ्रूण के साथ coverslip जगह और यह सील.
2. भ्रूण को 5-12 मिनट के लिए desiccate करने की अनुमति दें।
  नोट: इस चरण का समय परिवेश के तापमान और आर्द्रता पर निर्भर करता है और इस प्रकार अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है।
3. कक्ष से coverslip निकालें और उस पर हेलोकार्बन तेल 700 की एक बूंद जगह, पूरी तरह से भ्रूण को कवर, आगे desication को रोकने के लिए.
4. उचित desication का न्याय करने के लिए एक विच्छेदन दायरे पर भ्रूण का निरीक्षण करें।
5. यदि भ्रूण को थोड़ा सा झुकाया जाता है, लेकिन डिफ्लेटेड नहीं किया जाता है, तो माइक्रोइंजेक्शन (चरण 6) पर आगे बढ़ें।
6. यदि भ्रूण पर्याप्त रूप से या अत्यधिक desiccated नहीं हैं, तो चरण 5.2 पर लौटें और भ्रूण का एक नया बैच तैयार करें क्योंकि हेलोकार्बन ऑयल 700 को हटाया नहीं जा सकता है। यदि भ्रूण को अत्यधिक desiccated थे, तो भ्रूण के अगले बैच के लिए 3 मिनट तक निर्जलीकरण समय को कम करें; यदि वे under-desiccated थे, तो 3 मिनट तक desication समय में वृद्धि।

6. Microinject भ्रूण

नोट: सुनिश्चित करें कि microinjection सेटअप में एक उल्टे माइक्रोस्कोप, इंजेक्शन सुई को पकड़ने और स्थिति में रखने के लिए एक माइक्रोमैनिपुलेटर, और नियंत्रित मात्रा देने के लिए एक वाणिज्यिक माइक्रोइंजेक्टर शामिल है।

माइक्रोइंजेक्टर पर पावर और पसंदीदा सेटिंग्स इनपुट करें।
नोट:: इस प्रोटोकॉल के लिए, यह रैखिक गति आउटपुट और तेजी से सेटिंग का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है, लेकिन कई अन्य काम करेंगे। ऑपरेटर को व्यक्तिगत वरीयता निर्धारित करनी चाहिए।
सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर में लोड करें। भ्रूण युक्त कवरस्लिप को लोड करते समय सुई को क्षतिग्रस्त होने से रोकने के लिए, इसे सुरक्षित स्थिति में रास्ते से बाहर ले जाएं।
कवरस्लिप को मंच पर रखें, शीर्ष पर भ्रूण के साथ, सुई की ओर। फिर, ध्यान से सुई को इंजेक्शन के लिए स्थिति में वापस ले जाएं, इसकी नोक अभी भी मंच से ऊपर है।
4x उद्देश्य को प्रकाश पथ में रखें। माइक्रोस्कोप पर फोकस घुंडी का उपयोग करते हुए, भ्रूण को ध्यान में लाएं।
नोट: यह इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाने वाला फोकल प्लेन होगा और इसे केवल न्यूनतम रूप से आगे बढ़ने के लिए समायोजित किया जाएगा।
चरण नियंत्रण का उपयोग करते हुए, भ्रूण को क्षैतिज रूप से दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में ले जाएं।
1. सुई को कम करने की तैयारी में, भ्रूण से दूर पैन, उन्हें देखने के क्षेत्र के किनारे पर रखते हुए। यह सुनिश्चित करने के लिए एक ही फोकल प्लेन में रहें कि सुई को सही स्थिति में उतारा जाए।
सुई की नोक को सही फोकल प्लेन में कम करें और सुनिश्चित करें कि यह भ्रूण के साथ दृश्य के क्षेत्र में दिखाई दे रहा है।
1. माइक्रोमैनिपुलेटर नियंत्रण का उपयोग करना और ऊपर से देखना (अभी तक आईपीस के माध्यम से नहीं), धीरे-धीरे सुई की नोक को तेल में छोड़ दें, उस क्षेत्र के लिए लक्ष्य रखें जहां उद्देश्य इंगित करता है। चूंकि तेल काफी चिपचिपा है, इसलिए सुई को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धीरे-धीरे जाएं।
2. एक बार जब सुई आईपीस के माध्यम से दिखाई देती है, तो माइक्रोमैनिपुलेटर नियंत्रण का उपयोग करना जारी रखें जब तक कि सुई की नोक फोकस में न हो और दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में न हो।
3. चरण को स्थानांतरित करके, भ्रूण को दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में वापस लाएं। चरण नियंत्रण, micromanipulator नियंत्रण का उपयोग करें, और ध्यान केंद्रित घुंडी भ्रूण की स्थिति को ठीक ट्यून करने के लिए और एक दूसरे के सापेक्ष सुई टिप जबकि दोनों फोकस में हैं. जितना संभव हो सके कवरस्लिप के करीब इंजेक्शन करने का लक्ष्य रखें।
सुई गुणवत्ता नियंत्रण करें।
1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सुई कार्यात्मक है, भ्रूण के आसपास के हेलोकार्बन ऑयल 700 में कुछ इंजेक्शन समाधान वितरित करें, जो तेल में बुलबुले के रूप में दिखाई देता है।
2. यदि सुई से कुछ भी नहीं बह रहा है, तो धीरे-धीरे इंजेक्टर पर दबाव बढ़ाएं। यदि यह काम नहीं करता है, तो एक नई सुई प्राप्त करें।
भ्रूण को इंजेक्ट करें।
नोट: स्वीकार्य इंजेक्शन वॉल्यूम ~ 0.06-1 pL से रेंज। निचली सीमा इस बात से निर्धारित होती है कि भ्रूण में प्रवेश करने की कल्पना क्या की जा सकती है। ऊपरी सीमा आघात द्वारा निर्धारित की जाती है जो इंजेक्शन भ्रूण पर लगाता है।
1. भ्रूण के पार्श्व किनारों के साथ इंजेक्ट करें क्योंकि यह कम से कम आक्रामक है।
2. चरण नियंत्रण का उपयोग करते हुए, भ्रूण को सुई की नोक की ओर ले जाएं जब तक कि बाद वाला धीरे से भ्रूण को पंचर न कर दे और इसमें प्रवेश न कर दे।
3. उसी समय, इंजेक्शन समाधान का प्रवाह शुरू करें और सुई की नोक की साइट पर एक क्षणिक स्पष्ट स्थान की उपस्थिति के लिए देखें, जो भ्रूण में तरल के सफल हस्तांतरण को इंगित करता है।
4. भ्रूण की निगरानी करें। यदि भ्रूण सुई का विरोध करता है और प्रवेश पर टूट जाता है (साइटोप्लाज्म स्क्वर्ट्स आउट) करता है, तो चरण 5 पर लौटें और निर्जलीकरण समय बढ़ाएं। यदि भ्रूण कवरस्लिप के खिलाफ सपाट है और इंजेक्शन के दौरान फ्लॉपी दिखाई देता है, तो चरण 5 पर लौटें, और निर्जलीकरण समय को कम करें।
5. यदि कोई डाई भ्रूण में प्रवेश नहीं करती है, तो पुष्टि करें कि डाई अभी भी चरण 6.7 के रूप में सुई से स्वतंत्र रूप से प्रवाहित हो सकती है। यदि डाई प्रवाहित नहीं होती है, तो सुई को बदलें। यदि डाई प्रवाहित होती है, तो एक नया भ्रूण इंजेक्ट करें, और सुई के भ्रूण को पंचर करने से ठीक पहले डाई को छोड़ना शुरू करें।
  नोट: एक ही भ्रूण के दोहराए गए इंजेक्शन की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह पिछले घाव / इंजेक्शन साइट को तोड़ता है।
तब तक दोहराएं जब तक कि सभी भ्रूण इंजेक्ट न हो जाएं।

7. छवि भ्रूण

नोट: यह प्रोटोकॉल एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर धातु धारक में कवरस्लिप रखें ताकि भ्रूण को कवरस्लिप के माध्यम से नीचे से सीधे चित्रित किया जा सके; कवरस्लिप के ऊपर, केवल तेल है और कोई अन्य बाधा नहीं है।
एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में, छवि पहले confocal माइक्रोस्कोप पर epifluorescence समारोह का उपयोग कर, एक 40x उद्देश्य के साथ. सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले भ्रूण में फ्लोरोफोर दिखाई दे रहा है।
यदि इमेजिंग का वांछित विमान इंजेक्शन की साइट से अलग है, तो डाई को लक्ष्य क्षेत्र में फैलाने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें।
नोट:: BOPIPY 493/503 के लिए, यह समय आमतौर पर 30-60 मिनट से होता है। चूंकि प्रसार समय डाई पर बहुत निर्भर करता है, इसलिए अन्य रंजक को इंजेक्शन और प्रतीक्षा समय की साइट को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
विभिन्न पैमानों पर इमेजिंग के लिए विभिन्न उद्देश्यों का उपयोग करें। सभी भ्रूण को प्रतिबिंबित करने के लिए 40x उद्देश्य का उपयोग करें और छोटे तराजू के लिए उप-वर्गों की छवि के लिए 63x उद्देश्य।
सेलुलरीकरण से पहले सिंक्टियल चरणों के दौरान लाइव इमेजिंग के लिए, शुरू करने के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग करें: 512 x 512 पिक्सेल की छवि का आकार, 3 की रेखा औसत, प्रति सेकंड 0.1 फ्रेम की फ्रेम दर (यानी, हर 10 सेकंड में 1 फ्रेम का अधिग्रहण)। नियोजित माइक्रोस्कोप की क्षमताओं के अनुसार शर्तों को समायोजित करें।
नोट: ये शर्तें BOPIPY 493/503 से ~ 500+ छवियों को प्राप्त करने और अधिकांश गति पर कब्जा करने की अनुमति देती हैं।

8. पहले फिजी का उपयोग करके एलडी प्रवाह का विश्लेषण छवियों की एक समय श्रृंखला तैयार करने के लिए, और फिर PIV विश्लेषण के लिए पायथन

छवि अधिग्रहण ऑप्टिमाइज़ करें.
1. उचित चरण में वांछित डाई के इंजेक्शन का प्रदर्शन करें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि दिन-प्रतिदिन भिन्नता नगण्य न हो जाए।
2. आवर्धन, ज़ूम, रिज़ॉल्यूशन और फ़्रेम दर सहित छवि अधिग्रहण सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें.
  नोट: उच्च गुणवत्ता वाली छवियों (रिज़ॉल्यूशन + लाइन औसत) और अधिग्रहण गति (फ्रेम दर) के बीच एक ट्रेडऑफ है।
फिजी में डेटा तैयार करें।
1. विश्लेषण करने के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाली समय श्रृंखला प्राप्त करें।
2. फिजी के साथ एक मुखौटा उत्पन्न करने के लिए समय श्रृंखला का एक फ्रेम खोलें। छवि डुप्लिकेट करें. छवि के प्रकार को 8 बिट में कनवर्ट करें.
3. बहुभुज या फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके भ्रूण की सीमा निर्धारित करें। चयन के बाहर पिक्सेल मानों को 0 पर सेट करने के लिए बाहर साफ़ करें का उपयोग करें. साफ़ करें और तब चयन के भीतर पिक्सेल का मान अधिकतम मान (255) पर सेट करने के लिए चयन में उलटें.
4. अचयनित करें, फिर यह सुनिश्चित करने के लिए हिस्टोग्राम आदेश का उपयोग करें कि केवल 0 और 255 के पिक्सेल मान मौजूद हैं.
5. विशिष्ट समय श्रृंखला के लिए इस नए छवि मुखौटा को सहेजें।
6. ब्याज की समय श्रृंखला खोलें। चुनें कि कौन से दस फ्रेम ब्याज के समय को सबसे अच्छा कैप्चर करते हैं, उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल संकुचन की शुरुआत में परमाणु चक्र 9। ब्याज के दस फ्रेम डुप्लिकेट, एक substack बनाने.
7. PIV के साथ विश्लेषण करने के लिए 10 छवियों को उत्पन्न करने के लिए छवियों के लिए स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग करें।
8. अलग-अलग फ़ाइलों को इस तरह से सहेजें जो उनके क्रम को संरक्षित करता है (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...)।
PIV विश्लेषण के लिए तैयार मास्क और व्यक्तिगत फ़्रेम का उपयोग करें, प्रदान की गई नमूना पायथन स्क्रिप्ट (पूरक डेटा) या उपयोगकर्ता द्वारा उत्पन्न एक कस्टम स्क्रिप्ट को नियोजित करें।
नोट:: प्रदान की गई स्क्रिप्ट OpenPIV¹⁷ के पायथन अनुप्रयोग पर आधारित है। यह पिक्सेल में दूरी को आउटपुट करता है जिसे गति या वेग उत्पन्न करने के लिए पिक्सेल चौड़ाई और फ्रेम दर का उपयोग करके परिवर्तित किया जा सकता है।
अतिरिक्त भ्रूण के लिए पिछले चरणों को पूरा करने और आउटपुट मानों को संकलित करके प्रतिकृति उत्पन्न करें।

Representative Results

इंजेक्शन के बाद, डाई को केवल उस साइट पर स्थानीयकृत किया जाएगा जहां सुई की नोक डाली गई थी। डाई तब अपनी विसर्पण विशेषताओं के आधार पर इंजेक्शन साइट से दूर फैल जाएगी। चित्रा 1 BODIPY 493/503 के इंजेक्शन से पता चलता है, इंजेक्शन (पैनल ए) के तुरंत बाद और 24 मिनट बाद (पैनल बी)। 24 मिनट के बाद, डाई ने इसे भ्रूण की लंबी धुरी के मध्य बिंदु पर लगभग बना दिया है।

ऑर्गेनेल गतिशीलता का विश्लेषण डाई इंजेक्शन और समय-अंतराल इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 2 में, एक भ्रूण को BODIPY 493/503 (चित्रा 2A) और LysoTracker Red (चित्रा 2B) के साथ सह-इंजेक्ट किया गया था और क्रमशः 488 और 596 एनएम पर लेजर उत्तेजना का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इस भ्रूण को तब समय-अंतराल इमेज किया गया था (30 मिनट के लिए हर 30 सेकंड में एक फ्रेम, 5 मिनट का विश्लेषण किया गया)। समय श्रृंखला को तब PIV विश्लेषण के माध्यम से चलाया गया था, जिसका आउटपुट चित्रा 2A, B में सुव्यवस्थित के माध्यम से दिखाया गया है। ध्यान दें कि सुव्यवस्थित व्यक्तिगत कणों के प्रक्षेपवक्र का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, लेकिन साइटोप्लाज्मिक प्रवाह को साइटोप्लाज्म के उस क्षेत्र में सभी कणों का विश्लेषण करने से अनुमान लगाया जाता है। दो स्वतंत्र सेलुलर संरचनाओं (एलडी और अम्लीय ऑर्गेनेल) के लेबलिंग के माध्यम से, पीआईवी विश्लेषण समान प्रवाह पाता है, दोनों लेबल भ्रूण के केंद्रीय क्षेत्र पर अभिसरण करते हैं जहां साइटोप्लाज्म भ्रूण के इंटीरियर⁶ में बह रहा है।

वर्तमान में उपलब्ध एफपी कई अन्य ऑर्गेनेल और सेलुलर संरचनाओं के लेबलिंग की अनुमति देते हैं। चित्रा 3 ईआर ट्रैकर ग्रीन के माध्यम से ईआर की लेबलिंग दिखाता है ईआर ट्रैकर परमाणु लिफाफे का एक अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, जिससे प्रमुख सेल चक्र चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। ईआर ट्रैकर ग्रीन 488 एनएम उत्तेजना का उपयोग कर imaged है.

माइटोकॉन्ड्रिया की लेबलिंग मुश्किल है, क्योंकि परीक्षण किए गए अधिकांश रंजक पहले माइटोकॉन्ड्रियन में फंस जाते हैं जो वे दर्ज करते हैं। दूसरी ओर, डाई विषाक्तता का कोई संकेत नहीं पाया गया था, जिससे सेलुलराइजेशन और एक्टोडर्मल परमाणु चक्र 15 के माध्यम से लेबल किए गए माइटोकॉन्ड्रिया का पालन करना संभव हो गया। चित्रा 4 एक एक्टोडर्मल सेल को कई घंटे बाद इंजेक्शन के साथ Mitoview 633 (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 633 एनएम) से पता चलता है।

BODIPY, Lysotracker, और LipidSpot मजबूत हैं और 512 x 512, लाइन औसत 3, 1/s से 0.1/s तक फ्रेम दरों पर ~ 500+ छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

ब्लास्टोडर्म चरणों में शुरू होकर, एलडी सूक्ष्मनलिकाएं के साथ द्विदिश रूप से आगे बढ़ते हैं, जो विपरीत-ध्रुवीयता मोटर्स किनेसिन -1 और साइटोप्लाज्मिक डायनेइन 5 द्वारा संचालित होते^हैं। इस गति को BODIPY 493/503 और SiR-Tubulin (चित्रा 5) दोनों को इंजेक्ट करने के माध्यम से एलडी और सूक्ष्मनलिकाएं सह-लेबलिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। चूंकि एलडी अक्सर आंदोलन की अपनी दिशा को उलट देते हैं (जैसा कि वे किनेसिन -1 और साइटोप्लाज्मिक डायनेइन के बीच स्विच करते हैं), अधिग्रहण के दौरान उच्च फ्रेम दरें एलडी गतिशीलता के महत्वपूर्ण विवरणों को बेहतर तरीके से कैप्चर करती हैं।

डाई इंजेक्शन के किसी भी रूप के बिना ऑटोफ्लोरोसेंट जर्दी पुटिकाओं की लाइव इमेजिंग संभव है (चित्रा 6)। हालांकि, autofluorescence मंद है, और उत्तेजना लेजर phototoxic है। इस प्रकार, ऑटोफ्लोरोसेंट जर्दी की लाइव इमेजिंग में डाई इंजेक्शन के सापेक्ष एक खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है।

चित्रा 1: भ्रूण के माध्यम से BODIPY 493/503 का प्रसार। डाई को पूर्वकाल के अंत (ऊपर दाएं) की ओर पार्श्व किनारे के साथ इंजेक्ट किया गया था और इस इंजेक्शन साइट से भ्रूण में फैलता है, एलडी लेबल करता है। (ए) डाई इंजेक्शन साइट से सटे भ्रूण के कुछ हिस्सों के माध्यम से फैल गया है। (बी) लगभग 24 मिनट / 2 परमाणु चक्र बाद में, डाई भ्रूण के मध्य बिंदु से पहले फैल गई है। स्केल बार: 100 μm. एक 1024 x 1024 फ्रेम (लाइन औसत 4) हर 30 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: एलडी और अम्लीय ऑर्गेनेल के लिए कण छवि velocimetry (PIV)। एक भ्रूण दोनों BODIPY 493/503 और LysoTracker लाल के साथ इंजेक्ट किया गया था। (ए) बोडीपी चैनल। (बी) लाइसोट्रैकर रेड चैनल। (A', B') 10 अनुक्रमिक फ़्रेमों से उत्पन्न दो चैनलों के PIV विश्लेषण द्वारा उत्पन्न आरेखों को सुव्यवस्थित करें, जिनमें A और B में दिखाए गए चैनल शामिल हैं। ए ' एलडी के प्रवाह से मेल खाता है, और बी' अम्लीय ऑर्गेनेल के प्रवाह से मेल खाता है। ध्यान दें कि ए और बी दोनों एक बाएं-केंद्र संगम दिखाते हैं जहां भ्रूण सामग्री दृश्य के विमान से बाहर बह रही है, भ्रूण के केंद्र में। इसके अलावा, ध्यान दें कि BODIPY ने LysoTracker से अधिक फैलाया है क्योंकि विभिन्न रंगों में अलग-अलग विसर्पण गुण होते हैं। स्केल बार: 100 μm. एक 1024 x 1024 फ्रेम (लाइन औसत 4) हर 30 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: ईआर ट्रैकर लेबल syncytial परमाणु प्रभागों. एक syncytial blastoderm भ्रूण ईआर ट्रैकर के साथ microinjected था और इसकी सतह का एक हिस्सा समय के साथ चित्रित किया गया था। (ए) एक परमाणु विभाजन के दौरान स्पिंडल असेंबली। (बी) एक ही विभाजन के दौरान परमाणु लिफाफे का अवशोषण। (c) बाद के इंटरफेज़। (डी) अगले विभाजन की शुरुआत सेंट्रोसोम उपस्थिति (परिपत्र ईआर-मुक्त क्षेत्रों की घटना, एरोहेड्स द्वारा चिह्नित) द्वारा इंगित की जाती है। क्रमिक डाई ब्लीचिंग पर ध्यान दें। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 488 एनएम। स्केल बार: 5 μm. A: प्रारंभिक फ्रेम, B: 3 मिनट बीत चुका है, C: 10 मिनट बीत चुका है, D: 13 मिनट बीत चुका है। एक 1024 x 1024 फ्रेम (लाइन औसत 4) हर 30 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: माइटोकॉन्ड्रिया के Mitoview 633 लेबलिंग। एक भ्रूण को सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान मिटोव्यू 633 के साथ इंजेक्ट किया गया था और सेलुलराइजेशन के बाद 4 घंटे बाद चित्रित किया गया था। छवि रोगाणु-बैंड विस्तार में एक भ्रूण की एक न्यूरोइक्टोडर्मल कोशिका दिखाती है। स्केल बार: 5 μm. एक 1024 x 1024 फ्रेम (लाइन औसत 4) हर 30 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5: एलडी और सूक्ष्मनलिकाएं की सह-लेबलिंग। एक सेलुलरिंग भ्रूण को BODIPY 493/503 (पीला A, B, C) और SiR ट्यूबुलिन (magenta A', B', C') के मिश्रण के साथ इंजेक्ट किया गया था। A', B', C' मर्ज किए गए चैनलों को दिखाते हैं। पैनल ए, ए और ए ' प्रारंभिक फ्रेम दिखाते हैं, पैनल बी, बी' और बी ' 5 एस के बाद फ्रेम दिखाते हैं, और पैनल सी, सी और सी '10 सेकंड के बाद फ्रेम दिखाते हैं। स्केल बार: 5 μm. एक 512 x 512 फ्रेम (लाइन औसत 3) हर 2.5 s का अधिग्रहण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6: इमेजिंग जर्दी पुटिका autofluorescence syncytial दरार चरणों के दौरान. (A) अधिग्रहण की शुरुआत में. (B) 8 मिनट के बाद (C) 16 मिनट के बाद। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 405 एनएम। भ्रूण को जीवित रखने के लिए कम उत्तेजना तीव्रता का उपयोग किया गया था। स्केल बार: 100 μm. एक 1024 x 1024 फ्रेम (लाइन औसत 4) हर 30 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक डेटा. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

ड्रोसोफिला भ्रूण सेलुलर और जीव जीव विज्ञान में मौलिक प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और सुविधाजनक मॉडल है। इसकी सापेक्ष सादगी, शक्तिशाली आनुवांशिकी, और छोटे आकार इसे सेलुलर प्रक्रियाओं और विकास दोनों को इमेजिंग के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली बनाते हैं। यहां, एक मानक माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल को भ्रूण में एफपी उपयोग को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यह दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोरस की आवश्यकता के बिना विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जिससे इमेजिंग के लिए कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि खुलती हैं। एकाधिक रंजक के संयोजन के साथ-साथ रणनीतिक रूप से चुने गए फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन दृश्यमान प्रकाश के पूरे स्पेक्ट्रम को फैलाने वाले मल्टीचैनल लाइव इमेजिंग को खोल सकते हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण:
यह प्रोटोकॉल LDs लेबल करने के लिए BODIPY 493/503 का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण को आसानी से अन्य सेलुलर संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। बाद के छवि विश्लेषण के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, यानी, पृष्ठभूमि संकेत की तुलना में डाई की चमक। लाइसोसोम को सफलतापूर्वक चित्रित किया गया है (लाइसोट्रैकर रेड, 1 एमएम), साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया (माइटोकॉन्ड्रिया 633, 200 μM), ईआर (ईआर ट्रैकर ग्रीन, 10 μM), और सूक्ष्मनलिकाएं (एसआईआर ट्यूबुलिन, डीएमएसओ में 200 एनएम), जैसा कि चित्र 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5 में दिखाया गया है। इसके अलावा, जर्दी पुटिकाएं ऑटोफ्लोरोसेंट होती हैं और यूवी उत्तेजना पर नीली रोशनी देती हैं (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (चित्रा 6) के रूप में 405 एनएम का उपयोग करके छवि)। अन्य रंजक के लिए, डाई एकाग्रता के लिए लक्ष्य 100-1,000x होने के लिए क्या सुसंस्कृत कोशिकाओं को जीवित धुंधला करने के लिए आवश्यक होगा; यह एक स्टॉक समाधान की एकाग्रता के समान है जिसे सेल संस्कृति मीडिया में पतला किया जाएगा। जैसा कि यह प्रोटोकॉल 100 fL के इंजेक्शन के लिए कहता है और ड्रोसोफिला भ्रूण वॉल्यूम 18 में लगभग 9^nL है, ये डाई सांद्रता सेल संस्कृति मीडिया में मौजूद 1/100 वें से कम की आंतरिक भ्रूण एकाग्रता के लिए औसत होगी। अस्थायी रूप से, इंजेक्शन की साइट पर स्थानीय एकाग्रता अधिक होगी, जो एफपी के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक है जो अच्छी तरह से फैलाते नहीं हैं (यानी, माइटोकॉन्ड्रियल रंजक और एसआईआर-ट्यूबुलिन)। इन एफपी के लिए, अनुशंसित उच्च सांद्रता से शुरू करें; यदि अप्रत्याशित मृत्यु देखी जाती है, तो जीवित रहने और संकेत की ताकत के बीच एक स्वीकार्य समझौता होने तक क्रमिक रूप से दो गुना पतला करें।

जब कई रंगों को सह-इंजेक्ट किया जाता है, तो दोनों रंजक या तो एक ही विलायक में होने चाहिए, या सॉल्वैंट्स और रंजक दोनों को मिश्रण के साथ संगत होना चाहिए (~ 10% से अधिक अल्कोहल सांद्रता की सिफारिश नहीं की जाती है)।

सुइयों की गुणवत्ता इस प्रक्रिया की सफलता के लिए आवश्यक है, क्योंकि टिप को यथासंभव ठीक होने की आवश्यकता है। अन्यथा, इंजेक्शन घाव से नुकसान भ्रूण के बाद के विकास से समझौता कर सकता है। जैसा कि वाणिज्यिक सुई खींचने वाले अलग-अलग होते हैं, निर्माता के सुझावों का पालन करना और वांछित आकार प्राप्त होने तक कई खींचने वाले मापदंडों का प्रयास करना महत्वपूर्ण है। गुणवत्ता नियंत्रण चरण 1.1.3 को निष्पादित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि एक फटा हुआ, जकड़ा हुआ, या बड़े बोर सुई की नोक के साथ काम करना सफल इंजेक्शन को और अधिक कठिन या यहां तक कि असंभव बना देगा।

भ्रूण को आंशिक रूप से निर्जलित करने की आवश्यकता होती है ताकि इंजेक्शन के दौरान तरल की अतिरिक्त मात्रा जोड़ी जा सके। यदि भ्रूण को कम-desiccated है, तो सुई आसानी से प्रवेश नहीं करेगी, और सुई के प्रवेश के रूप में या समाधान इंजेक्ट किए जाने के रूप में साइटोप्लाज्म बाहर निकल जाएगा। यदि भ्रूण को अधिक desiccated है, तो यह deflated दिखेगा और ठीक से विकसित नहीं होगा। सटीक सुखाने का समय स्थानीय स्थितियों पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, हवा की आर्द्रता, और दिन-प्रतिदिन बदल सकती है। यह प्रत्येक सत्र के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

माइक्रोइंजेक्शन के बाद जीवित रहने के लिए भ्रूण की क्षमता सुई की गुणवत्ता, उचित निर्जलीकरण, और इंजेक्शन की मात्रा को 1 पीएल (आदर्श रूप से 100 एफएल) से कम तक सीमित करने पर गंभीर रूप से निर्भर करती है। जब तक इन मापदंडों को अनुकूलित किया जाता है, तब तक कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता स्पष्ट नहीं होती है जब वर्णित रंजक को अनुशंसित सांद्रता में इंजेक्ट किया जाता है। यदि भ्रूण निर्जलीकरण और इंजेक्शन चरणों से बचते हैं, तो वे आमतौर पर रोगाणु-बैंड विस्तार में सफलतापूर्वक अच्छी तरह से विकसित होते हैं, एक अपवाद सूक्ष्मनलिकाएं और ईआर जांच होती है जो उच्च स्तर पर सेलुलरीकरण दोषों का कारण बनती है (प्रत्येक के स्टॉक एकाग्रता का 100 एफएल इंजेक्शन)। परीक्षण में कोई स्पष्ट विकासात्मक दोष नहीं पाया गया जब डीएमएसओ, पानी और दोनों के मिश्रण को अनुशंसित मात्रा में इंजेक्ट किया गया था, जिसमें ~ 75% या उससे अधिक के रोगाणु-बैंड विस्तार के माध्यम से भ्रूण जीवित रहने की दर थी। 1 pL से अधिक इंजेक्शन की मात्रा दोषों और भ्रूण के कारण ~ 4 pL वॉल्यूम के साथ इंजेक्ट किया गया जो 1 घंटे से भी कम समय के लिए विकसित किया गया था। इसलिए, इंजेक्शन की मात्रा को कम रखने की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि डाई सांद्रता उच्च होनी चाहिए।

आम तौर पर, भ्रूण के पार्श्व किनारे के साथ इंजेक्शन की सिफारिश की जाती है क्योंकि उन लोगों के परिणामस्वरूप कम से कम नुकसान होता है। हालांकि, इंजेक्शन साइट को नियोजित एफपी के विसर्पण गुणों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। BODIPY 493/503 और LysoTracker लिपिड स्पॉट 610 (एलडी को चिह्नित करने के लिए एक और डाई) की तुलना में पूरे भ्रूण में तेजी से फैलता है, जबकि एसआईआर-ट्यूबुलिन और मिटोव्यू 633 भ्रूण में पूरी तरह से फैलता नहीं है (7 एच पोस्ट-इंजेक्शन के रूप में देर से इमेजिंग)। इस प्रकार, ब्याज की साइट में या उसके पास इंजेक्शन आवश्यक हो सकता है। पूर्वकाल या पीछे के क्षेत्रों में इंजेक्शन लगाते समय, एक विशेष रूप से ठीक सुई की सिफारिश की जाती है।

छवि अधिग्रहण ऑप्टिकल रूप से अनुभाग और छोटे ऑर्गेनेल और सभी साइटोस्केलेटल घटकों को हल करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर निर्भर करता है। कई छवियों (जैसे, STORM या PALM) के विश्लेषण की आवश्यकता वाली तकनीकें काम नहीं करेंगी क्योंकि भ्रूण सामग्री गति में हैं और फ्लोरोफोर्स को फोटोस्विचिंग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में अधिकांश ऑर्गेनेल और छोटे सेलुलर संरचनाओं को बनाने के लिए पार्श्व और अक्षीय संकल्प का अभाव होता है। इन कारणों से, एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करने या प्रकाश शीट तकनीक को नियोजित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

छवि विश्लेषण की पुनरुत्पादकता सुसंगत इमेजिंग डेटा पर बहुत निर्भर करती है। सफलता की सबसे बड़ी संभावना के लिए, इंजेक्शन तकनीक और छवि अधिग्रहण के अनुकूलन की आवश्यकता है। एक ऐसी तकनीक की स्थापना और अभ्यास करना जहां ब्याज के डाई (ओं), इंजेक्शन की साइट, भ्रूण की उम्र, इंजेक्शन की मात्रा और अधिग्रहण सेटअप सभी सुसंगत हैं, छवि विश्लेषण के लिए सबसे मजबूत डेटा उत्पन्न करेंगे।

विधि के संशोधन और समस्या निवारण
यह प्रोटोकॉल कण छवि velocimetry का उपयोग कर दरार चरण भ्रूण में LDs के थोक प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए एक विधि को प्रदर्शित करता है। एक ही दृष्टिकोण का उपयोग अन्य ऑर्गेनेल, अन्य विकास चरणों और अन्य विश्लेषण विधियों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 भ्रूणजनन के syncytial चरणों में बहने वाले LDs और अम्लीय ऑर्गेनेल का विश्लेषण दिखाता है, जो BODIPY 493/503 और LysoTracker Red को सह-इंजेक्ट करके विज़ुअलाइज़ किया गया है। निषेचन के बाद 7 ज तक भ्रूण में एलडी गति की आगे सफल इमेजिंग प्राप्त की गई है; ये भ्रूण इंजेक्शन घाव को बनाए रखते हैं लेकिन कई घंटों तक विकसित करने में सक्षम होते हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा का उपयोग कण छवि वेलोसिमेट्री के लिए किया गया है, लेकिन कई अन्य विश्लेषण तकनीकें उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, ImageJ, Imaris, या मैनुअल ट्रैकिंग में पाए जाने वाले कण ट्रैकिंग कार्यक्रमों का उपयोग चलती संरचनाओं के वेग और दिशात्मकताओं को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ध्यान दें कि इस तरह के अधिकांश ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर प्लानर सेल कल्चर सिस्टम से डेटा के साथ काम करने के लिए बनाए जाते हैं और हमेशा ड्रोसोफिला भ्रूण जैसी 3 डी संरचनाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित नहीं होते हैं। इसके अलावा, सबसे अच्छी गुणवत्ता वाले कण ट्रैकिंग डेटा की पीढ़ी के लिए, कई जेड विमानों को चित्रित करने की आवश्यकता होगी; यह संभव होना चाहिए अगर छवि स्टैक अधिग्रहण समय ~ 2 एस के तहत कर रहे हैं. इस बेंचमार्क कताई डिस्क confocal, जाली प्रकाश शीट, और हाल ही में लेजर स्कैनिंग confocal प्रणालियों पर पहुँच योग्य होना चाहिए. हालांकि, एलडी, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम जैसे प्रचुर मात्रा में ऑर्गेनेल के लिए कण ट्रैकिंग की व्यवहार्यता कम है क्योंकि वर्तमान ट्रैकिंग विधियों के लिए दृश्य के क्षेत्र में सकारात्मक संकेत की मात्रा बहुत अधिक है। नाभिक या जर्दी पुटिकाओं जैसी कम प्रचुर मात्रा में संरचनाओं का ट्रैकिंग संभव हो सकता है। प्रवाह विश्लेषण के लिए PIV दरार चरणों में एलडी और अम्लीय ऑर्गेनेल के लिए अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि दोनों ऑर्गेनेल स्वतंत्र रूप से चलते हैं। नाभिक, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल को अन्य सेलुलर संरचनाओं से जोड़ा जाता है और इस प्रकार स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित नहीं होते हैं और सॉफ्टवेयर विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं जो मुक्त गति को मानते हैं। अन्वेषक को ब्याज के ऑर्गेनेल के लिए सबसे उपयुक्त तकनीकों को चुनना चाहिए।

syncytial और सेलुलर ब्लास्टोडर्म चरणों के दौरान, LDs (साथ ही साथ कुछ अन्य ऑर्गेनेल) रेडियल रूप से उन्मुख सूक्ष्मनलिकाएं 5 के साथ चलते^हैं। इसलिए क्रॉस-सेक्शनल दृश्यों को ढूंढना संभव है (जैसे कि चित्रा 5 में) जहां एकल सूक्ष्मनलिकाएं लंबी दूरी के लिए ध्यान में हैं, जिससे 2 डी में कण ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। चूंकि ये ऑप्टिकल विमान भ्रूण के भीतर गहरे होते हैं, इसलिए समग्र सिग्नल ताकत कम हो जाती है, और सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम हो जाता है।

ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए, जितनी जल्दी हो सके इमेजिंग गति के महत्वपूर्ण विवरणों को प्रकट कर सकती है और इस प्रकार गतिशील मशीनरी की। उदाहरण के लिए, लिपिड-ड्रॉपलेट गति दो गतिशील राज्यों, धीमी गति (~ 200 एनएम / एस; औसत यात्रा दूरी ~ 100 एनएम) और तेजी से लंबी गति (~ 450 एनएम / एस; औसत यात्रा दूरी ~ 1,000 एनएम) ¹⁹ का मिश्रण है; इस प्रकार, यदि छवियों को हर दूसरे या उससे भी कम बार लिया जाता है, तो धीमी गति से छोटी स्थिति का पता नहीं लगाया जा सकता है। हालांकि, लगातार इमेजिंग भी फ्लोरोफोर ब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करती है। इमेजिंग शर्तों, इसलिए, संबोधित करने के लिए सटीक प्रश्न के आधार पर समायोजित किया जाना है।

विधि की सीमाएँ
वांछित डाई के आधार पर, विधि डाई घुलनशीलता और इंजेक्शन समाधान की विषाक्तता के बीच संगतता द्वारा सीमित किया जा सकता है। आइसोप्रोपेनॉल और इथेनॉल जैसे अल्कोहल को उनकी कम चिपचिपाहट के कारण सुई के भीतर संभालना मुश्किल होता है और सेलुलर घटकों को नुकसान पहुंचाने और भ्रूण को मारने के लिए दिखाई देता है।

यह विधि भ्रूणजनन में शुरुआती चरणों की कल्पना करने के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है क्योंकि इंजेक्शन के लिए भ्रूण को तैयार करने में 30 + मिनट लगते हैं। कमरे के तापमान पर, भ्रूण के प्रारंभिक सेल चक्र केवल ~ 10 मिनट लंबे होते हैं; इसलिए, भले ही कोई चरण 5.2.3 में एक नए निषेचित अंडे को चुनना चाहता था, पहले कुछ सेल चक्र पहले से ही उस समय तक पूरा हो जाएंगे जब भ्रूण इमेजिंग के लिए तैयार होता है।

यूवी / नीली सीमा में प्रकाश के साथ रोशनी लंबे तरंग दैर्ध्य की तुलना में काफी अधिक फोटोटॉक्सिक है। ऐसी स्थितियों के तहत (उदाहरण के लिए, ऑटोफ्लोरोसेंट जर्दी पुटिकाओं का पालन करने के लिए; चित्रा 6), किसी को इमेजिंग समय को सीमित करना होगा (कम समय श्रृंखला के लिए अग्रणी) या कम लेजर शक्ति का उपयोग करना होगा (जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम हो गया)।

सेलुलरीकरण के बाद, एक विशिष्ट स्थान पर इंजेक्ट किए गए रंजक खराब तरीके से फैलते हैं, क्योंकि उन्हें कई सेल झिल्ली को पार करना चाहिए। यह बाद के विकास के चरणों में अवलोकन के क्षेत्र को सीमित करता है।

मौजूदा/वैकल्पिक विधियों के संबंध में विधि का महत्व
प्रारंभिक भ्रूण में एलडी और अन्य लिपिड युक्त ऑर्गेनेल की गति को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोर, लेबल-मुक्त तकनीकों और एफपी की शुरुआत के साथ कल्पना की जा सकती है। उत्तरार्द्ध vitelline झिल्ली¹² या microinjection दृष्टिकोण यहाँ चर्चा की permeabilization द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोर्स बहुमुखी मार्कर हैं जिनके स्तर आमतौर पर भ्रूण से भ्रूण तक अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य होते हैं। हालांकि, उनके पास एफपी की तुलना में कम क्वांटम पैदावार और ब्लीच अधिक आसानी से होता है। आमतौर पर, वे केवल एक या दो टैग किए गए संस्करणों (जैसे, जीएफपी या एमचेरी) में उपलब्ध होते हैं, जो इस विकल्प को सीमित करते हैं कि किन संरचनाओं को एक साथ चित्रित किया जा सकता है। दूसरी ओर, एफपी, अक्सर एक बड़ी विविधता में मौजूद होते हैं; उदाहरण के लिए, विभिन्न लिपिड-ड्रॉपलेट विशिष्ट रंजक यूवी / नीले स्पेक्ट्रम में ऑटोडॉट से लिपिडटॉक्स और लिपिडस्पॉट 610 में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ दूर-लाल स्पेक्ट्रम में उपलब्ध हैं। एफपी को सीधे ब्याज के किसी भी तनाव पर भी लागू किया जा सकता है, और इस प्रकार तनाव निर्माण की आवश्यकता नहीं होती है, उदाहरण के लिए, ब्याज के उत्परिवर्ती तनाव में वांछित ऑर्गेनेल मार्कर पेश करें। यह लाभ विशेष रूप से स्पष्ट है जब कई संरचनाओं को एक साथ लेबल किया जाना है; कई पीढ़ियों में फैले समय लेने वाले क्रॉस के बजाय, यह प्रासंगिक रंगों को मिलाकर और उन्हें एक ही समय में पेश करके एक ही दिन में प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, यदि सेलुलर प्रक्रियाओं को औषधीय निषेध के साथ जांचना है, तो दवाओं और रंजक को एक साथ पेश किया जा सकता है।

लेबल-मुक्त तरीके विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं का पता लगाने के लिए बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं। उदाहरण के लिए, एलडी को विशेष रूप से प्रारंभिक भ्रूण में तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी की माइक्रोस्कोपी²⁰ या फेम्टोसेकंड उत्तेजित रमन लॉस माइक्रोस्कोपी²¹ द्वारा पता लगाया जा सकता है। एफपी की तरह, इन दृष्टिकोणों को किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में लागू किया जा सकता है, और क्योंकि वे ब्लीचिंग का कारण नहीं बनते हैं, वे संभावित रूप से तेजी से छवि अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। हालांकि, वे आमतौर पर विशिष्ट ऑर्गेनेल तक सीमित होते हैं और इस प्रकार मल्टीप्लेक्स इमेजिंग का समर्थन नहीं करते हैं; उन्हें विशेष माइक्रोस्कोप की भी आवश्यकता होती है।

भ्रूण में छोटे अणुओं को पेश करने के लिए दो सामान्य रणनीतियां हैं। एक माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण है जो यहां नियोजित है; दूसरा रासायनिक (terpene) उपचार vitelline झिल्ली permeabilize करने के लिए है. उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण¹² माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में कम शामिल है, लेकिन भ्रूण से भ्रूण तक अधिक चर भी है। इसके अलावा, permeabilization के बाद, vitelline झिल्ली द्वारा प्रदान की गई सुरक्षा से समझौता किया जाता है और भ्रूण उचित बाहरी माध्यम के लिए सुलभ है, जिससे इसे जीवित रखना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। माइक्रोइंजेक्शन परमेबिलाइजेशन की तुलना में भ्रूण के विकास को पटरी से उतारने की संभावना बहुत कम है। हालांकि, permeabilization की सिफारिश की जाती है यदि कई भ्रूणों को एक साथ निगरानी करने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, दवा स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए। सेलुलर संरचनाओं के आंदोलन का पालन करने और छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छवि श्रृंखला प्राप्त करने के लिए, माइक्रोइंजेक्शन पसंद की विधि है।

विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
ड्रोसोफिला भ्रूण कई सेल-जैविक और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है ^1,5,6। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैगिंग ऑर्गेनेल ने यह समझने में प्रमुख योगदान दिया है कि प्रारंभिक भ्रूण कैसे विकसित होता है, विभिन्न ऑर्गेनेल कैसे यातायात करते हैं, और इस तरह की तस्करी को विकासात्मक और आनुवंशिक रूप से कैसे संशोधित किया जाता है। हालांकि, ब्लीच करने की उनकी प्रवृत्ति और उपभेदों को उत्पन्न करने की चुनौतियां जिसमें कई ऑर्गेनेल को विभिन्न रंगों के साथ लेबल किया जाता है, इस दृष्टिकोण के आवेदन को सीमित करते हैं। माइक्रोइंजेक्शन द्वारा पेश किए गए एफपी का उपयोग इन चुनौतियों में से कई को हल करता है और यहां तक कि फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन के साथ भी जोड़ा जा सकता है। यह तकनीक किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में कई ऑर्गेनेल, सेल संरचनाओं और साइटोस्केलेटल घटकों की इमेजिंग के लिए अनुमति देती है। नतीजतन, लाइव इमेजिंग के माध्यम से कई जीनोटाइप की तुलना की जा सकती है, जिससे कई ऑर्गेनेल की तस्करी पर उत्परिवर्तन के प्रभाव को निर्धारित करना संभव हो जाता है।

यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के भ्रूण के लिए एफपी इंजेक्शन दृष्टिकोण को दर्शाता है, लेकिन सिद्धांत रूप में, यह दृष्टिकोण किसी भी कीट अंडे पर लागू होता है, जिसके लिए माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों को स्थापित किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला की अन्य प्रजातियां, क्रिकेट²² और एफिड्स²³ शामिल हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणियों के लिए Pakinee Phromsiri, ब्रायन Jencik, Jinghong (जेम्स) तांग, और रोजर व्हाइट धन्यवाद. हम पैट्रिक Oakes, Stefano Di Talia, और Victoria Deneke को PIV विश्लेषण करने के तरीके पर अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था F31 HD100127 अनुदान (M. D. K.) और R01 GM102155 (M. A. W के लिए)।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue

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References

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Developmental Biology

ड्रोसोफिला भ्रूण में लिपिड युक्त ऑर्गेनेल की साइटोस्केलेटन-निर्भर तस्करी की कल्पना करना

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