Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Summary

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Abstract

Erken Drosophila embriyoları, çok çeşitli geleneksel ve embriyoya özgü organeller içeren büyük hücrelerdir. Embriyogenezin ilk üç saati boyunca, bu organeller aktin bazlı sitoplazmik akış ve mikrotübüller boyunca motor kaynaklı kaçakçılık ile güçlendirilmiş dramatik hareketlere maruz kalırlar. Çok sayıda küçük, organele özgü floresan probun (FP) geliştirilmesi, herhangi bir genotipte çok çeşitli farklı lipit içeren yapıların görselleştirilmesini mümkün kılar ve genetik olarak kodlanmış bir florofor gerektirmeden canlı görüntülemeye izin verir. Bu protokol, canlı görüntüleme yoluyla belirli organellerin kaçakçılığını izlemek için hayati boyaların ve moleküler probların Drosophila embriyolarına nasıl enjekte edileceğini göstermektedir. Bu yaklaşım, lipit damlacıklarının (LD'ler) etiketlenmesi ve partikül görüntü velosimetrisi (PIV) ile toplu hareketlerinin takip edilmesiyle gösterilmiştir. Bu protokol, lizozomlar, mitokondri, yumurta sarısı vezikülleri ve ER dahil olmak üzere diğer organellerin incelenmesine ve bireysel LD'lerin mikrotübüller boyunca hareketinin izlenmesine uygun bir strateji sağlar. Ticari olarak temin edilebilen boyaların kullanılması, spektrumun mor / mavi ve uzak kırmızı bölgelerine ayırmanın faydalarını getirir. Organellerin ve / veya sitoiskelet elementlerinin mikroenjeksiyon yoluyla multipleks birlikte etiketlenmesiyle, Drosophila'daki tüm genetik kaynaklar, floresan etiketli proteinlerin tanıtılmasına gerek kalmadan kaçakçılık çalışmaları için kullanılabilir. Düşük kuantum verimine ve kolayca ağartıcıya sahip genetik olarak kodlanmış floroforların aksine, mevcut boyaların çoğu, yüksek foton verimine sahip birkaç kanalın hızlı ve eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir.

Introduction

Hayati boyalar ve moleküler problar, belirli hücresel yapıları ve organelleri canlı olarak görüntülemek için güçlü araçlardır. Drosophila embriyosunda, birçok farklı organel sitoiskelet güdümlü lokalizasyon 1,2,3,4 gösterir, ancak bu küçük moleküllerin uygulanması zordur^, çünkü yumurta kabuğu birçoğu için geçirimsizdir. Bu protokol, organellerin büyük ölçekli kaçakçılığını tespit etmek için mikroenjeksiyon yoluyla canlı embriyolarda floresan probların (FP'ler) kullanılması için bir yöntem açıklamaktadır. Prosedür, enjeksiyon çözeltisinin hazırlanmasını, yumurta toplanmasını ve embriyoların hazırlanmasını, mikroenjeksiyonu, görüntülemeyi ve görüntü analizini kapsar.

Organellerin dramatik mekansal yeniden düzenlenmesi, kısmen bu hücrelerin büyüklüğü nedeniyle birçok hayvan oositinde, yumurtada ve embriyoda yaygındır. Örneğin, Drosophila embriyosunda, lipit damlacıkları (LD'ler) ve yumurta sarısı vezikülleri, hücreselleşmeden hemen önce embriyo merkezine doğru hareket eder⁵. Bu hareket mikrotübüllere bağlıdır ve iki organelden tükenmiş embriyonun çevresinin her yerinde ~ 40 μm'lik bir bölge bırakır. Daha erken bölünme aşamalarında, birçok organel, embriyo yüzeyinde aktin-miyozin bazlı kasılmalar tarafından tahrik edilen sitoplazmik akışlarla taşınır⁶. Birçok türün embriyoları benzer yeniden düzenlemeler sergilese de, Drosophila embriyosu görüntüleme yoluyla bu süreçleri takip etmek için özellikle uygundur, çünkü standart laboratuvar 'oda sıcaklığında' harici olarak gelişir, nispeten şeffaftır, çoğu mikroskop kurulumuna sığacak kadar küçüktür ve güçlü genetik araçlar kullanılarak manipüle edilebilir.

Bazı organeller için, bu yapıları özel olarak etiketleyen floresan etiketli proteinler mevcuttur. Örneğin, LSD-2 (dPLIN2 olarak da bilinir), embriyolarda özellikle LDs^7'yi hedef alan bir proteindir. Yeşil Floresan Protein (GFP) ve LSD-2⁸ arasında bir füzyonu kodlayan indüklenebilir transgenleri veya endojen LSD-2 geninin kodlama bölgesine sarı floresan proteinin (YFP) yerleştirildiği bir gen tuzağını taşıyan sinek hatları mevcuttur ^9,10. Bununla birlikte, bu yaklaşımın, bu füzyon proteinlerinin düşük kuantum verimine sahip olması ve kolayca ağartma eğiliminde olması da dahil olmak üzere sınırlamaları vardır. Ek olarak, aynı anda birden fazla farklı yapının etiketlenmesi zor olabilir: birçok organel için, şu anda yalnızca bir tür floresan etiketi (genellikle GFP veya mCherry) mevcuttur, bu nedenle iki organelin aynı anda görüntülenmesi yeni transgenler veya eklemeler gerektirebilir; Ayrıca, uyumlu etiketler mevcut olsa bile, bunları tek bir suşa sokmak zaman alıcı haçlar gerektirebilir. Aynı zamanda, birçok güçlü genetik kaynağın kullanılmasını daha az kullanışlı hale getirir, örneğin, iki organel belirteç, bir Gal4 sürücüsü ve indüklenebilir bir RNAi yapısının hepsinin aynı annede bulunması gerekiyorsa.

Prensip olarak, bu sınırlamalar, hayati boyalar (örneğin, lizozomları işaretlemek için LysoTracker), moleküler problar (örneğin, mikrotübülleri etiketlemek için SiR-tübülin) ve floresan olarak etiketlenmiş biyolojik moleküller (örneğin, yağ asidi metabolizmasını araştırmak için C12 BODIPY¹¹) dahil olmak üzere FP'lerin kullanımıyla aşılabilir. Kültürlü hücrelerde kullanımdan, tipik olarak hücresel biyolojiyi araştırmak için güçlü araçlar olarak iyi doğrulanırlar. FP'ler çok yönlüdür, üstün fotoğraf özelliklerine sahiptir ve floresan proteinlerle uyumludur. Birden fazla boya aynı anda karıştırılabilir ve uygulanabilir, genellikle spektrumun mor / mavi ve uzak kırmızı alanlarına ayırmanın faydaları ve küçük Stokes kaymaları, kanalın kanamasını önler. Küçük Stokes vardiyaları, birden fazla görüntüleme kanalının aynı anda yakalanmasını sağlayarak aynı anda birkaç organelin izlenmesini sağlar. Son olarak, diğer Drosophila türlerinin embriyolarındaki organelleri etiketlemek için eşit derecede uygulanabilirler, hatta floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin bulunmadığı diğer böcekler.

Bununla birlikte, bu FP'lerin çoğu, Drosophila embriyosunun ayrıntılı yumurta kabuğunu geçemez. Beş katmandan oluşur: mekanik hasarı önleyen üç dış koryonik katman (koryon) artı vitelin membranı çevreleyen ve kimyasal bir bariyer oluşturan mumsu bir tabaka¹². Basitlik için, mumsu tabaka ve vitelin membranın kombinasyonu aşağıdaki "vitelin membran" olarak anılacaktır. Yumurta kabuğunu atlamak için, bu protokol FP'leri Drosophila embriyosuna sokmak için yerleşik bir embriyo mikroenjeksiyon yaklaşımını uyarlar. Protokol, bölünme evresi embriyolarında LD'lerin sitoplazmik akışının nasıl izleneceğini açıklar. Enjeksiyon iğnelerinin ve yumurta toplama kafeslerinin hazırlanmasını, yumurta toplama işlemini ve koryonun mekanik olarak çıkarılmasını içerir. Embriyoların nasıl mikroenjekte edileceğini ve görüntüleneceğini ve parçacık görüntü velosimetrisini kullanarak LD'lerin toplu akışının nasıl analiz edileceğini ele alır (PIV,^6'dan uyarlanmıştır). Embriyonun hayatta kalmasını sağlamak ve görüntüleme için en iyi sistemi oluşturmak için sorun giderme konusunda tavsiyelerde bulunur. Ayrıca, protokolün LD'leri ve mikrotübülleri aynı anda görüntülemek veya lizozomlar, mitokondri, yumurta sarısı vezikülleri ve endoplazmik retikulum (ER) dahil olmak üzere diğer organellerin çalışmasına uygulamak için nasıl değiştirilebileceği de tartışılmaktadır.

Protocol

1. Gerekli malzemeleri hazırlayın

NOT: Bu hazırlıklar en iyi günler veya haftalar öncesinden yapılır.

1. Enjeksiyon iğneleri hazırlayın.
   NOT: İğneler kapalı bir kapta süresiz olarak saklanabilir. İğneler, vitelin membranı delecek kadar güçlü olurken ~ 700 fL verecek kadar ince olmalıdır.
   1. İğne çektirme makinesindeki kılcal tutucuya bir kılcal damar yerleştirin. Kılcal damarı kanat somunlarıyla sabitleyin. Kılcal damarın merkezini ısıtma elemanı ile hizalayın, böylece iki simetrik iğne üretilir.
   2. Üreticinin talimatlarına göre iğne çektirmesinde uygun ayarları seçin.
   3. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak kalite kontrolü gerçekleştirin.
      NOT: İğne uçları mümkün olduğunca ince olmalıdır. Çatlamış, pürüzlü veya büyük delikli iğne uçları atılır.
   4. Bir seferde 10 iğne (5 kılcal damar değeri) partileri hazırlayın.
   5. Kapaklı bir kabın tabanının ortasına, bir silindir halinde yuvarlanmış deforme edilebilir bir macun yerleştirin. İğneleri, hasarı önlemek için havada güvenli bir şekilde asılı duran iğne uçlarıyla yatay olarak tutacak şekilde macunun içine dikkatlice bastırın. Kapakla örtün ve kullanana kadar saklayın.
2. Yumurta toplama tabakları hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   NOT: Yumurta toplama plakaları, yumurtlamayı teşvik etmek için meyve suyuyla desteklenmiş küçük agar plakalarıdır. Bunların nasıl hazırlanacağı,¹³ dahil olmak üzere birçok protokolde açıklanmaktadır.
3. Heptan tutkal hazırlayın.
   NOT: Bu yapıştırıcı çift taraflı banttan çıkarılır ve embriyoları bir kapak kapağına güvenli bir şekilde tutturmak için kullanılır. Enjeksiyon ve görüntüleme sırasında embriyonun odak dışına çıkmasını engeller. Tutkal günler veya haftalar öncesinden hazırlanabilir.
   1. Çift taraflı bandı bir golf topundan daha büyük bir boyuta toplayın ve sıkıca kapatılan bir kapakla ~ 50 mL'lik bir cam kabın altına yerleştirin. Bandı sıkıca paketleyin, böylece yeterli yapıştırıcı mevcut olacaktır.
   2. Bir duman davlumbazında, tüm bandı örtmek için cam kabı heptan ile doldurun. Kullanılmadığında kabı sıkıca kapalı tutun.
      DİKKAT: Heptan sıvı ve buhar olarak yanıcıdır. Göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Solunum buharları uyuşukluk, baş dönmesi ve akciğer hasarına neden olabilir. Heptanı ateşleme kaynaklarından uzak tutun ve yanıcılar için iyi havalandırılan bir alanda ve uyumsuz maddelerden uzak tutun.
   3. Heptan tutkalın gece boyunca veya daha uzun süre oturmasına izin verin. En iyi sonuçlar için, yapıştırıcının çözülmesine yardımcı olmak için kabı gece boyunca bir çalkalayıcıya veya başka bir karıştırıcıya yerleştirin.
      NOT: Bandın kendisi kalacaktır, ancak yapıştırıcı heptan içinde çözülecektir. Adım 5.1.2'de, yapıştırıcı bir kapak kapağına uygulanır; heptan, yapıştırıcıyı geride bırakarak buharlaşır.
   4. Heptan tutkal preparatını, bir cam slayt üzerine bir damla yerleştirerek ve heptan buharlaştıktan sonra yapışkan bir kalıntının kaldığından emin olarak test edin. Daha sonra yapışkan kalıntı görünmüyorsa, cam kaba daha fazla bant ekleyin ve önceki adımı tekrarlayın.
      NOT: Bir kez hazırlandıktan sonra, yapıştırıcı aylarca hatta yıllarca kullanılabilir.
4. Ticari olarak elde edilen preparatı saf susuz DMSO'da seyrelterek 1 mg/mL (3,8 mM) BODIPY493/503 stok çözeltisi hazırlayın. Işıktan ve sudan korumak için kapalı tutun. Süresiz olarak -20 °C'de veya kısa süreli 4 °C'de saklayın.

2. Yumurta toplama kafesleri hazırlayın

NOT: Bunu planlanan enjeksiyon(lar)dan en az bir gün (tercihen 2 veya 3 gün) önce yapın.

1. Maya ezmesi hazırlayın.
   NOT: Maya ezmesi, elma suyu plakalarında sağlanmayan protein ve diğer hayati besinleri destekler. Yumurta üretimini ve yumurtlamayı teşvik eder.
   1. Küçük bir beherin içine 2-10 g kuru ekmek mayası ve ardından 1 mL musluk suyu ekleyin. Bir spatula kullanarak karıştırın.
   2. İstenen, diş macunu benzeri kıvama ulaşana kadar 1 mL'lik artışlarla musluk suyu eklemeye devam edin.
   3. Karışımı örtün ve 4 °C'de saklayın.
2. Yumurta toplama için sinek kafesleri kurun.
   NOT: İstenilen genotipteki erkek ve dişi sinekler gereklidir: 2 haftalıktan küçük 10-50 dişi ve benzer sayıda erkek. Sinek kafesleri için ev yapımı seçenekler^14,13 de dahil olmak üzere bir dizi farklı seçenek mevcuttur. Elma suyu plakalarının boyutunun sinek kafeslerinin boyutuyla eşleştirilmesi önemlidir.
   1. Bir elma suyu tabağına küçük bir maya ezmesi lekesi yerleştirin. Kapalı tutun ve oda sıcaklığına gelmesine izin verin, çünkü çok soğuksa sinekler tabağa yumurta bırakmaz.
   2. Sinekleri bir embriyo toplama kafesine aktarın, mayalı elma suyu plakasıyla kapatın ve plakayı embriyo toplama kafesine sabitleyin.
   3. Yeni aktarılan sineklerin 1-2 gün boyunca kafese alışmasına izin verin ve plakayı günlük olarak yenisiyle değiştirin. Tüm mayalar ertesi güne kadar yenmişse, gelecekteki koleksiyonlar için maya ezmesi miktarını artırın.
      NOT: Bu, iyi beslenen dişiler daha fazla yumurta bıraktığı için yumurta verimini artırmak için önemli bir adımdır.

3. Enjeksiyon gününde, enjeksiyon çözeltisini hazırlayın ve iğneye yükleyin.

1. Enjeksiyon çözeltisi olarak BODIPY 493/503 (DMSO'da 3,8 mM) stok çözeltisini kullanın.
2. İğne yükleme uçlarını kullanarak enjeksiyon çözeltisinin 1 μL'si ile tek bir iğne yükleyin.
   NOT: Hava kabarcıklarını yakalamadan sıvıyı uca kadar almaya çalışın. Kazara kırılma durumunda yüklenen iğneyi hızlı bir şekilde değiştirmeye hazır olun.
   1. Bir mikropipete bir yükleme ucu takın ve enjeksiyon çözeltisinin 1 μL'sini uca çekin. Eldiven kullanarak, kırılma riskini en aza indirmek için iğneyi bir elinizde ucu uzağa bakacak şekilde tutun.
   2. Yükleme ucunu dikkatlice iğneye yerleştirin ve iğne ucuna yaklaştırın. Sıvıyı iğne ucunun yanına dağıtın. Pipetten çıkardıktan sonra, sıvı uca akana kadar iğneyi ucu aşağı bakacak şekilde dikey olarak tutun.
3. Yüklenen iğneleri yukarıdaki gibi macunlu ayrı bir kapta saklayın (bkz. adım 1.1.5).
   NOT: İğneler enjeksiyondan önce (birkaç saate kadar) hazırlanmalı, ancak bir günden fazla bir süre sonra kullanılmamalıdır.
4. Boyaların ağartılmasını önlemek için iğneleri ortam ışığından uzak tutun. İğne uçlarına zarar vermeden saklama kabını alüminyum folyo ile örtün. Tüm ışığın gizlendiğinden emin olun.

4. Enjeksiyon için embriyo toplanması

NOT: Toplama zamanlaması, enjeksiyonun embriyoların hangi aşamasında yapılması gerektiğine bağlıdır. Aşağıdaki zamanlama şeması ile, enjeksiyona hazırlık sırasındaki embriyolar, bölünme aşamaları^15'e karşılık gelen 0-90 dakika yaşında olacaktır.

1. Enjeksiyon gününde, adım 2.2.1'de olduğu gibi maya ile elma suyu plakaları hazırlayın. N tur enjeksiyon planlanıyorsa, N + 2 plakaları hazırlayın. Bu plakaları oda sıcaklığında tutun.
   NOT: Enjeksiyon için embriyo toplamak için N plakalarına ek olarak, bir ön toplama plakası olarak bir plakaya ve koleksiyonlar tamamlandıktan sonra kafesteki sinekleri beslemek için başka bir plakaya ihtiyaç vardır.
2. Kafes üzerindeki plakayı taze mayalı bir plaka (ön toplama plakası) ile değiştirin ve 1-2 saat boyunca kafeste bırakın.
3. Kafesteki plakayı taze bir plaka (toplama plakası) ile değiştirin. Ön toplama plakasını atın, çünkü istenenden daha eski embriyolar içerecektir. Ardından, sineklerin 1,5 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.
   NOT: İyi beslenmiş sinekler tipik olarak yumurtalarını döllendikten kısa bir süre sonra bıraktığından, 1,5 saatlik bir toplama süresi, koleksiyonun sonunda, plakadaki embriyoların çoğunun 0-90 dakika yaşında olduğunu, yani bölünme aşamalarında olduğunu garanti eder. Önceki günden beri taze maya ile beslenmeyen dişi sinekler, döllenmiş yumurtaları döşemeden önce belirsiz bir süre tutma eğiliminde olacaktır. Bu nedenle, toplama öncesi plaka, toplama başlamadan önce döllenmiş embriyolara sahip olabilir ve bu nedenle 60 dakikadan daha eski, bazen çok daha yaşlıdır.
4. Kafesteki plakayı taze mayalı bir plaka ile değiştirin. Toplama plakasını örtün, böylece başıboş sinekler üzerlerine yumurta bırakmazlar.

5. Embriyoları mikroenjeksiyon için hazırlayın

1. Gerekli malzemeleri monte edin.
   1. Bir cam slayta bir parça çift taraflı bant takın. Banda parmaklarınızla dokunmaktan kaçının, çünkü bu yapışkanlığını azaltır.
      NOT: Bu slayt, görüntüleme için değil, koryonu çıkarmak için kullanılacaktır.
   2. Bir transfer pipeti veya mikropipet (p200 veya p1000) kullanarak, dikdörtgen bir kapak kapağının (60 x 25 mm) ortasına kabaca küçük bir damla (200 μL veya daha az) heptan yapıştırıcı yerleştirin. Heptanın buharlaşmasına izin verin (bu bir dakikadan az sürer).
      NOT: Bu kapak kayması, enjeksiyon ve görüntüleme için embriyoları monte etmek için kullanılacaktır. Boyutlar, konfokal mikroskopta ayarlanabilir bir metal tutucuya sığacak şekilde seçilir.
   3. Bir kurutma odası, kurutma boncukları içeren kapalı bir oda (örneğin, bir Tupperware sandviç kutusu) monte edin. Sadece nemlendirilmemiş kurutma boncukları kullanın.
      NOT: Embriyoların enjeksiyon solüsyonunu almasını sağlamak için, iç basıncı azaltmak için embriyo hafifçe kurutulmalıdır. Bu, kapak kaymasını, dekoryonlu, havaya maruz kalan embriyolarla birlikte kuruma odasına yerleştirerek yapılır.
2. Koryonu mekanik olarak çıkarın.
   1. Yumurta kabuğunu şeffaf hale getirmek için uygun şekilde yaşlandırılmış embriyo plakasını ince bir Halokarbon Yağı 27 tabakası ile örtün.
      NOT: Embriyolar onlarca saniye içinde yarı saydam hale gelir¹⁵. Bu adım verimli bir şekilde gerçekleşmezse, elma suyu plakaları çok ıslak olabilir ve kullanımdan önce kurutulması gerekebilir.
   2. Embriyoların aşamasını doğrulamak için plakayı transillumination (yani, plakadan göz merceklerine giden ışık) ile bir diseksiyon kapsamı altında görüntüleyin.
   3. Bölünme aşamalarındaki embriyoları seçin.
      NOT: Bölünme evresi embriyoları tamamen opaktır; sonraki blastoderm aşamaları, opak merkez^15'in her yerinde bir şeffaf sitoplazma bandı ile tanınabilir. Çeşitli embriyonik aşamaların nasıl tanınacağına dair iyi bir giriş, Gelişim Biyolojisi Derneği tarafından sürdürülen web sitesinde (referans^16'da verilmiştir) mevcuttur.
   4. İnce cımbız kullanarak, dorsal uzantılarından istenen aşamanın bir embriyosunu alın ve bir parça çift taraflı bantla kaplı hazırlanmış cam slayda aktarın. Embriyoyu bandın üzerine yerleştirin. Yağ transferini en aza indirin.
   5. Mümkün olduğunca nazikçe, embriyoyu cımbız ucunun yan tarafıyla hafifçe dürterek embriyoyu bandın yüzeyi boyunca yuvarlayın. Embriyoyu doğrudan keskin cımbız uçlarıyla dürtmeyin.
      NOT: Uygulanan kuvvet çok düşükse, embriyo yuvarlanmaz. Çok yüksekse, patlar. Uygun ara kuvveti bulmak deneyim gerektirir ve bu nedenle bu adım önceden uygulanmalıdır.
   6. Koryon geçici olarak banda yapışana ve çatlaklara kadar embriyoyu yuvarlamaya devam edin.
   7. Koryon çatladığında, embriyoyu (hala vitelin zarının içinde) koryondan ayırmak için yuvarlanmaya devam edin, çünkü koryon banda yapışmış olarak kalır.
   8. Embriyodan dorsal uzantıların kaybını gözlemleyerek koryonun tamamen çıkarıldığını onaylayın.
   9. Embriyoyu, banttan daha az yapışkan olan koryonun üzerine geri yuvarlayın. Embriyoyu, transfer için cımbızlara yapışana kadar cımbızla hafifçe ovalayın.
   10. Embriyoyu heptan tutkalı ile kapak kapağına aktarın ve tipik olarak cımbızdan ayıran tutkalla temas ettirin.
   11. Kapak fişi üzerindeki embriyonun yönünü ayarlayın.
       1. Embriyonun yanal yüzeyini tutkalın içine yerleştirin.
          NOT: Yapıştırıcıya gömülü embriyonun yüzeyi, görüntülenecek olan yüzeydir. Yanal yüzeyin gömülmesi en basit olanıdır, ancak bu kişisel tercihe veya cevaplanacak biyolojik soruya bağlı olarak ayarlanabilir.
       2. Embriyonun uzun eksenini, kapak kaymasının uzun eksenine dik olarak yönlendirin.
       3. Embriyo tercih edilen yönde yatmazsa, embriyoyu tutkaldan ayıracak herhangi bir yağı çıkarmak için cımbızı temizleyin. Ardından, embriyoyu yavaşça yerine oturtmaya çalışın.
   12. Yukarıda açıklanan şekilde enjeksiyon için istenen sayıda embriyo hazırlayın.
       NOT: Koryonun çıkarılmasından sonra zaman geçtikçe, ortam havası embriyoları kurutmaya başlayacak ve böylece adım 5.3'ün etkisi, farklı zamanlarda dekoryonlanmış olan kapak kayması üzerindeki embriyolar için eşit olmayacaktır. Tipik olarak, 1-3 embriyo en yönetilebilir olanlardır.
3. Embriyoları kurutun.
   1. Kapak kapağını embriyolarla birlikte hazırlanan kurutma odasına yerleştirin ve kapatın.
   2. Embriyoların 5-12 dakika kurumasına izin verin.
      NOT: Bu adımın zamanlaması ortam sıcaklığına ve neme bağlıdır ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
   3. Kapak kaymasını odadan çıkarın ve daha fazla kurumayı önlemek için embriyoları tamamen kaplayan bir damla Halokarbon Yağı 700 yerleştirin.
   4. Uygun kurumayı değerlendirmek için embriyoları diseksiyon kapsamında inceleyin.
   5. Embriyolar hafifçe buruşmuşsa, ancak sönmemişse, mikroenjeksiyona devam edin (adım 6).
   6. Embriyolar yeterince veya aşırı kurutulmamışsa, adım 5.2'ye geri dönün ve Halokarbon Yağı 700 çıkarılamadığından yeni bir embriyo grubu hazırlayın. Embriyolar aşırı kurutulmuşsa, bir sonraki embriyo grubu için kuruma süresini 3 dakika kısaltın; az kurutulmuşlarsa, kuruma süresini 3 dakika artırın.

6. Mikroenjekte embriyolar

NOT: Mikroenjeksiyon kurulumunun ters çevrilmiş bir mikroskop, enjeksiyon iğnesini tutmak ve konumlandırmak için bir mikromanipülatör ve kontrollü hacimler sağlamak için ticari bir mikroenjektör içerdiğinden emin olun.

1. Mikroenjektörü açın ve tercih edilen ayarları girin.
   NOT: Bu protokol için, doğrusal hareket çıkışının ve hızlı ayarın kullanılması önerilir, ancak diğerleri çalışacaktır. Operatör kişisel tercihini belirlemelidir.
2. İğneyi mikromanipülatöre yükleyin. Embriyoları içeren kapak kapağını yüklerken iğnenin zarar görmesini önlemek için, iğneyi yoldan güvenli bir konuma getirin.
3. Kapak kaymasını sahneye, üstte embriyolar olacak şekilde iğneye doğru yerleştirin. Daha sonra, iğneyi enjeksiyon için dikkatlice tekrar yerine getirin, ucu hala sahnenin çok üzerindedir.
4. 4x hedefini ışık yoluna koyun. Mikroskop üzerindeki odak düğmesini kullanarak, embriyoları odaklayın.
   NOT: Bu, enjeksiyon için kullanılan odak düzlemi olacak ve ileriye dönük olarak yalnızca minimum düzeyde ayarlanacaktır.
5. Aşama kontrollerini kullanarak, embriyoları yatay olarak görüş alanının merkezine taşıyın.
   1. İğneyi düşürmeye hazırlanırken embriyolardan uzaklaşın, görüş alanının kenarında tutun. İğnenin doğru konuma indirildiğinden emin olmak için aynı odak düzleminde kalın.
6. İğne ucunu doğru odak düzlemine indirin ve embriyolarla birlikte görüş alanında görünür olduğundan emin olun.
   1. Mikromanipülatör kontrollerini kullanarak ve yukarıdan bakarak (henüz göz merceğinden değil), iğne ucunu yavaşça yağın içine bırakın ve hedefin işaret ettiği alanı hedefleyin. Yağ oldukça viskoz olduğundan, iğneye zarar vermemek için yavaşça gidin.
   2. İğne göz merceklerinden görülebildikten sonra, iğne ucu odakta ve görüş alanının merkezinde olana kadar mikromanipülatör kontrollerini kullanmaya devam edin.
   3. Sahneyi hareket ettirerek, embriyoları görüş alanının merkezine geri getirin. Her ikisi de odaktayken embriyonun ve iğne ucunun birbirine göre konumunu hassas bir şekilde ayarlamak için sahne kontrolünü, mikromanipülatör kontrollerini ve odak düğmesini kullanın. Enjeksiyonları mümkün olduğunca örtü kapağına yakın yapmayı hedefleyin.
7. İğne kalite kontrolünü gerçekleştirin.
   1. İğnenin işlevsel olduğundan emin olmak için, enjeksiyon çözeltisinin bir kısmını, yağda bir kabarcık olarak görülebilen embriyoyu çevreleyen Halokarbon Yağı 700'e dağıtın.
   2. İğnenin dışına hiçbir şey akmıyorsa, enjektördeki basıncı kademeli olarak artırın. Bu işe yaramazsa, yeni bir iğne alın.
8. Embriyoyu enjekte edin.
   NOT: Kabul edilebilir enjeksiyon hacimleri ~ 0,06-1 pL arasında değişmektedir. Alt sınır, embriyoya girerken görselleştirilebilecek olanla belirlenir. Üst sınır, enjeksiyonun embriyoya uyguladığı travma ile belirlenir.
   1. Embriyonun yanal kenarları boyunca enjekte edin, çünkü bu en az invazivdir.
   2. Aşama kontrollerini kullanarak, embriyoyu hafifçe delip girene kadar embriyoyu iğne ucuna doğru hareket ettirin.
   3. Aynı zamanda, enjeksiyon çözeltisinin akışını başlatın ve iğne ucunun bulunduğu yerde, embriyoya başarılı bir sıvı transferini gösteren geçici bir berrak noktanın ortaya çıkmasını izleyin.
   4. Embriyoyu izleyin. Embriyo iğneye direnirse ve girişte yırtılırsa (sitoplazma dışarı fışkırırsa), adım 5'e geri dönün ve kuruma süresini artırın. Embriyo kapak kaymasına karşı düzse ve enjeksiyon sırasında sarkık görünüyorsa, adım 5'e geri dönün ve kuruma süresini kısaltın.
   5. Embriyoya hiçbir boya girilmemişse, boyanın adım 6.7'de olduğu gibi iğneden serbestçe akabileceğini doğrulayın. Boya akmazsa, iğneyi değiştirin. Boya akarsa, yeni bir embriyo enjekte edin ve iğne embriyoyu delmeden hemen önce boyayı serbest bırakmaya başlayın.
      NOT: Aynı embriyonun tekrarlanan enjeksiyonları, önceki yara / enjeksiyon bölgesini yırttığı için önerilmez.
9. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar tekrarlayın.

7. Görüntü embriyoları

NOT: Bu protokol lazer taramalı konfokal mikroskop kullanır.

1. Kapak kaymasını konfokal mikroskoptaki metal tutucuya yerleştirin, böylece embriyolar doğrudan aşağıdan kapak kayması yoluyla görüntülenir; Kapak kapağının üstünde, sadece yağ vardır ve başka bir bariyer yoktur.
2. Bir kalite kontrol adımı olarak, ilk önce konfokal mikroskoptaki epifloresan fonksiyonunu kullanarak, 40x hedefi ile görüntü. Devam etmeden önce floroforun embriyoda görünür olduğundan emin olun.
3. İstenilen görüntüleme düzlemi enjeksiyon bölgesinden farklıysa, boyanın hedef bölgeye yayılması için yeterli zaman tanıyın.
   NOT: BOPIPY 493/503 için bu süre tipik olarak 30-60 dakika arasında değişmektedir. Difüzyon süresi büyük ölçüde boyaya bağlı olduğundan, diğer boyalar enjeksiyon bölgesini ve bekleme süresini optimize etmeyi gerektirebilir.
4. Farklı ölçeklerde görüntüleme için farklı hedefler kullanın. Tüm embriyoyu görüntülemek için 40x hedefi ve daha küçük ölçekler için alt bölümleri görüntülemek için 63x hedefi kullanın.
5. Hücreselleştirmeden önceki sinsitiyal aşamalarda canlı görüntüleme için, başlamak üzere aşağıdaki koşulları kullanın: 512 x 512 piksel görüntü boyutu, satır ortalaması 3, saniyede 0,1 kare kare hızı (yani, her 10 saniyede 1 kare elde edildi). Kullanılan mikroskobun yeteneklerine göre koşulları ayarlayın.
   NOT: Bu koşullar, BOPIPY 493/503'ten ~500'den fazla görüntü elde etmeyi ve hareketin çoğunu yakalamayı sağlar.

8. Önce bir zaman serisi görüntüsü hazırlamak için FIJI'yi ve ardından PIV analizi için python'u kullanarak LD akışını analiz edin

1. Görüntü yakalamayı optimize edin.
   1. İstenilen boya enjeksiyonlarını uygun aşamada gerçekleştirin. Günlük varyasyon ihmal edilebilir olana kadar bu adımı tekrarlayın.
   2. Büyütme, yakınlaştırma, çözünürlük ve kare hızı dahil olmak üzere görüntü alma ayarlarını optimize edin.
      NOT: Yüksek kaliteli görüntüler (çözünürlük + satır ortalaması) ile çekim hızı (kare hızı) arasında bir denge vardır.
2. FIJI'de veri hazırlama.
   1. Analiz edilecek yüksek kaliteli bir zaman serisi edinin.
   2. FIJI ile maske oluşturmak için zaman serisinin bir karesini açın. Görüntüyü çoğaltın. Görüntünün türünü 8 bit'e dönüştürün.
   3. Poligon veya Freehand Seçim Aracı'nı kullanarak embriyonun sınırını tanımlayın. Seçimin dışındaki piksel değerlerini 0 olarak ayarlamak için Dışarıyı Temizle'yi kullanın. Seçimdeki piksellerin değerini maksimum değere (255) ayarlamak için seçimin içinde Temizle ve ardından Ters Çevir'i tıklatın.
   4. Seçimi kaldırın, ardından yalnızca 0 ve 255 piksel değerlerinin bulunduğundan emin olmak için Histogram komutunu kullanın.
   5. Bu yeni görüntü maskesini belirli zaman serileri için kaydedin.
   6. İlgilendiğiniz zaman serisini açın. Hangi on karenin ilgilenilen zamanı en iyi şekilde yakaladığını seçin, örneğin, kortikal kasılmanın başlangıcındaki nükleer döngü 9. Bir alt yığın oluşturarak ilgilendiğiniz on kareyi çoğaltın.
   7. PIV ile analiz etmek üzere 10 görüntü oluşturmak için Görüntülere Yığınla işlevini kullanın.
   8. Tek tek dosyaları sıralarını koruyacak şekilde kaydedin (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. PIV analizi için hazırlanan maskeyi ve tek tek çerçeveleri, sağlanan örnek python betiğini (Ek veriler) veya kullanıcı tarafından oluşturulan özel bir komut dosyasını kullanarak kullanın.
   NOT: Sağlanan komut dosyası, OpenPIV^17'nin python uygulamasını temel alır. Mesafeyi, hız veya hız oluşturmak için piksel genişliği ve kare hızı kullanılarak dönüştürülebilen piksel cinsinden çıkarır.
4. Ek embriyolar için önceki adımları tamamlayarak ve çıktı değerlerini derleyerek replikalar oluşturun.

Representative Results

Enjeksiyonu takiben, boya sadece iğne ucunun yerleştirildiği yerde lokalize olacaktır. Boya daha sonra difüzyon özelliklerine bağlı olarak enjeksiyon bölgesinden uzağa yayılacaktır. Şekil 1 , BODIPY 493/503 enjeksiyonunu, enjeksiyondan hemen sonra (panel A) ve 24 dakika sonra (panel B) göstermektedir. 24 dakika sonra, boya embriyonun uzun ekseninin kabaca orta noktasına ulaştı.

Organel hareketliliğinin analiz edilmesi, boya enjeksiyonları ve hızlandırılmış görüntüleme ile elde edilebilir. Şekil 2'de, bir embriyoya BODIPY 493/503 (Şekil 2A) ve LysoTracker Red (Şekil 2B) ile birlikte enjekte edildi ve sırasıyla 488 ve 596 nm'de lazer uyarma kullanılarak görüntülendi. Bu embriyo daha sonra hızlandırılmış olarak görüntülendi (30 dakika boyunca her 30 saniyede bir kare, 5 dakika analiz edildi). Zaman serisi daha sonra PIV analizi ile çalıştırıldı ve çıktısı Şekil 2A, B'deki streamline'larla gösterildi. Akış çizgilerinin bireysel parçacıkların yörüngesini temsil etmediğini, ancak sitoplazmik akışın, sitoplazmanın o bölgesindeki tüm parçacıkların analiz edilmesinden çıkarıldığını unutmayın. İki bağımsız hücresel yapının (LD'ler ve asidik organeller) etiketlenmesi yoluyla, PIV analizi benzer akışları bulur, her iki etiket de sitoplazmanın embriyonun içine aktığı embriyonun merkezi bölgesinde yakınsar⁶.

Şu anda mevcut olan FP'ler, diğer birçok organelin ve hücresel yapının etiketlenmesine izin verir. Şekil 3 , ER'nin ER izleyici Yeşil ile etiketlenmesini göstermektedir. ER izleyici, nükleer zarfın güzel bir çözünürlüğünü sağlayarak ana hücre döngüsü aşamalarının görselleştirilmesine izin verir. ER izleyici Green, 488 nm uyarma kullanılarak görüntülenir.

Mitokondrinin etiketlenmesi zordur, çünkü test edilen boyaların çoğu, girdikleri ilk mitokondride sıkışmış gibi görünmektedir. Öte yandan, boya toksisitesi belirtisi tespit edilmedi, bu da etiketli mitokondrilerin hücreselleştirme ve ektodermal nükleer döngü 15 yoluyla takip edilmesini mümkün kıldı. Şekil 4 , Mitoview 633 (uyarma dalga boyu 633 nm) ile enjeksiyondan birkaç saat sonra ektodermal bir hücreyi göstermektedir.

BODIPY, Lysotracker ve LipidSpot sağlamdır ve 512 x 512'de ~500'den fazla görüntü, satır ortalaması 3, 1 / s'den 0.1 / s'ye kadar kare hızları elde etmek için kullanılabilir. ER izleyici Green, SiR-tubulin ve bahsedilen mitokondriyal boyalar daha az sağlamdır ve aynı koşullar altında ~ 50-200 görüntü verir.

Blastoderm aşamalarından başlayarak, LD'ler, kinesin-1 ve sitoplazmik dinein⁵ zıt polarite motorları tarafından desteklenen mikrotübüller boyunca çift yönlü olarak hareket eder. Bu hareket, hem BODIPY 493/503 hem de SiR-Tubulin enjekte edilerek LD'lerin ve mikrotübüllerin birlikte etiketlenmesiyle görselleştirilebilir (Şekil 5). LD'ler sıklıkla hareket yönlerini tersine çevirdikçe (kinezin-1 ve sitoplazmik dinein arasında geçiş yaptıklarından), edinme sırasında daha yüksek kare hızları LD hareketliliğinin kritik ayrıntılarını daha iyi yakalar.

Otofloresan yumurta sarısı veziküllerinin canlı görüntülenmesi, herhangi bir boya enjeksiyonu şekli olmadan mümkündür (Şekil 6). Bununla birlikte, otofloresan loştur ve uyarma lazeri fototoksiktir. Bu nedenle, otofloresan yumurta sarısının canlı görüntülenmesi, boya enjeksiyonuna göre zayıf bir sinyal-gürültü oranına sahiptir.

Resim 1: BODIPY 493/503'ün embriyo boyunca difüzyonu. Boya, lateral kenar boyunca ön uca (sağ üstte) doğru enjekte edildi ve bu enjeksiyon bölgesinden embriyoya yayılarak LD'leri etiketledi. (A) Boya, embriyonun enjeksiyon bölgesine bitişik kısımları boyunca yayıldı. (B) Kabaca 24 dakika / 2 nükleer döngü sonra, boya embriyonun orta noktasının ötesine yayılmıştır. Ölçek çubuğu: 100 μm. Her 30 saniyede bir 1024 x 1024 kare (çizgi ortalaması 4) elde edildi .

Şekil 2: LD'ler ve asidik organeller için partikül görüntü velosimetrisi (PIV). Bir embriyoya hem BODIPY 493/503 hem de LysoTracker Red enjekte edildi. (A) BODIPY kanalı. (B) LysoTracker Kırmızı kanalı. (A',B') A ve B'de gösterilenler de dahil olmak üzere 10 sıralı çerçeveden oluşturulan iki kanalın PIV analizi ile oluşturulan diyagramları kolaylaştırın. A' LD'lerin akışına karşılık gelir ve B' asidik organellerin akışına karşılık gelir. Hem A' hem de B'nin, embriyonik içeriğin görüş düzleminden embriyonun merkezine aktığı merkezin solunda bir birleşim gösterdiğini unutmayın. Ayrıca, BODIPY'nin LysoTracker'dan daha fazla yayıldığını unutmayın, çünkü farklı boyalar farklı difüzyon özelliklerine sahiptir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Her 30 saniyede bir 1024 x 1024 kare (çizgi ortalaması 4) elde edildi.

Şekil 3: ER izleyici sinsityal nükleer bölünmeleri etiketler. Sinsityal blastoderm embriyosuna ER izleyici ile mikroenjekte edildi ve yüzeyinin bir kısmı zamanla görüntülendi. (A) Nükleer bölünme sırasında iş mili tertibatı. (B) Aynı bölünme sırasında nükleer zarfın çıkarılması. (C) Sonraki interfaz. (D) Bir sonraki bölümün başlangıcı merkezbaz görünüm (ok uçlarıyla işaretlenmiş dairesel ER-free bölgelerin oluşumu) ile gösterilir. Kademeli boya ağartmaya dikkat edin. Uyarma dalga boyu: 488 nm. Ölçek çubuğu: 5 μm. A: ilk kare, B: 3 dakika geçti, C: 10 dakika geçti, D: 13 dakika geçti. Her 30 saniyede bir 1024 x 1024 kare (çizgi ortalaması 4) elde edildi .

Resim 4: Mitoview 633 mitokondri etiketlemesi. Sinsityal blastoderm aşamasında Mitoview 633 ile bir embriyo enjekte edildi ve hücreselcileştirmeden 4 saat sonra görüntülendi. Görüntü, germ bandı uzantısında bir embriyonun nöroektodermal hücresini göstermektedir. Ölçek çubuğu: 5 μm. Her 30 saniyede bir 1024 x 1024 kare (çizgi ortalaması 4) elde edildi .

Şekil 5: LD'lerin ve mikrotübüllerin birlikte etiketlenmesi. Hücreselleştirici bir embriyoya BODIPY 493/503 (sarı A, B, C) ve SiR Tubulin (macenta A', B', C') karışımı enjekte edildi. A'', B'', C'' birleştirilmiş kanalları gösterir. A, A' ve A'' panelleri ilk çerçeveyi, B, B' ve B'' panelleri 5 saniyeden sonra çerçeveyi ve C, C ' ve C' panelleri 10 saniyeden sonra çerçeveyi gösterir. Ölçek çubuğu: 5 μm. Her 2,5 saniyede bir 512 x 512 kare (çizgi ortalaması 3) elde edildi.

Şekil 6: Sinsityal bölünme aşamalarında yumurta sarısı vezikül otofloresansının görüntülenmesi . (A) Edinimin başlangıcında. (B) 8 dakika sonra (C) 16 dakika sonra Uyarma dalga boyu: 405 nm. Embriyoyu canlı tutmak için düşük uyarma yoğunluğu kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 μm. Her 30 saniyede bir 1024 x 1024 kare (çizgi ortalaması 4) elde edildi .

Ek veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Drosophila embriyosu, hücresel ve organizma biyolojisindeki temel soruları incelemek için güçlü ve kullanışlı bir modeldir. Göreceli basitliği, güçlü genetiği ve küçük boyutu, onu hem hücresel süreçleri hem de gelişimi görüntülemek için mükemmel bir sistem haline getirir. Burada, embriyolarda FP kullanımını sağlamak için standart bir mikroenjeksiyon protokolü uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floroforlara ihtiyaç duymadan spesifik hücresel yapıların floresan görüntülenmesine izin verir ve görüntülemeye birçok genetik arka plan açar. Birden fazla boyanın yanı sıra stratejik olarak seçilmiş floresan etiketli proteinlerin birleştirilmesi, görünür ışığın tüm spektrumunu kapsayan çok kanallı canlı görüntülemeyi açabilir.

Protokoldeki kritik adımlar:
Bu protokol, LD'leri etiketlemek için BODIPY 493/503 kullanır. Bu yaklaşım, diğer hücresel yapıları işaretlemek için kolayca uyarlanabilir. Sonraki görüntü analizi için en önemli faktörlerden biri, sinyal-gürültü oranı, yani boyanın arka plan sinyaline kıyasla parlaklığıdır. Lizozomlar (LysoTracker Red, 1 mM), ayrıca mitokondri (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER izleyici Yeşil, 10 μM) ve mikrotübüller (SiR tübülini, DMSO'da 200 nM), Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5'te gösterildiği gibi başarıyla görüntülenmiştir. Ek olarak, yumurta sarısı vezikülleri otofloresandır ve UV uyarımı üzerine mavi ışık yayar (uyarma dalga boyu olarak 405 nm kullanan görüntü (Şekil 6)). Diğer boyalar için, boya konsantrasyonunun, kültürlenmiş hücrelerin canlı boyanması için gerekli olanın 100-1000 katı olmasını hedefleyin; bu, hücre kültürü ortamına seyreltilecek bir stok çözeltisinin konsantrasyonuna benzer. Bu protokol 100 fL'lik bir enjeksiyon gerektirdiğinden ve Drosophila embriyosu hacim^18'de kabaca 9 nL olduğundan, bu boya konsantrasyonları, hücre kültürü ortamında bulunanın 1 / 100'ünün altındaki bir iç embriyonik konsantrasyona ortalamaya ulaşacaktır. Geçici olarak, lokal konsantrasyon enjeksiyon bölgesinde daha yüksek olacaktır, bu da iyi yayılmayan FP'ler (yani, mitokondriyal boyalar ve SiR-tübülin) için en uygun olanıdır. Bu FP'ler için, önerilen yüksek konsantrasyonlardan başlayın; Beklenmeyen bir ölüm gözlenirse, hayatta kalma ve sinyal gücü arasında kabul edilebilir bir uzlaşmaya varılana kadar art arda iki kat seyreltin.

Birden fazla boyayı birlikte enjekte ederken, her iki boya da aynı çözücüde olmalı veya hem çözücüler hem de boyalar karışımla uyumlu olmalıdır (~% 10'u aşan alkol konsantrasyonları önerilmez).

İğnelerin kalitesi, bu prosedürün başarısı için esastır, çünkü ucun mümkün olduğunca ince olması gerekir. Aksi takdirde, enjeksiyon yarasından kaynaklanan hasar, embriyonun sonraki gelişimini tehlikeye atabilir. Ticari iğne çektiriciler farklı olduğundan, üreticinin önerilerini takip etmek ve istenen şekle ulaşana kadar birden fazla çekme parametresini denemek önemlidir. Çatlak, pürüzlü veya büyük delikli bir iğne ucu ile çalışmak başarılı enjeksiyonu daha zor veya hatta imkansız hale getireceğinden, kalite kontrol adımı 1.1.3'ü gerçekleştirmek çok önemlidir.

Embriyonun kısmen kurutulması gerekir, böylece enjeksiyon sırasında ek hacimlerde sıvı eklenebilir. Embriyo az kurutulmuşsa, iğne kolayca girmeyecek ve iğne nüfuz ettikçe veya çözelti enjekte edildikçe sitoplazma fışkıracaktır. Embriyo aşırı kurutulmuşsa, sönük görünecek ve düzgün gelişmeyecektir. Tam kuruma süresi, hava nemi gibi yerel koşullara bağlıdır ve günden güne değişebilir. Her seans için ampirik olarak belirlenmelidir.

Embriyonun mikroenjeksiyondan sonra hayatta kalma kabiliyeti, iğnenin kalitesine, uygun kurumaya ve enjeksiyon hacminin 1 pL'den (ideal olarak 100 fL) daha azına sınırlandırılmasına kritik olarak bağlıdır. Bu parametreler optimize edildiği sürece, tarif edilen boyalar önerilen konsantrasyonlarda enjekte edildiğinde önemli bir toksisite görülmez. Embriyolar kuruma ve enjeksiyon adımlarında hayatta kalırlarsa, tipik olarak mikrop bandı uzantısına başarılı bir şekilde gelişirler, bunun bir istisnası, yüksek seviyelerde selülariizasyon kusurlarına neden olan mikrotübül ve ER problarıdır (her birinin stok konsantrasyonunun 100 fL enjeksiyonu). Test, DMSO, su ve ikisinin karışımları önerilen hacimlerde enjekte edildiğinde, ~% 75 veya daha fazla germ-bant uzantısı yoluyla embriyo hayatta kalma oranı ile belirgin bir gelişimsel kusur bulamamıştır. 1 pL'den fazla enjeksiyon hacimleri kusurlara neden oldu ve embriyolar 1 saatten az bir süre için geliştirilen ~ 4 pL hacimleriyle enjekte edildi. Bu nedenle, enjeksiyon hacimlerinin düşük tutulması gerekir, bu da boya konsantrasyonlarının yüksek olması gerektiği anlamına gelir.

Genel olarak, embriyonun yanal kenarı boyunca enjeksiyonlar, en az hasarla sonuçlandığı için tavsiye edilir. Bununla birlikte, enjeksiyon bölgesinin, kullanılan FP'lerin difüzyon özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. BODIPY 493/503 ve LysoTracker, tüm embriyo boyunca Lipid Spot 610'dan (LD'leri işaretlemek için başka bir boya) daha hızlı yayılırken, SiR-Tubulin ve Mitoview 633 embriyo boyunca asla tam olarak yayılmaz (enjeksiyon sonrası 7 saate kadar görüntüleme). Bu nedenle, ilgilenilen bölgeye veya yakınına enjeksiyon gerekli olabilir. Ön veya arka bölgelere enjekte edilirken, özellikle ince bir iğne önerilir.

Görüntü elde etme, küçük organelleri ve tüm sitoiskelet bileşenlerini optik olarak kesitlemek ve çözmek için konfokal mikroskopiye dayanır. Birçok görüntünün (örneğin, STORM veya PALM) analizini gerektiren teknikler işe yaramaz, çünkü embriyonik içerikler hareket halindedir ve floroforlar fotoşalter için optimize edilmemiştir. Epifloresan mikroskopi, çoğu organeli ve daha küçük hücresel yapıları ortaya çıkarmak için yanal ve eksenel çözünürlükten yoksundur. Bu nedenlerden dolayı, konfokal mikroskop kullanılması veya ışık tabakası teknolojisinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Görüntü analizinin tekrarlanabilirliği büyük ölçüde tutarlı görüntüleme verilerine dayanır. En yüksek başarı şansı için, enjeksiyon tekniğinin optimizasyonu ve görüntü elde edilmesi gerekir. İlgilenilen boyaların (boyaların), enjeksiyon yerinin, embriyonun yaşının, enjeksiyon hacminin ve edinme kurulumunun tutarlı olduğu bir tekniğin oluşturulması ve uygulanması, görüntü analizi için en sağlam verileri üretecektir.

Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
Bu protokol, parçacık görüntü velosimetrisi kullanarak bölünme aşaması embriyolarındaki LD'lerin toplu akışını analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Aynı yaklaşım diğer organeller, diğer gelişim aşamaları ve diğer analiz yöntemleri için de kullanılabilir. Örneğin, Şekil 2 , embriyogenezin sinsityal aşamalarında akan LD'lerin ve asidik organellerin analizini, BODIPY 493/503 ve LysoTracker Red'in birlikte enjekte edilmesiyle görselleştirilmiştir. Döllenme sonrası 7 saate kadar embriyolarda LD hareketinin daha başarılı bir şekilde görüntülenmesi sağlanmıştır; Bu embriyolar enjeksiyon yarasını korur, ancak birkaç saat boyunca gelişebilir.

Bu protokol kullanılarak toplanan veriler parçacık görüntü velosimetrisi için kullanılmıştır, ancak başka birçok analiz tekniği mevcuttur. Örneğin, ImageJ, Imaris veya manuel izlemede bulunanlar gibi parçacık izleme programları, hareketli yapıların hızlarını ve yönselliklerini elde etmek için kullanılabilir. Bu tür izleme yazılımlarının çoğunun, düzlemsel hücre kültürü sistemlerinden gelen verilerle çalışmak üzere oluşturulduğunu ve Drosophila embriyosu gibi 3D yapılara her zaman iyi uyum sağlamadığını unutmayın. Ayrıca, en kaliteli parçacık izleme verilerinin oluşturulması için, birden fazla Z düzleminin görüntülenmesi gerekir; görüntü yığını edinme süreleri ~2 s'nin altındaysa bu mümkün olmalıdır. Bu kıyaslama, dönen disk konfokal, kafes ışık tabakası ve son lazer tarama konfokal sistemlerinde erişilebilir olmalıdır. Bununla birlikte, LD'ler, mitokondri ve lizozomlar gibi bol miktarda organel için parçacık izlemenin fizibilitesi, bir görüş alanındaki pozitif sinyal miktarı mevcut izleme yöntemleri için çok yüksek olduğu için düşüktür. Çekirdekler veya yumurta sarısı vezikülleri gibi daha az miktarda bulunan yapıların izlenmesi mümkün olabilir. Akış analizi için PIV, bölünme aşamalarındaki LD'ler ve asidik organeller için iyi çalışır, çünkü her iki organel de serbestçe hareket eder. Çekirdekler, ER ve mitokondri gibi organeller diğer hücresel yapılara bağlıdır ve bu nedenle serbestçe hareket etmezler ve serbest hareketi varsayan yazılım analizine uygun değildirler. Araştırmacı, ilgilendiği organele en uygun teknikleri seçmelidir.

Sinsityal ve hücresel blastoderm aşamaları sırasında, LD'ler (ve diğer bazı organeller) radyal olarak yönlendirilmiş mikrotübüller boyunca hareket eder⁵. Bu nedenle, tek mikrotübüllerin uzun mesafeler için odakta olduğu ve 2B'de parçacık izlemesine izin veren kesitsel görünümler ( Şekil 5'te olduğu gibi) bulmak mümkündür. Bu optik düzlemler embriyonun derinliklerinde olduğundan, genel sinyal gücü azalır ve sinyal-gürültü oranı azalır.

İzleme analizi için, mümkün olduğunca hızlı görüntüleme, hareketin ve dolayısıyla hareketli makinelerin önemli ayrıntılarını ortaya çıkarabilir. Örneğin, lipit-damlacık hareketi iki hareketli durumun bir karışımıdır: yavaş-kısa hareket (~200 nm / s; ortalama seyahat mesafesi ~ 100 nm) ve hızlı-uzun hareket (~ 450 nm / s; ortalama seyahat mesafesi ~ 1.000 nm)¹⁹; Böylece, görüntüler her saniye veya daha az sıklıkta çekilirse, yavaş-kısa durum tespit edilemez hale gelir. Bununla birlikte, sık görüntüleme aynı zamanda florofor beyazlatma ve fototoksisiteyi de indükler. Bu nedenle, görüntüleme koşulları, ele alınacak kesin soruya bağlı olarak ayarlanmalıdır.

Yöntemin sınırlamaları
İstenilen boyaya bağlı olarak, yöntem, boya çözünürlüğü ile enjeksiyon çözeltisinin toksisitesi arasındaki uyumluluk ile sınırlandırılabilir. İzopropanol ve etanol gibi alkollerin, düşük viskoziteleri nedeniyle bir iğne içinde işlenmesi zordur ve hücresel bileşenlere zarar verir ve embriyoyu öldürür.

Yöntem aynı zamanda embriyogenezdeki en erken adımları görselleştirmek için de uygun değildir, çünkü embriyoları enjeksiyona hazırlamak 30+ dakika sürer. Oda sıcaklığında, embriyonun ilk hücre döngüleri her biri sadece ~ 10 dakika uzunluğundadır; Bu nedenle, 5.2.3 adımında yeni döllenmiş bir yumurta seçilse bile, embriyo görüntülemeye hazır olduğunda ilk birkaç hücre döngüsü zaten tamamlanmış olacaktır.

UV / mavi aralığındaki ışıkla aydınlatma, daha uzun dalga boylarına göre çok daha fototoksiktir. Bu koşullar altında (örneğin, otofloresan yumurta sarısı veziküllerini takip etmek için; Şekil 6), görüntüleme süresini sınırlamak (daha kısa zaman serilerine yol açar) veya daha düşük lazer gücü kullanmak (sinyal-gürültü oranının azalmasıyla sonuçlanır) gerekir.

Hücreselcileştirmeden sonra, belirli bir yere enjekte edilen boyalar, birçok hücre zarından geçmeleri gerektiğinden, zayıf bir şekilde yayılma eğilimindedir. Bu, daha sonraki gelişim aşamalarında gözlem bölgesini sınırlar.

Yöntemin mevcut/alternatif yöntemler açısından önemi
LD'lerin ve diğer lipit içeren organellerin erken embriyolardaki hareketi, genetik olarak kodlanmış floroforlar, etiketsiz teknikler ve FP'lerin tanıtılmasıyla görselleştirilebilir. İkincisi, vitelin membran^12'nin geçirgenleştirilmesi veya burada tartışılan mikroenjeksiyon yaklaşımı ile elde edilebilir.

Genetik olarak kodlanmış floroforlar, seviyeleri tipik olarak embriyodan embriyoya yüksek oranda tekrarlanabilen çok yönlü belirteçlerdir. Bununla birlikte, FP'lerden daha düşük kuantum verimlerine ve ağartıcılara sahiptirler. Tipik olarak, yalnızca bir veya iki etiketli versiyonda (örneğin, GFP veya mCherry) bulunurlar ve hangi yapıların aynı anda görüntülenebileceği seçimini sınırlarlar. Öte yandan, FP'ler genellikle çok çeşitli şekillerde bulunur; Örneğin, UV / mavi spektrumdaki Autodot'tan uzak kırmızı spektrumdaki Lipidtox ve LipidSpot 610'a kadar emisyon spektrumları ile çeşitli lipit-damlacık spesifik boyalar mevcuttur. FP'ler ayrıca herhangi bir ilgi alanına doğrudan uygulanabilir ve bu nedenle, örneğin, istenen organel işaretleyicisini mutant bir ilgi suşuna sokmak için gerinim yapısı gerektirmez. Bu avantaj, birden fazla yapının aynı anda etiketlenmesi gerektiğinde özellikle belirgindir; Birden fazla nesle yayılan zaman alıcı haçlar yerine, ilgili boyaların karıştırılması ve aynı anda tanıtılmasıyla tek bir günde bu elde edilebilir. Son olarak, hücresel süreçler farmakolojik inhibisyon ile araştırılacaksa, ilaçlar ve boyalar birlikte tanıtılabilir.

Etiketsiz yöntemler, belirli hücresel yapıları tespit etmek için çok güçlü yaklaşımlardır. Örneğin, LD'ler erken embriyolarda üçüncü harmonik nesil mikroskopi²⁰ veya femtosaniye Uyarılmış Raman Kaybı mikroskobu²¹ ile spesifik olarak tespit edilebilir. FP'ler gibi, bu yaklaşımlar da herhangi bir genetik arka planda uygulanabilir ve ağartmaya neden olmadıkları için potansiyel olarak daha hızlı görüntü elde edilmesine izin verirler. Bununla birlikte, tipik olarak belirli organellerle sınırlıdırlar ve bu nedenle kendi başlarına multipleks görüntülemeyi desteklemezler; ayrıca özel mikroskoplar gerektirirler.

Küçük molekülleri embriyolara sokmak için iki genel strateji vardır. Birincisi, burada kullanılan mikroenjeksiyon yaklaşımı; diğeri ise vitelin membranı geçirgenleştirmek için kimyasal (terpen) işlemdir. İkinci yaklaşım¹² , mikroenjeksiyondan daha az ilgilidir, ancak embriyodan embriyoya daha değişkendir. Ek olarak, geçirgenlikten sonra, vitelin membranı tarafından sağlanan koruma tehlikeye girer ve embriyo dış ortama uygun şekilde erişilebilir hale gelir, bu da onu canlı tutmayı daha zor hale getirir. Mikroenjeksiyonun embriyonik gelişimi raydan çıkarma olasılığı geçirgenlikten çok daha düşüktür. Bununla birlikte, birçok embriyonun aynı anda izlenmesi gerekiyorsa, örneğin ilaç taraması amacıyla permeabilizasyon önerilir. Hücresel yapıların hareketini takip etmek ve görüntü analizine uygun tekrarlanabilir görüntü serileri elde etmek için mikroenjeksiyon tercih edilen yöntemdir.

Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Drosophila embriyosu, birçok hücre-biyolojik ve gelişimsel süreci incelemek için önemli bir model sistemdir ^1,5,6. Organelleri floresan proteinlerle etiketlemek, erken embriyonun nasıl geliştiğinin, çeşitli organellerin nasıl trafiğe çıktığının ve bu tür kaçakçılığın gelişimsel ve genetik olarak nasıl modüle edildiğinin anlaşılmasına büyük katkılarda bulunmuştur. Bununla birlikte, ağartma eğilimleri ve birden fazla organelin farklı renklerle etiketlendiği suşlar üretme zorlukları bu yaklaşımın uygulanmasını sınırlar. Mikroenjeksiyon ile tanıtılan FP'lerin kullanımı bu zorlukların çoğunu çözer ve hatta floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle birleştirilebilir. Bu teknik, herhangi bir genetik arka planda çoklu organellerin, hücre yapılarının ve sitoiskelet bileşenlerinin görüntülenmesini sağlar. Sonuç olarak, canlı görüntüleme yoluyla çeşitli genotipler karşılaştırılabilir ve bu da mutasyonların çoklu organel kaçakçılığı üzerindeki etkisini belirlemeyi mümkün kılar.

Bu protokol, Drosophila melanogaster'in embriyoları için FP enjeksiyon yaklaşımını göstermektedir, ancak prensip olarak, bu yaklaşım, diğer Drosophila türleri, cırcır böcekleri²² ve yaprak bitleri²³ de dahil olmak üzere mikroenjeksiyon tekniklerinin oluşturulduğu herhangi bir böcek yumurtası için geçerlidir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue