Summary
I denne protokollen er en tarmmikrobiota antigenspesifikk T-celle adoptivoverførings kolittmodell beskrevet. CD4+ T-celler er isolert fra CBir1 TCR-transgene mus. Disse er spesifikke for en immunodominant tarmmikrobiota antigen CBir1 flagellin, som overføres til mottaker Rag1-/- mus, noe som fører til tarmbetennelse.
Abstract
Med økningen av forekomst pålegger inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), som er kroniske sykdommer som påvirker mage-tarmkanalen, en betydelig helse og økonomisk byrde på enkeltpersoner og samfunn. Derfor er det viktig å undersøke mekanismene som ligger til grunn for patogenesen og utviklingen av IBD. Her er en tarmmikrobiota antigenspesifikk T-celleoverføring kolittmodell beskrevet. CBir1 flagellin har blitt anerkjent som immunodominant tarmbakteriell antigen i eksperimentell kolitt og pasienter med Crohns sykdom. CBir1 TCR forbigående naϊve CD4+ T-celler, spesifikke for CBir1 flagellin, kan indusere kronisk kolitt etter adoptivoverføring til immundefektende Rag1-/- mus. Sykdommens alvorlighetsgrad vurderes av histopatologi. CD4+ T cellefenotyper i koloniske lamina propria bestemmes også. Denne modellen ligner på utviklingen av IBD, som gir en ideell murine modell for å undersøke mekanismene som driver patogenesen til IBD og tester de potensielle stoffene for behandling av IBD.
Introduction
Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), hovedsakelig inkludert Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC), er preget av kronisk, relapsing-remitterende betennelse i mage-tarmkanalen, som påvirker millioner over hele verden1. Flere faktorer har vært involvert i utviklingen og patogenesen av IBD, inkludert genetisk følsomhet, tarmmikrobiota, immunresponser, kosthold og livsstil2. Imidlertid er den eksakte mekanismen til IBD fortsatt ikke helt forstått.
En av de spesielle interessene er samspillet mellom tarmmikrobiota og vertsimmuneresponser ved regulering av tarmbetennelse3. Tarmmikrobiota gir en rekke immunostimulatoriske molekyler og antigener, som kan aktivere immunresponser4. Mens balansen mellom effektor T-celler og regulatoriske T-celler (Tregs) er avgjørende for å opprettholde intestinal homeostase, bidrar overdreven intestinal slimhinne CD4 + T cellerespons på tarmmikrobiotaantigener til tarmbetennelse5,6,7. Som et immunodominant tarmmikrobiota-antigen har CBir1 flagellin vært relatert til patogenesen av menneskelig CD8,9. Videre induserer overføring av CBir1 TCR transgene (Tg) T-celler tarmbetennelse hos immundefektende mus6, som ligner den menneskelige IBD, noe som indikerer at denne T-celleoverføringsmodellen bidrar til å undersøke mekanismene til menneskelig IBD.
Dette arbeidet beskriver den detaljerte protokollen for å indusere kolitt i Rag1-/- mus ved adoptivoverføring av CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler og vurdere alvorlighetsgraden av sykdommen. Dessuten vises de forventede resultatene, og de kritiske trinnene i prosedyren og feilsøkingen diskuteres, noe som vil hjelpe forskere med å undersøke mekanismene for patogenese av tarmbetennelse og teste de potensielle stoffene for behandling av IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til University of Texas Medical Branch's Committee on the Use and Care of the animals. CBir1 TCR Tg mus ble levert av Dr. Charles Elson ved University of Alabama i Birmingham. CBir1 TCR Tg mus kan være kvinnelige eller mannlige, men bør være på 8-12 uker. Rag1-/- mus på C57BL/6-bakgrunn ble hentet fra Jackson Laboratory10. Rag1-/- mus må være kjønn og alderstilpasset, og enten mann eller kvinne kan brukes, men bør være på 8-12 uker. Hele protokollen er oppsummert i figur 1.
1. Forberedelse av mottakermusene
- Forbered Rag1-/- mus på C57BL/6-bakgrunnen, oppdrettet i samme spesifikke patogenfrie dyreanlegg. Beregn antall mus per gruppe etter kraftanalyse11.
MERK: Rag1-/- mus har ikke modne T-celler og B-celler10. - Merk musene ved øret.
- Vei musene på samme dag med T-celleoverføring.
2. Utarbeidelse av reagenser og løsninger
MERK: Reagensene som brukes er giftige, eller biofarende og håndteringen deres trenger forholdsregler og sikkerhetstiltak.
- Klargjør vaskebuffer: Tilsett 5 ml 100x Penicillin-Streptomycin i 500 ml RPMI 1640 medium. Bland den grundig og oppbevar den ved 4 °C.
- Klargjør Tris-NH4Cl Lysis Buffer.
- Forbered løsning del A. Løs opp 2,06 g Tris-base i 100 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O) og juster pH-verdien til 7,2 med HCl.
- Klargjør løsning Del B. Løs opp 7,47 g NH4Cl i 800 ml ddH2O.
- Bland A og B grundig. Mål pH og juster den til 7.2 hvis ikke.
- Juster det totale volumet til 1000 ml. Autoklaver og oppbevar den deretter ved 4 °C.
- Klargjør isolasjonsbufferen.
- Tilsett 2,5 g BSA og 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 500 ml 1x PBS. Bland det grundig.
- Filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm vakuumdrevet toppfilter for engangsflasker (se Materialtabell). Oppbevar den ved 4 °C.
- Klargjør aktivabuffer. Tilsett 1 ml FBS og 50 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 50 ml vaskebuffer (utarbeidet i trinn 2.1). Bland grundig og oppbevar den ved 4 °C.
- Forbered fullstendig medium. Tilsett 5 ml FBS i 45 ml vaskebuffer. Bland grundig og oppbevar den ved 4 °C.
- Klargjør EDTA-PBS-buffer.
- Beregn volumet på EDTA-PBS-bufferen som trengs. Volum (ml) = musenummer x 20.
- Legg til passende volum av FBS, EDTA og HEPES i PBS (2 % av FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES i PBS) (se Materialfortegnelser).
- Bland det grundig og forvarm i et 37 °C vannbad.
- Klargjør fordøyelsesbufferen.
- Beregn volumet på fordøyelsesbufferen som kreves. Volum (ml) = musenummer x 10.
- Tilsett passende volum AV FBS, Collagenase IV og DNase I i vaskebuffer (2 % av FBS, 0,5 mg/ml kollagennase IV og 10 U/ml DNase I i vaskebuffer) (se materialfortegnelse).
- Bland det grundig og forvarm i et 37 °C vannbad.
- Forbered Percoll Solution.
- Forbered 100% percoll. Tilsett 5 ml 10x PBS i 45 ml original percoll (se materialliste).
- Forbered 2% FBS i vaskebuffer. Tilsett 1 ml FBS i 49 ml vaskebuffer.
- Caulculate volumet av 40 % percoll løsning og 75 % percoll løsning. Volum på 40 % percoll-løsning (ml) = musenummer x 4; Volum på 75 % percoll-løsning (ml) = musenummer x 2.
MERK: Reagensene/løsningene som er utarbeidet i trinn 2.1-2.5, vil bli brukt i trinn 3-4, og de som er utarbeidet i trinn 2.6-2.8 vil bli brukt i trinn 9. Alle reagensene/løsningene som brukes i trinn 9, bør tilberedes på nytt. Å lage 5 % ekstra buffer anbefales for alle trinnene.
3. Isolering av miltika CBir1 TCR Tg CD4+ T celler
- Euthanize CBir1 TCR Tg mus/mus ved en cervical dislokasjon med CO2 eutanasi (30%-70% gass-luft forskyvning rate). Våt musene med 70% etanol.
- Utfør et ~ 1 cm venstre magesnitt, trekk huden bort fra magemuskelvevet, gjør et ~ 3 cm snitt i magemuskelvevet, og fjern milten med steril saks og tang. Plasser milten i en kulturrett som inneholder 5 ml forkjølet vaskebuffer (fremstilt i trinn 2.1).
- Slip milten med den grove overflaten av to sterile glasssklier. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml sentrifugerør ved å passere gjennom en 100 μm cellesil (se Materialfortegnelse). Skyll glasssklier og kulturfat med 5 ml forkjølet vaskebuffer og overfør vaskebufferen inn i røret.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspend cellene med 5 ml forvarmet Tris-NH4Cl Lysis Buffer (utarbeidet i trinn 2.2) per milt. Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Tilsett 10 ml forkjølet vaskebuffer på røret.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Kast supernatanten og bruk cellene på nytt med 10 ml forkjølet isolasjonsbuffer (fremstilt i trinn 2.3).
- Tell cellene. Bland 10 μL celleoppheng med 10 μL trypan blå grundig. Legg 10 μL av blandingen på et lysbilde, sett lysbildet inn i den automatiserte celletelleren (se Materialfortegnelse) og få det levedyktige cellenummeret12.
MERK: Omtrent 1 x 108 celler kan fås fra en donormus i dette trinnet. - Sentrifuger den gjenværende cellefjæringen fra trinn 3,6 ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast alle supernatantene.
- Virvel antimus CD4 magnetiske partikler grundig (se Tabell over materialer), tilsett direkte 50 μL av partiklene per 107 celler og bland med cellepellets grundig. Inkuber i 30 min ved 4 °C.
MERK: Alle andre kommersielle CD4+ T-celleberikelsessett kan brukes her. - Overfør cellepartikkelfjæringen til et sterilt oppsamlingsrør. Tilsett 3,5 ml forkjølet isolasjonsbuffer i røret.
- Plasser røret på celleseparasjonsmagneten (se Materialtabellen) i 8 minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig av supernatanten ved hjelp av en 3 ml overføringspipette.
- Fjern røret fra celleseparasjonsmagneten (se Materialtabell), resuspend cellene med 3,5 ml forkjølet isolasjonsbuffer, og plasser røret til magneten i 4 minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig av supernatanten ved hjelp av en 3 ml overføringspipette.
- Gjenta trinn 3.11.
- Resuspend cellene med 1 ml pre-cold FACS Buffer (utarbeidet i trinn 2.4).
4. Rensing av CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler
- Tell cellene etter trinn 3.6.
- Hvis cellekonsentrasjonen er >107/ml, legger du til et volum FACS-buffer for å sikre at cellekonsentrasjonen er ≤ 107/ml.
MERK: ~ 1 × 107 celler kan fås fra en donormus i dette trinnet. - Beflekk overflatemarkørene med 10 μL antimus CD4-APC, 10 μL antimus CD25-Percp/Cy5,5 og 10 μL antimus CD62L-PE13,14 (se Materialfortegnelser). Bland forsiktig og inkuber i 30 min ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene med 2 ml forkjølet FACS-buffer. Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer alle supernatantene som bruker en 3 ml transferpipette.
- Gjenta trinn 4.4.
- Resuspend cellene til konsentrasjonen av 40 x 106/ ml i pre-cold FACS buffer.
MERK: For å forhindre at sorteringen tetter seg, før cellene gjennom en 70 μm sil. - Tilsett 0,1 μg/ml DAPI.
MERK: DAPI brukes til å ekskludere dødcellene. - Forbered 15 ml sentrifugerør som inneholder 4 ml Komplett medium (utarbeidet i trinn 2.5) for å samle de sorterte cellene.
- Last cellene inn i sorteringen. Sorter enkle levedyktige naϊve CD4+ T-celler (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ celler) i renhetsmodus (Dysestørrelse: 70 μm; Trykk: 70 PSI; Frekvens for arrangement: 8000-12000 hendelser/s; Effektivitet: høyere enn 90 %) (figur 2).
MERK: Naϊve CD4+ T-celler uttrykker høyt uttrykk for CD62L og mangler aktiveringsmarkøren CD2513,14. - Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer alle supernatantene ved hjelp av en 3 ml transferpipette.
- Resuspend cellene i 500 μL av 1x PBS.
- Telle celler etter trinn 3.6
MERK: ~ 5 × 106 celler kan fås fra en donormus i dette trinnet.
5. Celleoverføring til mottakermusene
- Resuspend CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler til konsentrasjonen 5 x 106/ml ved å tilsette 1x PBS.
- Varm opp Rag-/- musene under en varmelampe (se Materialbord) i 4 min, og hold musene fast ved hjelp av en musebeherskelse.
- Overfør intravenøst 200 μL av cellefjæringen til halevenen til Rag-/- mus ved hjelp av en 1 ml insulinsprøyte (27 G) (se materialtabellen).
MERK: Celler fra en donormus er nok til å overføres til rundt fem mottakermus.
6. Overvåking av kliniske tegn under kolittprogresjon
- Vei musene hver uke og øk observasjonen til to ganger i uken når musene begynner å miste > 5% av originale vekter.
- Vær oppmerksom på musenes respons/bevegelse når de stimuleres forsiktig.
- Vær oppmerksom på andre kliniske abnormiteter. det vil si holdning og avføringskonsistens.
7. Kolon samling og histopatologisk scoring
- Ofre mottakermusene ved en cervical dislokasjon med CO2 på et tidspunkt for vekttapet >20% av opprinnelig vekt eller 6 uker etter celleoverføring. Våt musene med 70% etanol.
- Utfør en ~ 1 cm ventral midtlinje hud snitt, trekke huden bort fra bukmuskelen vev, gjøre en ~ 3 cm snitt i bukmuskelen vev, identifisere cecum, og fjerne hele tykktarmen med steril saks og tang. Fukt tykktarmen med forkjølet PBS i en kulturrett.
- Øk tykktarmen på langs og skyll den med forkjølet PBS. Klipp 1/3 av tykktarmen langsgående.
- Plasser kolonstrimmelen i et papirhåndkle med lyssiden vendt oppover. Utfør sveitsisk rulling ved hjelp av en tannpirker15.
- Plasser tykktarmen swiss i en kassett og legg kassetten i 10% bufret formalin for 24 h16, etterfulgt av dehydrering ved hjelp av en automatisert prosessor (se Tabell over materialer) og parafin innebygging.
- Klipp 5 μm vevsseksjoner på en mikrotom, montert på lysbilder, og utfør Hematoxylin og eosin (H&E) stain17 (se Materialtabell).
- Bestem de histopatologiske poengsummene ved å kombinere poengsummene for hver av de seks parameterne for maksimalt 12. Lamina propria betennelse (normal, 0; mild, 1; moderat, 2; alvorlig, 3); begercelletap (normalt, 0; mildt, 1; moderat, 2; alvorlig, 3); unormal krypt (normal, 0; hyperplastisk, 1; uorganisering, 2; krypttap, 3); krypt abscesser (fraværende, 0; til stede, 1); slimhinne erosjon og sårdannelse (normal, 0; mild, 1; moderat, 2; alvorlig, 3); og submukosal forandring (ingen, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Isolering og farging av tarm lamina propria celler
- Etter trinn 7.3, kutt ytterligere 2/3 av tykktarmen i 0,5-1 cm stykker og vask den med forkjølet PBS.
- Overfør kolonsegmentene til 20 ml forvarmet EDTA-PBS-buffer i et 50 ml sentrifugerør. Inkuber ved 37 °C med 250 o/min risting i 30 minutter.
- Virvel røret, kast supernatantene ved å føre det gjennom en steril sikt (diameter: 0,01 tommer), og resuspend kolonsegmentene i 20 ml forkjølet PBS i 50 ml-røret.
- Gjenta trinn 8.3 to ganger.
- Plasser kolonsegmentene i et C-rør (se Materialtabell) som inneholder 10 ml forvarmet fordøyelsesbuffer.
- Plasser røret på en dissosiatormaskin (se Materialbord) og inkuber under programmet "37C_m_LPDK_1" i 25 min.
MERK: "37C_m_LPDK_1" er et standard forhåndsinnstilt program i Dissociator-maskinen som brukes til å røre prøvene og holde dem ved 37 °C. - Sjekk om vev fordøyes helt, noe som betyr at ingen vev er i fordøyelsesbufferen. Hvis ikke, gjenta programmet "37C_m_LPDK_1".
- Samle supernatanten ved å passere gjennom en metallsikte og 100 μL sil. Skyll med 10 ml forkjølet PBS.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer alle supernatantene.
- Resuspend cellene i 4 ml 40% Percoll Solution og bland den grundig (tilberedt i trinn 2.8).
- Overfør de resuspenderte cellene til 2 ml 75% Percoll-oppløsning i et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 850 x g i 20 minutter ved 20 °C (Akselerasjonsrampe: 0; Bremserampe: 0).
- Fjern forsiktig fett på topplaget ved hjelp av en 3 ml Transfer Pipette og overfør cellelaget til 20 ml vaskebuffer i et 50 ml rør.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Kast alle supernatanter og resuspendceller i 1 ml fullført medium.
- Tell cellene etter trinn 3.6.
- Frø cellene i en 24-brønns plate, aktiver dem med 50 ng/ml Phorbol-12-myristate 13-acetat og 750 ng/ml ionomycin i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon med 5 μg/ml Brefeldin A i 3 timer (se Materialliste).
MERK: Reagensene som brukes er giftige, og håndteringen deres trenger forholdsregler og sikkerhetstiltak. - Overfør cellene til et FACS-rør, tilsett 2 ml FACS Buffer, og sentrifuger cellene ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Inkuber cellene med 12,5 μg/ml antimus CD16/3219 i (se Materialfortegnelse) FACS-buffer for å blokkere Fc-reseptorer i 5 minutter ved romtemperatur.
- Flekk for levende/død og overflatemarkør.
- Vask cellene med 2 ml FACS Buffer og sentrifuger dem ved 350 x g i 8 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Flekk cellene med levende fargestoffer og overflatemarkører (dvs. antimus CD3 og antimus CD4 antistoffer)20 (se Materialtabell) i FACS Buffer ved optimalisert konsentrasjon i 30 min ved 4 °C i mørket.
MERK: Reagensene som brukes er giftige, og håndteringen deres trenger forholdsregler og sikkerhetstiltak.
- Utfør cellulære og kjernefysiske flekker.
- Tilsett 2 ml FACS Buffer og sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Gjennomsyre og fikse cellene ved å resuspendere cellene med 200 μL transkripsjonsfaktorfiks arbeidsløsning (se materialtabell) i 40 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 2 ml Perm buffer og sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Inkuber cellene med cellulære og kjernefysiske markører (dvs. antimus IFNγ, antimus IL-17A og antimus Foxp3 antistoffer)20 i Perm buffer (se Materialliste) i 30 min-1 h ved romtemperatur.
- Tilsett 2 ml Perm buffer og sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml FACS Buffer og sentrifuger cellefjæringen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Resuspendceller med 200 μL FACS Buffer og kjør prøvene på et strømningscytometer (se Materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omtrent 5 x 106 CBir1 TCR Tg-naϊve CD4+ T-celler per milt ble isolert fra en voksen CBir1 TCR Tg-mus. Overføring av CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler induserte kronisk kolitt hos mottaker Rag1-/- mus. Etter celleoverføring ble kliniske tegn overvåket for å evaluere progresjonen av tarmbetennelse, inkludert vekttap, avføringskonsistens og hakket holdning. Som forventet begynte mus å gå ned i vekt rundt tre uker etter celleoverføring, og vekten nådde rundt 80% -85% av opprinnelig vekt seks uker etter celleoverføring (figur 3). I tillegg viste mus diaré rundt 3-4 uker etter celleoverføring og demonstrerte hunched holdning da de utviklet alvorlig kolitt. Grov morfologi av tykktarmen ble vist, og kolitt alvorlighetsgraden ble vurdert av histopatologisk score når mus ble ofret. Mus som fikk CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler viste kort kolonlengde 6 uker etter celleoverføring (figur 4A). Mottakermusene demonstrerte mer celleinfiltrasjon i tarm lamina propria 4 uker etter celleoverføring (figur 4C), begercelletap og intestinal epitelcellehyperplasi 5 uker etter celleoverføring (figur 4D), og slimhinneerosjon og inflammatorisk celleinfiltrasjon i submucosa i tykktarmen 6 uker etter celleoverføring (figur 4F). Samtidig var det ingen betennelse i Rag1-/- mus som fikk PBS alene (figur 4B). Dessuten er det ingen betennelse i tynntarmen, men cecum har betennelse. I tillegg ble CD4+ T cellefenotyper i koloniske lamina propria bestemt av strømningscytometri. Gatingstrategien vises (figur 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler utviklet til IFNγ+ Th1-celler, IL-17A+ Th17-celler, IFNγ+ IL-17+ CD4+ T-celler (figur 5F) og Foxp3+ Treg-celler i tarm lamina propria av Rag1-/- mottakere (figur 5G).
Figur 1: Prosedyren for induksjon kolitt og vurdering av alvorlighetsgraden av sykdommen. Splenic CD4+ T-celler ble isolert fra CBir1 TCR-transgene mus ved hjelp av magnetiske perler, og deretter ble naϊve T-celler renset ved sortering. CBir1 TCR transgene naϊve T-celler ble deretter intravenøst overført til mottaker Rag1-/- mus. Da musene ble ofret rundt seks uker etter celleoverføring, ble kolitt alvorlighetsgrad vurdert av histopatologiske score. CD4+ T cellefenotyper i koloniske lamina propria ble bestemt av strømningscytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating-strategien for sortering av CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler. Levedyktige enkelt CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler ble renset ved å ekskludere rusk (A), ikke-enkeltceller (B-C), døde celler (D) og aktiverte celler (E-F). Delpopulasjonen ble vist i (G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vektendringene til Rag1-/- mus etter T-celleoverføring. 1 x 106 CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler ble overført til Rag1-/- mus, og Rag1-/- mus som fikk PBS ble brukt som kontroller. Musevekter ble registrert hver uke. Data ble presentert i gjennomsnittlig ± SD; Studentens t-test; p<0.001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bruttomorfologi og hematoksylin og eosinfarging av tykktarmen fra Rag1-/- mus som fikk CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler. (A) Mottakermusene ble ofret seks uker etter celleoverføring, og tykktarmens bruttomorfologi ble vist. (B-E) Mottakermusene ble ofret på forskjellige tidspunkter, og Rag1-/- mus fikk PBS som kontroller. Kolonene ble behandlet for Hematoksylin og eosinfarging. Representative bilder av Hematoxylin og eosinfarging av tykktarmen er vist. Skala bar = 200 μm. (F) Histopatologiske score ble bestemt. Data ble presentert i gjennomsnitt ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: CD4+ T-cellefenotypene i koloniske lamina-propria av Rag-/- mus som mottar CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler. Da mottakermusene ble ofret 6 uker etter celleoverføring, ble koloniske lamina propriaceller isolert for farging av CD4 + T-cellefenotyper. (A-E) Gating strategien for analyse av T celle fenotyper. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T-celler, IFNγ+ CD4+ T-celler, IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-celler og (G) Foxp3+ Tregs ble bestemt av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om hvert trinn er viktig for reproduserbarheten til denne kolittmodellen, er det flere kritiske trinn. Mottakeren Rag-/- mus bør få tilstrekkelig levedyktige naϊve CD4+ T-celler for å indusere tarmbetennelse. Vi brukte milt til isolering av naive CD4+ T-celler i stedet for MLNer. Fordi utbyttet av naive CD4+ T-celler i MLNer er mye lavere enn i milter. CD62L er sterkt uttrykt i naive T-celler, og CD44 og CD25 er aktiveringsmarkørene til T-celler13,14. I denne studien brukte vi først anti-CD4 magnetiske perler for å isolere CD4 + T-celler fra milter. Deretter brukte vi kombinasjonen av anti-CD4, anti-CD62L og anti-CD25 antistoffer for isolering av naive CD4 + T-celler13,14. Forskere kan bruke andre markører for å sortere de naive CD4 + T-cellene. CD45RBHI er også markør for naive T-celler. CD45RBHI CD25- CD4+ T-celler brukes ofte som naive T-celler av villtype ikke-TCR-transgene T-celler23. Derfor er teknikkene for sortering av celler og intravenøst injeksjon av T-cellene i mottakermusene avgjørende. Det er nyttig å sette opp gatingprotokollen som en mal for å øke hastigheten på eksperimentene med færre feil. For å unngå celledød, bør celler alltid holdes på is. Dessuten anbefales farging av celler med DAPI sterkt for å ekskludere døde celler fordi DAPI ikke kan passere over intakte cellemembraner, noe som gjør det til en utmerket dødcellesonde24. Oppvarming av musene for å stimulere utvidelse av haleårene gir bedre venesynlighet for intravenøs injeksjon. Alle prosedyrer anbefales utført av opplærte forskere.
Mange faktorer kan påvirke utfallet av kolittmodellene, som må tas hensyn til. Først skal mottakeren Rag1-/- mus være alder og kjønn-matchet. I celleoverføringsmodellen CD45RBHI T kan T-celler fra mannlige og kvinnelige givere overføres til mannlige Rag-/- mottakere, mens bare kvinnelige givere kan brukes ved bruk av kvinnelige mottakere23. Vi ser imidlertid ingen signifikant forskjell mellom mannlige og kvinnelige mottakere. Mottakermusene kan være enten kvinner eller menn, og T-celler fra mannlige donorer kan også indusere kolitt hos kvinnelige mottakere. Siden vektendring er en verdifull indikator på kolittprogresjon, anbefales det å bruke mottakermusene mellom 8-12 uker for å presentere en stabil vektlinje. Disse mottakermusene skal avles og holdes i samme rom i dyreanlegget fordi mikrobiota er avgjørende for å regulere kolittutvikling25. Tiden for å utvikle kolitt varierer ved overføring av forskjellige antall CBir1 TCR Tg naive CD4 T-celler. Som forventet krever færre celler lengre tid for induksjon av kolitt, og et høyere antall celler krever kortere tid for induksjon av kolitt. Bruk av 1 x 106 celler per mottakermus anbefales siden mottakermusene demonstrerer kliniske tegn på kolitt ~ 2-3 uker etter celleoverføring og utvikler relativt alvorlig kolitt ~ 6 uker etter celleoverføring. I tillegg, sammenlignet med intraperitoneal injeksjon, induserer intravenøs injeksjon av celler i halevenen mer konsistent kolitt. For isolering av koloniske lamina propriaceller må kolonvevet ikke bli tørt; Ellers ville det redusere cellenes utbytte og levedyktighet. En av de spesielle bekymringene er at varigheten av kolitten vil bli endret hvis mottakermusene overføres med genetisk modifiserte CBir1 TCR Tg T-celler eller behandles med narkotika26. I tillegg induserer CBir1 TCR Tg T-celler også tarmbetennelse hos andre immundefektende mus, som TCRβ /δ-/- mus, som mangler T-celler27.
Som akkumulerende bevis indikerer en avgjørende rolle i tarmbakterielle antigenspesifikke reaktive T-celler i patogenesen av IBD, ved hjelp av T-celler som er spesifikke for et definert tarmbakterielt antigen, vil gi innsikt i hvordan tarmbakteriell antigen induserer T-celleresponser for å indusere kolitt. Tarmmikrobiota antigen CBir1 flagellin er rikelig i mage-tarmkanalen, som er relatert til patogenesen av IBD8,9. Denne kolittmodellen ligner flere kritiske egenskaper ved IBD, inkludert diaré, vekttap, histopatologiske funn og unormale tarmimmuneresponser. Derfor er denne kolittmodellen nyttig for å studere mekanismene til menneskelig IBD og gir et verktøy for å evaluere behandlingene for IBD. Interessant nok indikerte det nylige arbeidet til Chiaranunt et al. at T-cellespdysifisitet til microbiota CBir 1-antigenet alene kanskje ikke er tilstrekkelig til å indusere T-celleaktivering og kolitt. Dette fremgår av wild-type CBir1 TCR Tg T-celler indusert kolitt i Rag-/- mottakere, mens Rag-/- CBir1 T-celler ikke induserte kolitt i dyreanlegget, noe som tyder på at tarm T-celler som reagerer på spesifikk tarmbakteriell antigen, kan kreve andre sammenhengende kommensale bakterier, for eksempel Helicobacter spp, for å fungere som en adjuvant28 . Et spennende aspekt ved denne modellen er at forskjellige T-celledelsett, nemlig Th1, Th17 og Treg-celler, er til stede i lamina propria av kollittiske mottakermus, noe som gir en unik mulighet til å undersøke rollene til ikke bare effektor T-celler, men også Tregs i patogenesen av kolitt29.
Men siden denne kolittmodellen formidles av tarmmikrobiota-spesifikke T-celler, er en begrensning for denne kolittmodellen at varigheten av induksjon av kolitt kan variere i forskjellige dyreanlegg avhengig av tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har motstridende økonomiske, profesjonelle eller personlige interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health grants DK125011, AI150210 og DK124132, University of Texas System STARs award (Y.C.), og James W. McLaughlin Fellowship Fund fra University of Texas Medical Branch ved Galveston (W.Y.). Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
