Summary
Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.
Abstract
Com o aumento da incidência, as doenças inflamatórias intestinais (DII), que são doenças crônicas que afetam o trato gastrointestinal, impõem uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Por isso, é fundamental investigar os mecanismos subjacentes à patogênese e ao desenvolvimento do IBD. Aqui, um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal é descrito. CBir1 flagellin foi reconhecido como o antígeno bacteriano intestinal imunodominante em colite experimental e pacientes com doença de Crohn. As células CD4+ T transgênicas CBir1 T, específicas do CBir1 flagellin, podem induzir colite crônica após transferência adotiva para rag1-/- camundongos deficientes imunológicos. A gravidade da doença é avaliada pela histopatologia. Os fenótipos de células T CD4+ em lavíria lamina colonia também são determinados. Este modelo se assemelha muito ao desenvolvimento do IBD, que fornece um modelo murino ideal para investigar os mecanismos que conduzem a patogênese do IBD e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.
Introduction
As doenças inflamatórias intestinais (DII), principalmente incluindo a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC), são caracterizadas pela inflamação crônica, reencenando-reencenação do trato gastrointestinal, afetando milhões em todo o mundo1. Vários fatores foram implicados no desenvolvimento e na patogênese do DII, incluindo suscetibilidade genética, microbiota intestinal, respostas imunes, dieta e estilo de vida2. No entanto, o mecanismo exato do IBD ainda não é completamente compreendido.
Um dos interesses particulares é a interação entre microbiota intestinal e respostas imunes hospedeiras na regulação da inflamação intestinal3. A microbiota intestinal fornece uma série de moléculas imunoestimulatórias e antígenos, que podem ativar as respostas imunológicas4. Enquanto o equilíbrio entre células T effector e células T regulatórias (Tregs) é fundamental na manutenção da homeostase intestinal, a resposta excessiva das células T mucosas intestinais à microbiota intestinal contribui para inflamação intestinal5,6,7. Como um antígeno de microbiota intestinal imunodominante, cBir1 flagellin tem sido relacionado com a patogênese do CD8,9 humano. Além disso, a transferência de células T transgênicas CBir1 TCR (Tg) induz inflamação intestinal em camundongos imuno-deficientes6, assemelhando-se intimamente ao IBD humano, indicando que este modelo de transferência de células T ajuda a investigar os mecanismos do IBD humano.
Este trabalho descreve o protocolo detalhado de indução de colite em Rag1-/- camundongos por transferência adotiva de células CD4+ T CBir1 Tcr t e avaliação da gravidade da doença. Além disso, os resultados antecipados são mostrados, e são discutidas as etapas críticas do procedimento e solução de problemas, que ajudarão os pesquisadores a investigar os mecanismos da patogênese da inflamação intestinal e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com o Comitê de Uso e Cuidado dos animais da Universidade do Texas Medical Branch. Os ratos CBir1 TCR Tg foram fornecidos pelo Dr. Charles Elson da Universidade do Alabama em Birmingham. Os camundongos CBir1 TCR Tg podem ser fêmeas ou machos, mas devem estar entre 8 e 12 semanas. Os camundongos rag1-/- no fundo C57BL/6 foram obtidos do Laboratório Jackson10. Os camundongos devem ser compatível com sexo e idade, e homens ou mulheres podem ser usados, mas devem ter entre 8 e 12 semanas. Todo o protocolo está resumido na Figura 1.
1. Preparação dos camundongos receptores
- Prepare rag1-/- ratos no fundo C57BL/6, criados na mesma instalação animal específica sem patógenos. Calcule o número de ratos por grupo por análise de energia11.
NOTA: Os camundongos rag1-/- não têm células T maduras e células B10. - Marque os ratos com um soco de orelha.
- Pesar os ratos no mesmo dia da transferência de células T.
2. Preparação dos reagentes e soluções
NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, ou de risco biológico e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança.
- Prepare o tampão de lavagem: adicione 5 mL de penicilina-estreptomicina de 100x em 500 mL de meio RPMI 1640. Misture bem e armazene a 4 °C.
- Prepare o tampão de lise tris-NH4Cl.
- Prepare a solução Parte A. Dissolva 2,06 g de base Tris em 100 mL de água dupla destilada (ddH2O) e ajuste o valor do pH para 7,2 com HCl.
- Prepare a solução Parte B. Dissolva 7,47 g de NH4Cl em 800 mL de ddH2O.
- Misture bem A e B. Meça o pH e ajuste-o para 7,2 se não.
- Ajuste o volume total para 1000 mL. Autoclave e, em seguida, armazene-o a 4 °C.
- Prepare o Tampão de Isolamento.
- Adicione 2,5 g de BSA e 500 μL de EDTA (0,5 M, pH 8.0) em 500 mL de 1x PBS. Misture bem.
- Filtre a solução através de um filtro de garrafa descartável movido a vácuo de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). Armazene a 4 °C.
- Prepare o buffer FACS. Adicione 1 mL de FBS e 50 μL de EDTA (0,5 M, pH 8.0) em 50 mL de Tampão de Lavagem (preparado na etapa 2.1). Misture bem e armazene a 4 °C.
- Prepare o Meio Completo. Adicione 5 mL de FBS em 45 mL de tampão de lavagem. Misture bem e armazene a 4 °C.
- Prepare o buffer EDTA-PBS.
- Calcule o volume do buffer EDTA-PBS necessário. Volume (mL) = número do mouse x 20.
- Adicione volume adequado de FBS, EDTA e HEPES no PBS (2% de FBS, 0,5 mM de EDTA, 10 mM de HEPES na PBS) (ver Tabela de Materiais).
- Misture bem e pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
- Prepare o buffer de digestão.
- Calcule o volume do buffer de digestão necessário. Volume (mL) = número do mouse x 10.
- Adicione o volume apropriado de FBS, Collagenase IV e DNase I em Tampão de Lavagem (2% de FBS, 0,5 mg/mL de Colagenase IV e 10 U/mL de DNase I em Tampão de Lavagem) (ver Tabela de Materiais).
- Misture bem e pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
- Prepare a Solução Percoll.
- Prepare-se 100% Percoll. Adicione 5 mL de PBS de 10x em 45 mL de Percoll original (ver Tabela de Materiais).
- Prepare 2% de FBS no tampão de lavagem. Adicione 1 mL de FBS em 49 mL de tampão de lavagem.
- Caulule o volume de 40 % Solução Percoll e Solução Percoll de 75 %. Volume de Solução Percoll de 40% (mL) = número do mouse x 4; Volume de 75% Solução Percoll (mL) = número do mouse x 2.
NOTA: Os reagentes/soluções preparados nas etapas 2.1-2.5 serão utilizados nas etapas 3-4, e aqueles preparados nas etapas 2.6-2.8 serão utilizados na etapa 9. Todos os reagentes/soluções utilizados na etapa 9 devem ser preparados recentemente. A fabricação de 5 % de buffer extra é recomendada para todas as etapas.
3. Isolamento das células CBir1 TCR Tg CD4+
- Eutanize O rato/camundongos TCR TCR de eutanize CBir1 por uma luxação cervical com eutanásia de CO2 (taxa de deslocamento gaso-ar de 30%-70%). Molhe os ratos com 70% de etanol.
- Realize uma incisão do abdômen esquerdo de ~1 cm, puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal, faça uma incisão de ~3 cm no tecido muscular abdominal e remova o baço com tesouras estéreis e fórceps. Coloque o baço em um prato de cultura contendo 5 mL de tampão de lavagem pré-frio (preparado na etapa 2.1).
- Triture o baço com a superfície áspera de duas lâminas de vidro estéreis. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mL passando por um coador de células de 100 μm (ver Tabela de Materiais). Enxágüe os slides de vidro e o prato de cultura com 5 mL de tampão de lavagem pré-frio e transfira o tampão de lavagem para o tubo.
- Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernascer e resuspenque as células com 5 mL de tampão de lyse tris-nh4Cl pré-aquecido (preparado na etapa 2.2) por baço. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Adicione 10 mL de tampão de lavagem pré-frio ao tubo.
- Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque as células com 10 mL de tampão de isolamento pré-frio (preparado na etapa 2.3).
- Conte as células. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul trypan completamente. Carregue 10 μL da mistura em um slide, insira o slide no Contador automatizado de células (ver Tabela de Materiais) e obtenha o número de célula viável12.
NOTA: Aproximadamente 1 x 108 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa. - Centrifugar a suspensão celular restante da etapa 3.6 a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte todos os supernantes.
- Vórtice as partículas magnéticas CD4 anti-mouse cuidadosamente (ver Tabela de Materiais), adicione diretamente 50 μL das partículas por 107 células e misture-se completamente com pelotas celulares. Incubar por 30 min a 4 °C.
NOTA: Qualquer outro kit comercial de enriquecimento celular CD4+ T pode ser usado aqui. - Transfira a suspensão da célula-partícula para um tubo de coleta estéril. Adicione 3,5 mL de tampão de isolamento pré-frio no tubo.
- Coloque o tubo no ímã de separação celular (ver Tabela de Materiais) por 8 minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaste usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
- Remova o tubo do ímã de separação celular (ver Tabela de Materiais), resuspense as células com 3,5 mL de tampão de isolamento pré-frio e coloque o tubo no Ímã por 4 minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaste usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
- Repita o passo 3.11.
- Resuspende as células com 1 mL de tampão FACS pré-frio (preparado na etapa 2.4).
4. Purificação de células CBir1 TCR Tg naic4+ T
- Conte as células seguindo o passo 3.6.
- Se a concentração celular estiver >107/mL, adicione um volume de tampão FACS para garantir que a concentração celular esteja ≤ 107/mL.
NOTA: ~1 × 107 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa. - Colorigue os marcadores de superfície com 10 μL de CD4-APC anti-mouse, 10 μL de CD25-Percp/Cy5.5 anti-mouse e 10 μL de anti-mouse CD62L-PE13,14 (ver Tabela de Materiais). Misture delicadamente e incubar por 30 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células com 2 mL de tampão FACS pré-frio. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todas as supernatantsusing uma Pipette de transferência de 3 mL.
- Repita o passo 4.4.
- Resuspende as células à concentração de 40 x 106/mL no buffer FACS pré-frio.
NOTA: Para evitar que o classificador entupisse, passe as células através de um filtro de 70 μm. - Adicione 0,1 μg/mL de DAPI.
NOTA: O DAPI é usado para excluir as células mortas. - Prepare tubos de centrífugas de 15 mL contendo 4 mL de Meio Completo (preparado na etapa 2.5) para coleta das células classificadas.
- Coloque as células no classificador. Classificar células CD4+ T únicas viáveis (células DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ) no modo de pureza (tamanho do bocal: 70 μm; Pressão: 70 PSI; Taxa de eventos: 8000-12000 eventos/s; Eficiência: superior a 90%) (Figura 2).
NOTA: As células Narsve CD4+ T expressam alta expressão do CD62L e não possuem o marcador de ativação CD2513,14. - Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todos os supernantes usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
- Resuspend as células em 500 μL de 1x PBS.
- Contar células seguindo a etapa 3.6
NOTA: ~5 × 106 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa.
5. Transferência celular para os camundongos receptores
- Resuspende as células CBir1 TCR Tg nars cd4+ T à concentração de 5 x 106/mL adicionando 1x PBS.
- Aqueça os ratos rag-/- sob uma lâmpada de calor (ver Tabela de Materiais) por 4 minutos, e contenha os ratos usando um conterrante de rato.
- Transfira por via intravenosa 200 μL da suspensão celular para a veia traseira de rag-/- camundongos usando uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Células de um rato doador são suficientes para transferir para cerca de cinco ratos receptores.
6. Monitoramento de sinais clínicos durante a progressão da colite
- Pesar os camundongos toda semana e aumentar a observação para duas vezes por semana, uma vez que os ratos começam a perder >5% dos pesos originais.
- Observe a resposta/movimento dos camundongos quando suavemente estimulado.
- Observe outras anormalidades clínicas. ou seja, postura e consistência nas fezes.
7. Coleção de cólons e pontuação histopatológica
- Sacrifique os camundongos receptores por uma luxação cervical com CO2 em um ponto de tempo da perda de peso >20% do peso original ou 6 semanas de transferência pós-célula. Molhe os ratos com 70% de etanol.
- Realizar uma incisão de pele de linha média ventral de ~1 cm, puxar a pele para longe do tecido muscular abdominal, fazer uma incisão de ~3 cm no tecido muscular abdominal, identificar o ceco e remover todo o cólon com tesouras e fórceps estéreis. Molhe o cólon com PBS pré-frio em um prato de cultura.
- Incise o cólon longitudinalmente e enxágue-o com PBS pré-frio. Corte 1/3 do cólon longitudinalmente.
- Coloque a tira do cólon em uma toalha de papel com o lado luminal voltado para cima. Execute a rolagem suíça usando um palito15.
- Coloque o cólon suíço em um e coloque o em formalina 10% tamponada por 24 h16, seguido de desidratação usando um processador automatizado (ver Tabela de Materiais) e incorporação de parafina.
- Corte seções de tecido de 5 μm em um microtome, montado em lâminas, e realize a mancha de Hemaoxilina e eosina (H&E)17 (ver Tabela de Materiais).
- Determine os escores histopatológicos combinando os escores para cada um dos seis parâmetros para um máximo de 12. Inflamação da lavíria (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); perda de célula de cálice (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); cripta anormal (normal, 0; hiperplástica, 1; desorganização, 2; perda de cripta, 3); abscesso cripta (ausente, 0; presente, 1); erosão mucosa e ulceração (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); e mudança submucosal (nenhum, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Isolamento e coloração de células de lamina propria intestinal
- Após a etapa 7.3, corte mais 2/3 do cólon em pedaços de 0,5-1 cm e lave-o com PBS pré-frio.
- Transfira os segmentos de cólon para um buffer EDTA-PBS pré-aquecido de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50 mL. Incubar a 37 °C com 250 rpm tremendo por 30 min.
- Vórtice do tubo, descarte os supernantes passando-o através de uma peneira estéril (diâmetro: 0,01 polegadas), e resuspenque os segmentos de cólon em 20 mL de PBS pré-frio no tubo de 50 mL.
- Repita o passo 8.3 duas vezes.
- Coloque os segmentos de cólon em um tubo C (ver Tabela de Materiais) contendo 10 mL de buffer de digestão pré-aquecido.
- Coloque o tubo em uma máquina dissociadora (ver Tabela de Materiais) e incubar sob o programa de "37C_m_LPDK_1" por 25 min.
NOTA: "37C_m_LPDK_1" é um programa de pré-definido padrão na máquina dissociadora usada para agitar as amostras e mantê-las a 37 °C. - Verifique se o tecido é digerido completamente, o que significa que nenhum pedaço de tecido está no tampão de digestão. Se não, repita o programa de "37C_m_LPDK_1".
- Colete o supernatante passando por uma peneira metálica e um coador de 100 μL. Enxágüe com 10 mL de PBS pré-frio.
- Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todos os supernantes.
- Resuspense as células em 4 mL de solução percoll de 40% e misture-a completamente (preparada na etapa 2.8).
- Transfira as células resuspended para 2 mL de solução percoll de 75% em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a 850 x g por 20 min a 20 °C (Rampa de aceleração: 0; Rampa de freio: 0).
- Remova cuidadosamente a gordura na camada superior usando uma Pipeta de transferência de 3 mL e transfira a camada celular para 20 mL de tampão de lavagem em um tubo de 50 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte todos os supernacantes e células resuspend em 1 mL de Meio Concluído.
- Conte as células seguindo o passo 3.6.
- Semente as células em uma placa de 24 poços, ative-as com 50 ng/mL de Phorbol-12-myristate 13-acetato e 750 ng/mL de ionomicina por 2h, seguida de incubação com 5 μg/mL de Brefeldin A por 3 h (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança. - Transfira as células para um tubo FACS, adicione 2 mL de tampão FACS e centrifugar as células a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Incubar as células com 12,5 μg/mL de CD16/3219 anti-rato (ver Tabela de Materiais) tampão FACS para bloquear receptores Fc por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Mancha para marcador vivo/morto e superfície.
- Lave as células com 2 mL de Tampão FACS e centrífugue-as a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Colorir as células com corante vivo e marcadores de superfície (ou seja, anticorpos CD3 anti-mouse e anticorpos CD4 anti-mouse)20 (ver Tabela de Materiais) em Tampão FACS na concentração otimizada por 30 min a 4 °C no escuro.
NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança.
- Faça a coloração celular e nuclear.
- Adicione 2 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Permeabilize e fixe as células reutilizando as células com 200 μL de solução de trabalho de correção de fator de transcrição (ver Tabela de Materiais) por 40 minutos à temperatura ambiente.
- Adicione 2 mL de tampão perm e centrifule a suspensão celular a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Incubar as células com marcadores celulares e nucleares (ou seja, anti-rato IFNγ, anticorpos anti-mouse IL-17A e anti-mouse Foxp3)20 em tampão perm (ver Tabela de Materiais) por 30 min-1 h em temperatura ambiente.
- Adicione 2 mL de tampão perm e centrifule a suspensão celular a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Adicione 1 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Resuspend células com 200 μL de Tampão FACS e executar as amostras em um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Aproximadamente 5 x 106 CBir1 TCR Tg na camiseta CD4+ células T por baço foram isoladas de um rato CBir1 TCR Tg adulto. Transferência de células CBir1 TCR Tg naic4+ T induzidas colite crônica em rag1-/- camundongos receptores. Após a transferência celular, foram monitorados sinais clínicos para avaliar a progressão da inflamação intestinal, incluindo perda de peso, consistência das fezes e postura curvada. Como esperado, os camundongos começaram a perder peso em torno de três semanas após a transferência celular, e o peso atingiu cerca de 80%-85% do peso original de seis semanas após a transferência celular (Figura 3). Além disso, os camundongos apresentaram diarreia em torno de 3-4 semanas após a transferência celular e demonstraram postura curvada quando desenvolveram colite grave. A morfologia bruta do cólon foi mostrada, e a gravidade da colite foi avaliada pelo escore histopatológico quando os camundongos foram sacrificados. Camundongos que receberam células CBir1 TCR Tg naicoV4+ mostraram comprimento curto de cólon 6 semanas após transferência celular (Figura 4A). Os camundongos receptores demonstraram mais infiltração celular na lavíria intestinal 4 semanas pós-transferência celular (Figura 4C), perda de células de cálice e hiperplasia de células epiteliais intestinais 5 semanas pós-transferência celular (Figura 4D), e erosão mucosa e infiltração celular inflamatória na submucosa do cólon 6 semanas pós-transferência celular (Figura 4F). Ao mesmo tempo, não houve inflamação em rag1-/- camundongos que receberam PBS sozinhos (Figura 4B). Além disso, não há inflamação no intestino delgado, mas o ceco tem inflamação. Além disso, os fenótipos de células CD4+ T na lavíria lamina colonia foram determinados por citometria de fluxo. A estratégia de gating é mostrada (Figura 5A-E). Células TCR Tg nars cd4+ C4+ desenvolvidas em células IFNγ+ Th1, células IL-17A+ Th17, células IFNγ+ IL-17+ CD4+ T (Figura 5F) e células Foxp3+ Treg em propria de lâmina intestinal de Rag1-/- receptores (Figura 5G).
Figura 1: Procedimento de colite por indução e avaliação da gravidade da doença. As células T C4+ esplênicas foram isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR usando contas magnéticas, e então as células T naizenas foram purificadas por triagem. As células na tela transgênica CBir1 T foram então transferidas por via intravenosa para camundongos Rag1-/- receptores. Quando os camundongos foram sacrificados por volta de seis semanas após a transferência celular, a gravidade da colite foi avaliada por escores histopatológicos. Os fenótipos de células CD4+ T na úria lamina colonia foram determinados por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A estratégia de gating para classificar células Tcr transgênicas CBir1 TCR. As células na tela transgênicas CBir1 TCR foram purificadas pela exclusão de detritos (A), células não únicas (B-C), células mortas (D) e células ativadas (E-F). A subpopulação foi mostrada em (G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As mudanças de peso de Rag1-/- camundongos pós transferência de células T. 1 x 106 CBir1 TCR células na tela transgênicas T foram transferidas para rag1-/- camundongos, e rag1-/- camundongos que recebem PBS foram usados como controles. Os pesos do rato eram registrados toda semana. Os dados foram apresentados em média ± SD; Teste t do aluno; p<0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A morfologia bruta e a hematoxilina e a coloração de eosina do cólon de Rag1-/- camundongos que recebem células na tela transgênica CBir1 T. (A) Os camundongos receptores foram sacrificados seis semanas após a transferência celular, e a morfologia bruta do cólon foi mostrada. (B-E) Os ratos receptores foram sacrificados em diferentes pontos de tempo, e rag1-/- ratos receberam PBS como controles. Os cólons foram processados para hematoxilina e mancha de eosina. Imagens representativas da hematoxilina e da coloração de eosina do cólon são mostradas. Barra de escala = 200 μm. (F) Foram determinados escores histopatológicos. Os dados foram apresentados em média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Os fenótipos de células CD4+ T na lamina propria colonia de Rag-/- camundongos que recebem células T transgênicas CBir1 T. Quando os camundongos receptores foram sacrificados 6 semanas após a transferência celular, as células coloniais de lamina propria foram isoladas por coloração de fenótipos de células T CD4+. (A-E) A estratégia de gating para análise de fenótipos de células T. (F-G) (F) Células T IL-17A+, células IFNγ+ CD4+T, células IL-17+ IFNγ+ CD4+ T e (G) Foxp3+ Tregs foram determinadas por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora cada passo seja essencial para a reprodutibilidade desse modelo de colite, existem várias etapas críticas. Os camundongos rag-/- receptores devem receber células INV4+ inválidas adequadas para induzir inflamação intestinal. Usamos baços para o isolamento de células T CD4+ ingênuas em vez de MLNs. Porque o rendimento de células T CD4+ ingênuas em MLNs é muito menor do que em baços. CD62L é altamente expresso em células T ingênuas, e CD44 e CD25 são os marcadores de ativação das células T13,14. Neste estudo, usamos primeiro contas magnéticas anti-CD4 para isolar células T CD4+ de baços. Em seguida, usamos a combinação de anticorpos anti-CD4, anti-CD62L e anti-CD25 para o isolamento de células ingênuas CD4+ T13,14. Os pesquisadores poderiam usar outros marcadores para classificar as células T CD4+ ingênuas. CD45RBhi também é marcador de células T ingênuas. As células CD45RBHI CD25-CD4+ T são comumente usadas como células T ingênuas de células T transgênicas não-TCR do tipo selvagem23. Portanto, as técnicas de classificação de células e injeção intravenosa das células T nos camundongos receptores são essenciais. Configurar o protocolo de gating como um modelo é útil para acelerar os experimentos com menos erros. Para evitar a morte celular, as células devem ser sempre mantidas no gelo. Além disso, as células de coloração com DAPI são altamente recomendadas para excluir células mortas porque o DAPI não pode transitar através de membranas celulares intactas, tornando-se uma excelente sonda de células mortas24. O aquecimento dos camundongos para estimular a dilatação das veias da cauda proporciona melhor visibilidade venosa para injeção intravenosa. Todos os procedimentos são recomendados para serem realizados por pesquisadores treinados.
Muitos fatores podem impactar o resultado dos modelos de colite, que precisam ser prestados atenção. Primeiro, o destinatário Rag1-/- ratos deve ter idade e sexo compatível. No modelo de transferência de células CD45RBHI T, as células T de doadores masculinos e femininos podem ser transferidas para os agressores de Rag masculino, enquanto apenas doadores do sexo feminino podem ser usados quando usam receptores femininos23. No entanto, não vemos diferença significativa entre os receptores masculinos e femininos. Os camundongos receptores podem ser fêmeas ou machos, e células T de doadores masculinos também podem induzir colite em receptores femininos. Uma vez que a mudança de peso é um indicador valioso de progressão de colite, recomenda-se usar os camundongos receptores entre 8-12 semanas para apresentar uma linha de peso estável. Esses camundongos receptores devem ser criados e mantidos na mesma sala da instalação animal porque a microbiota é fundamental na regulação do desenvolvimento da colite25. O tempo para desenvolver colite varia ao transferir diferentes números de células CD4 T ingênuas CBir1 TCR. Como esperado, menos células requerem um tempo maior para indução de colite, e um número maior de células requerem um tempo menor para indução de colite. O uso de 1 x 106 células por rato receptor é recomendado uma vez que os camundongos receptores demonstram sinais clínicos de colite ~2-3 semanas após a transferência celular e desenvolvem colite relativamente grave ~6 semanas após a transferência celular. Além disso, em comparação com a injeção intraperitoneal, a injeção intravenosa de células na veia da cauda induz colite mais consistente. Para o isolamento das células de lamina propria coloniais, os tecidos do cólon não devem secar; caso contrário, reduziria o rendimento e a viabilidade das células. Uma das preocupações particulares é que a duração da colite seria alterada se os camundongos receptores fossem transferidos com células CBir1 Tg Tg T ou tratadas com drogas26. Além disso, as células Tg T CBir1 Tcr também induzem inflamação intestinal em outros camundongos imunes deficientes, como TCRβ/δ-/- camundongos, que não possuem células T27.
Como as evidências acumuladas indicam um papel crucial das células T reativas específicas do antígeno bacteriano intestinal na patogênese do DIB, o uso de células T específicas para um antígeno bacteriano intestinal definido fornecerá insights sobre como o antígeno bacteriano intestinal induzirá as respostas das células T para induzir colite. O antígeno de microbiota intestinal CBir1 flagellin é abundante no trato gastrointestinal, que está relacionado com a patogênese do IBD8,9. Este modelo de colite se assemelha a várias características críticas do DII, incluindo diarreia, perda de peso, achado histopatológico e respostas imunes intestinais anormais. Portanto, este modelo de colite é útil para estudar os mecanismos do IBD humano e fornece uma ferramenta para avaliar os tratamentos para o DII. Curiosamente, o trabalho recente de Chiaranunt et al. indicou que a especificidade das células T para o antígeno microbiota CBir 1 por si só pode não ser suficiente para induzir ativação celular T e colite. Isso é evidenciado pelas células CBir1 Tg T induzidas pelo tipo selvagem em Rag-/- receptores, enquanto as células Rag-/- CBir1 T não induziram colite em suas instalações animais, sugerindo que células T intestinais que respondem a antígenos bacterianos iniciais específicos podem exigir outras bactérias commensais interrelacionadas, por exemplo, Helicobacter spp, para funcionar como um adjuvant28 . Um aspecto emocionante deste modelo é que diferentes subconjuntos de células T, ou seja, células Th1, Th17 e Treg, estão presentes na propria lamina de camundongos receptores coliticos, o que fornece uma oportunidade única para investigar os papéis não apenas das células T efeito, mas também Tregs na patogênese da colite29.
No entanto, como este modelo de colite é mediado por células T específicas da microbiota intestinal, uma limitação para este modelo de colite é que a duração da indução de colite pode variar em diferentes instalações animais dependendo da microbiota intestinal.
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Disclosures
Nenhum autor tem interesses financeiros, profissionais ou pessoais conflitantes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios do National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, o prêmio STARs do Sistema da Universidade do Texas (Y.C.), e o James W. McLaughlin Fellowship Fund da University of Texas Medical Branch em Galveston (W.Y.). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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