Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti

I compartimenti lipidici a doppio strato sono utilizzati come cellule sintetiche modello per lo studio di reazioni organiche chiuse e processi basati su membrana o come moduli portanti in applicazioni di somministrazione di farmaci ^1,2. La biologia bottom-up con componenti purificati richiede sistemi sperimentali minimi per esplorare le proprietà e le interazioni tra biomolecole, come proteine e lipidi ^3,4. Tuttavia, con l'avanzamento del campo, c'è una maggiore necessità di sistemi sperimentali più complessi che imitino meglio le condizioni nelle cellule biologiche. L'incapsulamento nei VGV è un approccio pratico che può offrire alcune di queste proprietà simili alle cellule fornendo un doppio strato lipidico deformabile e selettivamente permeabile e uno spazio di reazione ristretto. In particolare, la ricostituzione in vitro di sistemi citoscheletrici, come modelli di cellule sintetiche, può trarre beneficio dall'incapsulamento nei compartimenti di membrana⁵. Molte proteine citoscheletriche si legano e interagiscono con la membrana cellulare. Poiché la maggior parte degli assemblaggi citoscheletrici formano strutture che coprono l'intera cellula, la loro forma è naturalmente determinata dal confinamento delle dimensioni della cellula⁶.

Diversi metodi sono utilizzati per generare GUV, come il gonfiore ^7,8, la fusione di piccole vescicole ^9,10, il trasferimento di emulsione ^11,12, il getto pulsato¹³ e altri approcci microfluidici^14,15. Sebbene questi metodi siano ancora utilizzati, ognuno ha i suoi limiti. Pertanto, un approccio robusto e diretto con un alto rendimento di incapsulamento GUV è altamente desiderabile. Sebbene tecniche come il gonfiore spontaneo e l'elettroswelling siano ampiamente adottate per la formazione di GUV, questi metodi sono principalmente compatibili con specifiche composizioni lipidiche¹⁶, tamponi a bassa concentrazione salina¹⁷, dimensioni molecolari incapsulanti più piccole¹⁸ e richiedono un volume elevato dell'incapsulante. La fusione di più piccole vescicole in un GUV è intrinsecamente sfavorevole dal punto di vista energetico, richiedendo quindi specificità nelle composizioni lipidiche cariche⁹ e / o agenti esterni che inducono la fusione, come peptidi¹⁹ o altre sostanze chimiche. Il trasferimento di emulsioni e i metodi microfluidici, d'altra parte, possono richiedere la stabilizzazione delle goccioline attraverso la rimozione di tensioattivi e solventi dopo la formazione di due strati, rispettivamente^18,20. La complessità della configurazione sperimentale e del dispositivo nelle tecniche microfluidiche come il getto pulsato impone un'ulteriore sfida²¹. cDICE è un metodo basato sull'emulsione derivato da principi simili che regolano il trasferimento dell'emulsione^22,23. Una soluzione acquosa (soluzione esterna) e una miscela lipidico-olio sono stratificate da forze centrifughe in una camera cilindrica rotante (camera cDICE) formando un'interfaccia satura lipidica. Lo spostamento di goccioline acquose lipidiche monostrato nella camera cDICE rotante provoca la compressione di un doppio strato mentre le goccioline attraversano l'interfaccia satura di lipidi nella soluzione acquosa esterna^22,24. L'approccio cDICE è una tecnica robusta per l'incapsulamento GUV. Con il metodo modificato presentato, non solo si ottiene l'elevata resa di vescicole tipica del cDICE con un tempo di incapsulamento significativamente più breve (pochi secondi), ma il tempo di generazione di GUV che consente l'osservazione di processi dipendenti dal tempo (ad esempio, la formazione della rete citoscheletrica di actina) è significativamente ridotto. Il protocollo richiede circa 15-20 minuti dall'inizio alla raccolta e all'imaging GUV. Qui, la generazione di GUV è descritta utilizzando il metodo cDICE modificato per incapsulare l'actina e le proteine leganti l'actina (ABP). Tuttavia, la tecnica presentata è applicabile per incapsulare una vasta gamma di reazioni biologiche e interazioni di membrana, dall'assemblaggio di biopolimeri all'espressione proteica senza cellule al trasferimento del carico basato sulla fusione di membrana.

1. Preparazione della miscela olio-lipidi

NOTA: Il passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo tutte le linee guida di sicurezza per la manipolazione del cloroformio.

1. Prendere 0,5 ml di cloroformio in un flaconcino di vetro da 15 ml. Aggiungere 88 μL di 25 mg/mL di dioleoil-fosfocolina (DOPC), 9,3 μL di 50 mg/mL di colesterolo e 5 μL di 1 mg/mL di dioleoil-fosfoetanolammina-lissamina rodamina B (rodamina PE) (vedere Tabella dei materiali) nel flaconcino di vetro da 15 ml.
   NOTA: Le frazioni moli finali di DOPC e colesterolo in olio di silicone / olio minerale sono rispettivamente del 69,9% e del 30%. È stato stabilito che il colesterolo 20-30 mol% è una concentrazione ottimizzata per la fluidità e la stabilità della membrana dei GUV generati utilizzando la tecnica presentata^25,26. Fisiologicamente, questi valori sono ben all'interno dell'intervallo di concentrazione di colesterolo trovato nelle membrane plasmatiche delle cellule di mammifero⁶. Le scorte lipidiche vengono acquisite come soluzioni in cloroformio e conservate a -20 °C. I flaconcini lipidici devono essere acclimatati a temperatura ambiente prima di essere aperti.
2. Pipetta 7,2 mL di olio di silicone e 1,8 mL di olio minerale in un secondo flaconcino da 15 mL (vedi Tabella dei materiali). Generalmente, questo deve essere fatto in un vano portaoggetti a bassa umidità, principalmente se l'olio minerale viene riutilizzato.
3. Mescolare gli oli vorticosamente alla massima velocità di rotazione (3200 giri/min) per 10 s, aggiungere la miscela al flaconcino contenente la miscela lipidico-in-cloroformio e posizionarla immediatamente sul miscelatore a vortice. Vortice per 10-15 s alla massima velocità di rotazione (3200 rpm). La miscela lipidica in olio risultante dovrebbe essere leggermente torbida, poiché i lipidi non sono completamente disciolti nell'olio ma piuttosto dispersi come piccoli aggregati²⁴.
4. Mettere la dispersione lipidico-in-olio in un sonicatore da bagno (vedi Tabella dei materiali) con potenza ultrasonica di 80 W e frequenza operativa di 40 kHz a temperatura ambiente per 30 min. Utilizzare immediatamente la miscela o conservare a 4 °C per un massimo di 24 ore.

2. Generazione di vescicole

1. Montare l'albero stampato in 3D (file supplementare 1) in resina nera (vedere Tabella dei materiali) sulla piastra di agitazione del piano di lavoro e impostare la velocità di rotazione a 1200 giri / min.
2. Montare la camera cDICE stampata in 3D (file supplementare 2) in resina trasparente (vedere Tabella dei materiali) sull'albero (Figura 1A, B).
3. Preparare separatamente le soluzioni di actina e proteine leganti l'actina (ABP) in un volume totale di 20 μL.
   1. Preparare 1-10 μM di actina in tampone globulare di actina (G-buffer), incluso il 10% di atto 488 actina (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: 1x G-buffer comprende 5 mM di Tris-HCl, pH 8,0 e 0,2 mM di CaCl₂.
   2. Aggiungere un tampone di polimerizzazione dell'actina filamentosa (F-buffer) per iniziare la polimerizzazione dell'actina sul ghiaccio. Mantenere le soluzioni su ghiaccio per rallentare la polimerizzazione dell'actina prima dell'aggiunta di un reticolante.
      NOTA: il 1x F-buffer contiene 50 mM di KCl, 2 mM di MgCl₂ e 3 mM di ATP in 10 mM di Tris, pH 7,5.
   3. Attendere 15 minuti per consentire l'inizio della polimerizzazione dell'actina sul ghiaccio prima di aggiungere reticolanti di interesse al rapporto molare desiderato. Tenere la soluzione sul ghiaccio fino all'incapsulamento.
   4. Preparare le proteine leganti l'actina (ABP) separatamente in un microtubo (Figura 1C).
      NOTA: Questo passaggio viene eseguito quando una combinazione di ABP (ad esempio, miosina, α-actinina, fascina, complesso Arp2/3) si incapsula con actina 25,26,27. In questi casi, la quantità desiderata di ciascun ABP viene prelevata dal suo stock e aggiunta al microtubo designato per gli ABP. Poiché la soluzione totale deve essere di 20 μL, le aliquote di riserva degli ABP devono essere preparate in modo che la quantità desiderata della miscela ABP totale non superi i 5-6 μL. L'unico ABP utilizzato nei risultati rappresentativi qui è il fascin, la cui preparazione è menzionata di seguito.
      1. Aliquota 1,57 μL di fascina da 1,75 mg/mL di fascina (vedi Tabella dei materiali) e aggiungere direttamente alla soluzione di actina nella fase 2.7. Ciò corrisponde a 2,5 μM di fascina nella soluzione.
4. Aggiungere il 7,5% del mezzo con gradiente di densità (vedere Tabella dei materiali) nella soluzione di actina per creare un gradiente di densità tra la fase acquosa esterna e quella interna per facilitare la sedimentazione GUV.
5. Erogare 700 μL della soluzione esterna di 200 mM di glucosio nella camera (Figura 1D, a sinistra).
   NOTA: L'osmolarità della soluzione interna determina la concentrazione di glucosio. Per questi esperimenti, l'osmolarità della soluzione interna è di ~ 200 mOsm, quindi una soluzione di glucosio da 200 mM viene utilizzata come soluzione esterna.
6. Aggiungere una quantità sufficiente di miscela lipidico-olio (>3 ml in base alle dimensioni della camera) nella camera fino a riempire il 60%-80% della camera (Figura 1D, a destra). Si formerà un'interfaccia tra la miscela lipidico-olio e la soluzione esterna.
7. Trasferire gli ABP (preparati al punto 2.3.4) nella soluzione di actina. Utilizzando una normale pipetta da 100-1000 μL, trasferire immediatamente i 700 μL della miscela lipidico-olio nella miscela actina-ABP (Figura 1E, a sinistra). Pipetta su e giù 8 volte per generare goccioline lipidiche monostrato di dimensioni cellulari con diametro nell'intervallo di 7-100 μm (Figura 1E, al centro).
   NOTA: il passaggio 2.7 deve essere completato in pochi secondi per evitare qualsiasi assemblaggio di rete actina prima dell'incapsulamento. Pertanto, prima di eseguire il passaggio, assicurarsi che le punte delle pipette siano già inserite nelle pipette e pronte per trasferire le miscele.
8. Utilizzando la stessa pipetta da 100-1000 μL, erogare immediatamente l'intera emulsione nella camera rotante. Le goccioline acquisiranno un secondo foglietto di lipidi incrociando il monostrato lipidico all'interfaccia olio-soluzione esterna, formando così GUV (Figura 1E, a destra).
9. Rimuovere la camera dalla piastra di agitazione e scartare la maggior parte della miscela lipidico-olio inclinando la camera nel contenitore dei rifiuti in modo che gran parte della miscela lipidico-olio venga drenata dalla grande apertura al centro della camera.
   NOTA: In questo modo, la miscela lipidico-olio viene estratta dalla camera, evitando la miscelazione della miscela lipidico-olio con la soluzione esterna nella fase successiva.
10. Tenere la camera con il coperchio rivolto verso l'utente. Aprire il coperchio della camera e inclinare leggermente la camera verso l'utente. L'interfaccia tra la soluzione esterna contenente GUV e la miscela lipidico-olio è visibile dall'apertura della camera (dove si trova il coperchio).
11. Utilizzando una pipetta, raccogliere una soluzione esterna sufficiente contenente GUV ed erogare 50-300 μL della soluzione esterna in una piastra a 96 pozzetti per ottenere una densità appropriata di GUV.
    NOTA: Seguendo questo protocollo, un totale di circa 2 x 10⁵ GUV vengono rilasciati nella soluzione esterna all'interno della camera. La dispersione del GUV non è stata quantificata; tuttavia, il diametro di circa il 90% dei VAV è compreso tra 12 e 30 μm. GuV con qualsiasi diametro nell'intervallo di 7-50 μm possono essere trovati nella popolazione. A seconda del mezzo gradiente di densità incapsulato, delle dimensioni GUV e della profondità della soluzione nella piastra del pozzo, ci vogliono 2-15 minuti perché i GUV si depositino sulla superficie. La resa dei GUV con fasci di actina ricostituiti è di circa il 90%.

3. Imaging e ricostruzione di immagini 3D

1. Impostare la piastra a 96 pozzetti sul palco di un microscopio invertito dotato di un disco rotante (o scansione laser) un'unità confocale, una fotocamera EMCCD o sCMOS e un obiettivo 60x ad immersione in olio (vedere Tabella dei materiali).
2. Concentrati su qualsiasi regione di interesse (ROI) e prendi una sequenza di immagini z-stack dal ROI con un intervallo z-step di 0,5 μm.
   NOTA: poiché i VVV possono essere leggermente spostati sulla superficie nel tempo, si consiglia di acquisire un set di immagini a più lunghezze d'onda su ciascun piano z se vengono ripresi più fluorofori, ovvero prendere un gruppo di immagini a 561 nm e 488 nm in ogni corsia z alla volta per acquisire immagini atto 488 actina e Rhod PE.
3. Salva ogni sequenza di immagini z-stack in .tiff formato.
4. Aprire una sequenza di immagini di interesse in un software di elaborazione delle immagini (ImageJ/Fiji). Identifica l'immagine con la massima intensità. Tieni premuto "ctrl + maiusc + c" per aprire la finestra Luminosità e contrasto e fai clic su Ripristina.
5. Dal menu ImageJ/Fiji, vai a Analizza > Imposta scala e inserisci la distanza fisica nota e la relativa unità per ogni pixel dell'immagine.
6. Dal menu ImageJ/Fiji, vai a Image > Stacks > progetto 3D per ricostruire un'immagine 3D dallo z-stack. Impostate "Metodo di proiezione" come Punto di luminosità, "Spaziatura tra sezioni (μm)" come 0,5 e spuntare il segno di spunta Interpola. Le opzioni predefinite possono essere utilizzate per il resto delle impostazioni.
   NOTA: gli intervalli z in alcuni microscopi potrebbero non essere calibrati e il movimento effettivo in direzione z potrebbe differire leggermente dall'intervallo z inserito (cioè 0,5 μm). In questi casi, un campione di calibrazione 3D come microsfere fluorescenti con un diametro noto può essere utilizzato per ottenere l'intervallo z effettivo. Questo valore verrà quindi utilizzato come "Slice Spacing (μm)" per la proiezione 3D.

Per dimostrare il successo della generazione di GUV citoscheletrici utilizzando il protocollo attuale, sono state ricostituite strutture di fascio di fascina-actina nei GUV. Il fascin è un breve reticolante di filamenti di actina che forma rigidi fasci di actina allineati parallelamente ed è purificato da E. coli come proteina di fusione glutatione-S-transferasi (GST)26. 5 μM di actina sono stati ricostituiti per la prima volta, inclusi 0,53 μM di actina ATTO488 nel tampone di polimerizzazione dell'actina e il 7,5% del mezzo gradiente di densità. Dopo aver aggiunto la fascina ad una concentrazione di 2,5 μM e incapsulando la miscela fascina-actina, si sono formate strutture di fascio di actina in GUV. Le sequenze di immagini confocali Z-stack delle strutture del fascio di actina incapsulate nei GUV marcati con rhodamine PE sono state catturate 1 ora dopo l'incapsulamento (Figura 2A). Usando questo protocollo, la concorrenza intrinseca e l'ordinamento dei reticolanti di actina incapsulati, α-attinina e fascina, che, insieme, formano diversi modelli di fascio di actina in modo dipendente dalle dimensioni GUV, è stato precedentemente dimostrato26.

Come l'approccio a emulsione invertita modificata qui presentato, il tradizionale processo cDICE genera GUV citoscheletrici ad alta resa, ma richiede una pompa a siringa e una configurazione del tubo per l'iniezione controllata di soluzione proteica nella camera rotante a basse portate nell'ordine dei nanolitri al secondo22,28. In questo approccio, l'emulsione viene generata direttamente nella camera cDICE rotante; un sottile capillare viene inserito nella fase oleosa. La soluzione proteica viene iniettata attraverso una pompa a siringa. Le goccioline si formano e vengono tranciate sulla punta capillare prima di viaggiare verso la fase esterna acquosa, dove si trasformano in GUV, simile al metodo sopra descritto. La Figura 2B mostra le vescicole che incapsulano una miscela di reazione usando questo approccio. La miscela di reazione contiene 6 μM di actina che è impacchettata da 0,9 μM di fascina. Qui, i due metodi e i loro risultati non vengono confrontati, ma si noti che entrambi generano un alto rendimento di GUV.

Figura 1: Configurazione sperimentale per la generazione di GUV. (A) Vista dall'alto e sezione laterale della camera cDICE. (B) Foto della configurazione per la camera di filatura. (C-E) Illustrazioni schematiche di procedure graduali per la generazione di GUV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Incapsulamento di strutture di fasci di actina. (A) Le immagini mostrano fette confocali di fluorescenza rappresentative di GUV (a sinistra) e proiezioni massime di una pila z confocale di actina e canali lipidici (a destra). Fascina, 2,5 μM; actina, 5 μM (incluso il 10% atto 488 actina). Barra di scala = 10 μm. (B) Incapsulamento di strutture di fasci di actina utilizzando cDICE convenzionale. L'immagine mostra una proiezione massima rappresentativa di immagini di fluorescenza confocale di fasci di actina incapsulati formati in presenza di fascina. Fascina, 0,9 μM; Actina, 6 μM. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: progettazione dell'albero stampato in 3D. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Progettazione per la camera cDICE stampata in 3D. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.