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Bioengineering

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

Abstract

거대한 unilamellar vesicles (GUVs)는 생물학적 막의 모델로 자주 사용되므로 시험관 내에서 막 관련 세포 과정을 연구하는 데 훌륭한 도구입니다. 최근 몇 년 동안, GUV 내의 캡슐화는 세포 생물학 및 관련 분야의 재구성 실험에 유용한 접근법임이 입증되었습니다. 그것은 기존의 생화학 적 재구성과는 달리 살아있는 세포 내부의 감금 조건을 더 잘 모방합니다. GUV 내부에 캡슐화하는 방법은 구현하기가 쉽지 않은 경우가 많으며 성공률은 실험실마다 크게 다를 수 있습니다. 더 복잡한 단백질 시스템을 캡슐화하는 데 성공한 것으로 입증 된 한 가지 기술을 연속 액적 인터페이스 교차 캡슐화 (cDICE)라고합니다. 여기에서, 높은 캡슐화 효율로 GUVs에 세포골격 단백질을 신속하게 캡슐화하기 위한 cDICE 기반 방법이 제시된다. 이 방법에서, 첫째, 지질-단층 액적은 지질/오일 혼합물에 관심있는 단백질 용액을 유화시킴으로써 생성된다. 회전하는 3D 인쇄 챔버에 첨가 된 후,이 지질 단층 액적은 챔버 내부의 물 / 오일 계면에서 두 번째 지질 단일층을 통과하여 단백질 시스템을 포함하는 GUV를 형성합니다. 이 방법은 GUV 내 캡슐화의 전반적인 절차를 단순화하고 프로세스 속도를 높여 지질 이중층 소포 내부의 네트워크 어셈블리의 동적 진화를 제한하고 관찰 할 수있게합니다. 이 플랫폼은 감금에서 세포 골격 - 막 상호 작용의 역학을 연구하는 데 편리합니다.

Introduction

지질 이중층 구획은 밀폐 된 유기 반응 및 막 기반 공정을 연구하기위한 모델 합성 세포 또는 약물 전달 응용 프로그램 1,2에서 캐리어 모듈로 사용됩니다. 정제된 성분을 이용한 상향식 생물학은 단백질과 지질 3,4와 같은 생체분자 사이의 특성과 상호작용을 탐구하기 위해 최소한의 실험 시스템을 필요로 한다. 그러나 현장의 발전과 함께 생물학적 세포의 조건을 더 잘 모방하는보다 복잡한 실험 시스템에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. GUVs에서의 캡슐화는 변형가능하고 선택적으로 투과가능한 지질 이중층 및 제한된 반응 공간을 제공함으로써 이러한 세포 유사 특성 중 일부를 제공할 수 있는 실용적인 접근법이다. 특히, 합성 세포의 모델로서 세포골격계의 시험관내 재구성은 막 구획5에 캡슐화함으로써 이익을 얻을 수 있다. 많은 세포골격 단백질은 세포막에 결합하고 상호작용한다. 대부분의 세포골격 어셈블리는 세포 전체에 걸쳐 있는 구조를 형성하기 때문에, 그 형상은 세포 크기의 감금6에 의해 자연적으로 결정된다.

팽윤7,8, 소형 소포 융합9,10, 에멀젼 전달 11,12, 펄스 젯팅 13, 및 다른 미세유체 접근법(14,15)과 같은 GUV를 생성하기 위해 상이한 방법이 사용된다. 이러한 방법은 여전히 활용되지만 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서, 높은 수율의 GUV 캡슐화를 갖는 견고하고 직접적인 접근법이 매우 바람직하다. GUVs의 형성을 위해 자발적 팽윤 및 전기팽윤과 같은 기술이 널리 채택되었지만, 이들 방법은 주로 특정 지질 조성물(16), 낮은 염 농도 완충제(17), 더 작은 캡슐화제 분자 크기(18)와 양립가능하고, 높은 부피의 캡슐화제를 필요로 한다. 여러 개의 작은 소포를 GUV에 융합시키는 것은 본질적으로 에너지적으로 바람직하지 않으며, 따라서 하전된 지질 조성물(9) 및/또는 펩티드(19) 또는 다른 화학물질과 같은 외부 융합 유도제에서의 특이성을 필요로 한다. 한편, 에멀젼 전달 및 미세유체 방법은 각각18,20개의 이중층 형성 후 계면활성제 및 용매 제거를 통한 액적 안정화를 필요로 할 수 있다. 펄스 분사와 같은 미세유체 기술에서의 실험 셋업 및 장치의 복잡성은 추가적인 도전(21)을 부과한다. cDICE는 에멀젼 전달22,23을 지배하는 유사한 원리로부터 유래된 에멀젼-기반 방법이다. 수용액(outer solution)과 지질-오일 혼합물은 회전하는 원통형 챔버(cDICE chamber)에서 원심력에 의해 층화되어 지질 포화 계면을 형성한다. 회전하는 cDICE 챔버 내로 지질 단층 수성 액적을 떨어뜨리는 것은 액적이 외부 수용액(22,24) 내로 지질-포화 계면을 가로질러감에 따라 이중층의 지퍼링을 초래한다. cDICE 접근 방식은 GUV 캡슐화를 위한 강력한 기술입니다. 제시된 변형 방법에 의해, 상당히 짧은 캡슐화 시간(수 초)을 갖는 cDICE에 대해 전형적인 높은 소포 수율이 달성될 뿐만 아니라, 시간-의존적 과정(예를 들어, 액틴 시토골격 네트워크 형성)의 관찰을 허용하는 GUV 생성 시간이 상당히 감소된다. 이 프로토콜은 GUV 수집 및 이미징까지 처음부터 약 15-20 분이 걸립니다. 여기에서, GUV 생성은 액틴 및 액틴 결합 단백질 (ABPs)을 캡슐화하기 위한 변형된 cDICE를 사용하는 방법을 사용하여 기술된다. 그러나, 제시된 기술은 바이오폴리머의 조립에서부터 무세포 단백질 발현, 막 융합 기반 화물 전달에 이르기까지 광범위한 생물학적 반응 및 막 상호작용을 캡슐화하는데 적용가능하다.

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Protocol

1. 오일-지질-혼합물의 제조

참고: 이 단계는 클로로포름 취급에 대한 모든 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.

  1. 0.5 mL의 클로로포름을 15 mL 유리 바이알에 담으십시오. 25mg/mL 디올레오일포스포콜린(DOPC) 88μL, 50mg/mL 콜레스테롤 9.3μL, 1mg/mL 디올레오일-포스포에탄올아민-리사민 로다민 B(로다민 PE)( 로다민 PE) 5μL를 15ml 유리 바이알에 넣습니다.
    참고 : 실리콘 오일 / 미네랄 오일에서 DOCC와 콜레스테롤의 최종 몰분율은 각각 69.9 %와 30 %입니다. 20-30 몰% 콜레스테롤이 제시된 기술25,26을 사용하여 생성된 GUVs의 막 유동성 및 안정성에 대해 최적화된 농도임을 입증하였다. 생리학적으로, 이들 값은 포유동물 세포 원형질막(6)에서 발견되는 콜레스테롤 농도 범위 내에 잘 있다. 지질 스톡은 클로로포름 중의 용액으로서 획득되고 -20°C에서 저장된다. 지질 스톡 바이알은 열리기 전에 실온에 적응해야합니다.
  2. 두 번째 15 mL 바이알에 7.2 mL의 실리콘 오일 및 1.8 mL의 광유를 피펫 한다 (물자의 표 참조). 일반적으로, 이것은 주로 미네랄 오일이 재사용되는 경우 저습도 글로브 박스에서 수행되어야합니다.
  3. 최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10 초 동안 볼텍싱하여 오일을 혼합하고, 혼합물을 지질 인 클로로포름 혼합물을 포함하는 바이알에 첨가하고, 즉시 와류 믹서 상에 놓는다. 최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10-15 초 동안 소용돌이. 생성된 지질-중-유질 혼합은 지질이 오일에 완전히 용해되지 않고 오히려 작은 응집체(24)로서 분산되기 때문에 약간 흐려야 한다.
  4. 지질 중-유 분산액을 80W의 초음파 전력과 40kHz의 작동 주파수로 욕조 초음파 처리기 ( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 30 분 동안 사용하십시오. 혼합물을 즉시 사용하거나 최대 24 시간 동안 4°C에서 보관한다.

2. 소포 생성

  1. 검정색 수지로 만든 3D 프린트 샤프트(보충 파일 1)( 자료 표 참조)를 벤치탑 교반판에 장착하고 회전 속도를 1200rpm으로 설정합니다.
  2. 투명 수지(재료 표 참조)로 만든 3D 프린트된 cDICE 챔버(보충 파일 2)를 샤프트에 장착합니다(그림 1A,B).
  3. 액틴 및 액틴 결합 단백질(ABP) 용액을 20 μL의 총 부피로 별도로 준비한다.
    1. 10% ATTO 488 액틴을 포함하는 구상 액틴 완충액(G-buffer)에서 1-10 μM의 액틴을 제조하였다( 표 참조).
      참고: 1x G-완충액은 5 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 mM의CaCl2를 포함한다.
    2. 필라멘트성 액틴 중합 완충액(F-완충액)을 첨가하여 얼음 위에서 액틴 중합을 시작한다. 가교제를 첨가하기 전에 액틴 중합을 늦추기 위해 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 1x F-버퍼는 10mM의 트리스, pH 7.5에서 50mM의 KCl,2mM의 MgCl2 및 3mM의 ATP를 함유한다.
    3. 원하는 몰비로 관심있는 가교제를 첨가하기 전에 얼음 상에서 액틴 중합의 개시를 허용하도록 15분 동안 기다린다. 캡슐화 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    4. 액틴 결합 단백질(ABPs)을 마이크로튜브에 별도로 준비한다(도 1C).
      참고: 이 단계는 ABP(예를 들어, 미오신, α-액티닌, 파신, Arp2/3 복합체)의 조합이 액틴25,26,27로 캡슐화될 때 수행된다. 이러한 경우, 각 ABP의 원하는 양은 재고에서 추출되어 ABP용으로 지정된 마이크로튜브에 추가됩니다. 총 용액이 20 μL가 되어야 하므로, ABPs의 스톡 분취량은 총 ABP 혼합물의 원하는 양이 5-6 μL를 초과하지 않도록 제조되어야 한다. 여기서 대표적인 결과에 사용 된 유일한 ABP는 fascin이며, 그 준비는 아래에 언급되어 있습니다.
      1. 1.75 mg/mL의 파신 스톡으로부터 파신 1.57 μL를 분취하고(표 표 참조), 단계 2.7에서 액틴 용액에 직접 첨가한다. 이것은 용액 중 2.5 μM의 파신에 해당합니다.
  4. 7.5%의 밀도 구배 매질( 표 참조)을 액틴 용액에 첨가하여 GUV 침강을 용이하게 하기 위해 외부와 내부 수성상 사이에 밀도 구배를 생성한다.
  5. 200 mM의 글루코오스의 외부 용액 700 μL를 챔버 내로 분주한다(도 1D, 왼쪽).
    참고 : 내부 용액의 삼투압은 포도당의 농도를 결정합니다. 이러한 실험에서 내부 용액의 삼투압은 ~ 200mOsm이므로 200mM 포도당 용액이 외부 용액으로 사용됩니다.
  6. 챔버의 60%-80%가 채워질 때까지 충분한 양의 지질-오일 혼합물(챔버 크기 기준 >3 mL)을 챔버에 첨가한다(그림 1D, 오른쪽). 지질-오일 혼합물과 외부 용액 사이에 계면이 형성될 것이다.
  7. ABP (단계 2.3.4에서 준비)를 액틴 용액으로 옮깁니다. 규칙적인 100-1000 μL 피펫을 사용하여, 즉시 700 μL의 지질-오일 혼합물을 액틴-ABP 혼합물로 옮긴다(도 1E, 왼쪽). 피펫을 8회 상하로 하여 직경이 7-100 μm 범위인 세포 크기의 지질단층 액적을 생성한다(도 1E, 중간).
    참고: 캡슐화하기 전에 actin 네트워크 어셈블리를 피하기 위해 2.7단계를 몇 초 안에 완료해야 합니다. 따라서 단계를 수행하기 전에 피펫 팁이 이미 피펫에 삽입되어 혼합물을 옮길 준비가되었는지 확인하십시오.
  8. 동일한 100-1000 μL 피펫을 사용하여 즉시 전체 에멀젼을 회전 챔버 내로 분배하십시오. 액적은 오일-외부 용액 계면에서 지질 단일층을 교차시켜 지질의 두 번째 전단지를 획득하고, 이에 따라 GUVs를 형성한다(도 1E, 오른쪽).
  9. 교반 플레이트로부터 챔버를 제거하고, 지질-오일 혼합물의 큰 부분이 챔버의 중앙에 있는 큰 개구로부터 배수되도록 폐기물 용기 내의 챔버를 기울임으로써 대부분의 지질-오일 혼합물을 버린다.
    참고: 이런 식으로, 지질-오일 혼합물은 챔버 밖으로 인출되어, 다음 단계에서 지질-오일 혼합물과 외부 용액의 혼합을 피한다.
  10. 뚜껑이 사용자 쪽으로 향하도록 챔버를 잡으십시오. 챔버 뚜껑을 열고 챔버를 사용자 쪽으로 약간 기울입니다. GUVs를 함유하는 외부 용액과 지질-오일 혼합물 사이의 계면은 챔버 개구부(뚜껑이 있는 곳)로부터 볼 수 있다.
  11. 피펫을 사용하여 GUV를 포함하는 충분한 외부 용액을 수집하고 50-300 μL의 외부 용액을 96-웰 플레이트에 분주하여 적절한 밀도의 GUV를 얻습니다.
    참고: 이 프로토콜에 따라 챔버 내부의 외부 솔루션에서 총 약 2 x 105개의 GUV가 방출됩니다. GUV 분산도는 정량화되지 않았다; 그러나, GUVs의 약 90%의 직경은 12-30 μm의 범위이다. 7-50 μm의 범위 내의 임의의 직경을 갖는 GUVs는 집단에서 발견될 수 있다. 캡슐화된 밀도 구배 매질, GUV 크기 및 웰 플레이트의 용액 깊이에 따라 GUV가 표면에 정착하는 데 2-15분이 걸립니다. 재구성 된 액틴 번들을 가진 GUV의 수율은 약 90 %입니다.

3. 이미징 및 3D 이미지 재구성

  1. 회전 디스크 (또는 레이저 스캐닝) 공초점 장치, EMCCD 또는 sCMOS 카메라 및 오일 침지 60x 대물 렌즈가 장착 된 반전 현미경 무대에 96 웰 플레이트 를 설치하십시오 (재료 표 참조).
  2. 관심 영역(ROI)에 초점을 맞추고 0.5μm의 z-스텝 간격으로 ROI에서 z-스택 이미지 시퀀스를 가져옵니다.
    참고: GUV는 시간이 지남에 따라 표면에서 약간 변위될 수 있기 때문에 여러 형광단이 이미지화되는 경우 각 z-평면에서 다중 파장 이미지 세트를 캡처하는 것이 좋습니다. 즉, 한 번에 각 z-레인에서 561nm 및 488nm 이미지 그룹을 촬영하여 ATTO 488 액틴 및 Rhod PE 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다.
  3. 각 z-스택 이미지 시퀀스를 .tiff 형식으로 저장합니다.
  4. 이미지 처리 소프트웨어(ImageJ/Fiji)에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 엽니다. 강도가 가장 높은 이미지를 식별합니다. "ctrl + shift + c"를 눌러 밝기 및 대비 창을 열고 재설정을 클릭하십시오.
  5. ImageJ/피지 메뉴에서 분석 > 배율 설정 으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 해당 단위를 입력합니다.
  6. ImageJ/피지 메뉴에서 이미지 > 스택 > 3D 프로젝트로 이동하여 z- 스택에서 3D 이미지를 재구성합니다. "투영 방법"을 밝기 포인트로, "슬라이스 간격(μm)"을 0.5로 설정하고 보간을 체크오프합니다. 기본 옵션은 나머지 설정에 사용할 수 있습니다.
    참고: 일부 현미경의 z-간격은 보정되지 않을 수 있으며, z 방향의 실제 이동은 입력된 z-간격(즉, 0.5μm)과 약간 다를 수 있습니다. 이러한 경우에, 공지된 직경을 갖는 형광 미소 구체들과 같은 3D 교정 시편이 실제 z-interval을 얻기 위해 사용될 수 있다. 따라서 이 값은 3D 프로젝션의 "슬라이스 간격(μm)"으로 사용됩니다.

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Representative Results

현재의 프로토콜을 사용하여 세포골격 GUVs의 성공적인 생성을 입증하기 위해, GUVs에서의 파신-액틴 다발 구조가 재구성되었다. 파신은 뻣뻣한 병렬 정렬된 액틴 다발을 형성하는 액틴 필라멘트의 짧은 가교결합제이며, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질26으로서 대장균으로부터 정제된다. 5 μM의 액틴은 먼저 액틴 중합 완충액 중의 0.53 μM의 ATTO488 액틴 및 7.5%의 밀도 구배 매질을 포함하여 재구성되었다. 파신을 2.5 μM의 농도로 첨가하고 파신-액틴 혼합물을 캡슐화시, GUVs에서 액틴 다발 구조를 형성하였다. 로다민 PE 표지된 GUVs에서 캡슐화된 액틴 다발 구조의 Z-스택 공초점 이미지 서열은 캡슐화 후 1시간 동안 포획되었다(도 2A). 이 프로토콜을 사용하여, 캡슐화된 액틴 가교결합제, α-액티닌 및 파신의 내재적 경쟁 및 분류는, 함께, GUV 크기 의존적 방식으로 상이한 액틴 번들 패턴을 형성하는, 이전에 입증되었다(26).

여기에 제시된 변형된 반전 에멀젼 접근법과 마찬가지로, 전통적인 cDICE 공정은 높은 수율로 세포골격 GUV를 생성하지만, 초당나노리터 22,28 나노리터 순으로 낮은 유속으로 단백질 용액을 회전 챔버 내로 제어된 주입을 위한 주사기 펌프 및 튜빙 셋업을 필요로 한다. 이러한 접근법에서, 에멀젼은 회전하는 cDICE 챔버에서 직접 생성되고; 얇은 모세관이 오일상에 삽입됩니다. 단백질 용액은 시린지 펌프를 통해 주입된다. 물방울은 수성 외상을 향해 이동하기 전에 모세관 팁에서 형성되고 전단되며, 여기서 이들은 위에서 설명한 방법과 유사하게 GUV로 변합니다. 도 2B는 이러한 접근법을 사용하여 반응 혼합물을 캡슐화하는 소포를 보여준다. 반응 믹스는 0.9 μM의 파신에 의해 번들링되는 6 μM의 액틴을 함유한다. 여기서 두 가지 방법과 그 결과는 비교되지 않지만 둘 다 GUV의 높은 수율을 생성한다는 점에 유의하십시오.

Figure 1
그림 1: GUV를 생성하기 위한 실험 설정 . (A) cDICE 챔버의 상면도 및 측면 단면도. (b) 방사 챔버를 위한 셋업의 사진. (C-E) GUV 생성을 위한 단계적 절차의 개략적인 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 액틴 번들 구조의 캡슐화. (A) 이미지는 GUVs의 대표적인 형광 공초점 조각(왼쪽)과 액틴 및 지질 채널의 공초점 z-스택의 최대 투영(오른쪽)을 보여준다. 파신, 2.5 μM; 액틴, 5 μM (10% ATTO 488 액틴 포함). 스케일 바 = 10 μm. (B) 통상적인 cDICE를 이용한 액틴 다발 구조물의 캡슐화. 이미지는 파신의 존재하에 형성된 캡슐화된 액틴 다발의 공초점 형광 이미지의 대표적인 최대 투사를 보여준다. 파신, 0.9 μM; Actin, 6 μM. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : 3D 인쇄 샤프트 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2 : 3D 인쇄 cDICE 챔버 용 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

합성 세포의 생성을 위해 GUVs를 생성하는 다양한 방법이 탐구되었지만, 절차의 복잡성, 캡슐화를 달성하기 위한 연장된 시간, 캡슐화제의 지질 유형 및 분자 구성의 제한, 캡슐화를 용이하게 하기 위한 비생리학적 화학물질에 대한 필요성, 낮은 GUV 수율 및 캡슐화 효율의 불일치는 이 분야의 연구자들에게 계속 도전하고 있다. 상향식 합성 생물학에서 착수할 수 있는 광범위한 잠재적 연구를 고려할 때, 상이한 지질 조성물과 양립가능하고 크기에 관계없이 임의의 분자를 캡슐화할 수 있는 이음새가 없는 고처리량 GUV 캡슐화 접근법은 복잡한 생체모방 합성 시스템을 연구할 수 있는 새로운 기회를 촉발시킬 수 있다. cDICE 방법은 이전의 GUV 생성 방법에 내재된 대부분의 과제와 한계를 제거했습니다.

cDICE 방법을 사용하여 GUV를 생성하기 위한 접근법 및 지배 원리는 플랫폼에 선행하며, 반전된 에멀젼 전달(12)과 같은 이전 기술에서 구현되었다. 그러나, 반전 에멀젼 전달 방법은 낮은 소포 수율 및 소포의 이질성과 같은 한계를 갖는다. 여기에 제시된 cDICE 방법의 경우, 지질은 수십 나노미터의 응집체 형태로 오일에 분산된다(지질 응집체의 크기는 지질의 전체 농도에 의존한다)24. 지질의 분산은 두 개의 혼화성 오일에 있으며, 여기서 하나는 (미네랄 오일) 지질을 용해시킬 수 있고 두 번째 오일 (실리콘 오일)은 지질과 섞일 수 없습니다. 이것은 용매 시프팅(29)을 통해 지질 응집체 코아세르베이트를 생성한다. 이러한 특정 분산 접근법은 수성 액적의 즉각적인 단층 포화 및 수성 액적이 지질-포화 오일-수성 계면을 지속적으로 교차함에 따라 오일-수성 계면에서 지질의 더 빠른 갱신을 용이하게 한다. 이것은 또한 GUV를 형성하기 위해 이중층 압축을 개선하고 GUV 처리량을 증가시킵니다. 회전 챔버에 의해 생성된 원심력은 지질-포화 계면을 가로질러 다분산된 물방울을 떨게 하는 데 최적이다. cDICE 방법의 원래 버전은 미세 모세관 노즐을 사용하여 내부 용액을 오일 지질 혼합물에 주입합니다. 이 접근법에서, 회전하는 오일-지질 혼합물에 의해 생성된 전단력은 수성 액적을 생성하고, 결국 설명된 바와 같이 GUVs로 변형된다. 그러나, 주사 플랫폼을 준비하는 데 걸리는 시간을 줄이려는 의도로, 특히 액틴 네트워크 조립 및 미세 모세관의 잠재적 막힘과 같은 빠른 반응에 중요하며, 지질 단층을 가진 수성 액적은 이제 오일-지질 혼합물을 내부 용액에 직접 첨가하고 위아래로 피펫팅함으로써 생성된다. 이 접근법은 빠른 반응 실험을 위해 GUV 캡슐화에서 시간 지연을 제거합니다.

이전의 GUV 생성 방법에 의해 야기된 도전들 중에는 GUV 생성 기술에 따라 지질 유형(지질의 전하 및 지질의 단계)의 제한이 있다. DOPC, 디올레오일-글리세로-호스포세린 (DOPS), 디올레오일-글리세로-숙시네이트 (DGS), 디미리스토일-글리세로포스포콜린 (DMPC), 및 다양한 농도에서 상이한 지질 및 콜레스테롤의 조합을 포함하는 다중 지질 유형을 시험하였다. 모든 조건에 대해, cDICE 방법은 일관되게 높은 GUV 수율로 높은 캡슐화 효율을 갖는 GUV를 형성하는 것으로 나타났다. 또한, cDICE 방법은 또한 캡슐화 효율의 손실 또는 처리량 감소 없이 세포골격 단백질, 무세포 발현 반응, 크라우밍제, 염료 및 상이한 크기의 다른 세포 분자를 포함한 상이한 세포 성분을 효과적으로 캡슐화하는 것으로 나타났다. 더욱이, 정상적인 반전된 에멀젼 전달 방법(30)과 마찬가지로, 변형된 cDICE는 잠재적으로 미래의 작업을 위해 비대칭 GUV의 생성을 허용할 수 있다. 상이한 지질 조성물이 cDICE 챔버 내부의 이중층을 지퍼링하기 전에 단층 액적이 개별적으로 형성되기 때문에(위아래로 피펫팅에 의해 마이크로튜브 내부) 내부 리플릿 및 외부 리플릿에 사용될 수 있다. 지질-오일 혼합물이 오랫동안 유지될 때 지질의 침전이 관찰된다; 그러나, 캡슐화 전에 지질-오일 혼합물을 단순히 와류시켜 지질 응집체를 재분산시킬 수 있다. 지질-오일 혼합물이 지질-오일 혼합물에서 일반적인 지질 응집체보다 더 유의하게 나타나는 바와 같이 더 오래 유지될 때 캡슐화 품질이 저하될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 테스트되지는 않았지만 이러한 응집체는 잠재적으로 이중층 지퍼의 불완전성을 초래할 수 있으며 응집체는 원하는 화학 환경을 손상시키는 내부 용액으로 캡슐화 될 수도 있습니다.

수성 액적을 형성하기 위해 제시된 변형된 접근법의 한계는 액적의 크기에서 균일성을 발생시키는 데 있다. 이는 GUV 크기를 조절하기 위해 서로 다른 유속으로 내부 용액의 미세모세관 주입을 사용하여 개선될 수 있지만, 캡슐화된 GUV에서 액틴 어셈블리와 같은 빠른 반응을 모니터링하는 것은 덜 바람직하다. 서로 다른 GUV 크기를 초래하는 위아래로 피펫팅하여 물방울을 만들면 비슷한 크기의 소포 집단을 분석 할 수 있습니다. 이중층에서의 오일 보유 가능성에 대한 우려는 cDICE21과 같은 에멀젼 기반 GUV 생성 기술을 포함한 대부분의 GUV 생성 기술의 채택을 방해합니다. 그러나, 멤브레인 내에 잔류하는 오일의 양은 1-옥탄올과 같은 유기 제제를 사용하여 감소될 수 있으며, 이는 소포31,32를 생성한 후에 제거될 수 있다. 이 방법에 대한 장래의 변형은, 가능하게는 용매 조성을 변경함으로써, 조사될 필요가 있다.

상향식 합성 생물학에는 아직 조사되지 않은 많은 영역이 있으며 아마도 GUV의 세포 모방 감금이 필요할 수 있습니다. 이러한 실험적 노력은 cDICE와 같은 GUV 생성 플랫폼이 다양한 관심 분자를 효율적으로 캡슐화하면서 견고하게 GUV를 생성해야 합니다. 많은 세포 과정은 이전의 GUV 생성 기술을 사용하여 분자를 캡슐화하는 데 걸리는 시간보다 빠르게 발생합니다. 본원에 기술된 바와 같이, 액틴 용액은 액틴 네트워크 조립으로부터 야기되는 소포 변형을 관찰하기에 충분히 신속하게 캡슐화된다. 재구성된 액틴 세포골격을 갖는 이러한 합성 세포는 상이한 가교 결합제5,25,33 및 막 리모델링 25,27,28의 존재하에 액틴 네트워크 조직의 특징을 드러냈다. 그들은 더 정교한 합성 세포를 만들기위한 미래의 연구에 영감을 줄 것입니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

APL은 경험 많은 연구자를위한 훔볼트 연구 펠로우십과 국립 과학 재단 (1939310 및 1817909) 및 국립 보건원 (R01 EB030031)의 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

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References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

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생명공학 문제 177 에멀젼 이송 cDICE GUV 상향식 재구성 액틴 파신
거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화
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Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

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