Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Быстрая инкапсуляция восстановленного цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье представлен простой метод ускоренного производства гигантских одноламеллярных везикул с инкапсулированными цитоскелетными белками. Метод оказывается полезным для восстановления цитоскелетных структур снизу вверх в конфайнменте и взаимодействиях цитоскелет-мембрана.

Abstract

Гигантские одноламеллярные везикулы (GUV) часто используются в качестве моделей биологических мембран и, таким образом, являются отличным инструментом для изучения клеточных процессов in vitro, связанных с мембраной. В последние годы инкапсуляция в ГУВ оказалась полезным подходом для экспериментов по восстановлению в клеточной биологии и смежных областях. Он лучше имитирует условия удержания внутри живых клеток, в отличие от обычного биохимического восстановления. Методы инкапсуляции внутри ГУВ часто нелегко реализовать, и показатели успеха могут значительно отличаться от лаборатории к лаборатории. Один из методов, который оказался успешным для инкапсуляции более сложных белковых систем, называется непрерывной инкапсуляцией пересечения интерфейса капель (cDICE). Здесь представлен метод на основе cDICE для быстрой инкапсуляции цитоскелетных белков в ГУВ с высокой эффективностью инкапсуляции. В этом способе, во-первых, липидно-монослойные капли получают путем эмульгирования белкового раствора, представляющего интерес, в липидно-масляной смеси. После добавления во вращающуюся 3D-печатную камеру эти липидно-монослойные капли затем проходят через второй липидный монослой на границе раздела вода/масло внутри камеры с образованием ГУВ, содержащих белковую систему. Этот метод упрощает общую процедуру инкапсуляции в ГУВ и ускоряет процесс, и, таким образом, позволяет ограничить и наблюдать динамическую эволюцию сетевой сборки внутри липидных двухслойных везикул. Эта платформа удобна для изучения механики цитоскелетно-мембранных взаимодействий в конфайнменте.

Introduction

Липидные двухслойные компартменты используются в качестве модельных синтетических клеток для изучения замкнутых органических реакций и мембранных процессов или в качестве модулей-носителей в приложениях доставки лекарств 1,2. Биология снизу вверх с очищенными компонентами требует минимальных экспериментальных систем для изучения свойств и взаимодействий между биомолекулами, такими как белки и липиды 3,4. Однако с развитием этой области возрастает потребность в более сложных экспериментальных системах, которые лучше имитируют условия в биологических клетках. Инкапсуляция в ГУВ является практическим подходом, который может предложить некоторые из этих клеточных свойств, обеспечивая деформируемый и селективно проницаемый липидный бислой и ограниченное реакционное пространство. В частности, восстановление in vitro цитоскелетных систем, как моделей синтетических клеток, может извлечь выгоду из инкапсуляции в мембранных компартментах5. Многие цитоскелетные белки связываются и взаимодействуют с клеточной мембраной. Поскольку большинство цитоскелетных сборок образуют структуры, которые охватывают всю клетку, их форма естественным образом определяется удержанием размером с клетку6.

Для генерации ГУВ используются различные методы, такие как набухание 7,8, слияние малыхпузырьков 9,10, перенос эмульсии 11,12, импульсная струя13 и другие микрофлюидные подходы 14,15. Хотя эти методы все еще используются, каждый из них имеет свои ограничения. Таким образом, очень желателен надежный и простой подход с высокой урожайностью инкапсуляции ГУВ. Хотя такие методы, как спонтанное набухание и электросвеличивание, широко распространены для образования ГУВ, эти методы в первую очередь совместимы со специфическими липидными композициями16, буферами с низкой концентрацией соли17, меньшим размером молекулы инкапсуланта18 и требуют большого объема инкапсулянта. Слияние нескольких мелких пузырьков в ГУВ по своей природе энергетически неблагоприятно, что требует специфичности в заряженных липидных композициях9 и/или внешних агентах, вызывающих слияние, таких как пептиды19 или другие химические вещества. С другой стороны, перенос эмульсии и микрофлюидные методы могут потребовать стабилизации капель путем удаления поверхностно-активного вещества и растворителя после образования бислоя, соответственно18,20. Сложность экспериментальной установки и устройства в микрофлюидных методах, таких как импульсная струйная обработка, создает дополнительную проблему21. cDICE представляет собой метод на основе эмульсии, полученный из аналогичных принципов, регулирующих перенос эмульсии 22,23. Водный раствор (наружный раствор) и липидно-масляная смесь стратифицируются центробежными силами во вращающейся цилиндрической камере (камере cDICE), образуя насыщенную липидами границу раздела. Перемещение липидных монослойных водных капель во вращающуюся камеру cDICE приводит к застегиванию бислоя, поскольку капли пересекают насыщенную липидами границу в наружный водный раствор 22,24. Подход cDICE является надежным методом инкапсуляции GUV. При представленном модифицированном способе достигается не только высокий выход пузырьков, характерный для cDICE со значительно более коротким временем инкапсуляции (несколько секунд), но и время генерации ГУВ, позволяющее наблюдать зависимые от времени процессы (например, формирование актиновых цитоскелетных сетей), значительно сокращается. Протокол занимает около 15-20 минут от начала сбора и визуализации GUV. Здесь генерация GUV описывается с использованием модифицированного метода cDICE для инкапсуляции актина и актин-связывающих белков (ABP). Однако представленный способ применим для инкапсуляции широкого спектра биологических реакций и мембранных взаимодействий, от сборки биополимеров до бесклеточной экспрессии белка и переноса груза на основе мембранного слияния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление масляно-липидной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап должен быть выполнен в вытяжном шкафу в соответствии со всеми рекомендациями по безопасности при обращении с хлороформом.

  1. Возьмите 0,5 мл хлороформа в стеклянном флаконе объемом 15 мл. Добавьте 88 мкл 25 мг/мл диолеоил-фосфохолина (DOPC), 9,3 мкл холестерина 50 мг/мл и 5 мкл 1 мг/мл диолеоил-фосфоэтаноламина-лизрамина родамина B (родамин ПЭ) (см. Таблицу материалов) в стеклянный флакон объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные молевые фракции DOPC и холестерина в силиконовом масле/минеральном масле составляют 69,9% и 30% соответственно. Установлено, что 20-30 моль% холестерина является оптимизированной концентрацией для мембранной текучести и стабильности ГУВ, генерируемых по представленной методике25,26. Физиологически эти значения находятся в пределах диапазона концентраций холестерина, обнаруженного в плазматических мембранах клеток млекопитающих6. Запасы липидов получают в виде растворов хлороформа и хранят при -20 °C. Флаконы с липидным запасом должны быть акклиматизированы до комнатной температуры перед их открытием.
  2. Пипетка 7,2 мл силиконового масла и 1,8 мл минерального масла во втором флаконе объемом 15 мл (см. Таблицу материалов). Как правило, это нужно делать в бардачке с низкой влажностью, в основном, если минеральное масло используется повторно.
  3. Смешайте масла путем вихря на максимальной скорости вращения (3200 об/мин) в течение 10 с, добавьте смесь во флакон, содержащий липидно-хлороформную смесь, и немедленно поместите ее на вихревой смеситель. Вихрь на 10-15 с при максимальной скорости вращения (3200 об/мин). Полученная смесь липидов в масле должна быть слегка мутной, так как липиды не полностью растворяются в масле, а скорее диспергируются в виде мелких агрегатов24.
  4. Поместите дисперсию липидов в масле в ультразвуковой аппарат ванны (см. Таблицу материалов) с ультразвуковой мощностью 80 Вт и рабочей частотой 40 кГц при комнатной температуре в течение 30 мин. Используйте смесь немедленно или храните при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч.

2. Генерация везикул

  1. Установите 3D-печатный вал (дополнительный файл 1), изготовленный из черной смолы (см. Таблицу материалов) на настольной перемешиваемой пластине и установите скорость вращения до 1200 об/мин.
  2. Установите на вал 3D-печатную камеру cDICE (Дополнительный файл 2), изготовленную из прозрачной смолы (см. Таблицу материалов) (рисунок 1A,B).
  3. Готовят растворы актина и актин-связывающих белков (АБП) по отдельности в общем объеме 20 мкл.
    1. Получают 1-10 мкМ актина в глобулярном актиновом буфере (G-буфере), включая 10% актина ATTO 488 (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x G-буфер содержит 5 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 0,2 мМ CaCl2.
    2. Добавьте нитевидный буфер полимеризации актина (F-буфер), чтобы начать полимеризацию актина на льду. Держите растворы на льду, чтобы замедлить полимеризацию актина перед добавлением сшивателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x F-буфер содержит 50 мМ KCl, 2 мМMgCl2 и 3 мМ АТФ в 10 мМ Tris, рН 7,5.
    3. Подождите 15 минут, чтобы обеспечить начало полимеризации актина на льду, прежде чем добавлять интересующие сшиватели в желаемом молярном соотношении. Держите раствор на льду до инкапсуляции.
    4. Получают актин-связывающие белки (ABP) отдельно в микропробирке (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется, когда комбинация ABP (например, миозин, α-актинин, фазцин, комплекс Arp2/3) инкапсулируется с актином 25,26,27. В таких случаях желаемое количество каждого ABP извлекается из его запаса и добавляется в микропробирку, предназначенную для ABP. Поскольку общий раствор должен составлять 20 мкл, запасы АЛКВО должны быть подготовлены таким образом, чтобы желаемое количество общей смеси АВП не превышало 5-6 мкл. Единственным ABP, используемым в репрезентативных результатах здесь, является фасцин, препарат которого упомянут ниже.
      1. Аликвот 1,57 мкл фасцина из 1,75 мг/мл запаса фасцина (см. Таблицу материалов) и непосредственно добавляют в раствор актина на стадии 2.7. Это соответствует 2,5 мкМ фазцина в растворе.
  4. Добавьте 7,5% среды градиента плотности (см. Таблицу материалов) в раствор актина для создания градиента плотности между внешней и внутренней водной фазами для облегчения осаждения ГУВ.
  5. Дозировать 700 мкл наружного раствора 200 мМ глюкозы в камеру (рисунок 1D, слева).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осмолярность внутреннего раствора определяет концентрацию глюкозы. Для этих экспериментов осмолярность внутреннего раствора составляет ~200 мОсм, поэтому в качестве наружного раствора используется раствор глюкозы 200 мМ.
  6. Добавьте достаточное количество липидно-масляной смеси (>3 мл в зависимости от размера камеры) в камеру до тех пор, пока не будет заполнено 60-80% камеры (рисунок 1D, справа). Между липидно-масляной смесью и наружным раствором образуется интерфейс.
  7. Переведите ABP (приготовленные на этапе 2.3.4) в раствор актина. Используя обычную пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно переложите 700 мкл липидно-масляной смеси в смесь актин-АБФ (рисунок 1Е, слева). Пипетка вверх и вниз 8 раз для получения липидно-монослойных капель размером с клетку диаметром в пределах 7-100 мкм (рисунок 1Е, средний).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.7 должен быть выполнен за несколько секунд, чтобы избежать сборки сети актина перед инкапсуляцией. Таким образом, перед выполнением этапа убедитесь, что наконечники пипеток уже вставлены в пипетки и готовы к переносу смеси.
  8. Используя ту же пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно дозируйте всю эмульсию во вращающуюся камеру. Капли приобретают второй листок липидов, пересекая монослой липидов на границе раздела масло-внешний раствор, тем самым образуя ГУВ (рисунок 1E, справа).
  9. Снимите камеру с перемешиваемой пластины и выбросьте большую часть липидно-масляной смеси, наклонив камеру в контейнере для отходов так, чтобы большая часть липидно-масляной смеси была слита из большого отверстия в центре камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, липидно-масляная смесь вытягивается из камеры, избегая смешивания липидно-масляной смеси с наружным раствором на следующей стадии.
  10. Держите камеру крышкой лицом к пользователю. Откройте крышку камеры и слегка наклоните камеру в сторону пользователя. Интерфейс между наружным раствором, содержащим ГУВ, и липидно-масляной смесью виден из отверстия камеры (где расположена крышка).
  11. Используя пипетку, соберите достаточное количество наружного раствора, содержащего ГУВ, и дозируйте 50-300 мкл наружного раствора в 96-луночную пластину для получения соответствующей плотности ГУВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя этому протоколу, в общей сложности около 2 х 105 ГУВ высвобождаются во внешнем растворе внутри камеры. Дисперсия ГУВ не была количественно определена; однако диаметр около 90% ГУВ находится в пределах 12-30 мкм. ГУВ с любым диаметром в диапазоне 7-50 мкм можно встретить в популяции. В зависимости от инкапсулированной среды градиента плотности, размера ГУВ и глубины раствора в плите скважины, ГУВ оседанию на поверхности требуется 2-15 мин. Выход ГУВ с восстановленными актиновыми пучками составляет около 90%.

3. Визуализация и реконструкция 3D-изображений

  1. Установите пластину из 96 скважин на сцене перевернутого микроскопа, оснащенного вращающимся дисковым (или лазерным сканированием) конфокальным блоком, камерой EMCCD или sCMOS и объективом с погружением в масло 60x (см. Таблицу материалов).
  2. Сосредоточьтесь на любой интересующей области (ROI) и возьмите последовательность изображений z-стека из ROI с интервалом z-шага 0,5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ГУВ могут быть слегка смещены на поверхности с течением времени, рекомендуется захватывать многоволновый набор изображений в каждой z-плоскости, если визуализируется несколько флуорофоров, т. Е. Делать группу изображений 561 нм и 488 нм на каждой z-полосе за раз, чтобы захватить изображения АКТИНА ATTO 488 и RHOD PE.
  3. Сохраните каждую последовательность изображений z-стека в .tiff формате.
  4. Откройте интересующую последовательность изображений в программном обеспечении для обработки изображений (ImageJ/Fiji). Определите изображение с наибольшей интенсивностью. Удерживайте «ctrl + shift + c», чтобы открыть окно «Яркость и контрастность», и нажмите « Сброс».
  5. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Анализ > Установить масштаб и введите известное физическое расстояние и его единицу измерения для каждого пикселя изображения.
  6. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Image > Stacks > 3D-проект , чтобы реконструировать 3D-изображение из z-стека. Установите «Метод проекции» в качестве точки яркости, «Интервал между срезами (мкм)» в 0,5 и установите флажок Интерполировать. Параметры по умолчанию можно использовать для остальных параметров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: z-интервалы в некоторых микроскопах могут не калиброваться, и фактическое движение в z-направлении может незначительно отличаться от введенного z-интервала (т.е. 0,5 мкм). В таких случаях 3D-калибровочный образец, такой как флуоресцентные микросферы с известным диаметром, может быть использован для получения фактического z-интервала. Таким образом, это значение будет использоваться как «Интервал между срезами (мкм)» для 3D-проекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать успешную генерацию цитоскелетных ГУВ с использованием текущего протокола, были восстановлены структуры пучков фасцин-актин в ГУВ. Фасцин представляет собой короткий сшиватель актиновых нитей, который образует жесткие параллельно выровненные пучки актина и очищается от кишечной палочки в виде белка слияния глутатион-S-трансферазы (GST)26. Сначала было восстановлено 5 мкМ актина, включая 0,53 мкМ актина ATTO488 в буфере полимеризации актина и 7,5% среды градиента плотности. При добавлении фасцина в концентрации 2,5 мкМ и инкапсулировании смеси фасцин-актин в ГУВ образовывались структуры актиновых пучков. Конфокальные последовательности изображений Z-стека инкапсулированных структур актиновых пучков в ГУВ, меченных родамином PE, были захвачены через 1 ч после инкапсуляции (рисунок 2A). Использование этого протокола, присущая конкуренция и сортировка инкапсулированных актиновых сшивающих агентов, α-актинина и фасцина, которые вместе образуют различные паттерны актиновых пучков в зависимости от размера GUV, были ранее продемонстрированы26.

Как и модифицированный инвертированный эмульсионный подход, представленный здесь, традиционный процесс cDICE генерирует цитоскелетные ГУВ с высоким выходом, но требует шприцевого насоса и установки трубки для контролируемой инъекции белкового раствора во вращающуюся камеру при низких скоростях потока в порядке нанолитров в секунду22,28. При таком подходе эмульсия непосредственно генерируется во вращающейся камере cDICE; тонкий капилляр вводится в масляную фазу. Белковый раствор вводят через шприцевой насос. Капли образуются и срезаются на кончике капилляра, прежде чем они перемещаются в водную внешнюю фазу, где они превращаются в ГУВ, подобно способу, описанному выше. На рисунке 2B показаны везикулы, которые инкапсулируют реакционную смесь с использованием этого подхода. Реакционная смесь содержит 6 мкМ актина, который связывается с 0,9 мкМ фасцина. Здесь эти два метода и их результаты не сравниваются, но отмечают, что оба они генерируют высокий выход GUV.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная установка для генерации ГУВ. (A) Вид сверху и вид бокового сечения камеры cDICE. (B) Фотографии установки для прядильной камеры. (С-Е) Схематические иллюстрации пошаговых процедур генерации ГУВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Инкапсуляция структур актиновых пучков. (A) Изображения показывают репрезентативные флуоресцентные конфокальные срезы GUV (слева) и максимальные проекции конфокального z-стека актиновых и липидных каналов (справа). Фасцин, 2,5 мкМ; актин, 5 мкМ (в т.ч. 10% АТТО 488 актина). Шкала стержня = 10 мкм. (B) Инкапсуляция структур актиновых пучков с использованием обычного cDICE. На изображении показана репрезентативная максимальная проекция конфокальных флуоресцентных изображений инкапсулированных актиновых пучков, образующихся в присутствии фасцина. Фасцин, 0,9 мкМ; Актин, 6 мкМ. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: 3D-печатная конструкция вала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Дизайн для 3D-печатной камеры cDICE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Различные методы генерации ГУВ были изучены для создания синтетических клеток Однако сложность процедур, длительное время для достижения инкапсуляции, ограничение типов липидов и молекулярного состава инкапсулянта, потребность в нефизиологических химических веществах для облегчения инкапсуляции, низкий выход ГУВ и несоответствия в эффективности инкапсуляции продолжали бросать вызов исследователям в этой области. Учитывая широкий спектр потенциальных исследований, которые могут быть начаты в синтетической биологии снизу вверх, бесшовный подход к инкапсуляции GUV с высокой пропускной способностью, который совместим с различными липидными композициями и может инкапсулировать любые молекулы независимо от размера, может стимулировать новые возможности для изучения сложных биомимямических синтетических систем. Метод cDICE устранил большинство проблем и ограничений, присущих предыдущим методам генерации GUV.

Подход и руководящие принципы для генерации ГУВ с использованием метода cDICE предшествуют платформе и были реализованы в более ранних методах, таких как инвертированный перенос эмульсии12. Однако метод переноса инвертированной эмульсии имеет такие ограничения, как низкий выход пузырьков и гетерогенность везикул. Для метода cDICE, представленного здесь, липиды диспергируются в масле в виде агрегатов в десятки нанометров (размер липидного агрегата зависит от общей концентрации липидов)24. Дисперсия липидов происходит в двух смешивающихся маслах, где одно (минеральное масло) может растворять липиды, а второе масло (кремниевое масло), которое не смешивается с липидами. Это создает коацерваты липидного агрегата путем сдвига растворителя29. Этот особый дисперсионный подход способствует мгновенному монослойному насыщению водных капель и более быстрому обновлению липидов на масляно-водной границе раздела, поскольку водные капли непрерывно пересекают насыщенную липидами масляную водную границу. Это также впоследствии улучшает двухслойное заарготовку для формирования GUV и увеличивает пропускную способность GUV. Центробежные силы, создаваемые вращающейся камерой, оптимальны для перемещения полидисперсных капель через насыщенную липидами границу раздела. Оригинальная версия метода cDICE использует микрокапиллярное сопло для введения внутреннего раствора в масло-липидную смесь. В этом подходе сдвиговые силы, создаваемые вращающейся масло-липидной смесью, генерируют водные капли, в конечном итоге превращаясь в ГУВ, как описано. Однако с целью сокращения времени, затрачиваемого на подготовку инъекционной платформы, особенно критической для быстрых реакций, таких как сборка актиновой сети и потенциальное засорение микрокапилляра, водные капли с липидными монослоями теперь генерируются путем добавления масляно-липидной смеси непосредственно во внутренний раствор и пипетирования вверх и вниз. Такой подход устраняет временной лаг в инкапсуляции ГУВ для эксперимента с быстрой реакцией.

Среди проблем, вызванных более ранними методами генерации ГУВ, является ограничение типов липидов (заряд липидов и фаза липидов) в зависимости от техники генерации ГУВ. Было протестировано несколько типов липидов, включая DOPC, диолеоил-глицеро-госфоссерин (DOPS), диолеоил-глицеро-сукцинат (DGS), димиристоил-глицеро-фосфохолин (DMPC) и комбинации различных липидов и холестерина в различных концентрациях. Показано, что для всех условий метод cDICE образует ГУВ с высокой эффективностью инкапсуляции при стабильно высоком выходе ГУВ. Кроме того, было также показано, что метод cDICE эффективно инкапсулирует различные клеточные компоненты, включая цитоскелетные белки, реакции бесклеточной экспрессии, агенты скученности, красители и другие клеточные молекулы разных размеров без потери эффективности инкапсуляции или снижения пропускной способности. Кроме того, как и обычные методы переноса инвертированной эмульсии30, модифицированный cDICE потенциально может позволить генерацию асимметричных ГУВ для будущей работы. Различные липидные композиции могут быть использованы для внутреннего листа и внешнего листка, поскольку однослойные капли образуются отдельно (внутри микротрубки путем пипетки вверх и вниз) перед застегиванием бислоя внутри камеры cDICE. Осаждение липидов наблюдается, когда липидно-масляная смесь сохраняется длительно; однако можно просто вихрь липидно-масляной смеси перед инкапсуляцией для повторного диспергирования липидных агрегатов. Важно отметить, что качество инкапсуляции может быть нарушено, когда липидно-масляные смеси хранятся дольше, о чем свидетельствуют более значительные, чем обычно, липидные агрегаты в липидно-масляной смеси. Хотя эти агрегаты не тестируются, они могут потенциально привести к несовершенству двухслойного застегивания, и агрегаты также могут быть инкапсулированы внутренним раствором, ставящим под угрозу желаемую химическую среду.

Ограничение представленного модифицированного подхода к образованию водных капель заключается в получении однородности в размере капель. Хотя это может быть улучшено путем использования микрокапиллярной инъекции внутреннего раствора при различных скоростях потока для регулирования размеров ГУВ, менее желательно контролировать быстрые реакции, такие как актин в сборке в инкапсулированных ГУВ. Делая капли путем пипетки вверх и вниз, что приводит к различным размерам ГУВ, можно анализировать популяции везикул одинакового размера. Опасения по поводу возможного удержания масла в бислоях препятствуют внедрению большинства методов генерации ГУВ, включая методы генерации ГУВ на основе эмульсий, такие как cDICE21. Однако количество масла, оставшегося в мембране, может быть уменьшено с помощью органических агентов, таких как 1-октанол, который может быть удален после образования везикул31,32. Необходимо исследовать будущие модификации способа, возможно, путем изменения состава растворителя.

Есть много областей в синтетической биологии снизу вверх, которые еще предстоит исследовать и, возможно, требуют имитирующего клетки удержания ГУВ. Такие экспериментальные усилия требуют платформ генерации ГУВ, таких как cDICE, для надежной генерации ГУВ, эффективно инкапсулируя различные молекулы, представляющие интерес. Многие клеточные процессы происходят быстрее, чем время, необходимое для инкапсуляции молекул с использованием предыдущих методов генерации ГУВ. Как описано здесь, растворы актина инкапсулируются достаточно быстро, чтобы наблюдать деформацию пузырьков в результате сборки актиновой сети. Такие синтетические клетки с восстановленным актиновым цитоскелетом выявили особенности организации актиновой сети в присутствии различных сшивок 5,25,33 и ремоделирования мембран 25,27,28. Они вдохновят на будущую работу по созданию более сложных синтетических клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

APL признает поддержку со стороны Исследовательской стипендии Гумбольдта для опытных исследователей и Национального научного фонда (1939310 и 1817909) и Национальных институтов здравоохранения (R01 EB030031).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Tags

Биоинженерия выпуск 177 Перенос эмульсии cDICE GUV восстановление снизу вверх актин фасцин
Быстрая инкапсуляция восстановленного цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N.,… More

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter