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Bioengineering

विशालकाय यूनिलैमेलर वेसिकल्स के अंदर पुनर्गठित साइटोस्केलेटन का तेजी से एनकैप्सुलेशन

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एन्कैप्सुलेटेड साइटोस्केलेटल प्रोटीन के साथ विशाल यूनिलैमेलर पुटिकाओं के शीघ्र उत्पादन के लिए एक सरल विधि का परिचय देता है। विधि कारावास और साइटोस्केलेटन-झिल्ली इंटरैक्शन में साइटोस्केलेटल संरचनाओं के नीचे-ऊपर पुनर्गठन के लिए उपयोगी साबित होती है।

Abstract

विशालकाय यूनिलैमेलर वेसिकल्स (जीयूवी) का उपयोग अक्सर जैविक झिल्ली के मॉडल के रूप में किया जाता है और इस प्रकार इन विट्रो में झिल्ली से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण है। हाल के वर्षों में, जीयूवी के भीतर एनकैप्सुलेशन सेल जीव विज्ञान और संबंधित क्षेत्रों में पुनर्गठन प्रयोगों के लिए एक सहायक दृष्टिकोण साबित हुआ है। यह पारंपरिक जैव रासायनिक पुनर्गठन के विपरीत, जीवित कोशिकाओं के अंदर कारावास की स्थिति की बेहतर नकल करता है। जीयूवी के अंदर एनकैप्सुलेशन के तरीकों को अक्सर लागू करना आसान नहीं होता है, और सफलता दर प्रयोगशाला से प्रयोगशाला में काफी भिन्न हो सकती है। एक तकनीक जो अधिक जटिल प्रोटीन प्रणालियों को एनकैप्सुलेट करने के लिए सफल साबित हुई है, उसे निरंतर छोटी बूंद इंटरफ़ेस क्रॉसिंग एनकैप्सुलेशन (सीडीआईसीई) कहा जाता है। यहां, उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता के साथ जीयूवी में तेजी से साइटोस्केलेटल प्रोटीन को एनकैप्सुलेटल प्रोटीन को एनकैप्सुलेट करने के लिए एक सीडीआईसीई-आधारित विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि में, सबसे पहले, लिपिड-मोनोलेयर बूंदों को लिपिड / तेल मिश्रण में ब्याज के प्रोटीन समाधान को पायसीकारी करके उत्पन्न किया जाता है। एक घूर्णन 3 डी-मुद्रित कक्ष में जोड़े जाने के बाद, ये लिपिड-मोनोलेयर्ड बूंदें तब कक्ष के अंदर एक पानी / तेल इंटरफ़ेस पर एक दूसरे लिपिड मोनोलेयर से गुजरती हैं ताकि जीयूवी बन सकें जिसमें प्रोटीन प्रणाली होती है। यह विधि जीयूवी के भीतर एनकैप्सुलेशन की समग्र प्रक्रिया को सरल बनाती है और प्रक्रिया को गति देती है, और इस प्रकार हमें लिपिड बाइलेयर पुटिकाओं के अंदर नेटवर्क असेंबली के गतिशील विकास को सीमित करने और निरीक्षण करने की अनुमति देती है। यह प्लेटफ़ॉर्म कारावास में साइटोस्केलेटन-झिल्ली इंटरैक्शन के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए आसान है।

Introduction

लिपिड बाइलेयर डिब्बों का उपयोग संलग्न कार्बनिक प्रतिक्रियाओं और झिल्ली-आधारित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मॉडल सिंथेटिक कोशिकाओं के रूप में या दवा वितरण अनुप्रयोगों 1,2 में वाहक मॉड्यूलके रूप में किया जाता है। शुद्ध घटकों के साथ बॉटम-अप जीव विज्ञान को बायोमोलेक्यूल्स के बीच गुणों और बातचीत का पता लगाने के लिए न्यूनतम प्रयोगात्मक प्रणालियों की आवश्यकता होती है, जैसे कि प्रोटीन और लिपिड 3,4। हालांकि, क्षेत्र की उन्नति के साथ, अधिक जटिल प्रयोगात्मक प्रणालियों की बढ़ती आवश्यकता है जो जैविक कोशिकाओं में स्थितियों की बेहतर नकल करते हैं। जीयूवी में एनकैप्सुलेशन एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है जो एक विकृत और चुनिंदा पारगम्य लिपिड बाइलेयर और एक सीमित प्रतिक्रिया स्थान प्रदान करके इनमें से कुछ सेल जैसे गुणों की पेशकश कर सकता है। विशेष रूप से, सिंथेटिक कोशिकाओं के मॉडल के रूप में, साइटोस्केलेटल सिस्टम के इन विट्रो पुनर्गठन में, झिल्ली डिब्बों5 में एनकैप्सुलेशन से लाभ हो सकता है। कई साइटोस्केलेटल प्रोटीन कोशिका झिल्ली के साथ बांधते हैं और बातचीत करते हैं। चूंकि अधिकांश साइटोस्केलेटल असेंबली संरचनाओं का निर्माण करती हैं जो कोशिका की संपूर्णता को फैलाती हैं, इसलिए उनका आकार स्वाभाविक रूप से सेल-आकार के कारावास 6 द्वारा निर्धारितकिया जाता है।

जीयूवी उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे सूजन 7,8, छोटे पुटिका संलयन 9,10, पायस हस्तांतरण11,12, स्पंदित जेटिंग13, और अन्य माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण14,15। यद्यपि इन विधियों का अभी भी उपयोग किया जाता है, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। इस प्रकार, जीयूवी एनकैप्सुलेशन की उच्च उपज के साथ एक मजबूत और सीधा दृष्टिकोण अत्यधिक वांछनीय है। यद्यपि सहज सूजन और इलेक्ट्रोस्वेलिंग जैसी तकनीकों को जीयूवी के गठन के लिए व्यापक रूप से अपनाया जाता है, ये विधियां मुख्य रूप से विशिष्ट लिपिड रचनाओं16, कम नमक एकाग्रता बफर17, छोटे एनकैप्सुलेंट आणविक आकार18 के साथ संगत हैं, और एनकैप्सुलेंट की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है। जीयूवी में कई छोटे पुटिकाओं को फ्यूज करना स्वाभाविक रूप से ऊर्जावान रूप से प्रतिकूल है, इस प्रकार चार्ज किए गए लिपिड रचनाओं9 और / या बाहरी संलयन-उत्प्रेरण एजेंटों, जैसे पेप्टाइड्स19 या अन्य रसायनों में विशिष्टता की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, इमल्शन ट्रांसफर और माइक्रोफ्लूइडिक विधियों को क्रमशः18,20 बिलेयर गठन के बाद सर्फैक्टेंट और विलायक हटाने के माध्यम से छोटी बूंद स्थिरीकरण की आवश्यकता हो सकती है। स्पंदित जेटिंग जैसे माइक्रोफ्लूइडिक तकनीकों में प्रयोगात्मक सेटअप और डिवाइस की जटिलता एक अतिरिक्त चुनौती21 लगाती है। सीडीआईसीई एक पायस-आधारित विधि है जो इमल्शन ट्रांसफर22,23 को नियंत्रित करने वाले समान सिद्धांतों से प्राप्त होती है। एक जलीय समाधान (बाहरी समाधान) और एक लिपिड-तेल मिश्रण एक घूर्णन बेलनाकार कक्ष (सीडीआईसीई कक्ष) में केन्द्रापसारक बलों द्वारा स्तरीकृत होते हैं जो लिपिड संतृप्त इंटरफ़ेस बनाते हैं। घूर्णन सीडीआईसीई कक्ष में लिपिड मोनोलेयर्ड जलीय बूंदों को बंद करने के परिणामस्वरूप एक बाइलेयर की ज़िपिंग होती है क्योंकि बूंदें लिपिड-संतृप्त इंटरफ़ेस को बाहरी जलीय समाधान22,24 में पार करती हैं। सीडीआईसीई दृष्टिकोण जीयूवी एनकैप्सुलेशन के लिए एक मजबूत तकनीक है। प्रस्तुत संशोधित विधि के साथ, न केवल काफी कम एनकैप्सुलेशन समय (कुछ सेकंड) के साथ सीडीआईसीई के लिए विशिष्ट उच्च पुटिका उपज हासिल की जाती है, बल्कि जीयूवी पीढ़ी का समय जो समय-निर्भर प्रक्रियाओं (जैसे, एक्टिन साइटोस्केलेटल नेटवर्क गठन) के अवलोकन की अनुमति देता है, काफी कम हो जाता है। प्रोटोकॉल जीयूवी संग्रह और इमेजिंग के लिए शुरू से 15-20 मिनट के बारे में लेता है। यहां, जीयूवी पीढ़ी को एक्टिन और एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) को एनकैप्सुलेट करने के लिए संशोधित सीडीआईसीई विधि का उपयोग करके वर्णित किया गया है। हालांकि, प्रस्तुत तकनीक जैविक प्रतिक्रियाओं और झिल्ली इंटरैक्शन की एक विस्तृत श्रृंखला को एनकैप्सुलेट करने के लिए लागू होती है, बायोपॉलिमर की असेंबली से लेकर सेल-फ्री प्रोटीन अभिव्यक्ति से लेकर झिल्ली संलयन-आधारित कार्गो ट्रांसफर तक।

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Protocol

1. तेल-लिपिड-मिश्रण की तैयारी

नोट: क्लोरोफॉर्म को संभालने के लिए सभी सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए चरण को धूआं हुड में किया जाना चाहिए।

  1. 15 एमएल कांच की शीशी में 0.5 एमएल क्लोरोफॉर्म लें। एमएल डाइओलियोयल-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 50 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 9.3 μ एल, और 1 मिलीग्राम / एमएल डायोलियोइल-फॉस्फोथेनॉलमाइन-लिसामाइन रोडामाइन बी (रोडामाइन पीई) (रोडामाइन पीई) ( सामग्री की तालिका देखें) के 15 मिलीलीटर कांच की शीशी में 88 μL जोड़ें।
    खनिज तेल में डीओपीसी और कोलेस्ट्रॉल के अंतिम मोल अंश क्रमशः 69.9% और 30% हैं। यह स्थापित किया गया था कि 20-30 मोल% कोलेस्ट्रॉल झिल्ली तरलता और प्रस्तुत तकनीक25,26 का उपयोग करके उत्पन्न जीयूवी की स्थिरता के लिए एक अनुकूलित एकाग्रता है। शारीरिक रूप से, ये मूल्य स्तनधारी कोशिका प्लाज्मा झिल्ली6 में पाए जाने वाले कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता सीमा के भीतर अच्छी तरह से हैं। लिपिड स्टॉक को क्लोरोफॉर्म में समाधान के रूप में अधिग्रहित किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। लिपिड स्टॉक शीशियों को खोलने से पहले कमरे के तापमान पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. एक दूसरे 15 एमएल शीशी में सिलिकॉन तेल के 7.2 एमएल और खनिज तेल के 1.8 एमएल पिपेट ( सामग्री की तालिका देखें)। आम तौर पर, इसे कम आर्द्रता वाले दस्ताने बॉक्स में करने की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से यदि खनिज तेल का पुन: उपयोग किया जाता है।
  3. 10 एस के लिए अधिकतम घूर्णी गति (3200 आरपीएम) पर भंवर द्वारा तेलों को मिलाएं, लिपिड-इन-क्लोरोफॉर्म मिश्रण युक्त शीशी में मिश्रण जोड़ें और तुरंत इसे भंवर मिक्सर पर रखें। अधिकतम घूर्णी गति (3200 आरपीएम) पर 10-15 एस के लिए भंवर। परिणामी लिपिड-इन-ऑयल मिश्रण थोड़ा बादल होना चाहिए, क्योंकि लिपिड पूरी तरह से तेल में भंग नहीं होते हैं बल्कि छोटे समुच्चय24 के रूप में बिखरे हुए होते हैं।
  4. 80 डब्ल्यू की अल्ट्रासोनिक शक्ति और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 40 किलोहर्ट्ज की ऑपरेटिंग आवृत्ति के साथ एक स्नान सोनिकेटर ( सामग्री की तालिका देखें) में लिपिड-इन-ऑयल फैलाव रखो। मिश्रण का तुरंत उपयोग करें या अधिकतम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पुटिका पीढ़ी

  1. बेंचटॉप हलचल प्लेट पर काले राल (सामग्री की तालिका देखें) से बने 3 डी-मुद्रित शाफ्ट (पूरक फ़ाइल 1) को माउंट करें और घूर्णी गति को 1200 आरपीएम पर सेट करें।
  2. शाफ्ट (चित्रा 1 ए, बी) पर स्पष्ट राल (सामग्री की तालिका देखें) से बने 3 डी-मुद्रित सीडीआईसीई कक्ष (पूरक फ़ाइल 2) माउंट करें।
  3. एक्टिन और एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) समाधान अलग-अलग 20 μL की कुल मात्रा में तैयार करें।
    1. 10% एटीटीओ 488 एक्टिन ( सामग्री की तालिका देखें) सहित गोलाकार एक्टिन बफर (जी-बफर) में एक्टिन के 1-10 μM तैयार करें।
      नोट: 1एक्स जी-बफर में ट्रिस-एचसीएल के 5 एमएम, पीएच 8.0, और सीएसीएल 2 के0.2 एमएम शामिल हैं।
    2. बर्फ पर एक्टिन पोलीमराइजेशन शुरू करने के लिए फिलामेंटस एक्टिन पोलीमराइजेशन बफर (एफ-बफर) जोड़ें। क्रॉसलिंकर के अलावा एक्टिन पोलीमराइजेशन को धीमा करने के लिए बर्फ पर समाधान रखें।
      नोट: 1एक्स एफ-बफर में केसीएल के 50 एमएम, एमजीसीएल 2 के2 एमएम, और ट्रिस के 10 एमएम, पीएच 7.5 में एटीपी के 3 एमएम होते हैं।
    3. वांछित दाढ़ अनुपात में ब्याज के क्रॉसलिंकर्स को जोड़ने से पहले बर्फ पर एक्टिन पोलीमराइजेशन की दीक्षा की अनुमति देने के लिए 15 मिनट की प्रतीक्षा करें। एनकैप्सुलेशन तक समाधान को बर्फ पर रखें।
    4. एक माइक्रोट्यूब (चित्रा 1 सी) में अलग से एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) तैयार करें।
      नोट: यह चरण तब किया जाता है जब एबीपी (जैसे, मायोसिन, α-एक्टिनिन, फासिन, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स) का संयोजन एक्टिन25,26,27 के साथ समाहित होता है। ऐसे मामलों में, प्रत्येक एबीपी की वांछित मात्रा अपने स्टॉक से खींची जाती है और एबीपी के लिए नामित माइक्रोट्यूब में जोड़ा जाता है। चूंकि कुल समाधान 20 μL होना है, इसलिए एबीपी के स्टॉक एलिकोट तैयार किए जाने चाहिए ताकि कुल एबीपी मिश्रण की वांछित मात्रा 5-6 μL से अधिक न हो। यहां प्रतिनिधि परिणामों में उपयोग किया जाने वाला एकमात्र एबीपी फासिन है, जिसकी तैयारी नीचे उल्लिखित है।
      1. एमएल फासिन स्टॉक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1.75 मिलीग्राम / एमएल से फासिन के विभाज्य 1.57 μL, और सीधे चरण 2.7 में एक्टिन समाधान में जोड़ें। यह समाधान में फासिन के 2.5 μM से मेल खाती है।
  4. जीयूवी अवसादन को सुविधाजनक बनाने के लिए बाहरी और आंतरिक जलीय चरण के बीच घनत्व ढाल बनाने के लिए एक्टिन समाधान में घनत्व ढाल माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) का 7.5% जोड़ें।
  5. कक्ष में ग्लूकोज के 200 एमएम के बाहरी समाधान के 700 μL वितरित करें (चित्रा 1 डी, बाएं)।
    नोट: आंतरिक समाधान की ऑस्मोलरिटी ग्लूकोज की एकाग्रता को निर्धारित करती है। इन प्रयोगों के लिए, आंतरिक समाधान की ऑस्मोलरिटी ~ 200 एमओएसएम है, इसलिए बाहरी समाधान के रूप में 200 एमएम ग्लूकोज समाधान का उपयोग किया जाता है।
  6. कक्ष में लिपिड-तेल मिश्रण (कक्ष के आकार के आधार पर >3 एमएल) की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें जब तक कि कक्ष का 60% -80% नहीं भर जाता है (चित्रा 1 डी, दाएं)। लिपिड-तेल मिश्रण और बाहरी समाधान के बीच एक इंटरफ़ेस का गठन किया जाएगा।
  7. एक्टिन समाधान में एबीपी (चरण 2.3.4 में तैयार) को स्थानांतरित करें। एक नियमित 100-1000 μL विंदुक का उपयोग करते हुए, तुरंत लिपिड-तेल मिश्रण के 700 μL को एक्टिन-एबीपी मिश्रण (चित्रा 1ई, बाएं) में स्थानांतरित करें। 7-100 μm (चित्रा 1ई, मध्य) की सीमा में व्यास के साथ सेल आकार लिपिड-मोनोलेयर बूंदों उत्पन्न करने के लिए 8 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    नोट: एनकैप्सुलेशन से पहले किसी भी एक्टिन नेटवर्क असेंबली से बचने के लिए चरण 2.7 को कुछ सेकंड में पूरा करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, कदम प्रदर्शन करने से पहले, सुनिश्चित करें कि विंदुक युक्तियाँ पहले से ही विंदुक में डाला जाता है और मिश्रण को स्थानांतरित करने के लिए तैयार हैं।
  8. एक ही 100-1000 μL विंदुक का उपयोग कर, तुरंत घूर्णन कक्ष में पूरे पायस बांटना। बूंदें तेल-बाहरी समाधान इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर को पार करके लिपिड का एक दूसरा पत्रक प्राप्त करेंगी, जिससे जीयूवी (चित्रा 1 ई, दाएं) बन जाएंगे।
  9. हलचल प्लेट से कक्ष निकालें और अपशिष्ट कंटेनर में कक्ष को झुकाकर अधिकांश लिपिड-तेल मिश्रण को त्याग दें ताकि लिपिड-तेल मिश्रण का एक बड़ा हिस्सा कक्ष के केंद्र में बड़े उद्घाटन से सूखा हो।
    नोट: इस तरह, लिपिड-तेल मिश्रण को कक्ष से खींचा जाता है, अगले चरण में बाहरी समाधान के साथ लिपिड-तेल मिश्रण के मिश्रण से परहेज किया जाता है।
  10. उपयोगकर्ता की ओर सामना करना पड़ अपने ढक्कन के साथ कक्ष पकड़ो। चैम्बर ढक्कन खोलें और उपयोगकर्ता की ओर कक्ष को थोड़ा झुकाएं। जीयूवी और लिपिड-तेल मिश्रण युक्त बाहरी समाधान के बीच इंटरफ़ेस कक्ष खोलने से दिखाई देता है (जहां ढक्कन स्थित है)।
  11. एक विंदुक का उपयोग करके, जीयूवी युक्त पर्याप्त बाहरी समाधान एकत्र करें और जीयूवी के उचित घनत्व को प्राप्त करने के लिए बाहरी समाधान के 50-300 μL को 96-अच्छी तरह से प्लेट में वितरित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के बाद, कक्ष के अंदर बाहरी समाधान में लगभग 2 x 105 जीयूवी जारी किए जाते हैं। जीयूवी फैलाव की मात्रा निर्धारित नहीं की गई थी; हालांकि, जीयूवी के लगभग 90% का व्यास 12-30 μm की सीमा में है। 7-50 μm की सीमा में किसी भी व्यास के साथ जीयूवी आबादी में पाए जा सकते हैं। अच्छी तरह से प्लेट में समझाए गए घनत्व ढाल माध्यम, जीयूवी आकार और समाधान गहराई के आधार पर, जीयूवी को सतह पर बसने में 2-15 मिनट लगते हैं। पुनर्गठित एक्टिन बंडलों के साथ जीयूवी की उपज लगभग 90% है।

3. इमेजिंग और 3 डी छवि पुनर्निर्माण

  1. एक कताई डिस्क (या लेजर स्कैनिंग) कॉन्फोकल यूनिट, एक ईएमसीसीडी या एक एससीएमओएस कैमरा, और एक तेल विसर्जन 60x उद्देश्य लेंस ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर 96 अच्छी तरह से प्लेट सेट करें।
  2. ब्याज के किसी भी क्षेत्र (आरओआई) पर ध्यान केंद्रित करें और 0.5 μm के जेड-चरण अंतराल के साथ आरओआई से एक जेड-स्टैक छवि अनुक्रम लें।
    नोट: क्योंकि जीयूवी को समय के साथ सतह पर थोड़ा विस्थापित किया जा सकता है, इसलिए प्रत्येक जेड-प्लेन पर छवियों के बहु-तरंगदैर्ध्य सेट को कैप्चर करने की सिफारिश की जाती है यदि कई फ्लोरोफोरस को चित्रित किया जा रहा है, यानी, एटीटीओ 488 एक्टिन और रोड पीई छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रत्येक जेड-लेन पर 561 एनएम और 488 एनएम छवियों का एक समूह लें।
  3. प्रत्येक जेड-स्टैक छवि अनुक्रम को .tiff प्रारूप में सहेजें।
  4. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (ImageJ / फिजी) में ब्याज का एक छवि अनुक्रम खोलें। उच्चतम तीव्रता के साथ छवि की पहचान करें। ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट विंडो खोलने के लिए "ctrl + shift + c" दबाए रखें और रीसेट पर क्लिक करें।
  5. फिजी मेनू से, विश्लेषण > सेट स्केल पर जाएं और प्रत्येक छवि पिक्सेल के लिए ज्ञात भौतिक दूरी और इसकी इकाई दर्ज करें।
  6. फिजी मेनू से, जेड-स्टैक से 3 डी छवि का पुनर्निर्माण करने के लिए 3 डी प्रोजेक्ट > छवि > स्टैक पर जाएं। "प्रोजेक्शन विधि" को ब्राइटनेस पॉइंट के रूप में सेट करें, "स्लाइस स्पेसिंग (μm)" 0.5 के रूप में, और चेकमार्क इंटरपोलेट करें। डिफ़ॉल्ट विकल्पों का उपयोग शेष सेटिंग्स के लिए किया जा सकता है।
    नोट: कुछ माइक्रोस्कोप में जेड-अंतराल को कैलिब्रेट नहीं किया जा सकता है, और जेड-दिशा में वास्तविक आंदोलन दर्ज किए गए जेड-अंतराल (यानी, 0.5 μm) से थोड़ा भिन्न हो सकता है। ऐसे मामलों में, वास्तविक जेड-अंतराल प्राप्त करने के लिए एक ज्ञात व्यास के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स जैसे 3 डी अंशांकन नमूने का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार इस मान का उपयोग 3 डी प्रक्षेपण के लिए "स्लाइस स्पेसिंग (μm)" के रूप में किया जाएगा।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके साइटोस्केलेटल जीयूवी की सफल पीढ़ी को प्रदर्शित करने के लिए, जीयूवी में फासिन-एक्टिन बंडल संरचनाओं का पुनर्गठन किया गया था। फासिन एक्टिन फिलामेंट्स का एक छोटा क्रॉसलिंकर है जो कठोर समानांतर-संरेखित एक्टिन बंडल बनाता है और ई कोलाई से ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) संलयन प्रोटीन26 के रूप में शुद्ध होता है। एक्टिन के 5 μM को पहले पुनर्गठित किया गया था, जिसमें एक्टिन पॉलिमराइजेशन बफर में एटीटीओ 488 एक्टिन के 0.53 μM और घनत्व ढाल माध्यम का 7.5% शामिल था। 2.5 μM की एकाग्रता पर फासिन जोड़ने और फासिन-एक्टिन मिश्रण को एनकैप्सुलेट करने पर, जीयूवी में एक्टिन बंडल संरचनाओं का गठन किया गया था। रोडामाइन पीई-लेबल वाले जीयूवी में एन्कैप्सुलेटेड एक्टिन बंडल संरचनाओं के जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवि अनुक्रमों को 1 घंटे के बाद एनकैप्सुलेशन (चित्रा 2 ए) पर कब्जा कर लिया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अंतर्निहित प्रतिस्पर्धा और एन्कैप्सुलेटेड एक्टिन क्रॉसलिंकर्स, α-एक्टिनिन और फासिन की छंटाई, जो एक साथ, जीयूवी आकार-निर्भर तरीके से अलग-अलग एक्टिन बंडल पैटर्न बनाते हैं, पहले26 का प्रदर्शन किया गया था।

यहां प्रस्तुत संशोधित उल्टे पायस दृष्टिकोण की तरह, पारंपरिक सीडीआईसीई प्रक्रिया उच्च उपज के साथ साइटोस्केलेटल जीयूवी उत्पन्न करती है, फिर भी प्रति सेकंड नैनोलीटर के क्रम में कम प्रवाह दरों पर घूर्णन कक्ष में प्रोटीन समाधान के नियंत्रित इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज पंप और टयूबिंग सेटअप की आवश्यकता होती है22,28। इस दृष्टिकोण में, पायस सीधे घूर्णन सीडीआईसीई कक्ष में उत्पन्न होता है; एक पतली केशिका तेल चरण में डाली जाती है। प्रोटीन समाधान एक सिरिंज पंप के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है। बूंदें बनती हैं और जलीय बाहरी चरण की ओर यात्रा करने से पहले केशिका टिप पर कतरनी होती हैं, जहां वे ऊपर वर्णित विधि के समान जीयूवी में बदल जाती हैं। चित्रा 2 बी पुटिकाओं को दर्शाता है जो इस दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रतिक्रिया मिश्रण को समाहित करते हैं। प्रतिक्रिया मिश्रण में एक्टिन के 6 μM होते हैं जो 0.9 μM फासिन द्वारा बंडल किया जाता है। यहां, दो तरीकों और उनके परिणामों की तुलना नहीं की जा रही है लेकिन ध्यान दें कि वे दोनों जीयूवी की उच्च उपज उत्पन्न करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: जीयूवी उत्पन्न करने के लिए प्रायोगिक सेटअप (ए) सीडीआईसीई कक्ष के शीर्ष दृश्य और साइड सेक्शन व्यू। (बी) कताई कक्ष के लिए सेटअप की तस्वीरें। (सी-ई) जीयूवी की पीढ़ी के लिए चरणबद्ध प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक्टिन बंडल संरचनाओं का एनकैप्सुलेशन। (ए) छवियां जीयूवी (बाएं) के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल स्लाइस और एक्टिन और लिपिड चैनलों (दाएं) के कॉन्फोकल जेड-स्टैक के अधिकतम अनुमान दिखाती हैं। फास्किन, 2.5 μM; एक्टिन, 5 μM (10% एटीटीओ 488 एक्टिन सहित)। स्केल बार = 10 μm (बी) पारंपरिक सीडीआईसीई का उपयोग करके एक्टिन बंडल संरचनाओं का एनकैप्सुलेशन। छवि फासिन की उपस्थिति में गठित एन्कैप्सुलेटेड एक्टिन बंडलों की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियों का एक प्रतिनिधि अधिकतम प्रक्षेपण दिखाती है। फासिकिन, 0.9 μM; एक्टिन, 6 μM. स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: 3 डी मुद्रित शाफ्ट डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: 3 डी मुद्रित सीडीआईसीई कक्ष के लिए डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सिंथेटिक कोशिकाओं के निर्माण के लिए जीयूवी उत्पन्न करने के विभिन्न तरीकों का पता लगाया गया है हालांकि, प्रक्रियाओं की जटिलता, एनकैप्सुलेशन प्राप्त करने के लिए विस्तारित समय, लिपिड प्रकारों का प्रतिबंध और एनकैप्सुलेंट की आणविक संरचना, एनकैप्सुलेशन की सुविधा के लिए गैर-शारीरिक रसायनों की आवश्यकता, कम जीयूवी उपज, और एनकैप्सुलेशन दक्षता में विसंगतियों ने इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं को चुनौती देना जारी रखा है। संभावित अध्ययनों की विस्तृत श्रृंखला को ध्यान में रखते हुए जिन्हें नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान में शुरू किया जा सकता है, एक निर्बाध उच्च थ्रूपुट जीयूवी एनकैप्सुलेशन दृष्टिकोण जो विभिन्न लिपिड रचनाओं के साथ संगत है और आकार की परवाह किए बिना किसी भी अणु को समाहित कर सकता है, जटिल बायोमिमिकिंग सिंथेटिक सिस्टम का अध्ययन करने के नए अवसरों को प्रेरित कर सकता है। सीडीआईसीई विधि ने पूर्व जीयूवी पीढ़ी के तरीकों में निहित अधिकांश चुनौतियों और सीमाओं को समाप्त कर दिया है।

सीडीआईसीई विधि का उपयोग करके जीयूवी उत्पन्न करने के लिए दृष्टिकोण और शासी सिद्धांत मंच से पहले के हैं और उल्टे पायस हस्तांतरण12 जैसी पहले की तकनीकों में लागू किए गए हैं। हालांकि, उल्टे पायस हस्तांतरण विधि में कम पुटिका उपज और पुटिकाओं की विषमता जैसी सीमाएं हैं। यहां प्रस्तुत सीडीआईसीई विधि के लिए, लिपिड को नैनोमीटर के दसियों के समुच्चय के रूप में तेल में फैलाया जाता है (लिपिड समुच्चय का आकार लिपिड की समग्र एकाग्रता पर निर्भर है)24। लिपिड का फैलाव दो मिश्रणीय तेलों में होता है, जहां एक (खनिज तेल) लिपिड को भंग कर सकता है और दूसरा तेल (सिलिकॉन तेल) जो लिपिड के साथ मिश्रणीय नहीं है। यह विलायक-स्थानांतरण29 के माध्यम से लिपिड कुल कोसर्वेट्स बनाता है। यह विशेष फैलाव दृष्टिकोण जलीय बूंदों के तत्काल मोनोलेयर संतृप्ति और तेल-जलीय इंटरफ़ेस पर लिपिड के तेजी से नवीकरण की सुविधा प्रदान करता है क्योंकि जलीय बूंदें लिपिड-संतृप्त तेल-जलीय इंटरफ़ेस को लगातार पार करती हैं। यह बाद में जीयूवी बनाने के लिए बिलेयर ज़िपिंग में भी सुधार करता है और जीयूवी थ्रूपुट को बढ़ाता है। घूर्णन कक्ष द्वारा उत्पन्न केन्द्रापसारक बल लिपिड-संतृप्त इंटरफ़ेस में पॉलीडिप्रेस्ड बूंदों को बंद करने के लिए इष्टतम हैं। सीडीआईसीई विधि का मूल संस्करण तेल-लिपिड मिश्रण में आंतरिक समाधान को इंजेक्ट करने के लिए एक माइक्रोकेशिका नोजल का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण में, घूर्णन तेल-लिपिड मिश्रण द्वारा बनाई गई कतरनी बल जलीय बूंदों को उत्पन्न करते हैं, अंततः वर्णित जीयूवी में बदल जाते हैं। हालांकि, इंजेक्शन प्लेटफ़ॉर्म तैयार करने में लगने वाले समय को कम करने के इरादे से, विशेष रूप से तेज प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण, जैसे कि एक्टिन नेटवर्क असेंबली और माइक्रोकेशिका के संभावित क्लोजिंग, लिपिड मोनोलेयर्स के साथ जलीय बूंदें अब तेल-लिपिड मिश्रण को सीधे आंतरिक समाधान में जोड़कर उत्पन्न होती हैं और ऊपर और नीचे पाइपिंग करती हैं। यह दृष्टिकोण तेजी से प्रतिक्रिया प्रयोग के लिए जीयूवी एनकैप्सुलेशन में समय अंतराल को समाप्त करता है।

पहले जीयूवी पीढ़ी के तरीकों के कारण होने वाली चुनौतियों में जीयूवी पीढ़ी की तकनीक के आधार पर लिपिड प्रकारों (लिपिड का चार्ज और लिपिड का चरण) का प्रतिबंध है। डीओपीसी, डायोलियोइल-ग्लिसरो-होस्फोसेरिन (डीओपीएस), डायोलियोयल-ग्लिसरो-सक्सिनेट (डीजीएस), डिमिरिस्टॉयल-ग्लिसरो-फॉस्फोकोलाइन (डीएमपीसी), और अलग-अलग सांद्रता में विभिन्न लिपिड और कोलेस्ट्रॉल के संयोजन सहित कई लिपिड प्रकारों का परीक्षण किया गया था। सभी स्थितियों के लिए, सीडीआईसीई विधि को लगातार उच्च जीयूवी उपज पर उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता के साथ जीयूवी बनाने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, सीडीआईसीई विधि को विभिन्न सेलुलर घटकों को प्रभावी ढंग से समाहित करने के लिए भी दिखाया गया है, जिसमें साइटोस्केलेटल प्रोटीन, सेल-फ्री अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाएं, भीड़ एजेंट, रंजक और विभिन्न आकारों के अन्य सेलुलर अणु शामिल हैं, बिना एनकैप्सुलेशन दक्षता के नुकसान या थ्रूपुट में कमी के। इसके अलावा, सामान्य उल्टे पायस हस्तांतरण विधियों30 की तरह, संशोधित सीडीआईसीई संभावित रूप से भविष्य के काम के लिए असममित जीयूवी की पीढ़ी की अनुमति दे सकता है। विभिन्न लिपिड रचनाओं का उपयोग आंतरिक पत्रक और बाहरी पत्रक के लिए किया जा सकता है क्योंकि सीडीआईसीई कक्ष के अंदर बाइलेयर को ज़िप करने से पहले मोनोलेयर बूंदों को अलग-अलग (ऊपर और नीचे पाइप करके माइक्रोट्यूब के अंदर) अलग से बनाया जाता है। लिपिड का अवसादन तब देखा जाता है जब लिपिड-तेल मिश्रण को लंबे समय तक रखा जाता है; हालांकि, लिपिड समुच्चय को फिर से फैलाने के लिए एनकैप्सुलेशन से पहले लिपिड-तेल मिश्रण को भंवर किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लिपिड-तेल मिश्रण को लंबे समय तक रखने पर एनकैप्सुलेशन गुणवत्ता से समझौता किया जा सकता है, जैसा कि लिपिड-तेल मिश्रण में सामान्य लिपिड समुच्चय की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है। हालांकि परीक्षण नहीं किया गया है, इन समुच्चयों के परिणामस्वरूप संभावित रूप से बाइलेयर ज़िपिंग में अपूर्णता हो सकती है, और समुच्चय वांछित रासायनिक वातावरण से समझौता करने वाले आंतरिक समाधान के साथ भी समझाया जा सकता है।

जलीय बूंदों को बनाने के लिए प्रस्तुत संशोधित दृष्टिकोण की सीमा बूंदों के आकार में एकरूपता पैदा करने में है। यद्यपि जीयूवी आकारों को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रवाह दरों पर आंतरिक समाधान के माइक्रोकेशिका इंजेक्शन का उपयोग करके इसमें सुधार किया जा सकता है, लेकिन एन्कैप्सुलेटेड जीयूवी में एक्टिन असेंबली जैसी तेज प्रतिक्रियाओं की निगरानी करना कम वांछनीय है। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके बूंदों को बनाकर जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न जीयूवी आकार होते हैं, कोई भी समान आकार के पुटिकाओं की आबादी का विश्लेषण कर सकता है। बिलेयर में संभावित तेल प्रतिधारण के बारे में चिंताएं अधिकांश जीयूवी पीढ़ी तकनीकों को अपनाने में बाधा डालती हैं, जिसमें इमल्शन-आधारित जीयूवी पीढ़ी तकनीक जैसे सीडीआईसीई21 शामिल हैं। हालांकि, झिल्ली में शेष तेल की मात्रा को कार्बनिक एजेंटों जैसे 1-ऑक्टानोल का उपयोग करके कम किया जा सकता है, जिसे पुटिकाओं31,32 उत्पन्न करने के बाद हटाया जा सकता है। विधि में भविष्य के संशोधन, संभवतः विलायक संरचना को बदलकर, जांच करने की आवश्यकता है।

नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान में कई क्षेत्र हैं जिनकी अभी तक जांच नहीं की गई है और शायद जीयूवी के सेल-नकल कारावास की आवश्यकता होती है। इस तरह के प्रयोगात्मक प्रयासों के लिए जीयूवी पीढ़ी के प्लेटफार्मों जैसे सीडीआईसीई को जीयूवी उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है ताकि जीयूवी को मजबूती से उत्पन्न किया जा सके, जबकि ब्याज के विभिन्न अणुओं को कुशलतापूर्वक समझाया जा सके। कई सेलुलर प्रक्रियाएं पूर्व जीयूवी पीढ़ी तकनीकों का उपयोग करके अणुओं को समाहित करने में लगने वाले समय की तुलना में तेजी से होती हैं। जैसा कि यहां वर्णित है, एक्टिन समाधान ों को एक्टिन नेटवर्क असेंबली के परिणामस्वरूप पुटिका विरूपण का निरीक्षण करने के लिए जल्दी से पर्याप्त समझाया जाता है। पुनर्गठित एक्टिन साइटोस्केलेटन के साथ इस तरह की सिंथेटिक कोशिकाओं ने विभिन्न क्रॉसलिंकर्स 5,25,33 और झिल्ली रीमॉडेलिंग 25,27,28 की उपस्थिति में एक्टिन नेटवर्क संगठनकी विशेषताओं का खुलासा किया है। वे भविष्य के काम को अधिक परिष्कृत सिंथेटिक कोशिकाओं को बनाने के लिए प्रेरित करेंगे।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

एपीएल अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए हम्बोल्ट रिसर्च फैलोशिप और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1939310 और 1817909) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर 01 ईबी 030031) से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 177 इमल्शन ट्रांसफर सीडीआईसीई जीयूवी बॉटम-अप पुनर्गठन एक्टिन फासिन
विशालकाय यूनिलैमेलर वेसिकल्स के अंदर पुनर्गठित साइटोस्केलेटन का तेजी से एनकैप्सुलेशन
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Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

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