Summary
Hier presenteren we de fabricagemethode van een optrode-systeem met optische vezels voor lichtafgifte en een elektrode-array voor neurale opname. In vivo experimenten met transgene muizen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen, tonen de haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie.
Abstract
In het afgelopen decennium is optogenetica een essentieel hulpmiddel geworden voor het onderzoek naar neurale signalering vanwege het unieke vermogen van selectieve neurale modulatie of monitoring. Omdat specifieke soorten neuronale cellen genetisch kunnen worden gemodificeerd om opsine-eiwitten tot expressie te brengen, maakt optogenetica optische stimulatie of remming van de geselecteerde neuronen mogelijk. Er zijn verschillende technologische ontwikkelingen geweest in het optische systeem voor optogenetica. Onlangs werd voorgesteld om de optische golfgeleider voor lichtafgifte te combineren met elektrofysiologische opname om tegelijkertijd de neurale reacties op optogenetische stimulatie of remming te volgen. In deze studie werd een implanteerbare optrode array (2x2 optische vezels) ontwikkeld met ingebedde meerkanaals elektroden.
Een light-emitting diode (LED) werd gebruikt als lichtbron en een microgefabriceerde microlensarray werd geïntegreerd om voldoende lichtkracht te leveren aan de punt van de optische vezels. Het optrode array systeem bestaat uit het wegwerpdeel en het herbruikbare deel. Het wegwerponderdeel heeft optische vezels en elektroden, terwijl het herbruikbare deel de LED en elektronische circuits heeft voor lichtregeling en neurale signaalverwerking. Het nieuwe ontwerp van het implanteerbare optrode array-systeem wordt geïntroduceerd in de bijbehorende video naast de procedure van de optrode-implantatiechirurgie, optogenetische lichtstimulatie en de elektrofysiologische neurale opname. De resultaten van in vivo experimenten toonden met succes time-locked neurale spikes opgeroepen door de lichtprikkels van hippocampale exciterende neuronen van muizen.
Introduction
Het registreren en controleren van neurale activiteit is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen functioneren in een neuraal netwerk en op cellulair niveau. Conventionele elektrofysiologische opnamemethoden omvatten de patchklem 1,2,3,4 met behulp van een micropipette en extracellulaire opname met behulp van microneurale elektroden 5,6,7,8. Als neuromodulatiemethode is elektrische stimulatie vaak gebruikt om een focale hersenregio direct te stimuleren door directe of indirecte depolarisatie van neuronale cellen. De elektrische methode kan echter geen neuronale celtypen onderscheiden voor opname of stimulatie omdat de elektrische stromen zich in alle richtingen verspreiden.
Als een opkomende technologie heeft optogenetica een nieuw tijdperk ingeluid in het begrijpen hoe het zenuwstelsel werkt 9,10,11,12,13,14,15,16. De essentie van optogenetische technieken is om licht te gebruiken om de activiteit van lichtgevoelige opsine-eiwitten te regelen die tot expressie worden gebracht door genetisch gemodificeerde cellen. Optogenetica maakt dus de geavanceerde modulatie of monitoring van genetisch geselecteerde cellen in gecompliceerde neurale circuitsmogelijk 14,17. Het bredere gebruik van de optogenetische benadering heeft gelijktijdige neurale opname noodzakelijk gemaakt om optische neuromodulatie direct te bevestigen. Daarom zou een geïntegreerd apparaat met lichtregelings- en opnamefuncties uiterst waardevol zijn 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Er zijn beperkingen aan conventionele, lasergebaseerde optogenetische stimulatie, waarvoor een omvangrijk en duur lichtafgiftesysteem 26,27,28,29,30 vereist is. Daarom gebruikten sommige onderzoeksgroepen op μLED gebaseerde siliciumsondes om de grootte van het lichtafgiftesysteem 31,32,33,34 te minimaliseren. Er is echter een risico op thermische hersenschade veroorzaakt door direct contact met μLEDs als gevolg van de lage energieconversie-efficiëntie van LED's. Lichtgolfgeleiders, zoals optische vezels, SU-8 en siliciumoxynitride (SiON), zijn toegepast om thermische schade te voorkomen 30,35,36,37,38,39. Deze strategie heeft echter ook een nadeel vanwege de lage koppelingsefficiëntie tussen lichtbronnen en de golfgeleiders.
De microlensarray werd eerder geïntroduceerd om de lichtkoppelingsefficiëntie tussen LED's en optische vezels te verbeteren40. Een optrode-systeem werd ontwikkeld op basis van micro-elektromechanische systemen (MEMS) technologieën voor optische stimulatie en elektrische opname op microschaal40. De microlensarray tussen een LED en optische vezels verhoogde de lichtefficiëntie met 3,13 dB. Zoals te zien is in figuur 1, is een 2x2 optische vezelarray uitgelijnd op de 4x4 microlensarray en bevindt de LED zich onder de microlensarray. De 2x2 optische vezels worden gemonteerd in plaats van 4x4 om hersenschade te verminderen. Een wolfraamelektrode-array wordt naast de optrode-array geplaatst met behulp van silicium via gaten voor elektrofysiologische registratie (figuur 1B).
Het systeem bestaat uit een bovenste wegwerponderdeel en afneembare onderste onderdelen. Het bovenste wegwerpgedeelte, dat de optische vezelarray, microlensarray en de wolfraamelektrode-array omvat, is ontworpen om permanent in de hersenen te worden geïmplanteerd voor in vivo experimenten. Het onderste deel bevat een LED-lichtbron en een externe voedingslijn, die gemakkelijk verwijderbaar en herbruikbaar is voor een ander dierexperiment. Een bevestigbare plastic hoes beschermt het wegwerponderdeel wanneer het afneembare deel wordt verwijderd.
De haalbaarheid van het systeem wordt geverifieerd door implantatie in de hersenen van transgene muizen die channelrhodopsine-2 (ChR2) tot expressie brengen in Ca2+/calmodulin-afhankelijke eiwitkinase II-positieve neuronen (CaMKIIα::ChR2 muis). Opname-elektroden werden gebruikt om de neurale activiteiten van individuele neuronen vast te leggen tijdens optische stimulatie van de neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierverzorging en chirurgische procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ewha Womans University (nr. 20-029).
1. Voorbereiding van een optrode array (figuur 1 en figuur 2)
- Bevestig optische vezels met de microlensarray.
- Verwijder de passiveringscoating van de optische vezel en snijd deze in stukken van 5 mm lang met behulp van een precisie optische vezelmes.
- Dompel de optische vezel in de heldere UV-hars en plaats de optische vezels op de microlensarray.
- Hard de hars uit met een UV-lamp.
- Bevestig de microlensarray met epoxy aan de 3D-geprinte behuizing.
- Lijn perfluoroalkoxy (PFA) -gecoate wolfraamdraden uit.
- Soldeer de 4 stuks 30 mm lange PFA wolfraamdraden en 1 zilveren draad aan de 5-pins, 1,27 mm pitch female connector. Gebruik zilverdraad als referentie-elektrode.
- Sluit de vrouwelijke connector met 1,27 mm steek aan op de voorversterker van het hoofdbeeld.
- Plaats wolfraamdraden voorzichtig door het silicium via de gaten (figuur 1B) om de fijne uitlijning van de wolfraamelektroden te helpen.
- Knip de uitgelijnde wolfraamdraden 1 mm korter dan de glasvezellengte.
- Bevestig de connector aan de 3D-geprinte behuizing met behulp van epoxy.
- LED plaatsing
- Plaats de LED in de 3D-geprinte behuizing.
- Sluit de LED aan op het aandrijfcircuit dat pulsbreedtemodulatie (PWM) genereert.
OPMERKING: De PWM-puls wordt gegenereerd door de microcontroller. - Gezien het geluid dat wordt veroorzaakt door het LED-aandrijfcircuit, moet u ervoor zorgen dat de opname-elektroden zich 50 mm van het LED-aandrijfcircuit bevinden.
- Meet de lichtintensiteit aan het einde van de optische vezelpunt met behulp van een fotodiode.
- Dompel de wolfraamelektroden en optische vezels gedurende 15 minuten onder in alcohol. Dompel het systeem vervolgens onder in steriel D.I-water en steriliseer met ethyleenoxidegas.
2. Implantatiechirurgie (figuur 3 en figuur 4)
OPMERKING: Steriele techniek moet worden gevolgd tijdens de operatie.
- Bereid de transgene dieren voor, die genetisch gemodificeerd zijn om lichtgevoelige opsine-eiwitten tot expressie te brengen in het specifieke type neuronale cellen.
OPMERKING: Een mannelijke, 2 maanden oude, transgene muis die channelrhodopsine-2 (ChR2) tot expressie brengt in Ca2+/calmodulin-afhankelijke eiwitkinase II-positieve neuronen (CaMKIIα::ChR2 muis) werd gebruikt in deze studie41. - Verdoof de muis met een ketamine-xylazine cocktail - een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) - door intraperitoneale toediening.
- Controleer het verdoofde dier elke 30 minuten door de beweging van de snorharen en de reactie op het knijpen van de poot te controleren.
- Injecteer de ketamine-xylazinecocktail op de helft van de aanvangsdosis als extra anesthesie nodig is.
- Scheer de hoofdhuid en plaats de verdoofde muis in het stereotactische frame.
OPMERKING: Voer chirurgische huidvoorbereiding uit en drapeer het dier. Huidvoorbereiding omvat ontharing gevolgd door reiniging van de huid met antimicrobiële middelen.- Plaats de kop in het stereotactische frame en steek oorstaven in de meatus.
- Centreer de muiskop in het stereotactische frame door de oorstangen herhaaldelijk los te maken en aan te spannen voor een exacte positionering.
- Plaats de snijtandbalk zo dat de bovenste snijtanden over de voorste binnenrand haken.
- Pas de snijtandbalk aan voor het instellen van de hoogte van de snijstang en draai de neusklem tegen de snuit.
- Schakel het thermische verwarmingskussen dat in het stereotactische frame is ingebed van tevoren in om de lichaamstemperatuur tijdens de chirurgische ingrepen op 37 °C te houden.
- Plaats de thermische sonde in het rectum van de muis voor homeotherme regulatie.
OPMERKING: De plaatsing van de oorstang moet worden gecontroleerd door de snuit voorzichtig vast te pakken en te zwaaien. De oorstang moet opnieuw worden afgesteld als de snuit meer dan ~ 4 mm zijdelings kan worden verplaatst.
- Bedek de ogen met vaseline (zie de tabel met materialen) om uitdroging te voorkomen.
- Injecteer 1% lidocaïne in de hoofdhuid. Til de huid van het hoofd op met een tang, beveilig een injectieruimte en injecteer de lidocaïne onder de hoofdhuid.
- Voer een sagittale incisie uit met behulp van een scalpel en een fijne schaar. Houd de ingesneden huid vast met een microlamp om de zichtbaarheid van het operatiegebied te vergroten.
OPMERKING: De incisielengte is <1 cm boven de bregma en de caudale rand van het interpariëtale bot. - Verwijder het botvlies met wattenstaafjes. Als er bloedingen zijn, dichtschroei de schedel dan met behulp van een bovie om de bloedvaten te verzegelen.
- Reinig de schedel met zoutoplossing en markeer de craniotomieplaatsen met behulp van een manipulatorarm: hippocampus Anterior-Posterior (AP) −1,8 tot −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm en Dorsaal-Ventral (DV) −1 tot −2 mm.
OPMERKING: Gezien de dikte van de muizenschedel, plaatst u de optrode array -1,2 tot -2,2 mm van het blootgestelde hersengebied. Gezien de hippocampale route sturen piramidale cellen van CA3 hun axonen naar CA1. Daarom zijn optische vezels 1 mm langer dan opname-elektroden, zodat de optische vezels in CA3 worden geplaatst en de opname-elektroden in CA1. - Boor een gat boven het cerebellum en plaats een schroef voor de grond. Plaats de grondschroef 0,5 mm diep met een precisieschroef totdat deze de bovenkant van het cerebellum bereikt.
OPMERKING: Zorg voor een strakke inbrenging van de schroef, die zal worden gebruikt als een geslepen elektrode en een ondersteunende structuur om de stabiliteit van implantatie op lange termijn te maximaliseren, omdat het het driedimensionale oppervlak voor hechting van het tandcement verhoogt. - Boor het gemarkeerde gebied en verwijder een stuk van de schedel met een tang.
- Buig een naaldpunt van 26 G tot 120° met de klok mee en stel het hersengebied bloot door de schuine kant van de naald naar boven gericht in te brengen. Pas op dat u de hersenen en bloedvaten niet beschadigt.
- Reinig de blootgestelde hersenen met zoutoplossing om botstof en vreemde stoffen uit te spoelen.
- Bevestig de optrode-array in de manipulatorarm en ga dicht bij het blootgestelde gebied staan.
OPMERKING: Bij het plaatsen van het apparaat kan het opnieuw berekenen van het doelgebied vanaf de bregma de nauwkeurigheid van de plaatsing verhogen. - Plaats langzaam de optrode array en sluit de grondschroef aan op de zilverdraad die aan het systeem is bevestigd42.
OPMERKING: In dit proces moet de array stevig aan de manipulatorarm worden bevestigd om wiebelen te minimaliseren om hersenbeschadiging door micromotion tijdens het inbrengen te voorkomen. Het inbrengen moet langzaam worden uitgevoerd, met rust gedurende 10 minuten om rekening te houden met zwelling van de hersenen die mogelijk is ingedrukt na het inbrengen. Inbrengsnelheid van minder dan 1 μm/s in het hersenweefsel wordt aanbevolen voor de hoge kwaliteit van de signaal-ruisverhouding en het aantal scheidbare afzonderlijke eenheden42. - Als er bloedingen zijn, oefen dan directe druk uit op bloeders met een droog wattenstaafje of gebruik cautery. Ga niet verder met de volgende stappen totdat het bloeden volledig is gestopt.
- Plaats gelschuim tussen de blootgestelde hersenen en het apparaat om chemicaliën te beschermen tegen direct contact met de hersenen.
OPMERKING: Gelschuim helpt ook de hemostase en houdt de hersenen vochtig. - Veeg de schedel af met wattenstaafjes om vocht zoveel mogelijk te verwijderen en ga verder met de volgende fixatiestap.
- Breng voorzichtig tandcement aan op de schedel om het apparaat te bevestigen en het gelschuim te bedekken. Voordat het tandcement volledig is uitgehard, scheidt u de hoofdhuid als deze aan tandcement is bevestigd. Trek aan de ingesneden huid met een tang om het verharde tandcement te bedekken en hecht de hoofdhuid. Laat het apparaat vervolgens los van de manipulatorarm.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het tandcement niet aan de huid kleeft en alleen het schedelgebied bedekt. Wanneer de huid groeit, kan deze het cement wegduwen en uiteindelijk zal het apparaat eraf vallen. Dit zal een kritiek probleem veroorzaken voor langdurige in vivo experimenten.
3. Herstel en implantaatzorg
- Haal de muis uit het stereotactische frame.
- Dien Carprofen-oplossing toe met een naald van 26 G. Injecteer eenmaal voor de operatie en 12 uur (de volgende ochtend in het geval van een middagoperatie) en 24 uur na de operatie om de pijn te verminderen.
OPMERKING: De geneesmiddelconcentratie in de fles is 50 mg / ml en wordt bewaard bij 4 °C. Carprofen is stroperig en moet worden verdund in steriel water 1:10. Als de steriliteit wordt gehandhaafd, kan de oplossing maximaal 4 weken worden bewaard. Om de effectieve duur van het medicijn te behouden, injecteert u de Carprofen-oplossing met intervallen van 12 uur. - Plaats de muis op het verwarmingskussen en controleer of deze goed herstelt van de anesthesie.
OPMERKING: Het dier wordt niet onbeheerd achtergelaten totdat het weer voldoende bij bewustzijn is. - Verwijder de hechtdraadjes 7 - 10 dagen na de operatie.
- Laat het dier 1 week herstellen. Controleer de voedsel- en waterinname tijdens de hersteltijd. Dien het pijnstillend middel toe en controleer op tekenen van ongemak of pijn.
OPMERKING: De dieren die een operatie hebben ondergaan, kunnen niet bij de andere dieren blijven totdat ze volledig zijn hersteld.- Weeg tijdens de herstelperiode de muis elke dag om te controleren op gewichtsveranderingen. Offer de muis op (zie rubriek 6) als er sprake is van 20% gewichtsverlies in vergelijking met leeftijd en geslacht gematchte controledieren.
4. Optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie
- Verdoof de muis en plaats de verdoofde muis in het stereotactische frame.
- Stel de stimulatieparameters in.
- Stel het lichtpulsrecept in op 4% inschakelduur en 10 Hz frequentie43. Stel de lichtstimulatie in voor 2 s (20 pulsen) tijdens neurale opname.
- Gebruik een stroom van 50 mA om 3 mW/mm2 lichtintensiteit aan te sturen aan de optische vezelpunt. Meet het lichtvermogen met behulp van een fotodiode en vermogensmeter en deel het lichtvermogen door het facetgebied van de optische vezel.
- Verwijder de plastic afdekking en bevestig het bovenste deel met het lichttoevoersysteem met de herbruikbare LED en circuits.
- Sluit de voorversterker van de headstage aan op de geïmplanteerde 5-pins connector.
- Open de software om neurale signalen op te nemen.
- Stel de softwarefilters in. Gebruik een bandpass filter op 0,1-20 kHz en een notch filter op 60 Hz. Stel de samplefrequentie van de versterker in op 20 kHz.
- Controleer voor de opname of de neurale spike-signalen worden gedetecteerd.
OPMERKING: Ruisonderdrukking is belangrijk omdat neurale signalen te klein zijn. Als het geluidsniveau te hoog is, kunnen neurale signalen worden verduisterd door ruis en onzichtbaar worden. Gebruik de juiste aarding en elektromagnetische golfafscherming om ruis te verminderen. - Neem na de signaalcontrole neurale signalen op zonder lichtstimulatie voor basislijnregistratie.
- Led-licht leveren en tegelijkertijd neuronale reacties registreren (figuur 5 en figuur 6).
OPMERKING: Eenmaal gestimuleerd, moet het volgende stimulatie-experiment worden uitgevoerd na een interval van ten minste 5 minuten, zodat de neuronale activiteit die door de vorige stimulatie wordt opgeroepen, het volgende experiment niet beïnvloedt.
5. Data-analyse
- Laad de verkregen gegevens met behulp van het MATLAB-programma.
- Verkrijg enkele neurale activiteiten met behulp van een spike-sorteeralgoritme "Wave-Clus"44,45. Detecteer de pieken in elk kanaal met een amplitudedrempel zoals in Eq (1)45.
Drempel = 5 × mediaan
(1)
Waarbij x het bandpass-gefilterde signaal is.- Als u 'Wave-Clus' wilt installeren, raadpleegt u de downloadkoppeling in de materiaaltabel.
- Als u de GUI (Graphical User Interface) wilt openen, typt u wave_clus in de opdrachtprompt van MATLAB.
- Typ Get_spikes('bestandsnaam.ext') functie voor bestandsextensie voorbereid om spike detectie. Voer vervolgens Do_clustering ('filename_spikes.mat') uit voor het sorteren van spikes.
- Tel de gesorteerde spikes voor, tijdens en na lichtstimulatie met specifieke tijdbakken. Gebruik 0,2 s en 2 s tijdbakken voor analyse.
- Plot het aantal pieken van elk opnamekanaal.
OPMERKING: Gemiddelde met standaardfout van de middelen (SEM) van de gegevens uit de resultaten van 8 herhaalde experimenten werd berekend en uitgezet.
(1)6. Euthanasie
- Na alle experimenten offer je de muis op door inademing van koolstofdioxide (CO2).
- Plaats de muis zonder de kamer voor te laden in de transparante euthanasiekamer, zonder CO2-toevoer en/of -lekken.
- Schakel het CO2-gas in en verplaats de lucht met een snelheid van 30 - 50% van het volume euthanasiekamerlucht per minuut.
OPMERKING: Een flowmeter moet worden aangesloten op de CO 2-gasfles om ervoor te zorgen dat de luchtverplaatsingssnelheid 30-50% van het volume van de euthanasiekamer per minuut is. - Controleer de opgeofferde muis op gebrek aan ademhaling en veranderde oogkleur.
LET OP: De verwachte tijd voor euthanasie is meestal binnen 10 tot 15 min. - Na het observeren van de overlijdensverschijnselen, verwijdert u de muis uit de euthanasiekamer.
- Om de euthanasieprocedure te voltooien, verifieert u de dood door de ademhalings- en hartstilstand te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het optrode-systeem is met succes gefabriceerd om voldoende lichtkracht te leveren om de doelneuronen te activeren. De fijne uitlijning van de wolfraamelektroden wordt bereikt door het gemicrofabriceerde silicium via de gaten. De gemeten lichtintensiteit is 3,6 mW/mm2 aan de optische vezelpunt wanneer 50 mA stroom wordt toegepast. De microlens verhoogde de lichtefficiëntie met 3,13 dB. Vanwege de microlensarray, die de lichtkoppeling verbetert, is de toegepaste stroom ongeveer de helft van de stroom die nodig is om dezelfde lichtintensiteit te bereiken zonder het microlensarraysysteem. Omdat de LED meer warmte genereert met meer stroom, is het natuurlijk voordelig om de microlensarray te gebruiken voor het verlagen van de warmte van het apparaat. De gemiddelde impedantie van 4 elektroden was 71,39 kΩ bij een frequentie van 1 kHz, wat laag genoeg is voor de detectie van de actiepotentialen. Bovendien bestaat de optrode-array uit de wegwerp- en herbruikbare onderdelen om de kosten te verlagen en het totale gewicht van de implantatie te minimaliseren. Het gewicht van het wegwerponderdeel is ~0,58 g.
Een CaMKIIα::ChR2-muis werd gebruikt om de ChR2-expresserende neuronen direct te stimuleren en de opgeroepen neurale pieken werden met succes geregistreerd, zoals weergegeven in figuur 6. We toonden de hele geregistreerde golfvormen met exacte omstandigheden, waaronder 2 s lichtperiode in het midden (figuur 6A). Spike-sortering van het ruwe datasignaal werd uitgevoerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB-broncode. De totale neurale activiteit werd geanalyseerd na het sorteren van twee verschillende eenheden. Het aantal opgeroepen individuele neurale pieken na elke lichtstimulatiepuls nam aanzienlijk toe in vergelijking met de basislijn (figuur 6A, B), met verschillende tijdbakken van 2 s en 0,2 s. Als gevolg hiervan konden we het duidelijke effect van optogenetische stimulatie op de neuronen identificeren.
Figuur 1: Schematisch diagram van optrode array en microlens array. (A) 3D schematische weergave en crosssectieve weergave; (B) SEM-afbeelding van 4X4 microlens array en silicium vias. Schaalbalk = 1 mm (B). Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Apparaatprototype van optrode-systeem. (A) Volledig beeld van het systeem. (B) Vergrote weergave van de optrode array. Schaalstaven = 5 mm (A), 2 mm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Implantatiechirurgie. (A) Schedel wordt blootgesteld en gereinigd door botvlies te verwijderen. (B) Het hersengebied van het doel werd blootgelegd en de grondschroef werd boven het cerebellum ingebracht. (C) Optrode array werd in de hersenen ingebracht om diepte te bereiken. De grond was elektrisch aangesloten. (D) Tandcement wordt aangebracht om het apparaat te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematisch diagram van de toediening, bewerking en in vivo experimenttijdlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Experimentele opstelling van het elektrofysiologische opnamesysteem. (A) LED-licht uit, (B) LED-lampje aan. Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Elektrofysiologische opnameresultaten. (A) Representatieve golfvormen van neurale opname en vergrote golfvorm in rood onderbroken rechthoek die twee lichtprikkels (blauwe balken) en gesorteerde spikes (rode en zwarte pijlpunten) aangeeft. (B) Spike histogram voor elk kanaal voor, tijdens en na lichtstimulatie. De inzetfiguur geeft de locatie van de geïmplanteerde optrode-array aan. (C) Spike histogram met 100 ms tijdbak. Blauwe balk geeft de periode van led-lampje aan. Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie werd geverifieerd (figuur 6). De grote pieken tijdens lichtstimulatie zijn foto-elektrische artefacten die tegelijkertijd met de lichtstimulatie plaatsvinden (figuur 6A). Dit is duidelijk te zien in de ingezoomde weergave van de golfvorm in de rode rechthoek met stippelen (figuur 6A). Zoals te zien is in figuur 6A, konden de foto-elektrische artefacten duidelijk worden gesorteerd uit de geregistreerde golfvormen, en de neuronale reacties geïnduceerd door de optogenetische stimulatie van de hippocampale signaalroute werden duidelijk geïdentificeerd. Figuur 6B,C geeft het aantal pieken aan, waarbij het stimulatie-effect duidelijk wordt weergegeven. Figuur 6A is een van de golfvormen die worden gebruikt om de histogrammen in figuur 6B,C te verkrijgen, omdat de opnameresultaten worden verkregen uit 8 herhaalde opnamesessies.
Figuur 6A toont de door licht geïnduceerde toename van neurale activiteit. We hebben hetzelfde experiment uitgevoerd met controlemuizen zonder ChR2-expressie. In dat geval verhoogde de optogenetische stimulatie de neurale activiteit niet. Omdat de foto-elektrische artefacten gemakkelijk kunnen worden uitgesloten van de registratiegegevens, wordt het resultaat van het controledier niet in het manuscript opgenomen. Bovendien kunnen de verschillen in de opnameresultaten tussen de 4 kanalen, zoals weergegeven in figuur 6, worden gerechtvaardigd door te overwegen dat de afstand tussen de wolfraamopname-elektroden 300 μm (van midden tot midden) is. Het is waarschijnlijk dat de piekactiviteiten in verschillende kanalen afkomstig zijn van verschillende neuronen. Omdat de neuronale cellen echter verbonden zijn, vooral in het lokale hersengebied, waren de algemene patronen van neuronale spiking vergelijkbaar, maar niet precies hetzelfde.
Om het succes van deze dierproeven te garanderen, vereisen verschillende kritieke stappen een hoge nauwkeurigheid en extra aandacht tijdens de implantatieoperatie. Ten eerste moeten bloedingen uit de bloedvaten in de hersenen zorgvuldig worden behandeld. Ga niet verder met de volgende stappen totdat het bloeden volledig is gestopt. Dit zorgt voor een stevige bevestiging van het geïmplanteerde apparaat aan de hersenen en een duidelijk zicht tijdens de chirurgische ingreep. Het dichtschroeien van de bloedende plekken met een bovie, steriliseren met zoutoplossing en het inbrengen van gelschuim kan nuttig zijn om het bloeden te stoppen.
Ten tweede moeten de muizenhersenen worden beschermd tegen uitdroging tijdens de optrode-implantatie. Zoutoplossing en gelschuim worden gebruikt om vochtig te blijven. Als het dura-membraan wordt verwijderd en de hersenen volledig worden blootgesteld, moeten de andere chirurgische stappen zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Ten derde is de langzame invoegsnelheid van de optrode ook cruciaal. Langzamer inbrengen vermindert weefselschade en verbetert de nauwkeurigheid van de implantatie op de beoogde locatie46. Omdat de vervorming van het hersenweefsel onvermijdelijk is tijdens het inbrengen van de optrode, is langzame insertie zeer nuttig voor het misvormde weefsel om zijn oorspronkelijke vorm en volume te herstellen.
Ten vierde bepaalt het fixatieproces de stabiliteit op lange termijn. Het is nuttig om het schedeloppervlak droog te maken voordat het tandcement stolt voor een verbeterde, langdurige hechting. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat u niet te veel tandcement aanbrengt of het cement rechtstreeks op de huid laat plakken. Naarmate de ingesneden huid na verloop van tijd regenereert, kan deze het cement geleidelijk van de schedel duwen en losmaken naarmate de huid groeit. Bovendien moet direct contact van het tandcement met het hersenweefsel worden vermeden omdat tandcement schadelijk is voor hersenweefsel. Dit kan effectief worden voorkomen door gelschuiminbrenging tussen de blootgestelde hersenen en het apparaat.
Naast de chirurgische ingrepen moet het optrode-systeem zorgvuldig worden gecontroleerd voordat de experimenten worden gestart. Eerst moeten het implanteerbare deel van de optische vezelarray en de elektroden onder een microscoop worden onderzocht voordat ze worden ingebracht. Het is noodzakelijk om te controleren of er breuk is in de optische vezel, omdat zelfs een kleine scheur kritisch lichtverlies kan veroorzaken. Verder moet de uitlijning tussen de optische vezels en de opname-elektroden worden gecontroleerd op nauwkeurige inbrenging. Fijne tangen kunnen de wolfraamelektroden minutieus buigen om hun verkeerde uitlijning te corrigeren.
Ten tweede moet de lichtintensiteit vóór de implantatieoperatie worden gecontroleerd om te bepalen of het lichtvermogen boven de drempel ligt en hoog genoeg is om de opsins te activeren. In de praktijk is bekend dat de excitatiedrempel voor ChR2 ongeveer 1 mW/mm247 is. Lichtgegenereerde weefselverwarming moet echter worden geminimaliseerd en tegelijkertijd voldoende lichtintensiteit bieden om de neuronale cellen te prikkelen. Te sterke lichtenergie kan de hersenweefsels beschadigen als gevolg van een temperatuurstijging. Een temperatuurstijging van 6-8 °C in de hersenen kan onmiddellijke en onomkeerbare weefselschade veroorzaken12,48. Een eerdere studie toonde aan dat de temperatuurstijging aan de optische vezelpunt minder dan 0,5 °C49 is. Een lage duty cycle van optische stimulatie met een korte duur kan nuttig zijn. Vergeleken met eerdere studies die temperatuurproblemen met optogenetische stimulatie rapporteerden, is ons uitgangsvermogen (2 mW / mm2) en het protocol met lichtstimulatie met 4 ms bij 20 Hz gedurende 2 seconden geschikt en binnen het veilige bereik.
Een grote uitdaging voor neurale opname is het verwijderen van de artefacten die worden veroorzaakt door optische stimulatie. Artefacten die synchroon lopen met optische stimulatie moeten in verschillende aspecten worden beschouwd, omdat zowel elektrische als optische mechanismen deze artefacten kunnen genereren. Ten eerste kunnen elektrische artefacten worden veroorzaakt door het elektrische circuit dat de LED aandrijft. Wanneer een elektrische stroom in een circuit stroomt om lichtstimulatie aan te sturen, kunnen elektrische artefacten worden gegenereerd. Dit probleem kan worden ondervangen door het aantal draden voor de LED-aansluitingen te minimaliseren en de afstand tussen het lichtstimulatiecircuit en de draden verbonden met de wolfraamopname-elektroden te maximaliseren. Ten tweede kunnen foto-elektrische artefacten worden gegenereerd door het foto-elektrochemische effect tijdens optogenetische stimulatie. Deze artefacten kunnen worden geminimaliseerd door directe blootstelling van de opname-elektrode aan het stimulatielicht te vermijden en de afstand tussen de optische vezels en de elektroden te vergroten. Het is echter moeilijk om door licht geïnduceerde artefacten te elimineren als gevolg van lichtverstrooiing in het hersenweefsel.
Er zijn nog steeds beperkingen in de voorgestelde optrode-array, die in toekomstige studies kunnen worden verbeterd. Hoewel de optische vezelpunt in deze studie plat werd gesneden, zal afschuining of tapering van vezelpunten weefselschade tijdens het inbrengen minimaliseren en de lichthoek vergroten die zich vanaf de uiteinden verspreidt50. Een andere beperking is de lage lichtintensiteit. Ondanks de resultaten van de elektrofysiologische opname heeft het voorgestelde systeem een relatief lager uitgangsvermogen dan een op laser gebaseerd systeem. Daarom kan het voorgestelde LED-gebaseerde systeem optogenetisch een kleiner hersengebied prikkelen dan het op laser gebaseerde systeem. Dit komt vooral omdat de meeste LED's een veel lager vermogen hebben dan lasers in het algemeen. Omdat de efficiëntie en de maximale intensiteit van LED's onlangs echter drastisch zijn verbeterd, kunnen LED's met een hoger uitgangsvermogen worden ontwikkeld met nieuwe halfgeleidertechnologieën. De andere beperking is dat er geen longitudinaal opnameonderzoek is uitgevoerd. Er werd echter bevestigd dat het apparaat een maand lang goed aan de muizen was bevestigd. Dit resultaat toont de mogelijkheid dat het apparaat geschikt is voor langdurige experimenten. Daarom zullen langdurige in vivo tests worden uitgevoerd om de stabiliteit van het hulpmiddel te verifiëren.
De meest typische methode voor optogenetica in laboratoria is om een lasersysteem als lichtbron te gebruiken. Hoewel een laser een hoger uitgangsvermogen kan leveren dan LED's voor het activeren van opsins, kan het op laser gebaseerde systeem niet gemakkelijk worden geminiaturiseerd en vereist het een dure implementatie. Het op LED gebaseerde optogenetische systeem heeft daarentegen verschillende voordelen, zoals een lage systeemcomplexiteit, kosteneffectiviteit en een laag stroomverbruik, die gunstig zijn voor de ontwikkeling van het draadloze systeem. Daarom wordt in deze studie de LED gebruikt als de lichtbron en wordt de microlensarray gebruikt om de lichtintensiteit van de LED te verhogen.
Bovendien vormen de lichtbron en de huidige aandrijfcircuits de afneembare en herbruikbare delen van het systeem. Nieuwe LED's met verschillende golflengten kunnen eenvoudig in het apparaat worden gebruikt door eenvoudige vervanging, en de systeemkosten kunnen aanzienlijk worden verlaagd door hergebruik in meerdere experimenten. Het hele systeem kan verder worden geïmplementeerd als een draadloos systeem, dat op optogenetisch neuronale signalen stimuleert en registreert zonder vastgebonden lijnen door een draadloos systeem met laag vermogen in het geminiaturiseerde geïntegreerde apparaat te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door convergent technology R&D Program for Human Augmentation via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap en ICT (NRF-2019M3C1B8090805), en ondersteund door een subsidie van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019R1A2C1088909). We bedanken het laboratorium van Seung-Hee Lee bij het Department of Biological Sciences, KAIST, Daejeon, Korea, voor het vriendelijk leveren van de transgene muizen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
References
- Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
- Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
- Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
- Buzsáki, G.
- Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
- Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
- Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
- Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
- Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
- Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
- Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
- Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
- Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
- Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
- Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
- Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
- Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
- Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
- McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
- Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
- Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
- Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725 (2021).
- Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
- Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
- Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
- Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
- Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
- Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
- Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).
