Summary
Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.
Abstract
Durante la última década, la optogenética se ha convertido en una herramienta esencial para la investigación de la señalización neuronal debido a su capacidad única de modulación o monitoreo neuronal selectivo. Como tipos específicos de células neuronales pueden modificarse genéticamente para expresar proteínas opsina, la optogenética permite la estimulación óptica o la inhibición de las neuronas seleccionadas. Ha habido varios avances tecnológicos en el sistema óptico para la optogenética. Recientemente, se propuso combinar la guía de onda óptica para la entrega de luz con el registro electrofisiológico para monitorear simultáneamente las respuestas neuronales a la estimulación o inhibición optogenética. En este estudio, se desarrolló una matriz optrode implantable (fibras ópticas 2x2) con electrodos multicanal integrados.
Se empleó un diodo emisor de luz (LED) como fuente de luz, y se integró una matriz de microlentes microfabricadas para proporcionar suficiente potencia de luz en la punta de las fibras ópticas. El sistema optrode array comprende la parte desechable y la parte reutilizable. La parte desechable tiene fibras ópticas y electrodos, mientras que la parte reutilizable tiene el LED y los circuitos electrónicos para el control de la luz y el procesamiento de la señal neuronal. El novedoso diseño del sistema de matriz optrode implantable se introduce en el video adjunto, además del procedimiento de la cirugía de implantación optrode, la estimulación optogenética de la luz y el registro neuronal electrofisiológico. Los resultados de los experimentos in vivo mostraron con éxito picos neuronales bloqueados en el tiempo evocados por los estímulos de luz de las neuronas excitadoras del hipocampo de ratones.
Introduction
Registrar y controlar la actividad neuronal es esencial para comprender cómo funciona el cerebro en una red neuronal y a nivel celular. Los métodos convencionales de registro electrofisiológico incluyen la pinza de parche 1,2,3,4 utilizando una micropipeta y el registro extracelular utilizando electrodos microneurales 5,6,7,8. Como método de neuromodulación, la estimulación eléctrica se ha utilizado con frecuencia para estimular directamente una región focal del cerebro a través de la despolarización directa o indirecta de las células neuronales. Sin embargo, el método eléctrico no puede distinguir los tipos de células neuronales para el registro o la estimulación porque las corrientes eléctricas se propagan en todas las direcciones.
Como tecnología emergente, la optogenética ha marcado el comienzo de una nueva era en la comprensión de cómo funciona el sistema nervioso 9,10,11,12,13,14,15,16. La esencia de las técnicas optogenéticas es utilizar la luz para controlar la actividad de las proteínas opsina sensibles a la luz expresadas por células modificadas genéticamente. Así, la optogenética permite la modulación o monitorización sofisticada de células seleccionadas genéticamente en circuitos neuronales complicados14,17. El uso más amplio del enfoque optogenético ha requerido la grabación neuronal simultánea para confirmar directamente la neuromodulación óptica. Por lo tanto, un dispositivo integrado con funciones de control de luz y grabación sería extremadamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Existen limitaciones de la estimulación optogenética convencional basada en láser, que requiere un sistema de suministro de luz voluminoso y costoso 26,27,28,29,30. Por lo tanto, algunos grupos de investigación emplearon sondas de silicio basadas en μLED para minimizar el tamaño del sistema de suministro de luz 31,32,33,34. Sin embargo, existe el riesgo de daño cerebral térmico causado por el contacto directo con μLED debido a la baja eficiencia de conversión de energía de los LED. Se han aplicado guías de onda de luz, como fibras ópticas, SU-8 y oxinitruro de silicio (SiON), para evitar daños térmicos 30,35,36,37,38,39. Sin embargo, esta estrategia también tiene un inconveniente debido a su baja eficiencia de acoplamiento entre las fuentes de luz y las guías de onda.
La matriz de microlentes se introdujo anteriormente para mejorar la eficiencia de acoplamiento de luz entre LED y fibras ópticas40. Se desarrolló un sistema optrode basado en tecnologías de sistemas microelectromecánicos (MEMS) para la estimulación óptica y el registro eléctrico a microescala40. La matriz de microlentes entre un LED y fibras ópticas aumentó la eficiencia de la luz en 3,13 dB. Como se muestra en la Figura 1, una matriz de fibra óptica 2x2 está alineada en la matriz de microlentes 4x4, y el LED se coloca debajo de la matriz de microlentes. Las fibras ópticas 2x2 se montan en lugar de 4x4 para reducir el daño cerebral. Una matriz de electrodos de tungsteno se coloca adyacente a la matriz optrode utilizando silicio a través de orificios para el registro electrofisiológico (Figura 1B).
El sistema consta de una parte superior desechable y partes inferiores desmontables. La parte superior desechable, que incluye la matriz de fibra óptica, la matriz de microlentes y la matriz de electrodos de tungsteno, está diseñada para implantarse permanentemente en el cerebro para experimentos in vivo . La parte inferior incluye una fuente de luz LED y una línea de fuente de alimentación externa, que es fácilmente extraíble y reutilizable para otro experimento con animales. Una cubierta de plástico acoplable protege la pieza desechable cuando se retira la pieza desmontable.
La viabilidad del sistema se verifica mediante la implantación en el cerebro de ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas positivas para la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (ratón CaMKIIα::ChR2). Se utilizaron electrodos de grabación para registrar las actividades neuronales de neuronas individuales durante la estimulación óptica de las neuronas.
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Protocol
El cuidado de los animales y los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Mujeres Ewha (no. 20-029).
1. Preparación de una matriz optrode (Figura 1 y Figura 2)
- Conecte fibras ópticas con la matriz de microlentes.
- Retire el recubrimiento de pasivación de la fibra óptica y córtelo en trozos de 5 mm de largo con una cuchilla de fibra óptica de precisión.
- Sumerja la fibra óptica en la resina UV transparente y coloque las fibras ópticas en la matriz de microlentes.
- Curar la resina con una lámpara UV.
- Conecte la matriz de microlentes a la carcasa impresa en 3D mediante epoxi.
- Alinee los cables de tungsteno recubiertos de perfluoroalcoxi (PFA).
- Suelde las 4 piezas de cables de tungsteno PFA de 30 mm de largo y 1 cable plateado al conector hembra de paso de 5 pines y 1,27 mm. Utilice alambre de plata como electrodo de referencia.
- Conecte el conector hembra de paso de 1,27 mm al preamplificador del cabezal.
- Coloque cuidadosamente los cables de tungsteno a través del silicio a través de los orificios (Figura 1B) para ayudar a la alineación fina de los electrodos de tungsteno.
- Corte los cables de tungsteno alineados 1 mm más cortos que la longitud de la fibra óptica.
- Conecte el conector a la carcasa impresa en 3D mediante epoxi.
- Colocación del LED
- Coloque el LED en la carcasa impresa en 3D.
- Conecte el LED al circuito de conducción que genera la modulación de ancho de pulso (PWM).
NOTA: El pulso PWM es generado por el microcontrolador. - Dado el ruido inducido por el circuito de conducción LED, asegúrese de que los electrodos de grabación estén a 50 mm de distancia del circuito de conducción LED.
- Mida la intensidad de la luz en el extremo de la punta de la fibra óptica utilizando un fotodiodo.
- Sumergir los electrodos de tungsteno y las fibras ópticas en alcohol durante 15 min. Luego sumerja el sistema en agua D.I estéril y esterilize con gas óxido de etileno.
2. Cirugía de implantación (Figura 3 y Figura 4)
NOTA: Se debe seguir la técnica estéril durante la cirugía.
- Prepare a los animales transgénicos, que están modificados genéticamente para expresar proteínas opsina sensibles a la luz en el tipo específico de células neuronales.
NOTA: En este estudio se utilizó un ratón transgénico macho de 2 meses de edad que expresa canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas positivas para la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (ratón CaMKIIα::ChR2)41. - Anestesiar al ratón con un cóctel de ketamina-xilazina,una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg)- mediante administración intraperitoneal.
- Revise al animal anestesiado cada 30 minutos monitoreando el movimiento del bigote y la reacción al pellizco de la pata.
- Inyecte el cóctel de ketamina-xilazina a la mitad de la dosis inicial si se necesita anestesia adicional.
- Afeitar la piel de la cabeza y colocar el ratón anestesiado en el marco estereotáctico.
NOTA: Realice la preparación quirúrgica de la piel y cubra el animal. La preparación de la piel implica la depilación seguida de la limpieza de la piel con agentes antimicrobianos.- Coloque la cabeza dentro del marco estereotáctico e inserte barras para los oídos en el meato.
- Centra la cabeza del ratón en el marco estereotáctico aflojando y apretando repetidamente las barras de los oídos para un posicionamiento exacto.
- Coloque la barra incisiva de modo que los incisivos superiores se enganchen sobre el borde interior delantero.
- Ajuste la barra incisiva para ajustar la altura de la barra incisiva y apriete la abrazadera nasal contra el hocico.
- Encienda la almohadilla térmica incrustada en el marco estereotáctico con anticipación para mantener la temperatura corporal a 37 ° C durante los procedimientos quirúrgicos.
- Coloque la sonda térmica en el recto del ratón para la regulación homeotérmica.
NOTA: La colocación de la barra de la oreja debe verificarse agarrando y balanceando suavemente el hocico. La barra de la oreja debe reajustarse si el hocico se puede mover más de ~ 4 mm lateralmente.
- Cubra los ojos con vaselina (ver la Tabla de Materiales) para evitar la sequedad.
- Inyecte lidocaína al 1% en el cuero cabelludo. Levante la piel de la cabeza con fórceps, asegure un espacio de inyección e inyecte la lidocaína debajo del cuero cabelludo.
- Realice una incisión sagital con un bisturí y tijeras finas. Sostenga la piel incisa con una microclamp para ampliar la visibilidad del área quirúrgica.
NOTA: La longitud de la incisión es de <1 cm por encima del bregma y el borde caudal del hueso interparietal. - Retire el periostio con hisopos de algodón. Si hay sangrado, cauterice el cráneo usando un bovie para sellar los vasos sanguíneos.
- Limpie el cráneo con solución salina y marque los sitios de craneotomía con un brazo manipulador: hipocampo anterior-posterior (AP) −1.8 a −2.8 mm, Medial-Lateral (ML) 0.5-2.5 mm y Dorsal-Ventral (DV) −1 a −2 mm.
NOTA: Teniendo en cuenta el grosor del cráneo del ratón, inserte la matriz optrode de -1.2 a -2.2 mm desde el área del cerebro expuesta. Dada la vía del hipocampo, las células piramidales de CA3 envían sus axones a CA1. Por lo tanto, las fibras ópticas son 1 mm más largas que los electrodos de grabación, de modo que las fibras ópticas se colocan en CA3 y los electrodos de grabación en CA1. - Perfore un orificio por encima del cerebelo e inserte un tornillo para el suelo. Coloque el tornillo de tierra a 0,5 mm de profundidad con un tornillo de precisión hasta que llegue a la parte superior del cerebelo.
NOTA: Asegúrese de una inserción hermética del tornillo, que se utilizará como electrodo de tierra y estructura de soporte para maximizar la estabilidad a largo plazo de la implantación, ya que aumenta la superficie tridimensional para la adherencia del cemento dental. - Perfore el área marcada y retire un pedazo del cráneo con fórceps.
- Doble la punta de una aguja de 26 G en el sentido de las agujas del reloj 120° y exponga el área del cerebro insertando el lado biselado de la aguja hacia arriba. Tenga cuidado de no dañar el cerebro y los vasos sanguíneos.
- Limpie el cerebro expuesto con solución salina para eliminar el polvo óseo y la materia extraña.
- Fije la matriz optrode en el brazo manipulador y muévase cerca del área expuesta.
NOTA: Al colocar el dispositivo, volver a calcular el área objetivo desde el bregma puede aumentar la precisión de la colocación. - Inserte lentamente la matriz optrode y conecte el tornillo de tierra al cable plateado conectado al sistema42.
NOTA: En este proceso, la matriz debe fijarse firmemente al brazo manipulador para minimizar el bamboleo y evitar el daño cerebral por micromovimiento durante la inserción. La inserción debe realizarse lentamente, con reposo durante 10 minutos para tener en cuenta la hinchazón del cerebro que puede haber sido presionada después de la inserción. Se recomienda una velocidad de inserción inferior a 1 μm/s en el tejido cerebral por la alta calidad de la relación señal-ruido y el número de unidades individuales separables42. - Si hay sangrado, aplique presión directa a los sangrados con un hisopo de algodón seco o use cauterización. No pase a los siguientes pasos hasta que el sangrado se detenga por completo.
- Inserte espuma de gel entre el cerebro expuesto y el dispositivo para proteger los productos químicos del contacto directo con el cerebro.
NOTA: La espuma de gel también ayuda a la hemostasia y mantiene el cerebro húmedo. - Limpie el cráneo con hisopos de algodón para eliminar la humedad tanto como sea posible y continúe con el siguiente paso de fijación.
- Aplique cuidadosamente cemento dental en el cráneo para fijar el dispositivo y cubrir la espuma de gel. Antes de que el cemento dental se endurezca por completo, separe el cuero cabelludo si está unido al cemento dental. Tire de la piel incisa con fórceps para cubrir el cemento dental endurecido y suture el cuero cabelludo. Luego, suelte el dispositivo del brazo manipulador.
NOTA: Asegúrese de que el cemento dental no se adhiera a la piel y solo cubra la región del cráneo. Cuando la piel crece, puede empujar el cemento y, eventualmente, el dispositivo se caerá. Esto causará un problema crítico para los experimentos in vivo a largo plazo.
3. Recuperación y cuidado de implantes
- Saque el ratón del marco estereotáctico.
- Administrar la solución de carprofeno con una aguja de 26 G. Inyecte una vez antes de la cirugía y 12 h (a la mañana siguiente en caso de cirugía por la tarde) y 24 h después de la cirugía para reducir el dolor.
NOTA: La concentración del fármaco en el frasco es de 50 mg/ml, y se almacena a 4 °C. El carprofeno es viscoso y debe diluirse en agua estéril 1:10. Si se mantiene la esterilidad, la solución se puede almacenar hasta por 4 semanas. Para mantener la duración efectiva del medicamento, inyecte la solución de Carprofen a intervalos de 12 h. - Coloque el ratón sobre la almohadilla térmica y compruebe si se recupera bien de la anestesia.
NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que recupere la conciencia suficiente. - Retire los hilos de sutura de 7 a 10 días después de la cirugía.
- Permita que el animal se recupere durante 1 semana. Controle la ingesta de alimentos y agua durante el tiempo de recuperación. Administre el analgésico y verifique si hay signos de malestar o dolor.
NOTA: Los animales que se han sometido a cirugía no pueden permanecer con los otros animales hasta que se recuperen por completo.- Durante el período de recuperación, pese el ratón todos los días para verificar si hay cambios de peso. Sacrificar el ratón (ver sección 6) si hay una pérdida de peso del 20% en comparación con la edad y el sexo de los animales de control emparejados.
4. Estimulación optogenética y registro electrofisiológico
- Anestesia el ratón y coloca el ratón anestesiado en el marco estereotáctico.
- Configure los parámetros de estimulación.
- Ajuste la receta de pulso de luz al 4% del ciclo de trabajo y a la frecuencia de 10 Hz43. Configure la estimulación de luz durante 2 s (20 pulsos) durante la grabación neuronal.
- Utilice una corriente de 50 mA para impulsar una intensidad de luz de 3 mW/mm2 en la punta de la fibra óptica. Mida la potencia de la luz utilizando un fotodiodo y un medidor de potencia y divida la potencia de la luz por el área de la faceta de fibra óptica.
- Retire la cubierta de plástico y conecte la parte superior que contiene el sistema de suministro de luz con el LED y los circuitos reutilizables.
- Conecte el preamplificador del cabezal al conector implantado de 5 pines.
- Abra el software para grabar señales neuronales.
- Configure los filtros de software. Utilice un filtro de paso de banda a 0,1-20 kHz y un filtro de muesca a 60 Hz. Ajuste la frecuencia de muestreo del amplificador a 20 kHz.
- Antes de la grabación, verifique si se detectan las señales de pico neuronal.
NOTA: La cancelación de ruido es importante porque las señales neuronales son demasiado pequeñas. Si el nivel de ruido es demasiado alto, las señales neuronales pueden ser oscurecidas por el ruido y volverse invisibles. Utilice la conexión a tierra adecuada y el blindaje de ondas electromagnéticas para reducir el ruido. - Después de la verificación de la señal, grabe las señales neuronales sin estimulación de la luz para el registro de referencia.
- Entregue luz LED y registre simultáneamente las respuestas neuronales (Figura 5 y Figura 6).
NOTA: Una vez estimulado, el siguiente experimento de estimulación debe realizarse después de un intervalo de al menos 5 min para que la actividad neuronal evocada por la estimulación anterior no afecte al siguiente experimento.
5. Análisis de datos
- Cargue los datos adquiridos mediante el programa MATLAB.
- Obtener actividades neuronales individuales utilizando un algoritmo de clasificación de picos "Wave-Clus"44,45. Detecte los picos en cada canal por un umbral de amplitud como en Eq (1)45.
Umbral = mediana de
5 × (1)
Donde x es la señal filtrada por paso de banda.- Para instalar "Wave-Clus", consulte el enlace de descarga en la Tabla de materiales.
- Para abrir la interfaz gráfica de usuario (GUI), escriba wave_clus en el símbolo del sistema de MATLAB.
- Escriba Get_spikes('filename.ext') para la extensión de archivo preparada para la detección de picos. Luego, ejecute Do_clustering ('filename_spikes.mat') para la clasificación de picos.
- Cuente los picos clasificados antes, durante y después de la estimulación de la luz con contenedores de tiempo específicos. Utilice contenedores de tiempo de 0,2 s y 2 s para el análisis.
- Traza el número de picos de cada canal de grabación.
NOTA: Se calculó y graficó la media con error estándar de las medias (SEM) de los datos de los resultados de 8 experimentos repetidos.
5 × (1)6. Eutanasia
- Después de todos los experimentos, sacrifique al ratón por inhalación de dióxido de carbono (CO2).
- Sin precargar la cámara, coloque el ratón en la cámara de eutanasia transparente, sin suministro de CO2 y/o fugas.
- Encienda el gas CO2 y desplace el aire a una velocidad del 30 al 50% del volumen de aire de la cámara de eutanasia por minuto.
NOTA: Se debe conectar un caudalímetro al cilindro de gas CO2 para garantizar que la tasa de desplazamiento del aire sea del 30-50% del volumen de la cámara de eutanasia por minuto. - Monitoree al ratón sacrificado por falta de respiración y cambio de color de ojos.
NOTA: El tiempo esperado para la eutanasia suele ser dentro de 10 a 15 minutos. - Después de observar los signos de muerte, retire el ratón de la cámara de eutanasia.
- Para completar el procedimiento de eutanasia, verifique la muerte confirmando el paro respiratorio y cardíaco.
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Representative Results
El sistema optrode se fabrica con éxito para proporcionar suficiente potencia de luz para activar las neuronas objetivo. La alineación fina de los electrodos de tungsteno se logra a través del silicio microfabricado a través de los agujeros. La intensidad de luz medida es de 3,6 mW/mm2 en la punta de la fibra óptica cuando se aplica una corriente de 50 mA. La microlente aumentó la eficiencia lumínica en 3,13 dB. Debido a la matriz de microlentes, que mejora el acoplamiento de luz, la corriente aplicada es aproximadamente la mitad de la corriente requerida para lograr la misma intensidad de luz sin el sistema de matriz de microlentes. Como el LED genera más calor con más corriente, obviamente es ventajoso emplear la matriz de microlentes para reducir el calor del dispositivo. La impedancia media de 4 electrodos fue de 71,39 kΩ a una frecuencia de 1 kHz, que es lo suficientemente baja para la detección de los potenciales de acción. Además, la matriz optrode comprende las piezas desechables y reutilizables para reducir el costo y minimizar el peso total de la implantación. El peso de la pieza desechable es de ~ 0.58 g.
Se utilizó un ratón CaMKIIα::ChR2 para estimular directamente las neuronas que expresan ChR2, y los picos neuronales evocados se registraron con éxito, como se muestra en la Figura 6. Mostramos todas las formas de onda registradas con condiciones exactas, incluido el período de encendido de luz de 2 s en el medio (Figura 6A). La clasificación de picos a partir de la señal de datos sin procesar se realizó utilizando un código fuente de MATLAB personalizado. La actividad neuronal total se analizó después de clasificar dos unidades diferentes. El número de picos neuronales individuales evocados después de cada pulso de estimulación de luz aumentó significativamente en comparación con la línea de base (Figura 6A, B), con diferentes contenedores de tiempo de 2 s y 0.2 s. Como resultado, pudimos identificar el efecto claro de la estimulación optogenética en las neuronas.
Figura 1: Diagrama esquemático de la matriz optrode y la matriz de microlentes. (A) Vista esquemática 3D y vista transversal; (B) Imagen SEM de la matriz de microlentes 4X4 y vías de silicio. Barra de escala = 1 mm (B). Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Prototipo de dispositivo del sistema optrode. (A) Vista completa del sistema. (B) Vista ampliada de la matriz optrode. Barras de escala = 5 mm (A), 2 mm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cirugía de implantación. (A) El cráneo se expone y se limpia mediante la extirpación del periostio. (B) El área cerebral objetivo fue expuesta, y el tornillo de tierra se insertó por encima del cerebelo. (C) La matriz Optrode se insertó en el cerebro para apuntar a la profundidad. La toma de tierra estaba conectada eléctricamente. (D) Se aplica cemento dental para fijar el dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama esquemático de la línea de tiempo de administración, operación y experimento in vivo . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Configuración experimental del sistema de registro electrofisiológico. (A) Luz LED apagada, (B) Luz LED encendida. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados del registro electrofisiológico. (A) Formas de onda representativas de la grabación neuronal y la forma de onda agrandada en rectángulo discontinuo rojo que indica dos estímulos de luz (barras azules) y picos ordenados (puntas de flecha rojas y negras). (B) Histograma de pico para cada canal antes, durante y después de la estimulación de la luz. La figura del recuadro indica la ubicación de la matriz optrode implantada. (C) Histograma de pico con contenedor de tiempo de 100 ms. La barra azul indica el período de encendido de la luz LED. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se verificó la viabilidad del sistema de estimulación optogenética simultánea y registro electrofisiológico (Figura 6). Los grandes picos durante la estimulación de la luz son artefactos fotoeléctricos que ocurren al mismo tiempo que la estimulación de la luz (Figura 6A). Esto queda claro en la vista ampliada de la forma de onda en el rectángulo discontinuo rojo (Figura 6A). Como se muestra en la Figura 6A, los artefactos fotoeléctricos se pudieron separar claramente de las formas de onda registradas, y las respuestas neuronales inducidas por la estimulación optogenética de la vía de señal del hipocampo se identificaron claramente. La Figura 6B,C indica el número de picos, mostrando claramente el efecto de estimulación. La Figura 6A es una de las formas de onda utilizadas para obtener los histogramas de la Figura 6B,C, ya que los resultados de la grabación se obtienen a partir de 8 sesiones de grabación repetidas.
La Figura 6A muestra el aumento inducido por la luz en la actividad neuronal. Hemos realizado el mismo experimento con ratones control sin expresión de ChR2. En ese caso, la estimulación optogenética no aumentó la actividad neuronal. Como los artefactos fotoeléctricos se excluyen fácilmente de los datos de grabación, el resultado del animal de control no se incluye en el manuscrito. Además, las diferencias en los resultados de grabación entre los 4 canales, como se muestra en la Figura 6, pueden justificarse considerando que la distancia entre los electrodos de grabación de tungsteno es de 300 μm (centro a centro). Es probable que las actividades de pico en diferentes canales sean de diferentes neuronas. Sin embargo, debido a que las células neuronales están conectadas, especialmente en la región local del cerebro, los patrones generales de pico neuronal fueron similares, pero no exactamente los mismos.
Para garantizar el éxito de estos experimentos con animales, varios pasos críticos requieren una alta precisión y atención adicional durante la cirugía de implantación. Primero, el sangrado de los vasos sanguíneos cerebrales debe manejarse con cuidado. No continúe con los siguientes pasos hasta que el sangrado se haya detenido por completo. Esto permitirá la fijación firme del dispositivo implantado en el cerebro y una visibilidad clara durante el procedimiento quirúrgico. Cauterizar las manchas de sangrado con una bovie, esterilizar con solución salina e insertar espuma de gel puede ser útil para detener el sangrado.
En segundo lugar, el cerebro del ratón debe estar protegido de la sequedad durante la implantación de optrode. La espuma salina y de gel se utilizan para mantener la humedad. Si se extirpa la membrana de la duramadre y el cerebro está completamente expuesto, los otros pasos quirúrgicos deben realizarse lo más rápido posible. En tercer lugar, la lenta velocidad de inserción del optrode también es crucial. La inserción más lenta reduce el daño tisular y mejora la precisión de la implantación en la ubicación objetivo46. Como la deformación del tejido cerebral es inevitable durante la inserción de optrode, la inserción lenta es muy útil para que el tejido deformado restaure su forma y volumen originales.
Cuarto, el proceso de fijación determina la estabilidad a largo plazo. Es útil hacer que la superficie del cráneo se seque antes de solidificar el cemento dental para mejorar la fijación a largo plazo. Además, se debe tener cuidado para evitar aplicar demasiado cemento dental o dejar que el cemento se pegue directamente a la piel. A medida que la piel incisa se regenera con el tiempo, puede empujar y separar gradualmente el cemento del cráneo a medida que la piel crece. Además, se debe evitar el contacto directo del cemento dental con el tejido cerebral porque el cemento dental es dañino para el tejido cerebral. Esto se puede prevenir eficazmente mediante la inserción de espuma de gel entre el cerebro expuesto y el dispositivo.
Además de los procedimientos quirúrgicos, el sistema optrode debe revisarse cuidadosamente antes de comenzar los experimentos. Primero, la parte implantable de la matriz de fibra óptica y los electrodos deben examinarse bajo un microscopio antes de la inserción. Es necesario verificar si hay alguna rotura en la fibra óptica porque incluso una pequeña grieta puede causar una pérdida crítica de luz. Además, la alineación entre las fibras ópticas y los electrodos de grabación debe verificarse para una inserción precisa. Los fórceps finos pueden doblar minuciosamente los electrodos de tungsteno para rectificar su desalineación.
En segundo lugar, la intensidad de la luz debe verificarse antes de la cirugía de implantación para determinar si la potencia de la luz está por encima del umbral y es lo suficientemente alta como para activar las opsinas. En la práctica, se sabe que el umbral de excitación para ChR2 es de aproximadamente 1 mW/mm247. Sin embargo, el calentamiento del tejido generado por la luz debe minimizarse al tiempo que proporciona suficiente intensidad de luz para excitar las células neuronales. La energía lumínica demasiado fuerte puede dañar los tejidos cerebrales debido a un aumento de la temperatura. Un aumento de la temperatura de 6-8 °C en el cerebro puede causar daño tisular inmediato e irreversible12,48. Un estudio anterior mostró que el aumento de temperatura en la punta de la fibra óptica es inferior a 0,5 ° C49. Un ciclo de trabajo bajo de estimulación óptica con una duración corta puede ser útil. En comparación con estudios anteriores que informaron problemas de temperatura con la estimulación optogenética, nuestra potencia de salida (2 mW / mm2) y el protocolo con estimulación de luz con 4 ms a 20 Hz durante 2 segundos es apropiado y está dentro del rango seguro.
Un desafío importante para la grabación neuronal es eliminar los artefactos inducidos por la estimulación óptica. Los artefactos sincrónicos con la estimulación óptica deben considerarse en varios aspectos diferentes porque tanto los mecanismos eléctricos como los ópticos pueden generar estos artefactos. Primero, los artefactos eléctricos pueden ser causados por el circuito eléctrico que impulsa el LED. Cuando una corriente eléctrica fluye en un circuito para impulsar la estimulación de la luz, se pueden generar artefactos eléctricos. Este problema se puede superar minimizando el número de cables para las conexiones LED y maximizando la distancia entre el circuito de estimulación de luz y los cables conectados con los electrodos de grabación de tungsteno. En segundo lugar, los artefactos fotoeléctricos pueden ser generados por el efecto fotoelectroquímico durante la estimulación optogenética. Estos artefactos se pueden minimizar evitando la exposición directa del electrodo de grabación a la luz de estimulación y aumentando el espaciamiento entre las fibras ópticas y los electrodos. Sin embargo, es difícil eliminar los artefactos inducidos por la luz debido a la dispersión de la luz en el tejido cerebral.
Todavía hay limitaciones en la matriz optrode propuesta, que se pueden mejorar en estudios futuros. Aunque la punta de fibra óptica se cortó plana en este estudio, el biselado o estrechamiento de las puntas de fibra minimizará el daño tisular durante la inserción y aumentará el ángulo de propagación de la luz desde las puntas50. Otra limitación es la baja intensidad de la luz. A pesar de los resultados del registro electrofisiológico, el sistema propuesto tiene una potencia de salida relativamente menor que un sistema basado en láser. Por lo tanto, el sistema propuesto basado en LED puede excitar optogenéticamente una región cerebral más pequeña que el sistema basado en láser. Esto se debe principalmente a que la mayoría de los LED tienen una potencia mucho menor que los láseres en general. Sin embargo, como la eficiencia y la intensidad máxima de los LED se han mejorado drásticamente recientemente, los LED con una mayor potencia de salida se pueden desarrollar con nuevas tecnologías de semiconductores. La otra limitación es que no se realizó un estudio de registro longitudinal. Sin embargo, se confirmó que el dispositivo estuvo bien conectado a los ratones durante un mes. Este resultado muestra la posibilidad de que el dispositivo sea adecuado para experimentos a largo plazo. Por lo tanto, se realizarán pruebas in vivo a largo plazo para verificar la estabilidad del dispositivo.
El método más típico para la optogenética en los laboratorios es utilizar un sistema láser como fuente de luz. Aunque un láser puede proporcionar una potencia de salida más alta que los LED para activar opsinas, el sistema basado en láser no se puede miniaturizar fácilmente y requiere una implementación de alto costo. Por el contrario, el sistema optogenético basado en LED tiene varias ventajas, como la baja complejidad del sistema, la rentabilidad y el bajo consumo de energía, que son ventajosas para el desarrollo del sistema inalámbrico. Por lo tanto, en este estudio, el LED se emplea como fuente de luz, y la matriz de microlentes se adopta para aumentar la intensidad de la luz del LED.
Además, la fuente de luz y los circuitos de conducción actuales comprenden las partes desmontables y reutilizables del sistema. Los nuevos LED con diferentes longitudes de onda se pueden usar fácilmente en el dispositivo mediante un simple reemplazo, y el costo del sistema se puede reducir significativamente debido a la reutilización en múltiples experimentos. Todo el sistema se puede implementar aún más como un sistema inalámbrico, que estimula y registra optogenéticamente las señales neuronales sin líneas atadas mediante la adopción de un sistema inalámbrico de baja potencia en el dispositivo integrado miniaturizado.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa de I + D de Tecnología Convergente para el Aumento Humano a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019M3C1B8090805), y apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2019R1A2C1088909). Agradecemos al laboratorio de Seung-Hee Lee en el Departamento de Ciencias Biológicas, KAIST, Daejeon, Corea, por proporcionar amablemente a los ratones transgénicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
References
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