Summary
Er zijn verschillende verschillen tussen de rechter en linker ventrikels. De pathofysiologie van het rechterventrikelinfarct (RVI) is echter niet opgehelderd. In het huidige protocol wordt een reproduceerbare methode voor het genereren van RVI-muismodellen geïntroduceerd, die een middel kan bieden om het mechanisme van RVI te verklaren.
Abstract
Rechterventrikelinfarct (RVI) is een veel voorkomende presentatie in de klinische praktijk. Ernstige RVI kan leiden tot fatale hemodynamische disfunctie en aritmie. In tegenstelling tot het veel gebruikte muismyocardinfarct (MI) -model dat wordt gegenereerd door linker coronaire slagaderligatie, wordt het RVI-muismodel zelden gebruikt vanwege de moeilijkheid die gepaard gaat met modelgeneratie. Onderzoek naar de mechanismen en behandeling van RVI-geïnduceerde RV-remodellering en disfunctie vereist diermodellen om de pathofysiologie van RVI bij patiënten na te bootsen. Deze studie introduceert een haalbare procedure voor het genereren van RVI-modellen in C57BL / 6J-muizen. Verder werd dit model gekarakteriseerd op basis van het volgende: evaluatie van de infarctgrootte 24 uur na MI, beoordeling van cardiale remodellering en functie met echocardiografie, RV-hemodynamische beoordeling en histologie van de infarctzone 4 weken na RVI. Daarnaast werd een coronaire vasculatuur gegoten om de coronaire arteriële opstelling in RV te observeren. Dit muismodel van RVI zou het onderzoek naar mechanismen van rechterhartfalen vergemakkelijken en nieuwe therapeutische doelen van RV-remodellering zoeken.
Introduction
De rechter ventrikel (RV), lang beschouwd als een eenvoudige buis verbonden met de longslagader, is jarenlang ten onrechte verwaarloosd1. Er is echter de laatste tijd een toenemende belangstelling voor rv-functie, omdat het een essentiële rol speelt bij hemodynamische aandoeningen 2,3 en kan dienen als een onafhankelijke risicovoorspeller van hart- en vaatziekten 4,5,6,7. RV-ziekten omvatten RV-infarct (RVI), pulmonale arteriehypertensie en valvulaire ziekte8. In tegenstelling tot de immense belangstelling voor pulmonale arteriehypertensie is RVI verwaarloosdgebleven 7,9.
RVI, meestal vergezeld van inferieur-posterieur myocardinfarct 10,11, wordt veroorzaakt door occlusie van de rechter kransslagader (RCA). Volgens klinisch onderzoek induceert ernstige RVI waarschijnlijk hemodynamische stoornissen en aritmieën, zoals hypotensie, bradycardie en atrioventriculaire blok, geassocieerd met hogere ziekenhuismorbiditeit en mortaliteit 12,13,14. Rv-functie kon tot op zekere hoogte spontaan herstellen, zelfs zonder reperfusie15,16. Er bestaan verschillende morfologische en functionele verschillen tussen de linker ventrikel (LV) en RV17. Rv wordt verondersteld beter bestand te zijn tegen ischemie dan LV8, deels vanwege de uitgebreidere collaterale circulatievorming na RVI. Het verduidelijken van de verschillen tussen LV-infarct (LVI) en RVI en het identificeren van de onderliggende mechanismen zou nieuwe therapeutische doelen bieden voor hartregeneratie en ischemisch hartfalen. Vanwege de moeilijkheid die gepaard gaat met het genereren van RVI-muismodellen, is fundamenteel onderzoek naar RVI echter voornamelijk beperkt.
Een groot diermodel van RVI is gegenereerd door RCA te legen bij varkens18, wat gemakkelijker te bedienen is vanwege de zichtbare RCA. Ten opzichte van het grote diermodel heeft het muismodel de volgende voordelen: meer toegankelijkheid in genmanipulatie, lagere economische kosten en kortere experimentele periode 19,20. Hoewel eerder een muis RVI-model gericht op de invloed van RVI op de LV-functie werd gerapporteerd, werden de gedetailleerde stappen van de procedure, de moeilijkheden en belangrijkste werkingspunten en de modelkenmerken zoals hemodynamische veranderingen niet volledig geïntroduceerd 9,21.
Dit artikel biedt gedetailleerde chirurgische procedures voor het genereren van een muismodel van RVI. Bovendien werd dit model gekenmerkt door echocardiografische meting, invasieve hemodynamische evaluatie en histologische analyse. Verder werd een coronaire vasculatuurafgietsel uitgevoerd om de coronaire arteriële opstelling in RV te observeren. De techniek die in dit artikel wordt geïntroduceerd, zou beginners helpen om snel de generatie van het muis RVI-model te begrijpen met acceptabele bedrijfssterfte en betrouwbare evaluatiebenaderingen. Het muismodel van RVI zou helpen bij het onderzoeken van de mechanismen van rechterhartfalen en het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen van RV-remodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, herzien in 1996) en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, China). Gezonde mannelijke C57BL / 6J-muizen (8-10 weken oud; lichaamsgewicht, 25-30 g) werden verkregen van het Animal Center van de Southern Medical University. Vrouwelijke muizen kunnen ook worden gebruikt, maar het mengen van beide geslachten wordt niet aanbevolen vanwege de mogelijke invloeden van geslachtsverschillen. Na aankomst werden de muizen gehuisvest onder een 12-h/12-h donker/licht cyclus (3-4 muizen per kooi), met ad libitum voedsel en water.
1. Voorbereiding op de operatie
- Steriliseer chirurgische instrumenten door autoclaveren vóór de operatie. Stel het verwarmingskussen in op 37 °C.
- Anesthetiseer de muizen door een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbital (zie Tabel met materialen) om chirurgische pijn te verlichten. Plaats de muizen in aparte dozen voor anesthesie-inductie. Zorg voor de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een teenontwenningsreactie.
OPMERKING: Het wordt ook aanbevolen om 1,5% isofluraan te gebruiken voor inhalatie-anesthesie omdat het beter is voor analgesie. - Plaats de muizen liggend op het kussen door hun snijtanden met een hechtdraad te bevestigen en hun ledematen te immobiliseren met plakband. Zorg opnieuw voor de diepte van de anesthesie door de reflex te controleren.
- Verwijder het haar uit de nek tot xiphoid met een ontharingscrème. Desinfecteer het operatiegebied 3 keer met afwisselend antiseptische scrub en 75% alcohol en drapeer vervolgens het operatieveld.
- Voer intubatie uit volgens de onderstaande stappen.
- Stel de ademhalingsfrequentie van het dier met een mini-ventilator (zie Materiaaltabel) in op 150/min en het getijdenvolume op 300 μL.
OPMERKING: Het is niet nodig om de positieve eind-expiratoire drukmodus te gebruiken. - Trek de tong iets uit met een pincet, til de onderkaak op met een tongdepressor om de glottis bloot te leggen en voer intra-tracheale intubatie uit door een canule van 22 G in de glottis in te brengen.
- Schakel de mini-ventilator in en sluit de tracheale canule aan op de ventilator. Het fenomeen van thoracale golving die gelijk wordt aan de beademingsfrequentie duidt op succesvolle intubatie. Bevestig de canule met tape om uitglijden tijdens de operatie te voorkomen.
- Stel de ademhalingsfrequentie van het dier met een mini-ventilator (zie Materiaaltabel) in op 150/min en het getijdenvolume op 300 μL.
2. Permanente ligatie van de rechter kransslagader
- Sluit de elektrocardiografie (ECG) elektroden (zie Materiaaltabel) correct aan op de ledematen van de muis en neem het ECG op.
OPMERKING: Een van de II-, III- of AVF-leads wordt geselecteerd als bewakingslood; Lood III is geschikter. - Open de kist.
- Maak een 1 cm lange incisie in de huid parallel aan de derde rechter rib met een oogheelkundige schaar. Bepaal de derde intercostal opnieuw en zorg voor voldoende ruimte volgens de borstbeenhoek.
OPMERKING: De richting van de huidincisie wordt gemaakt van de borstbeenhoek naar de rechter voorste axillaire lijn. - Scheid en knip de pectoralis major en pectoralis minor spieren met een schaar en microtang boven de derde intercostale ruimte. Scheid daarna botweg de intercostale spier met een elleboogstang om het chirurgische veld bloot te leggen.
OPMERKING: Slechts een klein deel van de borstspieren hoeft te worden doorgesneden en dan wordt een stompe scheiding aanbevolen om het hart bloot te leggen. - Snijd het hartzakje in. Til het rechter atrium op met steriel katoen en lileer de RCA met een steriele 8-0 nylondraad met een ligatiebereik van 3-5 mm. Na het legen van de RCA toont het monitoring-ECG (lood III) st-segmenthoogte.
OPMERKING: Omdat de RCA van de muis onzichtbaar is, moet de anatomische locatie zorgvuldig worden bevestigd. Het myocard van de RV is veel dunner dan dat van de LV. Daarom is het moeilijk om de diepte van de ingebrachte naald te begrijpen. Het is gemakkelijk om sinus bradycardie en atrioventriculaire blok te induceren als de diepte van de ingebrachte naald te diep is en het ligatiebereik te groot is.
- Maak een 1 cm lange incisie in de huid parallel aan de derde rechter rib met een oogheelkundige schaar. Bepaal de derde intercostal opnieuw en zorg voor voldoende ruimte volgens de borstbeenhoek.
- Verwijder de steriele katoenen en hechtspieren en huid met een steriele 5-0 nylondraad om de intercostale incisie te sluiten. Desinfecteer de huid opnieuw met 75% alcohol en huisvest de muis na de operatie.
OPMERKING: De goed gehechte spier is belangrijk voor het vermijden van aerothorax. Een steriele drainagebuis wordt in de borstholte geplaatst tot de voltooiing van de borstsluiting en vervolgens wordt de borstholte geëvacueerd door een injectiespuit die de drainagebuis verbindt.
OPMERKING: Na de operatie worden muizen op een verwarmingskussen geplaatst. Pijnstillers zoals buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht, subcutane injectie) zijn nodig om de pijn van de dieren na de operatie te verminderen. De verwachte complicaties zijn sinus bradycardie en atrioventriculaire blok, en het sterftecijfer na de operatie is 10-20%.
3. Echocardiografische beoordeling van de RV-functie na de operatie
OPMERKING: Gebruik voor echocardiografie een MS400D-sonde met een middenfrequentie van 30 MHz, aangesloten op een echografiesysteem met hoge resolutie (zie Materiaaltabel). Het echocardiografie-onderzoek wordt 4 weken na de operatie uitgevoerd.
- Verdoof de muis met 3% isofluraan via inhalatie.
- Plaats de muis in rugligging op een ultrasoon platform voor dierfixatie en ultrasone bediening. Plak de klauwen op de elektrode om een ECG-opname te verkrijgen via een systeem dat aan de ultrasone machine is bevestigd.
- Controleer de hartslag via ECG en houd deze tussen 450-550 slagen / min door de verdovingsconcentratie tussen 1,5% en 3% aan te passen.
- Verwijder het haar van de borst van de muis met een ontharingscrème en breng ultrasone gel aan op de huid van de borst.
- Stel het platform in op de horizontale positie. Oriënteer de transducer evenwijdig aan het linkerbeen en verkrijg het linkerventrikelbeeld met lange as. Draai de sonde 90° met de klok mee om de LV-weergave met korte as te verkrijgen. Druk op de Cine store-knop om de afbeeldingen op te slaan.
OPMERKING: De linkerbovenhoek van het platform is op het laagste punt gekanteld. De LV korte-as rotatiehoek van de transducer wordt gehandhaafd terwijl de transducer is gericht op de rechterschouder van de muis. - Beweeg verticaal naar beneden op de transducer en behoud de positie over de bovenbuik en onder het middenrif van de muis onder de B-modus. Pas de positie van het platform enigszins aan door de x- en y-assen te draaien totdat de RV, het rechteratrium (RA), het linkeratrium (LA) en lv duidelijk zichtbaar zijn op het scherm. Sla apicale afbeeldingen met vier kamers op door op de knop Cine store of Frame Store te drukken.
OPMERKING: B-modus wordt gebruikt om de tweedimensionale (2D) weergave van het hart weer te geven. - Druk op M-mode; nadat de 2x-indicatorlijn verschijnt, zoekt u de indicatorlijn bij de tricuspidalisklepopening om de beweging van het tricuspidalis ringvormige vlak te verkrijgen. Druk op de knop Cine Store of Frame Store om gegevens en afbeeldingen op te slaan.
OPMERKING: M-modus betekent bewegingsmodus, die de beweging van het hart of vat in een kromme vorm onthult. - Druk op de knop Meten om naar de meetmodus te gaan. Klik op de knop Gebiedsmeting om te zoneren in RV en LV. Bereken het gebied van RV en LV om de oppervlakteverhouding van RV tot LV te verkrijgen.
- Klik op de knop Tijdlijn en maak twee basislijnen om het bewegingsbereik van het tricuspidalis ringvormige vlak tijdens de systolische en diastolische perioden te definiëren. Klik op de knop Afstand en meet de afstand tussen twee basislijnen om tricuspidalis ringvormige vlak systolische excursie (TAPSE) te verkrijgen.
- Kantel de linkerkant van het platform op het laagste punt. Houd de sonde in een hoek van 30° ten opzichte van de horizontale as langs de rechter voorste oksellijn. Draai de x- en y-assen van het platform om de rv weer te geven.
- Druk op de M-modusknop en zoek de indicatorlijn op het hyperechoïsche punt van het septum om het M-modusbeeld van de RV-interface te verkrijgen. Druk op de Cine store-knop om de foto op te slaan.
- Open de M-modusafbeelding van de RV-interface, druk op de knop Meten om naar de meetmodus te gaan. Meet de RV-binnenafstand aan het einde van diastole (RVIDd), RV-ejectiefractie (RVEF) en RV-fractieverkorting (RVFS) met behulp van het ingebouwde meetinstrument van het echocardiografische systeem.
- Stop met het toedienen van isofluraan en plaats de muis gedurende 3-5 minuten op het verwarmingskussen totdat deze weer bij bewustzijn komt. Breng de muis daarna terug naar zijn kooi met een licht / donkercyclus van 12 uur.
4. Invasieve metingen van RV hemodynamische
OPMERKING: RV hemodynamisch wordt beoordeeld door middel van rechter hartkatheterisatie 4 weken na RVI. Een katheter van 1,0 F samen met een bewakingssysteem wordt toegepast.
- Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg natriumpentobarbital (zie Materialentabel).
- Nadat u het verdwijnen van de pedaalontwenningsreflex hebt bevestigd, houdt u de muis in rugligging en immobiliseert u deze met plakband.
- Scheer het borsthaar van de sternale hoek naar de xiphoid. Desinfecteer het operatiegebied met 75% alcohol.
- Voer tracheale intubatie uit en stel de parameter van de dierlijke ventilator in zoals beschreven in stappen 1.5.2-1.5.3.
- Maak een bilaterale incisie van 1 cm op de huid boven het xiphoid-proces en transect het diafragma en de rib met een oogheelkundige schaar om het hart bloot te leggen.
- Prik de rechter ventrikelvrije wand met een naald van 32 G. Verwijder de naald en druk de wond met katoen om het bloeden te stelpen.
- Breng de punt van de katheter via de prikplaats in de rechterkamer en duw de katheter langzaam naar voren. Pas de positie van de tip aan om een typische RV-drukgolfvorm te verkrijgen die wordt weergegeven op een monitor en opnamesysteem.
OPMERKING: Rechter halsader is ook een geschikte route voor hemodynamische meting. - Na 10 minuten stabilisatie, registreer de gegevens van RV systolische bloeddruk (RVSBP), RV einddiastolische druk (RVEDP) en RV dP / dt. Klik op de knop Selecteren om hartcycli voor berekening te selecteren en klik vervolgens op de knop Analyseren om de gemiddelde waarden van de geselecteerde cycli te berekenen.
- Verwijder de katheter na voltooiing van de opname en plaats deze vervolgens in de normale zoutoplossing.
- Euthanaseer de muis met een intraperitoneale injectie van overdosering pentobarbital natrium (150 mg / kg) en offer het vervolgens op door cervicale dislocatie.
- Verzamel het hart en het scheenbeen voor histologische analyse.
5. Coronair vasculair gips met behulp van een vasculair gietmiddel
- Hepariniseer de muis met een intraperitoneale injectie van 200 IE/ml heparinenatrium bij 2000 IE/kg (zie Materialentabel).
- Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg natriumpentobarbital.
- Leg het dier op de pad en intubeer voor kunstmatige ventilatie volgens de stappen 1.5.2-1.5.3.
- Open de borst met een chirurgische schaar zoals beschreven in stap 4.5 en leg het hart bloot.
- Maak een inkeping van 3 mm met een oogheelkundige schaar op de rechter boezems en perfundeer het hart met 5 ml normale zoutoplossing door de harttop met een injector.
- Blokkeer het bloed uit de aorta met een aortaklem en perfundeer 0,1 ml nitroglycerine (1 mg / ml) door de harttop met een injector om de kransslagader te verwijden.
- Bereid het gegoten reagens door de ingrediënten in de kit te mengen volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het gegoten reagens en de perfusie gelijktijdig met normale zoutoplossing en nitroglycerine te bereiden om microvasculaire sluiting te voorkomen. - Perfundeer het hart met 1 ml gegoten reagens door de harttop en wacht tot 2-3 uur.
- Erodeer het hart met 50% natriumhydroxide gedurende 2-3 dagen en verwijder het spierweefsel of bindweefsel door te spoelen met een normale zoutoplossing.
- Maak foto's onder een camera.
LET OP: Het gegoten reagens is schadelijk voor de ogen, huid en luchtwegen. Natriumhydroxide is corrosief. Het dragen van beschermende handschoenen, een bril en een laboratoriumjas is vereist. Het gegoten reagens moet in een zuurkast worden bereid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden muizen willekeurig toegewezen aan de RVI (n = 11) of sham-operatie (n = 11) groep. Het coronaire gips in 2 normale muizenharten is weergegeven in figuur 1A. Als reactie op RCA-ligatie werd st-segmentverhoging waargenomen in lood III van het ECG (figuur 1B). Bovendien toonde 2,3,5-trifenyl tetrazoliumchloride (TTC) kleuring aan dat het infarctgebied 45% van de RV-vrije wand uitmaakt op 24 uur postoperatief (figuur 1C,D). De bovenstaande gegevens wezen op de succesvolle generatie van het RVI-muismodel.
Opnames van de 4-kamer apex view (figuur 2A) en 2-kamer view op LV korte as en de bijbehorende M-mode echocardiografie (figuur 2B) metingen werden uitgevoerd op 4 weken na de operatie om de RV-remodellering en -functie te evalueren. Vergeleken met die in de schijngroep nam de RV interne dimensie aan het einde van diastole (RVIDd) toe in de RVI-groep (figuur 2C), en het was meer dan 2 keer in de schijngroep (figuur 2A). RV-ejectiefractie (RVEF), RV-fractieverkorting (RVFS) en tricuspidalise ringvormige vlak systolische excursie (TAPSE) waren significant kleiner in de RVI-groep dan in de schijngroep (figuur 2D-F). De RV/LV-oppervlakteverhouding steeg met ongeveer 50% ten opzichte van de schijngroep (figuur 2G).
De muizen werden 4 weken na de operatie onderworpen aan RV hemodynamische meting. In de RVI-groep waren RVSBP, dp/dt max, dp/dt min en RV-contractiliteit significant kleiner. Tegelijkertijd waren de RVEDP- en τ (tau)-index aanzienlijk significanter dan die in de schijngroep (figuur 3A-E).
Vier weken na de operatie werden de muizen geofferd. Een RV-aneurysma was zichtbaar in het infarctgebied (figuur 4A). De verhouding hartgewicht/lichaamsgewicht (HW/BW) en hartgewicht/tibialengte (HW/TL) in de RVI-groep waren iets groter (zonder statistische significantie) dan die in de schijngroep (figuur 4B,C). Massonkleuring22 duidde op significante fibrose in de RV-vrije wand en zelden trad fibrose op in het septum in de RVI-groep (figuur 4D,E). Daarentegen bevonden enkele overlevende cardiomyocyten zich in het infarctgebied (figuur 4F).
Figuur 1: Elektrocardiografie (ECG) veranderingen en infarctgrootte na ligatie van de rechter kransslagader (RCA). (A) Representatieve beelden van coronaire vasculaire gips van muizen. Schaalbalk = 4 mm. (B) Lead III ECG-verandering als reactie op RCA-ligatie. (C) Representatieve foto's van 2,3,5-trifenyl tetrazoliumchloride (TTC) kleuring (wit duidt op infarctgebied, rood duidt op levensvatbaar weefsel). Schaalbalk = 4 mm. (D) Kwantificering van de grootte van het myocardinfarct van RVI-muizen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, *P < 0,01 vs. shamgroep, n = 6 per groep (twee onafhankelijke steekproef t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Echocardiografiebeoordeling van de remodellering en functie van de rechterventrikel (RV) bij muizen die aan RCA-ligatie werden onderworpen. (A) Representatieve B-modusbeelden in vierkamerweergave 4 weken na RCA-ligatie; schaalbalk = 2 mm. (B) Typische foto's van B-Mode op de rechter ventrikelinterface (boven) en de overeenkomstige M-Mode (onderste) met zowel LV als RV op 4 weken na RCA-ligatie; schaalbalk = 2 mm. (C) RV interne afmeting aan het einde van diastole (RVIDd). (D) RV fraction shortening (RVFS). (E) RV ejectiefractie (RVEF). (F) Tricuspid ringvormige vlak systolische excursie (TAPSE). (G) Rv/LV-oppervlakteverhouding. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *P < 0,01 vs. shamgroep, n = 6 per groep (twee onafhankelijke steekproef t-test). LV, linker ventrikel; RVI, rechterventrikelinfarct. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Rechterventrikel (RV) hemodynamiek 4 weken na de rechter coronaire ligatie. (A) Representatieve drukcurven werden verkregen met een drukkatheter. (B) Rechterventrikel systolische bloeddruk (RVSBP) en rechterventrikel einddiastolische druk (RVEDP). (C) De maximale en minimale stijgingssnelheid van de RV-druk (dp/dt max, dp/dt min). D) Rv-contractiliteit. (E) De exponentiële tijdconstante van RV-relaxatie (τ). *P < 0,01 vs. shamgroep, n = 6 per groep (twee onafhankelijke steekproef t-test). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. RVI, rechterventrikelinfarct; RVP, rechterventrikeldruk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische resultaten 4 weken na RVI. (A) Foto's van het hele representatieve hart uit de sham- en RVI-groep (rode cirkel geeft de infarctwand aan; schaalbalk = 3 mm). (B) Verhouding hartgewicht/lichaamsgewicht (HW/BW), P = 0,0536 tussen RVI en shamgroep. (C) HW/tibia lengteverhouding (HW/TL), P = 0,1682 tussen RVI en shamgroep. (D) Vertegenwoordig afbeeldingen van hematoxyline-eosine kleuring en Masson kleuring van hartsecties (schaalbalk = 3 mm). (E) Kwantitatieve resultaten van myocardiale fibrose. (F) Representatieve Masson-kleuringsfoto's met overlevingscardiomyocyten in het infarctgebied (de rechterfoto (schaalbalk = 100 μm) is een vergroting van het weefsel in het linkervak (schaalbalk = 1 mm). * P < 0,01 vs. schijngroep, n = 6 per groep (twee onafhankelijke monster t-test). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. RVI, rechterventrikelinfarct. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sicard en collega's uit Frankrijk rapporteerden voor het eerst een muismodel van RVI in 2019, dat het chirurgische proces beschreef en zich richtte op de interactie tussen LV en RV na RVI9. Tot op heden heeft echter geen enkele studie gemeld dat dit model voor verdere studies wordt gebruikt. Een meer gedetailleerde procedure zou nuttig zijn voor onderzoekers om het muismodel van RVI te gebruiken voor onderzoek. In tegenstelling tot het rapport van Sicard et al.9, hebben we stap voor stap informatie verstrekt voor modelgeneratie en strategie voor kwaliteitscontrole en de anatomische verdeling van RCA, RV-hemodynamiek en de overleving van cardiomyocyten in het infarctgebied verder geëvalueerd. Een recent rapport toonde aan dat cardiomyocyten in het infarctgebied een essentiële rol spelen bij myocardiale regeneratie23. De RV-functie bij patiënten met RVI zou binnen 3-12 maanden spontaan herstellen, zelfs zonder reperfusie16,24. Deze bevindingen suggereren dat het RVI-model van de muis zou helpen zoeken naar potentiële therapeutische doelen voor rechter hartfalen of hartregeneratie. Daarom is het noodzakelijk om het model te populariseren.
Vanwege de onzichtbaarheid van RCA en de variatie van RCA-distributie, zou het voor de junior operators moeilijk zijn om RVI-modellen met stabiele infarctgroottes te genereren. Om deze beperking te overwinnen, wordt aanbevolen het ligatieniveau en bereik te regelen en te zorgen voor voldoende verhoging van het ST-segment in II- of III-lood van ECG. De meest kritieke stap voor het succesvol genereren van een muis RVI-model is het lokaliseren van de anatomische structuur van RCA. Zoals weergegeven in figuur 1A, kan muis-RCA een primaire of meerdere parallelle slagaders bevatten; de grootte van het infarct hangt dus af van het aantal slagaders dat is geblokkeerd. Daarom kan intraoperatief de positie van de RCA worden bevestigd volgens de anatomische kenmerken van het naburige rechteratrium en de zichtbare ader. RVI-muizen vertonen meestal een hartinfarct in de vrije muur van RV. Toch kan het septum ook zelden betrokken zijn als de septumslagader afkomstig is van de RCA, zoals te zien is in figuur 4D. Het septum kan bij muizen worden geïrrigeerd door een eigen septale coronaire tak25 of een tak van RCA of LCA26,27. Na het legen van de RCA is de klassieke ECG-verandering van ST-segmentverhoging in EEG-leads II- of III-leads de gouden standaard om het succes van RVI te beoordelen.
Aangezien RV-verwijding geïnduceerd door RCA-ligatie de intrapericardiële druk zou verhogen en vervolgens de hartvulling zou beperken, wat zou resulteren in verergering van hemodynamischeaandoening 9,10, moet het pericardium tijdens de operatie uit elkaar worden gescheurd. In tegenstelling tot de hoge incidentie van hartruptuur bij muizen met LCA-ligatie, werd geen hartruptuur waargenomen bij de RVI-muizen. Chirurgische mortaliteit als gevolg van bloedingen en atrioventriculaire blok kan echter oplopen tot 50% voor beginners, wat kan worden vermeden door de piercingdiepte van naaldsteek en myocardiale bereik van hechtingsligatie te verminderen, de ligatiepositie te verlagen en zachte manipulatie. Ervaren technici in ons laboratorium kunnen de generatie van een RVI-muismodel in ongeveer 30 minuten voltooien met een slagingspercentage van 80% -90%, berekend door het overlevingspercentage van muizen met een aanzienlijke infarctgrootte. Het succes van de operatie werd beoordeeld aan de hand van onmiddellijke verhoging van het ST-segment in lood II of III van ecg na RCA-ligatie, TTC-negatieve kleuring van myocardium in de1e 24 uur na de operatie en RV-verwijding gemeten door echocardiografie op 3 dagen of 1 week na de operatie. ST-verhoging in ECG-leads van inferieure wand en echocardiografische dilatatie van RV 3 dagen na de operatie kunnen worden gebruikt als de inclusiecriteria voor studies met behulp van het RVI-model van de muis.
Tijdens de follow-upperiode van 4 weken werden nogal wat overlevende cardiomyocyten waargenomen in het infarctgebied van RVI-muizen, wat een redelijke basis kan zijn voor regeneratief onderzoek. RV-remodellering en disfunctieherstel na 4 weken werden niet opgemerkt na RVI in dit model, wat suggereert dat dit model ook haalbaar is voor fundamenteel onderzoek naar remodellering en falen van het rechterhart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82073851 to Sun) en de National China Postdoctoral Science Foundation (2021M690074 aan Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | For TTC staining |
| Animal Mini Ventilator | Havard | Type 845 | For artificial ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit | Polyscience Inc | 7349 | For vasculature casting |
| buprenorphine | Isoreag | 1134630-70-8 | For reduce the pain of mice after surgery |
| C57BL/6J mice + D29A1A2:D27 | Animal Center of South Medical University | - | For the generation of mouse RVI model |
| Camera | Sangnond | For taking photograph | |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light for operation |
| electrocardiograph | ADI Instrument | ADAS1000 | For recording electrocardiogram |
| hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove mouse hair |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Hematoxylin-eosin dye | Leagene | DH0003 | Hematoxylin-eosin staining |
| Heparin sodium salt | Macklin | H837056 | For heparization |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Lab made spatula | Work as a laryngoscope | ||
| Lab made tracheal cannula | For intubation | ||
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | For chest close |
| Microsurgical elbow tweezers | RWD life science | F11021-11 | For surgery |
| Microsurgical scissors | NAPOX | MB-54-1 | For arteriotomy |
| Millar Catheter | AD Instruments, Shanghai | 1.0F | Measurement of pressure gradient |
| MS400D ultrasonic probe | Visual Sonic | MS400D | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| needle forceps | Visual Sonic | F31006-12 | For surgery |
| nitroglycerin | BEIJING YIMIN MEDICINE Co | For dilating coronary artery | |
| Ophthalmic scissors | RWD life science | S11022-14 | For surgery |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System | AD Instruments, Shanghai | 4/35 | Pressure recording |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing scale |
| Silk suture (8-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 6-0 | coronary artery ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| tissue forceps | Visual Sonic | F-12007-10 | For surgery |
| tissue scissor | Visual Sonic | S13052-12 | Open chest for hemodynamic measurement |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | preparation for Echocardiography measurement |
| Vascular Clamps | Visual Sonic | R31005-06 | For blocking blood from aorta |
References
- Rallidis, L. S., Makavos, G., Nihoyannopoulos, P. Right ventricular involvement in coronary artery disease: role of echocardiography for diagnosis and prognosis. Journal of the American Society of Echocardiography: Official Publication of the American Society of Echocardiography. 27 (3), 223-229 (2014).
- Frangogiannis, N. G. Fibroblasts and the extracellular matrix in right ventricular disease. Cardiovascular Research. 113 (12), 1453-1464 (2017).
- Ondrus, T., et al. Right ventricular myocardial infarction: From pathophysiology to prognosis. Experimental & Clinical Cardiology. 18 (1), 27-30 (2013).
- Badagliacca, R., et al. Right ventricular concentric hypertrophy and clinical worsening in idiopathic pulmonary arterial hypertension. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (11), 1321-1329 (2016).
- Verhaert, D., et al. Right ventricular response to intensive medical therapy in advanced decompensated heart failure. Circulation: Heart Failure. 3 (3), 340-346 (2010).
- Chen, K., et al. RNA interactions in right ventricular dysfunction induced type II cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 13 (3), 4215-4241 (2021).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Harjola, V. P., et al. Contemporary management of acute right ventricular failure: A statement from the heart failure association and the working group on pulmonary circulation and right ventricular function of the European society of cardiology. European Journal of Heart Failure. 18 (3), 226-241 (2016).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: a novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Goldstein, J. A. Pathophysiology and management of right heart ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 40 (5), 841-853 (2002).
- Stiermaier, T., et al. Frequency and prognostic impact of right ventricular involvement in acute myocardial infarction. Heart. 0, 1-8 (2020).
- Zehender, M., et al. Right ventricular infarction as an independent predictor of prognosis after acute inferior myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 328 (14), 981-988 (1993).
- Brodie, B. R., et al. Comparison of late survival in patients with cardiogenic shock due to right ventricular infarction versus left ventricular pump failure following primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 99 (4), 431-435 (2007).
- Konstam, M. A., et al. Evaluation and management of right-sided heart failure: A scientific statement from the american heart association. Circulation. 137 (20), 578-622 (2018).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9830-9835 (2001).
- Dell'Italia, L. J., et al. Hemodynamically important right ventricular infarction: Follow-up evaluation of right ventricular systolic function at rest and during exercise with radionuclide ventriculography and respiratory gas exchange. Circulation. 75 (5), 996-1003 (1987).
- Friedberg, M. K., Redington, A. N. Right versus left ventricular failure: differences, similarities, and interactions. Circulation. 129 (9), 1033-1044 (2014).
- Haraldsen, P., Lindstedt, S., Metzsch, C., Algotsson, L., Ingemansson, R. A porcine model for acute ischaemic right ventricular dysfunction. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (1), 43-48 (2014).
- Ren, L., Colafella, K. M. M., Bovée, D. M., Uijl, E., Danser, A. H. J. Targeting angiotensinogen with RNA-based therapeutics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (2), 180-189 (2020).
- Hacker, T. A. Animal models and cardiac extracellular matrix research. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1098, 45-58 (2018).
- Chien, T. M., et al. Double right coronary artery and its clinical implications. Cardiology in the Young. 24 (1), 5-12 (2014).
- Zhu, Y., et al. Characterizing a long-term chronic heart failure model by transcriptomic alterations and monitoring of cardiac remodeling. Aging (Albany NY). 13 (10), 13585-13614 (2021).
- Cui, M., et al. Nrf1 promotes heart regeneration and repair by regulating proteostasis and redox balance. Nature Communications. 12 (1), 5270 (2021).
- Meyer, P., et al. Effects of right ventricular ejection fraction on outcomes in chronic systolic heart failure. Circulation. 121 (2), 252-258 (2010).
- Dunmore-Buyze, P. J., et al. Three-dimensional imaging of the mouse heart and vasculature using micro-CT and whole-body perfusion of iodine or phosphotungstic acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 9 (5), 383-390 (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2+ bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
