Summary
CUT&RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&RUN a singola cellula.
Abstract
Determinare le posizioni di legame di una proteina sulla cromatina è essenziale per comprenderne la funzione e i potenziali obiettivi regolatori. L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per determinare la localizzazione delle proteine per oltre 30 anni ed è definita dall'uso di un anticorpo per estrarre la proteina di interesse dalla cromatina sonicata o digerita enzimaticamente. Più recentemente, le tecniche di tethering degli anticorpi sono diventate popolari per valutare la localizzazione delle proteine sulla cromatina a causa della loro maggiore sensibilità. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) è il derivato genome-wide di Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utilizza la proteina A ricombinante legata alla nucleasi micrococcica (pA-MNasi) per identificare la regione costante IgG dell'anticorpo che prende di mira una proteina di interesse, consentendo così la scissione sito-specifica del DNA che fiancheggia la proteina di interesse. CUT&RUN può essere utilizzato per profilare le modificazioni istoniche, i fattori di trascrizione e altre proteine leganti la cromatina come i fattori di rimodellamento dei nucleosomi. È importante sottolineare che CUT&RUN può essere utilizzato per valutare la localizzazione di proteine associate a eucromatiche o eterocromatiche e modifiche istoniche. Per questi motivi, CUT&RUN è un metodo potente per determinare i profili di legame di una vasta gamma di proteine. Recentemente, CUT&RUN è stato ottimizzato per la profilazione del fattore di trascrizione in basse popolazioni di cellule e singole celle e il protocollo ottimizzato è stato definito CUT&RUN a bassissimo input (uliCUT&RUN). Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione del fattore a cella singola utilizzando uliCUT & RUN in un formato manuale a 96 pozzetti.
Introduction
Molte proteine nucleari funzionano interagendo con la cromatina per promuovere o prevenire attività modellate sul DNA. Per determinare la funzione di queste proteine che interagiscono con la cromatina, è importante identificare le posizioni genomiche in cui queste proteine sono legate. Dal suo sviluppo nel 1985, l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per identificare dove una proteina si lega alla cromatina 1,2. La tecnica ChIP tradizionale ha il seguente flusso di lavoro di base: le cellule vengono raccolte e reticolate (di solito con formaldeide), la cromatina viene tagliata (di solito con metodi di sonicazione aggressivi, che richiedono la reticolazione), la proteina di interesse è immunoprecipitata usando un anticorpo che prende di mira la proteina (o la proteina marcata) seguita da un anticorpo secondario (accoppiato ad agarosio o perline magnetiche), la reticolazione è invertita, proteine e RNA vengono digeriti per purificare il DNA e questo DNA arricchito con ChIP viene utilizzato come modello per l'analisi (utilizzando sonde radiomarcate 1,2, qPCR3, microarray 5,6 o sequenziamento4). Con l'avvento dei microarray e del sequenziamento profondo massicciamente parallelo, ChIP-chip 5,6 e ChIP-seq4 sono stati sviluppati più recentemente e consentono l'identificazione a livello di genoma della localizzazione delle proteine sulla cromatina. Il Crosslinking ChIP è stata una tecnica potente e affidabile sin dal suo avvento con importanti progressi nella risoluzione da parte di ChIP-exo7 e ChIP-nexus8. Parallelamente allo sviluppo di ChIP-seq, sono stati stabiliti protocolli nativi (non reticolanti) per ChIP (N-ChIP), che utilizzano la digestione della nucleasi (spesso utilizzando nucleasi micrococcica o MNasi) per frammentare la cromatina, al contrario della sonicazione eseguita nelle tradizionali tecniche ChIP di reticolazione9. Tuttavia, uno dei principali svantaggi delle tecnologie ChIP e N-ChIP è stato il requisito di un elevato numero di cellule a causa della bassa resa del DNA a seguito della manipolazione sperimentale. Pertanto, in anni più recenti, molti sforzi sono stati verso l'ottimizzazione delle tecnologie ChIP per l'input a bassa cella. Questi sforzi hanno portato allo sviluppo di molte potenti tecnologie basate su ChIP che variano nella loro applicabilità e requisiti di input 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, le tecnologie basate su ChIP-seq a singola cellula sono state carenti, specialmente per le proteine non istoniche.
Nel 2004 è stata sviluppata una tecnologia alternativa per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina denominata Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Queste tecniche a singolo locus utilizzano una fusione di MNase alla proteina di interesse (ChEC) o alla proteina A (ChIC) per il taglio diretto del DNA adiacente alla proteina di interesse. In anni più recenti, sia ChEC che ChIC sono stati ottimizzati per la profilazione proteica a livello di genoma sulla cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, rispettivamente)20,21. Mentre ChEC-seq è una tecnica potente per determinare la localizzazione dei fattori, richiede lo sviluppo di proteine di fusione MNasi per ciascun bersaglio, mentre ChIC e la sua variazione a livello di genoma, CUT & RUN, si basano su un anticorpo diretto verso la proteina di interesse (come con ChIP) e la proteina ricombinante A-MNasi, dove la proteina A può riconoscere la regione costante IgG dell'anticorpo. In alternativa, è stata sviluppata una proteina di fusione A/proteina G-MNasi (pA/G-MNasi) in grado di riconoscere una gamma più ampia di regioni di costante anticorpale22. CUT&RUN è diventato rapidamente un'alternativa popolare a ChIP-seq per determinare la localizzazione delle proteine su tutto il genoma della cromatina.
Nel 201923 è stato descritto l'input ultra-basso CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variante di CUT&RUN che consente l'uso di ingressi a cella bassa e singola. Qui viene descritta la metodologia per un'applicazione manuale a cella singola con formato a 96 pozzetti. È importante notare che dallo sviluppo di uliCUT&RUN, sono state sviluppate due alternative per la profilazione degli istoni, CUT&Tag e iACT-seq, fornendo una profilazione robusta e altamente parallela delle proteine istoniche 24,25. Inoltre, scCUT&Tag è stato ottimizzato per profilare più fattori in una singola cellula (multiCUT&Tag) e per l'applicazione a proteine non istoniche26. Insieme, CUT&RUN fornisce un'alternativa interessante al ChIP-seq a basso input in cui uliCUT&RUN può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare che abbia accesso a una selezionatrice cellulare e a un'apparecchiatura standard.
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Protocol
Dichiarazione etica: Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Office of Research Protections presso l'Università di Pittsburgh.
1. Preparare perline magnetiche
NOTA: eseguire prima dell'ordinamento delle celle e tenere premuto il ghiaccio fino all'uso.
- Pipettare 30 μL di microsfere paramagnetiche coniugate conA miscela di liquami di perline per reazione a un tubo di microfuga fresco da 1,5 mL e aggiungere 850 μL di Binding Buffer, pipettando delicatamente per mescolare.
NOTA: Le microsfere paramagnetiche coniugate conA sono perle magnetiche rivestite di lectina che consentono il legame della membrana lipidica. - Posizionare il tubo su un rack magnetico e lasciare magnetizzare le perline per 1-2 minuti. Una volta che il surnatante si è eliminato, rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Rimuovere il tubo dal rack magnetico e lavare le perline riesempendo in 1 mL di Binding Buffer.
- Ripetere i passaggi 1.2 e 1.3.
- Magnetizzare le perline per 2 minuti e rimuovere il surnatante da scartare.
- Rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospesciare le perline in 30 μL di Binding Buffer per reazione.
- Tenere la miscela di perline lavate sul ghiaccio fino a quando le cellule non sono ordinate.
2. Cellule di raccolta
NOTA: Questo passaggio è scritto per le cellule aderenti e ottimizzato per le cellule staminali embrionali murine E14. La coltivazione e la raccolta delle cellule dipendono dal tipo di cellula.
- Rimuovere le cellule dall'incubatore a 37 °C ed esaminarle al microscopio per garantire la qualità.
- Aspirare il fluido dalla piastra cellulare e risciacquare con 5 ml di 1x PBS.
- Aspirare PBS dalla piastra e raccogliere le cellule (utilizzando metodi tradizionali di raccolta delle cellule che differiranno per tipo di cellula). Ottenere la sospensione unicellulare pipettando delicatamente su e giù con una pipetta sierologica contro il piatto di coltura, se necessario.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e ruotare verso il basso a 200 x g per 5 minuti.
- Aspirare il fluido per scartare e lavare il pellet cellulare con 5 ml di PBS + 1% FBS.
- Abbassare le cellule a 200 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 5 ml di PBS + 1% FBS.
- Contare le cellule e trasferire 1 mL di 1 x 106 cellule in un tubo di microfuga fresco da 1,5 mL.
- Aggiungere 5 μL di 7-amino-actinomicina D (7-AAD), invertire bene il tubo per mescolare, quindi applicare il campione al selezionatore di cellule per ordinare singole cellule vive in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
NOTA: il colorante 7-AAD è escluso dalle cellule vive e pertanto può essere utilizzato nella selezione delle cellule vive.
3. Ordinamento e lisi delle cellule
- Preparare una piastra a 96 pozzetti compatibile con il selezionatore di celle con 100 μL di tampone di estrazione nucleare (NE) in ciascun pozzetto prima della selezione delle celle.
- Ordinare le celle in piastre a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore.
- Ruotare rapidamente la piastra (600 x g per 30 s) per assicurarsi che le cellule siano nel buffer all'interno dei pozzetti.
NOTA: Vale la pena verificare in un esperimento preliminare se le cellule utilizzate vengono portate in modo affidabile sul fondo dei pozzi. - Tenere i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.
- Girare i campioni a 600 x g per 5 minuti a 4 °C e pipettare con cura per rimuovere il surnatante (lasciando 5 μL).
- Risospesare ogni campione in 55 μL di tampone NE e aggiungere 30 μL delle microsfere paramagnetiche coniugate ConA prelavate (dal passo 1.7; in Binding Buffer) a ciascuna reazione.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Campioni pre-blocco per prevenire la digestione precoce da MNase
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che le perline si leghino per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 100 μL di buffer di blocco alle perle legate al nucleo e mescolare con un pipettaggio delicato.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Aggiunta di anticorpi primari
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 100 μL di wash buffer per reazione con un pipettaggio delicato.
- Riposizionare la piastra sul rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Risospendare le perline in 25 μL di wash buffer per reazione con un pipettaggio delicato.
- Fare un mix principale di anticorpi primari: 25 μL di wash buffer + 0,5 μL di anticorpo per reazione.
- Mentre si vorticano delicatamente le perle legate ai nuclei, aggiungere 25 μL del master mix di anticorpi primari a ciascun campione trattato con un anticorpo mirato alla proteina di interesse (in genere diluizione finale 1:100). Aggiungere 25 μL di wash buffer senza anticorpi, se si esegue un controllo.
- Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Posizionare i campioni su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Rimuovere la piastra dal rack magnetico e lavare le perline con 100 μL di wash buffer, rieseguendo mediante pipettaggio.
6. Aggiunta di pA-MNasi o pA/G-MNasi
NOTA: La proteina A ha un'alta affinità per le molecole IgG di alcune specie come i conigli, ma non è adatta per le IgG di altre specie come topi o ratti. In alternativa, è possibile utilizzare la proteina A / G-MNasi. Questo ibrido lega le IgG di coniglio, topo e ratto, evitando la necessità di anticorpi secondari quando vengono utilizzati anticorpi primari di topo o ratto.
- Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare ogni campione in 25 μL di wash buffer.
- Creare una miscela master pA-MNase (25 μL di Wash Buffer + quantità ottimizzata di pA-MNasi per reazione).
- Mentre si vortica delicatamente, aggiungere 25 μL della miscela master pA-MNasi a ciascun campione, compresi i campioni di controllo.
NOTA: La concentrazione di pA-MNasi varia con la preparazione, se fatta in casa, e deve essere testata prima dell'uso ad ogni purificazione indipendente. Per la pA/G-MNasi devono essere utilizzati 2,5 μL dello stock 20x. - Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Rimuovere la piastra dal rack magnetico e lavare le perline con 100 μL di wash buffer, rieseguendo con un delicato pipettaggio.
7. Digestione diretta del DNA
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Rimuovere i campioni dal rack magnetico e risospesciare le perline in 50 μL di wash buffer mediante un leggero pipettaggio.
- Equilibrare i campioni a 0 °C in una miscela ghiaccio/acqua per 5 minuti.
- Rimuovere i campioni dal bagno di ghiaccio/acqua a 0 °C e aggiungere 1 μL di CaCl2 da 100 mM utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare bene (3-5 volte) con un pipettaggio delicato utilizzando una pipetta multicanale di volume maggiore, quindi riportare i campioni a 0 °C.
NOTA: Mescolare bene qui è essenziale. CaCl2 viene aggiunto per attivare la digestione MNase del DNA che fiancheggia la proteina di interesse. - Avviare un timer di 10 minuti non appena la piastra è tornata nel bagno di ghiaccio / acqua.
- Arrestare la reazione pipettando 50 μL di 2XRSTOP+ Buffer in ciascun pozzetto, nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il CaCl2 .
NOTA: Fare 2XRSTOP + Buffer prima che la digestione di 10 minuti sia finita per prevenire la digestione eccessiva.
8. Frazionamento del campione
- Incubare i campioni per 20 minuti a 37 °C.
- Ruotare la piastra a 16.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti e trasferire i supernatanti in una piastra fresca da 96 pozzetti. Scartare le perline.
9. Estrazione del DNA
- Aggiungere 1 μL di 10% di sodio dodecil solfato (SDS) e 0,83 μL di 20 mg/mL di proteinasi K a ciascun campione.
ATTENZIONE: la polvere di SDS è dannosa se inalata. Gli utenti dovrebbero utilizzare in spazi ben ventilati indossando occhiali, guanti e un respiratore di grado N95, maneggiando con cura. - Mescolare i campioni mediante un delicato pipettaggio.
- Incubare i campioni per 10 minuti a 70 °C.
- Riportare la piastra a temperatura ambiente e aggiungere 46,6 μL di 5 M NaCl e 90 μL di 50% PEG 4000. Mescolare con un leggero pipettaggio.
- Aggiungere 33 μL di perle di polistirene-magnetite a ciascun campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Assicurarsi di portare le perle di polistirene-magnetite a temperatura ambiente (~ 30 min) e mescolare bene prima dell'uso. - Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che il surnatante si schiarisca per ~ 5 minuti, quindi scartare con cura il surnatante senza disturbare le perline.
- Risciacquare 2x con 150 μL di etanolo all'80% senza disturbare le perline.
ATTENZIONE: L'etanolo è altamente infiammabile e provoca irritazione della pelle, degli occhi e dei polmoni. Eseguire questo passaggio con abbigliamento da laboratorio appropriato e in un cappuccio ventilato. - Ruotare brevemente la piastra a 1000 x g per 30 s. Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere tutto l'EtOH residuo senza disturbare le perline.
- Asciugare all'aria i campioni per ~ 2-5 min.
NOTA: Non asciugare le perline per più di 5 minuti. Se diligente nel rimuovere l'EtOH, sono sufficienti 2-3 minuti di asciugatura. - Sospendere le perline con 37,5 μL di 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che le perline si leghino per 5 minuti.
- Trasferire 36,5 μL del surnatante in una piastra da 96 pozzetti compatibile con termociclatore fresco. Scartare le perline.
NOTA: l'esperimento può essere interrotto qui memorizzando i campioni a -20 °C o può continuare con la compilazione della libreria (passaggi 10-15).
10. Riparazione finale, fosforilazione, adenilazione
NOTA: i reagenti provengono da tale riferimento nella Tabella dei materiali. Il seguente protocollo segue un metodo simile al kit commerciale come il kit NEBNext Ultra DNA II.
- Diluire 5 U/μL di T4 DNA polimerasi 1:20 in 1x T4 DNA ligasi tampone.
- Preparare una miscela master end-repair/3'A: 2 μL di tampone 10x DNA ligasi T4, 2,5 μL di 10 mM dNTPs, 1,25 μL di 10 mM ATP, 3,13 μL di 40% PEG 4000, 0,63 μL di 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL di T4 DNA polimerasi diluita, 0,5 μL di 5U/μL Taq DNA polimerasi, con un volume totale di 13,5 μL per reazione.
NOTA: Assicurarsi di portare il 40% di PEG 4000 a temperatura ambiente prima del pipettaggio. - Aggiungere 13,5 μL di end-repair/3'A master mix a 36,5 μL di DNA.
- Mescolare la reazione con vortice rapido e quindi una rotazione rapida (500 x g per 10 s).
- Incubare utilizzando le seguenti condizioni di reazione in un termociclatore pre-raffreddato con coperchio riscaldato per temperature >20 °C. Utilizzare le condizioni di reazione: 12 °C per 15 min, 37 °C per 15 min, 72 °C per 20 min, tenere a 4 °C.
11. Legatura dell'adattatore
NOTA: Tenere i campioni su ghiaccio mentre si imposta la seguente reazione. Lasciare che il tampone ligasi arrivi a temperatura ambiente prima del pipettaggio. Diluire l'adattatore (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione di 10 mM Tris-HCl contenente 10 mM NaCl (pH 7,5). A causa della bassa resa, non pre-quantificare il DNA arricchito con CUT&RUN. Piuttosto, generare diluizioni 25 volte superiori dell'adattatore, utilizzando una concentrazione finale dell'adattatore di lavoro di 0,6 μM.
- Fare un mix principale di legatura: 55 μL di tampone ligasi (2x), 5 μL di T4 DNA ligasi e 5 μL di adattatore diluito, con un volume totale di 65 μL per reazione.
- Aggiungere 65 μL della miscela di legatura principale a 50 μL di DNA dal passaggio 10.5.
- Mescolare con vortice rapido, seguito da rotazione rapida (500 x g per 10 s).
- Incubare a 20 °C in un termociclatore (senza coperchio riscaldato) per 15 min.
NOTA: procedere immediatamente al passaggio seguente.
12. Digestione dell'UTENTE
- Aggiungere 3 μL di enzima USER a ciascun campione, vortice e spin (500 x g per 10 s).
- Incubare in termociclatore a 37 °C per 15 min (coperchio riscaldato impostato a 50 °C).
13. Pulizia del tallone di polistirene-magnetite a seguito di reazione di legatura
NOTA: Lasciare equilibrare le perle di polistirene-magnetite a temperatura ambiente (~30 min). Vortice per omogeneizzare la soluzione di perline prima dell'uso. Eseguire i seguenti passaggi a temperatura ambiente.
- Aggiungere 39 μL (0,33x) di soluzione di perline di polistirene-magnetite a ciascun pozzetto contenente DNA legato all'adattatore.
- Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire al DNA di legarsi alle perline.
- Posizionare i campioni su un rack magnetico a 96 pozzetti e incubare per 5 minuti fino a quando il surnatante non è chiaro.
- Tenere la piastra sul rack magnetico e rimuovere con cura e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Risciacquare le perline con 200 μL di EtOH all'80% senza disturbare le perline.
- Incubare per 30 s su un rack magnetico a 96 pozzetti per consentire alla soluzione di essere eliminata.
- Rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
- Ripetere i passaggi 13.5-13.7 per un totale di due lavaggi.
- Ruotare brevemente la piastra a 500 x g per 10 s, riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere l'EtOH residuo senza disturbare le perline.
- Tenere la piastra sul rack magnetico e asciugare all'aria i campioni per 2 minuti.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline. - Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 28,5 μL di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
ATTENZIONE: l'acido cloridrico è molto corrosivo. Gli utenti dovrebbero maneggiarlo con cura in un cappuccio di fumo chimico indossando occhiali, guanti e un camice da laboratorio. - Rivestire accuratamente le perline mediante pipettaggio, facendo attenzione a non produrre bolle.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che la soluzione si schiarisca per 5 minuti.
- Trasferire 27,5 μL di surnatante in una nuova piastra PCR ed eliminare le perline.
14. Arricchimento della biblioteca
NOTA: i primer vengono diluiti con la stessa soluzione dell'adattatore. Per questa compilazione della libreria, utilizzare una concentrazione finale di primer di lavoro di 0,6 μM.
- Aggiungere 5 μL di primer indicizzato diluito (vedere Tabella dei materiali) a ciascun campione.
NOTA: ogni campione necessita di un indice diverso da identificare dopo la sequenziazione. - Preparare una miscela master PCR: 10 μL di tampone PCR ad alta fedeltà 5x, 1,5 μL di 10 mM dNTPs, 5 μL di primer universale diluito, 1 μL di 1 U polimerasi ad alta fedeltà a avvio caldo, con un volume totale di miscela master di 17,5 μL per campione.
- Aggiungere 17,5 μL di miscela pcr a 32,5 μL di DNA legato all'adattatore purificato (5 μL di primer indicizzato sono inclusi in questo volume).
- Mescolare la soluzione mediante pipettaggio.
- Incubare in un termociclatore utilizzando le seguenti condizioni di reazione con una velocità di rampa massima di 3 °C/s: 98 °C per 45 s, 98 °C per 45 s, 60 °C per 10 s, ripetere il secondo e il terzo passaggio 21 volte, 72 °C per 1 min, tenere premuto a 4 °C.
NOTA: i campioni possono essere conservati a 4 °C per la conservazione a breve termine o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
15. Pulizia del tallone in polistirene-magnetite
- Aggiungere 60 μL (1,2x) di perline di polistirene-magnetite a ciascun campione.
- Risospesciare le perline mediante pipettaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico per 5 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
- Scartare il surnatante e risciacquare le perline con 200 μL di EtOH all'80% senza disturbare le perline.
- Ripetere la fase di lavaggio per un totale di due lavaggi EtOH all'80%.
- Ruotare la piastra a 500 x g per 10 s, posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che le perline si leghino per 5 minuti.
- Pipetta per rimuovere l'EtOH in eccesso senza disturbare le perline e lasciare asciugare le perline all'aria per 2 minuti.
NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline. - Sospendere le perline in 21 μL di acqua priva di nucleasi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca per 5 minuti.
- Trasferire 20 μL del surnatante in una nuova piastra.
NOTA: L'esperimento può essere interrotto qui conservando il campione a -20 °C. - Quantificare le concentrazioni della libreria con un fluorometro (vedere Tabella dei materiali), utilizzando un reagente HS 1x.
- Se la concentrazione lo consente, eseguire 30 ng di campione su gel di agarosio all'1,5% con una scala a basso peso molecolare da visualizzare. In alternativa, visualizzare su un analizzatore di frammenti o strumento correlato.
- Librerie di sequenze su una piattaforma Illumina per ottenere ~ 50.000-100.000 letture mappate in modo univoco.
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Representative Results
Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione della proteina monocellulare sulla cromatina utilizzando un formato manuale a 96 pozzetti uliCUT & RUN. Mentre i risultati varieranno in base alla proteina profilata (a causa dell'abbondanza di proteine e della qualità degli anticorpi), al tipo di cellula e ad altri fattori che contribuiscono, i risultati attesi per questa tecnica sono discussi qui. La qualità cellulare (aspetto cellulare e percentuale di cellule vitali) e lo smistamento di singole cellule devono essere valutati prima o al momento dello smistamento delle cellule vive nel tampone NE. Un esempio di colonie cellulari ES e di ordinamento cellulare è mostrato nella Figura 2A,B. In particolare, le cellule di bassa qualità non dovrebbero essere utilizzate e, se la qualità è un problema, è necessario prestare attenzione a seguire le linee guida per il tipo di cellula specifico. Inoltre, l'accurata selezione delle cellule da parte dello strumento di selezione cellulare dovrebbe essere valutata prima della sperimentazione. Ad esempio, le celle di prova potrebbero essere ordinate e colorate utilizzando la macchia hoechst 33342 e contate per garantire che 0 o 1 cella si trovi in ciascun pozzetto. Se non vengono trovate singole celle, le condizioni di ordinamento devono essere ottimizzate. Dopo la preparazione della libreria, i campioni possono essere valutati su un gel di agarosio (se la concentrazione consente un carico di 30 ng o più, poiché esiste un limite inferiore alla visualizzazione del DNA su un gel di agarosio) o su un analizzatore di frammenti (o dispositivo simile come una Tapestation o un bioanalyzer) prima del sequenziamento e i risultati dell'esempio sono mostrati nella Figura 2C, D. In particolare, la distribuzione dimensionale prevista va da ~150 a ~500 bp. In quantità cellulari più elevate, CUT&RUN eseguito su proteine di grandi dimensioni (come gli istoni) avrà una distribuzione dimensionale sul lato destro, dove la maggior parte del DNA sarà vista ~ 270 bp; tuttavia, questa spalla non è tipicamente osservata negli esperimenti a cellula singola.
Dopo il sequenziamento, la qualità delle letture di sequenziamento deve essere valutata utilizzando FASTQC. È necessario determinare la percentuale di letture di mapping univoche. In genere, negli esperimenti a cella singola si osservano letture di mappatura univoca dello 0,5%-10%. Queste percentuali di mappatura sono simili ad altre tecniche a singola cellula basate sul DNA30. Successivamente, la distribuzione dimensionale delle letture dopo la mappatura deve essere determinata per garantire che il profilo sia simile al pre-sequenziamento (con la sequenza dell'adattatore che non contribuisce più alle dimensioni di lettura).
Dopo aver valutato la qualità dei dati, l'occupazione delle proteine può essere visualizzata utilizzando vari metodi: le immagini del browser del genoma del singolo locus possono essere visualizzate utilizzando il browser del genoma UCSC o IGV (Figura 3A) e i modelli di occupazione a livello di genoma su specifiche coordinate genomiche possono essere visualizzati utilizzando metatrame (Figura 3B, in basso), mappe di calore (Figura 3B, in alto) o mappe di calore 1D (Figura 3C). Per ulteriori informazioni sull'analisi dei dati, fare riferimento allo studio di Patty e Hainer27. I dati a singola cellula da una cellula diploide si tradurranno in un massimo di quattro letture che contribuiscono a ciascun locus (quattro letture se la cellula era in mitosi), ma più spesso una o due letture. Pertanto, i dati sono binari e uno sfondo elevato può essere più facilmente scambiato per occupazione, rispetto agli esperimenti a celle elevate. Pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento parallelo CUT&RUN su un numero elevato di cellule (da 5.000 a 100.000 cellule), se possibile, per acquisire tutte le possibili posizioni di legame per la proteina di interesse. Quindi, i dati a cella singola possono essere confrontati con possibili posizioni di associazione. Negli esempi mostrati nella Figura 3, i risultati uliCUT&RUN CTCF a cella singola vengono confrontati con uliCUT&RUN CTCF ad alta cellula (Figura 3A) o ChIP-seq (Figura 3B,C). Come dimostrato in precedenza, i picchi uliCUT&RUN a cella singola CTCF, SOX2 e NANOG rappresentavano in gran parte picchi più forti da set di dati ChIP-seq ad alta cellula23.
Figura 1: Schema del protocollo uliCUT&RUN. Le cellule vengono raccolte e selezionate in una piastra a 96 pozzetti contenente tampone NE. I singoli nuclei sono quindi legati a microsfere paramagnetiche coniugate con ConA e sequenzialmente vengono aggiunti un anticorpo (mirato alla proteina di interesse) e pA-MNasi o pA/G-MNasi. Il DNA adiacente alle proteine viene scisso tramite MNasi e il DNA viene quindi purificato per l'uso nella preparazione della libreria. Questa figura è stata creata con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di risultati dello smistamento cellulare e del controllo di qualità delle librerie uliCUT&RUN. (A) Immagine di cellule staminali embrionali murine (ES) di alta qualità. Barra della scala: 200 μm. (B) Uscita dallo smistamento a cella singola dopo l'aggiunta di 7AAD alle celle ES raccolte e lo smistamento su uno strumento FACS. (C) Gel di agarosio macchiato di bromuro di etidio raffigurante librerie uliCUT&RUN completate. La corsia 1 è una scala a basso peso molecolare e le corsie 2-21 sono esempi di librerie uliCUT&RUN a singola cellula di successo prima del sequenziamento. (D) Gel di agarosio colorato con bromuro di etidio raffigurante librerie uliCUT&RUN complete sub-ottimali e ottimali. La corsia 1 è una scala a basso peso molecolare, la corsia 2 è una libreria sub-ottimale a causa dell'inefficiente digestione della MNase e la corsia 3 è una libreria di successo con una digestione appropriata. (E) Distribuzione dell'analizzatore di frammenti di una singola libreria uliCUT&RUN a cella prima del sequenziamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di risultati attesi per i dati uliCUT&RUN a cella ES singola. (A) Traccia del browser di alto numero di cellule (5.000 cellule) CTCF o controllo negativo (nessun anticorpo, no Ab) uliCUT & RUN (prime due tracce) e CTCF a cella singola uliCUT & RUN. L'immagine è riprodotta, con il permesso, da Patty e Hainer27. (B) Mappe di calore (in alto) e metatrame (in basso) di CTCF a cella singola o controllo negativo (No Ab) uliCUT&RUN su siti ChIP-seq CTCF precedentemente pubblicati (GSE11724). L'immagine è riprodotta, con il permesso, da Hainer et al.23. (C) Mappe di calore 1D di CTCF a cella singola o controllo negativo (No Ab) uliCUT&RUN su siti ChIP-seq CTCF precedentemente pubblicati (GSE11724). L'immagine è riprodotta, con il permesso, da Hainer et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizione dei vari buffer utilizzati in questo protocollo. Il volume di soluzione madre richiesta è elencato con la concentrazione finale scritta tra parentesi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
CUT&RUN è un protocollo efficace per determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina. Ha molti vantaggi rispetto ad altri protocolli, tra cui: 1) elevato rapporto segnale-rumore, 2) protocollo rapido e 3) bassa copertura di lettura di sequenziamento richiesta, portando così a risparmi sui costi. L'uso della proteina A- o proteina A/G-MNasi consente di applicare CUT&RUN con qualsiasi anticorpo disponibile; pertanto, ha il potenziale per profilare rapidamente e facilmente molte proteine. Tuttavia, l'adattamento alla singola cellula per qualsiasi profilo proteico sulla cromatina è stato difficile, specialmente se confrontato con la trascrittomica a singola cellula (cioè scRNA-seq), a causa del basso numero di copie di DNA rispetto all'RNA (da due a quattro copie di DNA rispetto a possibili migliaia di copie di RNA).
Nel protocollo sopra descritto, dovrebbero essere considerati diversi passaggi critici. In primo luogo, l'ordinamento appropriato delle cellule dipende dal tipo di cellula (o tessuto) e si dovrebbe prestare attenzione per una cernita accurata. Si raccomanda di testare l'efficacia dello smistamento a cella singola con lo strumento prima di qualsiasi esperimento. In secondo luogo, la scelta efficace degli anticorpi è essenziale. Prima di procedere a un'applicazione a singola cellula, si consiglia di testare l'anticorpo in un esperimento ad alto numero di cellule (così come altri test anticorpali standard, come la conferma della specificità usando western blot dopo il knockdown, la titolazione dell'anticorpo negli esperimenti CUT&RUN, ecc.). In terzo luogo, utilizzare un controllo negativo, come IgG o nessun anticorpo primario, perché un confronto appropriato con i campioni sperimentali è essenziale per l'interpretazione della qualità dei dati e dei risultati biologici. Quando si confrontano i risultati sperimentali di una singola cellula con un set di dati ad alto numero di cellule, gli esperimenti a singola cellula di controllo negativo dovrebbero avere una minore copertura di lettura su quei siti di legame identificati nell'esperimento ad alta cellula e piuttosto avere una distribuzione casuale di letture attraverso il genoma (con un pregiudizio per le regioni aperte della cromatina). In quarto luogo, è necessario prestare attenzione quando si aggiunge e si attiva la proteina A o la proteina A / G-MNasi in modo da non digerire eccessivamente la cromatina: non surriscaldare i campioni con le mani, mantenere i campioni a una temperatura di ghiaccio / bagno d'acqua (0 ° C) e chelare la reazione al momento opportuno. In quinto luogo, si dovrebbe prestare attenzione durante l'esperimento uliCUT & RUN e la preparazione della libreria, a causa del basso materiale. Ad esempio, l'incubazione prolungata sul rack magnetico durante il legame delle perline per garantire che il surnatante si sia schiarito e fare attenzione a non disturbare le perline durante la rimozione del surnatante sono essenziali per una resa sufficiente. Sesto, a seconda delle domande affrontate, il numero di esperimenti a cellula singola eseguiti è una considerazione importante. Alcuni degli esperimenti a singola cellula falliranno (come con tutti gli esperimenti a basso input) e, pertanto, il numero di risultati sperimentali positivi richiesti per un'interpretazione appropriata dovrebbe essere considerato prima di iniziare l'esperimento. Il numero di cellule da includere nell'esperimento dipende dalla quantità di dati sperimentali richiesti dallo sperimentatore e dalla qualità dell'anticorpo. Infine, si noti che risultati equivalenti potrebbero essere raggiunti con volumi ridotti di molti aspetti di questo protocollo. Le fasi in cui il volume è stato ridotto del 50% includono il volume del tampone NE, del tampone di lavaggio, della miscela di anticorpi primari (inclusa la quantità di anticorpo primario), della miscela pA-MNasi (inclusa la quantità di pA-MNasi) e tutte le fasi della preparazione della libreria.
Sulla base della natura complicata della profilazione fattoriale sulla cromatina, ci sono molte potenziali fonti di problemi e luoghi in cui potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi. Mentre ci possono essere molti passaggi in cui possono sorgere problemi, sono stati osservati tre problemi principali: 1) bassa resa del DNA per l'input nella costruzione della libreria; 2) alto segnale di fondo in campioni sperimentali e 3) bassa resa dopo la costruzione della libreria. Se il DNA non è sufficiente per la preparazione e il sequenziamento della libreria (punto 1), si noti il seguente consiglio per la risoluzione dei problemi: a) potrebbe esserci stata una lisi di membrana incompleta e quindi il tempo di lisi con tampone NE può essere aumentato; b) potrebbe esserci stato un legame inefficiente del nucleo alle microsfere paramagnetiche coniugate con ConA e ciò potrebbe essere risolto mediante un'appropriata miscelazione con l'aggiunta di queste perle; c) potrebbe essere stato aggiunto troppo poco anticorpo, e quindi si raccomanda di eseguire una titolazione di anticorpi per identificare la quantità più efficace; d) i tempi di incubazione con l'anticorpo primario o la proteina A- o la proteina A/G-MNasi sono troppo brevi (cioè non abbastanza tempo per consentire il legame) o troppo lunghi (si tratta di campioni nativi non incrociati) e potrebbero essere ottimizzati; e) l'interazione della proteina bersaglio con la cromatina potrebbe essere troppo transitoria per essere catturata in condizioni native e quindi potrebbe essere eseguita la reticolazione CUT&RUN28. Mentre i set di dati a cella singola produrranno uno sfondo elevato, potrebbe esserci uno sfondo eccessivamente alto in cui il segnale è difficile da interpretare dallo sfondo (punto 2). Per questo problema, si noti il seguente consiglio: a) la fase di blocco con EDTA per prevenire la digestione preventiva della MNase potrebbe essere aumentata o ottimizzata; b) se c'è un taglio eccessivo, potrebbe essere dovuto all'avere troppa proteina A- o proteina A/G-MNasi, e quindi può essere eseguita una titolazione di quantità appropriate; c) la digestione eccessiva da parte della MNasi potrebbe causare un elevato background, e pertanto dovrebbe essere valutata l'appropriata miscelazione di cloruro di calcio dopo l'aggiunta e l'ottimizzazione per il tempo di digestione della MNase. Infine, il DNA efficiente arricchito con uliCUT&RUN potrebbe essere stato recuperato, ma potrebbe essere stata recuperata una bassa quantità di libreria (punto 3). Per questo problema, si raccomanda quanto segue: a) manipolazione e utilizzo appropriati di perle di polistirene-magnetite per assicurare la corretta purificazione e nessuna perdita di DNA; in particolare, si consiglia di avere incubazioni di 15 minuti e un minimo di 5 minuti per magnetizzare le perline per prevenire la perdita; b) la sotto-amplificazione della libreria nella fase pcr comporterebbe una bassa resa e quindi i cicli appropriati dovrebbero essere determinati utilizzando qPCR (come precedentemente stabilito per le librerie ATAC-seq29).
Come per tutte le tecnologie, ci sono limitazioni a uliCUT&RUN che dovrebbero essere considerate prima di iniziare qualsiasi sperimentazione. In primo luogo, questi esperimenti sono progettati e ottimizzati per le condizioni native, e quindi se una proteina interagisce solo transitoriamente con la cromatina, potrebbe essere necessario un approccio di reticolazione per garantire il recupero dell'interazione. In secondo luogo, come con tutte le tecniche basate su anticorpi, la qualità dell'anticorpo è importante. Bisogna fare attenzione a garantire la qualità e la consistenza dell'anticorpo prima di intraprendere qualsiasi esperimento. In terzo luogo, può verificarsi un taglio di fondo MNase e, mentre c'è un segnale di fondo costantemente inferiore in CUT & RUN rispetto ad altri esperimenti, il segnale di fondo può essere elevato negli esperimenti a cella singola e quindi dovrebbero essere eseguiti controlli e analisi appropriati. Mentre la natura binaria dei dati di profilazione a singola cellula limita la visualizzazione, possono essere eseguite tecnologie genomiche computazionali più avanzate, come la riduzione dimensionale e altre (come descritto in precedenza27). Infine, mentre la profilazione a cella singola è stata estesa qui al formato a 96 pozzi, questo è un throughput basso rispetto ad altre tecnologie a cella singola che utilizzano 10xGenomics o altri formati.
Le tecnologie di profilazione basate su tethering come ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 e uliCUT&RUN23, possono determinare la localizzazione dei fattori sulla cromatina con una tempistica sperimentale più veloce, uno sfondo inferiore e un costo inferiore rispetto alle tecnologie di profilazione tradizionali, come ChIP-seq. Pertanto, queste sono tecnologie molto interessanti per l'applicazione a campioni preziosi come campioni di pazienti o campioni di sviluppo precoce. Inoltre, l'applicazione a singole cellule può fornire studi complementari eseguiti utilizzando altri esperimenti a singola cellula come scRNA-seq e scATAC-seq30. Come descritto utilizzando queste tecnologie a cella singola più ampiamente utilizzate, è possibile ottenere nuove intuizioni relative agli esperimenti sulle cellule di massa. Si prevede che il profilo proteico monocellulare sulla cromatina diventerà più regolarmente utilizzato man mano che le tecnologie continuano a migliorare e consentono una maggiore parallelizzazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi sono interessi concorrenti relativi a questo progetto.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri dell'Hainer Lab per aver letto e commentato una versione precedente di questo manoscritto. Questo progetto ha utilizzato il NextSeq500 disponibile presso l'Università di Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh per il sequenziamento con un ringraziamento speciale al suo direttore, William MacDonald. Questa ricerca è stata supportata in parte dal Center for Research Computing dell'Università di Pittsburgh attraverso le risorse informatiche fornite. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (a S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
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