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Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63536
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

CUT&RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&RUN unicellulaire.

Abstract

Déterminer les emplacements de liaison d’une protéine sur la chromatine est essentiel pour comprendre sa fonction et ses cibles régulatrices potentielles. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est la référence en matière de détermination de la localisation des protéines depuis plus de 30 ans et se définit par l’utilisation d’un anticorps pour extraire la protéine d’intérêt de la chromatine sonique ou digérée par voie enzymatique. Plus récemment, les techniques d’attache d’anticorps sont devenues populaires pour évaluer la localisation des protéines sur la chromatine en raison de leur sensibilité accrue. Le clivage sous cibles et libération sous nucléase (CUT&RUN) est le dérivé à l’échelle du génome de l’immunocléavage de la chromatine (ChIC) et utilise la protéine A recombinante attachée à la nucléase micrococcique (pA-MNase) pour identifier la région constante IgG de l’anticorps ciblant une protéine d’intérêt, permettant ainsi un clivage spécifique au site de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt. CUT&RUN peut être utilisé pour profiler les modifications des histones, les facteurs de transcription et d’autres protéines de liaison à la chromatine telles que les facteurs de remodelage des nucléosomes. Il est important de noter que CUT&RUN peut être utilisé pour évaluer la localisation des protéines associées à l’euchromatique ou à l’hétérochromatique et les modifications des histones. Pour ces raisons, CUT&RUN est une méthode puissante pour déterminer les profils de liaison d’une large gamme de protéines. Récemment, CUT&RUN a été optimisé pour le profilage des facteurs de transcription dans de faibles populations de cellules et de cellules individuelles et le protocole optimisé a été appelé CUT&RUN à entrée ultra-faible (uliCUT&RUN). Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de facteur unicellulaire à l’aide d’uliCUT&RUN dans un format manuel de 96 puits.

Introduction

De nombreuses protéines nucléaires fonctionnent en interagissant avec la chromatine pour promouvoir ou prévenir les activités modélisées par l’ADN. Pour déterminer la fonction de ces protéines interagissant avec la chromatine, il est important d’identifier les emplacements génomiques auxquels ces protéines sont liées. Depuis son développement en 1985, l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été l’étalon-or pour identifier où une protéine se lie à la chromatine 1,2. La technique ChIP traditionnelle a le flux de travail de base suivant: les cellules sont récoltées et réticulées (généralement avec du formaldéhyde), la chromatine est cisaillée (généralement avec des méthodes de sonication sévères, nécessitant une réticulation), la protéine d’intérêt est immunoprécipitée à l’aide d’un anticorps qui cible la protéine (ou protéine marquée) suivie d’un anticorps secondaire (couplé à l’agarose ou aux billes magnétiques), la réticulation est inversée, les protéines et l’ARN sont digérés pour purifier l’ADN, et cet ADN enrichi en ChIP est utilisé comme modèle d’analyse (à l’aide de sondes radiomarquées 1,2, qPCR3, microréseaux 5,6 ou séquençage4). Avec l’avènement des microréseaux et du séquençage profond massivement parallèle, ChIP-chip 5,6 et ChIP-seq4 ont été développés plus récemment et permettent l’identification à l’échelle du génome de la localisation des protéines sur la chromatine. La réticulation ChIP est une technique puissante et fiable depuis son avènement avec des avancées majeures en résolution par ChIP-exo7 et ChIP-nexus8. Parallèlement au développement de ChIP-seq, des protocoles natifs (non réticulants) pour ChIP (N-ChIP) ont été établis, qui utilisent la digestion nucléase (souvent à l’aide de nucléase micrococcique ou MNase) pour fragmenter la chromatine, par opposition à la sonication effectuée dans les techniques ChIP traditionnelles de réticulation9. Cependant, l’un des principaux inconvénients des technologies chIP et N-ChIP de réticulation a été l’exigence d’un nombre élevé de cellules en raison du faible rendement en ADN à la suite de la manipulation expérimentale. Par conséquent, au cours des dernières années, de nombreux efforts ont été déployés pour optimiser les technologies ChIP pour un faible apport cellulaire. Ces efforts ont abouti au développement de nombreuses technologies puissantes basées sur le ChIP dont l’applicabilité et les besoins en intrantsvarient 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Cependant, les technologies à base de ChIP-seq unicellulaire ont fait défaut, en particulier pour les protéines non histones.

En 2004, une technologie de rechange a été mise au point pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine appelée clivage endogène de la chromatine (ChEC) et immunocléavage de la chromatine (ChIC)19. Ces techniques à locus unique utilisent une fusion de la MNase à la protéine d’intérêt (ChEC) ou à la protéine A (ChIC) pour la coupe directe de l’ADN adjacente à la protéine d’intérêt. Au cours des dernières années, ChEC et ChIC ont été optimisés pour le profilage protéique à l’échelle du génome sur la chromatine (ChEC-seq et CUT&RUN, respectivement)20,21. Bien que ChEC-seq soit une technique puissante pour déterminer la localisation des facteurs, elle nécessite le développement de protéines de fusion MNase pour chaque cible, tandis que ChIC et sa variation à l’échelle du génome, CUT&RUN, reposent sur un anticorps dirigé vers la protéine d’intérêt (comme avec ChIP) et la protéine A-MNase recombinante, où la protéine A peut reconnaître la région constante IgG de l’anticorps. Comme alternative, une protéine de fusion A / protéine G-MNase (pA / G-MNase) a été développée qui peut reconnaître une gamme plus large de régions constantes d’anticorps22. CUT&RUN est rapidement devenu une alternative populaire au ChIP-seq pour déterminer la localisation des protéines sur l’ensemble du génome de la chromatine.

Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), une variante de CUT&RUN qui permet l’utilisation d’entrées low et single-cell, a été décrite en 201923. Ici, la méthodologie pour une application manuelle à cellule unique au format 96 puits est décrite. Il est important de noter que depuis le développement d’uliCUT&RUN, deux alternatives pour le profilage des histones, CUT&Tag et iACT-seq ont été développées, fournissant un profilage robuste et hautement parallèle des protéines d’histones24,25. De plus, scCUT&Tag a été optimisé pour le profilage de plusieurs facteurs dans une seule cellule (multiCUT&Tag) et pour une application aux protéines non histones26. Ensemble, CUT&RUN offre une alternative attrayante au ChIP-seq à faible entrée où uliCUT&RUN peut être effectué dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire ayant accès à un trieur de cellules et à un équipement standard.

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Protocol

Déclaration d’éthique : Toutes les études ont été approuvées par l’Institutional Biosafety Office of Research Protections de l’Université de Pittsburgh.

1. Préparez des perles magnétiques

REMARQUE: Effectuer avant le tri cellulaire et maintenir sur la glace jusqu’à l’utilisation.

  1. Pipette 30 μL de microsphères paramagnétiques conjuguées ConA mélange de boue de billes par réaction à un tube de microfuge frais de 1,5 mL et ajouter 850 μL de tampon de liaison, pipetage doucement pour mélanger.
    REMARQUE: Les microsphères paramagnétiques conjuguées ConA sont des billes magnétiques recouvertes de lectine qui permettent la liaison de la membrane lipidique.
  2. Placez le tube sur une grille magnétique et laissez les perles magnétiser pendant 1-2 min. Une fois que le surnageant s’est dissipé, retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
  3. Retirez le tube de la grille magnétique et lavez les billes en les remettant en suspension dans 1 mL de tampon de liaison.
  4. Répétez les étapes 1.2 et 1.3.
  5. Magnétiser les perles pendant 2 min et retirer le surnageant pour le jeter.
  6. Retirez le tube du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 30 μL de tampon de liaison par réaction.
  7. Maintenez le mélange de billes lavées sur de la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées.

2. Récolter des cellules

REMARQUE: Cette étape est écrite pour les cellules adhérentes et optimisée pour les cellules souches embryonnaires murines E14. La culture et la récolte des cellules dépendent du type de cellule.

  1. Retirez les cellules de l’incubateur à 37 °C et examinez-les au microscope pour en assurer la qualité.
  2. Aspirer le milieu de la plaque cellulaire et rincer avec 5 mL de 1x PBS.
  3. Aspirez le PBS de la plaque et récoltez les cellules (en utilisant des méthodes traditionnelles de récolte cellulaire qui diffèrent selon le type de cellule). Obtenir une suspension unicellulaire en piquant doucement de haut en bas avec une pipette sérologique contre la boîte de culture, si nécessaire.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et tourner vers le bas à 200 x g pendant 5 min.
  5. Aspirer le support pour jeter et laver la pastille de cellule avec 5 mL de PBS + 1% FBS.
  6. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de PBS + 1% FBS.
  7. Compter les cellules et transférer 1 mL de 1 x 106 cellules dans un tube de microfuge frais de 1,5 mL.
  8. Ajouter 5 μL de 7-amino-actinomycine D (7-AAD), bien inverser le tube pour mélanger, puis appliquer l’échantillon au trieur de cellules pour trier les cellules individuelles dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.
    REMARQUE: Le colorant 7-AAD est exclu des cellules vivantes et peut donc être utilisé dans le tri des cellules vivantes.

3. Tri et lyse des cellules

  1. Préparez une plaque de 96 puits compatible avec le trieur de cellules avec 100 μL de tampon d’extraction nucléaire (NE) dans chaque puits avant le tri des cellules.
  2. Triez les cellules en plaques de 96 puits en suivant les instructions du fabricant.
  3. Faites tourner rapidement la plaque (600 x g pendant 30 s) pour vous assurer que les cellules sont dans le tampon à l’intérieur des puits.
    REMARQUE: Il vaut la peine de tester dans une expérience préliminaire si les cellules utilisées sont amenées de manière fiable au fond des puits.
  4. Maintenez les échantillons sur la glace pendant 15 min.
  5. Faire tourner les échantillons à 600 x g pendant 5 min à 4 °C et pipeter soigneusement pour retirer le surnageant (en laissant derrière lui 5 μL).
  6. Remettre en suspension chaque échantillon dans 55 μL de tampon NE et ajouter 30 μL des microsphères paramagnétiques conjuguées ConA prélavées (à partir de l’étape 1.7; dans Le tampon de liaison) à chaque réaction.
  7. Incuber à température ambiante pendant 10 min.

4. Pré-bloquer les échantillons pour empêcher la digestion précoce par MNase

  1. Placez la plaque sur une grille magnétique à 96 puits, laissez les perles se lier pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
  2. Ajouter 100 μL de tampon bloquant aux billes liées au noyau et mélanger avec un pipetage doux.
  3. Incuber pendant 5 min à température ambiante.

5. Ajout d’anticorps primaires

  1. Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  2. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 100 μL de tampon de lavage par réaction avec un pipetage doux.
  3. Replacez la plaque sur le rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager, puis retirez et jetez le surnageant.
  4. Remettre en suspension les billes dans 25 μL de tampon de lavage par réaction avec pipetage doux.
  5. Faire un mélange maître d’anticorps primaires : 25 μL de tampon de lavage + 0,5 μL d’anticorps par réaction.
  6. Tout en tourbillonnant doucement les billes liées aux noyaux, ajoutez 25 μL du mélange maître d’anticorps primaires à chaque échantillon traité avec un anticorps ciblant la protéine d’intérêt (généralement une dilution finale de 1:100). Ajouter 25 μL de tampon de lavage sans anticorps, si vous effectuez un contrôle.
  7. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
  8. Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  9. Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage.

6. Ajout de pA-MNase ou de pA/G-MNase

REMARQUE: La protéine A a une forte affinité pour les molécules d’IgG de certaines espèces telles que les lapins, mais ne convient pas aux IgG d’autres espèces telles que les souris ou les rats. Alternativement, la protéine A / G-MNase peut être utilisée. Cet hybride lie les IgG du lapin, de la souris et du rat, évitant ainsi le besoin d’anticorps secondaires lorsque des anticorps primaires de souris ou de rat sont utilisés.

  1. Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  2. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension chaque échantillon dans 25 μL de tampon de lavage.
  3. Faire un mélange maître pA-MNase (25 μL de tampon de lavage + quantité optimisée de pA-MNase par réaction).
  4. Tout en tourbillonnant doucement, ajoutez 25 μL du mélange maître pA-MNase à chaque échantillon, y compris les échantillons témoins.
    REMARQUE: La concentration de pA-MNase varie selon la préparation, si elle est faite maison, et doit être testée avant utilisation à chaque purification indépendante. Pour la pA/G-MNase, il faut utiliser 2,5 μL du stock 20x.
  5. Incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante.
  6. Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  7. Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage doux.

7. Digestion dirigée de l’ADN

  1. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
  2. Retirez les échantillons de la grille magnétique et remettez en suspension les billes dans 50 μL de tampon de lavage par pipetage doux.
  3. Équilibrer les échantillons à 0 °C dans un mélange glace/eau pendant 5 min.
  4. Retirer les échantillons du bain-marie glace/eau à 0 °C et ajouter 1 μL de CaCl2 de 100 mM à l’aide d’une pipette multicanal. Bien mélanger (3-5 fois) avec un pipetage doux à l’aide d’une pipette multicanal de plus grand volume, puis ramener les échantillons à 0 °C.
    REMARQUE: Bien mélanger ici est essentiel. CaCl2 est ajouté pour activer la digestion MNase de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt.
  5. Démarrez une minuterie de 10 minutes dès que la plaque est de retour dans le bain de glace / eau.
  6. Arrêtez la réaction en pipetant 50 μL de tampon 2XRSTOP+ dans chaque puits, dans le même ordre que le CaCl2 a été ajouté.
    REMARQUE: Faites un tampon 2XRSTOP + avant la fin de la digestion de 10 minutes pour éviter une digestion excessive.

8. Fractionnement de l’échantillon

  1. Incuber les échantillons pendant 20 min à 37 °C.
  2. Faire tourner la plaque à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  3. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes et transférez les surnageants sur une plaque fraîche de 96 puits. Jetez les perles.

9. Extraction de l’ADN

  1. Ajouter 1 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 0,83 μL de protéinase K à 20 mg/mL à chaque échantillon.
    ATTENTION : La poudre de FDS est nocive en cas d’inhalation. Les utilisateurs doivent utiliser dans des espaces bien ventilés en portant des lunettes, des gants et un respirateur de qualité N95, à manipuler avec soin.
  2. Mélanger les échantillons par pipetage doux.
  3. Incuber les échantillons pendant 10 min à 70 °C.
  4. Remettre la plaque à température ambiante et ajouter 46,6 μL de 5 M NaCl et 90 μL de PEG 4000 à 50 %. Mélanger par pipetage doux.
  5. Ajouter 33 μL de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE: Assurez-vous d’apporter les billes de polystyrène-magnétite à température ambiante (~ 30 min) et mélangez bien avant de les utiliser.
  6. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez le surnageant dégager pendant environ 5 minutes, puis jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
  7. Rincer 2x avec 150 μL d’éthanol à 80% sans déranger les billes.
    ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et provoque une irritation de la peau, des yeux et des poumons. Effectuez cette étape avec des vêtements de laboratoire appropriés et dans une capuche ventilée.
  8. Faire tourner brièvement la plaque à 1000 x g pendant 30 s. Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et retirez tout etOH résiduel sans perturber les perles.
  9. Séchez les échantillons à l’air libre pendant environ 2 à 5 minutes.
    REMARQUE: Ne séchez pas les perles pendant plus de 5 minutes. Si vous êtes diligent à enlever l’EtOH, 2-3 min de séchage est suffisant.
  10. Remettre en suspension les billes avec 37,5 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  11. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez les perles se lier pendant 5 min.
  12. Transférer 36,5 μL du surnageant vers une plaque de 96 puits compatible avec le thermocycleur frais. Jetez les perles.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant des échantillons à -20 ° C ou peut continuer avec la construction de la bibliothèque (étapes 10-15).

10. Réparation finale, phosphorylation, adénylation

REMARQUE : Les réactifs proviennent de la liste des matériaux, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Le protocole ci-dessous suit une méthode similaire au kit commercial tel que le kit NEBNext Ultra DNA II.

  1. Diluer 5 U/μL d’ADN polymérase T4 1:20 dans 1x tampon d’ADN ligase T4.
  2. Préparer un mélange maître de réparation finale/3'A : 2 μL de 10x tampon d’ADN ligase T4, 2,5 μL de 10 mM dNTP, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40 % PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL d’ADN polymérase T4 diluée, 0,5 μL de 5U/μL d’ADN polymérase Taq, avec un volume total de 13,5 μL par réaction.
    REMARQUE: Assurez-vous d’apporter 40% PEG 4000 à la température ambiante avant le pipetage.
  3. Ajouter 13,5 μL de mélange maître de réparation finale/3'A à 36,5 μL d’ADN.
  4. Mélanger la réaction par vortex rapide, puis un spin rapide (500 x g pendant 10 s).
  5. Incuber en utilisant les conditions de réaction suivantes dans un thermocycleur pré-refroidi avec un couvercle chauffé pour des températures >20 °C. Utilisez les conditions de réaction : 12 °C pendant 15 min, 37 °C pendant 15 min, 72 °C pendant 20 min, maintenir à 4 °C.

11. Ligature de l’adaptateur

REMARQUE: Gardez les échantillons sur la glace tout en mettant en place la réaction suivante. Laissez le tampon ligase atteindre la température ambiante avant le pipetage. Diluer l’adaptateur (voir tableau des matériaux) dans une solution de 10 mM de Tris-HCl contenant 10 mM de NaCl (pH 7,5). En raison du faible rendement, ne pré-quantifiez pas l’ADN enrichi en CUT&RUN. Générez plutôt des dilutions 25 fois de l’adaptateur, en utilisant une concentration finale de l’adaptateur de travail de 0,6 μM.

  1. Faire un mélange maître de ligature : 55 μL de tampon ligase (2x), 5 μL d’ADN ligase T4 et 5 μL d’adaptateur dilué, avec un volume total de 65 μL par réaction.
  2. Ajouter 65 μL du mélange de ligature maître à 50 μL d’ADN à partir de l’étape 10.5.
  3. Mélanger par vortex rapide, suivi d’une rotation rapide (500 x g pendant 10 s).
  4. Incuber à 20 °C dans un thermocycleur (sans couvercle chauffant) pendant 15 min.
    REMARQUE : Passez immédiatement à l’étape suivante.

12. Digestion de l’UTILISATEUR

  1. Ajouter 3 μL d’enzyme USER à chaque échantillon, vortex et spin (500 x g pendant 10 s).
  2. Incuber dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 15 min (couvercle chauffé réglé à 50 °C).

13. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite après réaction de ligature

REMARQUE: Laissez les billes de polystyrène-magnétite s’équilibrer à température ambiante (~ 30 min). Vortex pour homogénéiser la solution de billes avant utilisation. Effectuez les étapes suivantes à température ambiante.

  1. Ajouter 39 μL (0,33x) de solution de billes de polystyrène-magnétite à chaque puits contenant de l’ADN ligaturé par adaptateur.
  2. Bien mélanger par pipetage, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min pour permettre à l’ADN de se lier aux perles.
  3. Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits et incubez pendant 5 minutes jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
  4. Gardez la plaque sur le support magnétique et retirez et jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
  5. Rincez les billes avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
  6. Incuber pendant 30 s sur un rack magnétique de 96 puits pour permettre à la solution de s’éclaircir.
  7. Retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
  8. Répétez les étapes 13.5 à 13.7 pour un total de deux lavages.
  9. Faites tourner brièvement la plaque à 500 x g pendant 10 s, replacez la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et retirez l’EtOH résiduel sans perturber les perles.
  10. Conservez la plaque sur la grille magnétique et séchez les échantillons à l’air libre pendant 2 min.
    REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
  11. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 28,5 μL de 10 mM tris-HCl (pH 8).
    ATTENTION : L’acide chlorhydrique est très corrosif. Les utilisateurs doivent le manipuler avec soin dans une hotte à fumée chimique en portant des lunettes, des gants et un manteau de laboratoire.
  12. Ressuspendez soigneusement les perles par pipetage, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
  13. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  14. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
  15. Transférer 27,5 μL de surnageant sur une nouvelle plaque PCR et jeter les billes.

14. Enrichissement de la bibliothèque

REMARQUE: Les apprêts sont dilués avec la même solution que l’adaptateur. Pour cette construction de bibliothèque, utilisez une concentration finale d’amorce de travail de 0,6 μM.

  1. Ajouter 5 μL d’amorce indexée diluée (voir tableau des matériaux) à chaque échantillon.
    REMARQUE : Chaque échantillon a besoin d’un index différent pour être identifié après le séquençage.
  2. Préparer un mélange maître PCR : 10 μL de 5x tampon PCR haute fidélité, 1,5 μL de dNTP 10 mM, 5 μL d’apprêt universel dilué, 1 μL de polymérase haute fidélité à démarrage à chaud de 1 U, avec un volume total de mélange maître de 17,5 μL par échantillon.
  3. Ajouter 17,5 μL de mélange PCR à 32,5 μL d’ADN purifié ligaturé par adaptateur (5 μL d’amorce indexée sont inclus dans ce volume).
  4. Mélanger la solution par pipetage.
  5. Incuber dans un thermocycleur en utilisant les conditions de réaction suivantes avec une vitesse de rampe maximale de 3 °C/s : 98 °C pendant 45 s, 98 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 10 s, répéter les deuxième et troisième étapes 21 fois, 72 °C pendant 1 min, maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pour le stockage à court terme ou à -20 °C pour le stockage à long terme.

15. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite

  1. Ajouter 60 μL (1,2x) de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon.
  2. Remettre en suspension les billes par pipetage et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  3. Placez la plaque sur un support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire.
  4. Jeter le surnageant et rincer les perles avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
  5. Répétez l’étape de lavage pour un total de deux lavages EtOH à 80%.
  6. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 10 s, placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez les perles se lier pendant 5 min.
  7. Pipette pour enlever l’excès d’EtOH sans déranger les perles et laisser sécher les perles à l’air libre pendant 2 min.
    REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
  8. Remettre en suspension les billes dans 21 μL d’eau sans nucléase et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  9. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
  10. Transférer 20 μL du surnageant sur une nouvelle plaque.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant l’échantillon à -20 ° C.
  11. Quantifier les concentrations de bibliothèque à l’aide d’un fluoromètre (voir Tableau des matériaux), à l’aide d’un réactif SH 1x.
  12. Si la concentration le permet, exécutez 30 ng d’échantillon sur un gel d’agarose à 1,5% avec une échelle de faible poids moléculaire pour visualiser. Vous pouvez également effectuer une visualisation sur un analyseur de fragments ou un instrument associé.
  13. Séquencer des bibliothèques sur une plate-forme Illumina pour obtenir environ 50 000 à 100 000 lectures mappées de manière unique.

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Representative Results

Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de protéines unicellulaires sur la chromatine en utilisant un format manuel de 96 puits uliCUT & RUN. Bien que les résultats varient en fonction de la protéine profilée (en raison de l’abondance des protéines et de la qualité des anticorps), du type de cellule et d’autres facteurs contributifs, les résultats prévus pour cette technique sont discutés ici. La qualité cellulaire (apparence cellulaire et pourcentage de cellules viables) et le tri unicellulaire doivent être évalués avant ou au moment du tri des cellules vivantes dans le tampon NE. Un exemple de colonies de cellules ES et de tri cellulaire est illustré à la figure 2A, B. Plus précisément, les cellules de mauvaise qualité ne doivent pas être utilisées, et si la qualité est un problème, il faut prendre soin de suivre les directives pour le type de cellule spécifique. En outre, un tri précis des cellules par l’instrument de tri cellulaire doit être évalué avant l’expérimentation. Par exemple, les cellules d’essai pourraient être triées et colorées à l’aide de la coloration Hoechst 33342 et comptées pour s’assurer que 0 ou 1 cellule se trouve dans chaque puits. Si des cellules individuelles ne sont pas trouvées, les conditions de tri doivent être optimisées. Après la préparation de la bibliothèque, les échantillons peuvent être évalués sur un gel d’agarose (si la concentration permet un chargement de 30 ng ou plus, car il existe une limite inférieure à la visualisation de l’ADN sur un gel d’agarose) ou sur un analyseur de fragments (ou un dispositif similaire tel qu’une station de bande ou un bioanalyseur) avant le séquençage et des exemples de résultats sont présentés à la figure 2C, D. Plus précisément, la distribution de taille attendue est de ~150 à ~500 pb. Dans des quantités cellulaires plus élevées, CUT&RUN effectué sur de grandes protéines (telles que les histones) aura une distribution de taille du côté droit, où la majorité de l’ADN sera vue ~ 270 pb; cependant, cette épaule n’est généralement pas observée dans les expériences unicellulaires.

Après le séquençage, la qualité des lectures de séquençage doit être évaluée à l’aide de FASTQC. Le pourcentage de lectures de mappage unique doit être déterminé. En règle générale, 0,5 % à 10 % des lectures cartographiques uniques sont observées dans des expériences à cellule unique. Ces pourcentages de cartographie sont similaires à d’autres techniques unicellulaires basées sur l’ADN30. Ensuite, la distribution de taille des lectures après le mappage doit être déterminée pour s’assurer que le profil est similaire au pré-séquençage (la séquence de l’adaptateur ne contribuant plus aux tailles de lecture).

Une fois la qualité des données évaluée, l’occupation des protéines peut être visualisée à l’aide de diverses méthodes : les images du navigateur du génome d’un seul locus peuvent être visualisées à l’aide du navigateur de génome UCSC ou IGV (Figure 3A) et les modèles d’occupation à l’échelle du génome sur des coordonnées génomiques spécifiques peuvent être visualisés à l’aide de métaplots (Figure 3B, en bas), de cartes thermiques (Figure 3B, en haut) ou de cartes thermiques 1D (Figure 3C). Pour plus d’informations sur l’analyse des données, reportez-vous à l’étude de Patty et Hainer27. Les données unicellulaires d’une cellule diploïde entraîneront jusqu’à quatre lectures contribuant à chaque locus (quatre lectures si la cellule était en mitose), mais le plus souvent une ou deux lectures. Par conséquent, les données sont binaires et un arrière-plan élevé peut être plus facilement confondu avec une occupation, par rapport aux expériences à cellules élevées. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer une expérience parallèle CUT&RUN sur un nombre élevé de cellules (5 000 à 100 000 cellules), si possible, pour acquérir tous les emplacements de liaison possibles pour la protéine d’intérêt. Ensuite, les données unicellulaires peuvent être comparées à des emplacements de liaison possibles. Dans les exemples illustrés à la figure 3, les résultats CTCF uliCUT&RUN à cellule unique sont comparés à ceux du CTCF à cellules élevées uliCUT&RUN (figure 3A) ou ChIP-seq (figure 3B, C). Comme démontré précédemment, les pics uliCUT&RUN unicellulaires CTCF, SOX2 et NANOG représentaient en grande partie des pics plus forts des ensembles de données ChIP-seq à haute cellule23.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du protocole uliCUT&RUN. Les cellules sont récoltées et triées dans une plaque de 96 puits contenant un tampon NE. Les noyaux individuels sont ensuite liés à des microsphères paramagnétiques conjuguées ConA, et séquentiellement un anticorps (ciblant la protéine d’intérêt) et pA-MNase ou pA/G-MNase sont ajoutés. L’ADN adjacent aux protéines est clivé via MNase, et l’ADN est ensuite purifié pour être utilisé dans la préparation de la bibliothèque. Cette figure a été créée avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exemple de résultats du tri cellulaire et du contrôle de la qualité des bibliothèques uliCUT&RUN. (A) Image de cellules souches embryonnaires murines (ES) de haute qualité. Barre d’échelle: 200 μm. (B) Sortie du tri à cellule unique après l’ajout de 7AAD aux cellules ES récoltées et le tri sur un instrument FACS. (C) Gel d’agarose teinté de bromure d’éthidium représentant les bibliothèques uliCUT&RUN terminées. La voie 1 est une échelle de faible poids moléculaire et les voies 2 à 21 sont des exemples de bibliothèques uliCUT&RUN individuelles à cellule unique réussies avant le séquençage. (D) Gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium représentant des bibliothèques uliCUT&RUN complétées sous-optimales et optimales. La voie 1 est une échelle de faible poids moléculaire, la voie 2 est une bibliothèque sous-optimale en raison de la digestion inefficace de MNase, et la voie 3 est une bibliothèque réussie avec une digestion appropriée. (E) Distribution de l’analyseur de fragments d’une seule cellule de la bibliothèque uliCUT&RUN avant le séquençage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple de résultats attendus pour les données uliCUT&RUN à cellule ES unique. (A) Suivi du navigateur du nombre élevé de cellules (5 000 cellules) CTCF ou contrôle négatif (pas d’anticorps, pas d’Ab), uliCUT & RUN (deux premières pistes) et CTCF unicellulaire uliCUT & RUN. L’image est reproduite, avec permission, par Patty et Hainer27. (B) Cartes thermiques (en haut) et métaplots (en bas) du CTCF unicellulaire ou du contrôle négatif (No Ab) uliCUT&RUN sur des sites CTCF ChIP-seq précédemment publiés (GSE11724). L’image est reproduite, avec permission, de Hainer et al.23. (C) Cartes thermiques 1D du CTCF unicellulaire ou du contrôle négatif (No Ab) uliCUT&RUN sur des sites CTCF ChIP-seq précédemment publiés (GSE11724). L’image est reproduite, avec permission, de Hainer et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des différents tampons utilisés dans ce protocole. Le volume de solution mère requis est indiqué avec la concentration finale indiquée entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

CUT&RUN est un protocole efficace pour déterminer la localisation des protéines sur la chromatine. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres protocoles, notamment: 1) un rapport signal/bruit élevé, 2) un protocole rapide et 3) une faible couverture de lecture de séquençage requise, ce qui entraîne des économies de coûts. L’utilisation de la protéine A- ou de la protéine A/G-MNase permet d’appliquer CUT&RUN avec n’importe quel anticorps disponible; par conséquent, il a le potentiel de profiler rapidement et facilement de nombreuses protéines. Cependant, l’adaptation à une seule cellule pour tout profilage protéique sur la chromatine a été difficile, en particulier par rapport à la transcriptomique unicellulaire (c.-à-d. scRNA-seq), en raison du faible nombre de copies d’ADN par rapport à l’ARN (deux à quatre copies d’ADN par rapport à des milliers possibles de copies d’ARN).

Dans le protocole détaillé ci-dessus, plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte. Tout d’abord, le tri approprié des cellules dépend du type de cellule (ou de tissu) et il faut veiller à un tri précis. Il est recommandé de tester l’efficacité du tri unicellulaire avec l’instrument avant toute expérience. Deuxièmement, un choix efficace d’anticorps est essentiel. Avant de procéder à une application unicellulaire, il est recommandé de tester l’anticorps dans une expérience à nombre élevé de cellules (ainsi que d’autres tests d’anticorps standard, tels que la confirmation de la spécificité à l’aide du transfert Western après le knockdown, le titrage de l’anticorps dans les expériences CUT & RUN, etc.). Troisièmement, utiliser un témoin négatif, comme l’IgG ou l’absence d’anticorps primaire, car une comparaison appropriée avec les échantillons expérimentaux est essentielle pour l’interprétation de la qualité des données et des résultats biologiques. Lorsque l’on compare les résultats expérimentaux d’une seule cellule à un ensemble de données à nombre élevé de cellules, les expériences à cellule unique témoins négatifs devraient avoir une couverture de lecture moindre sur les sites de liaison identifiés dans l’expérience de cellules hautes et plutôt avoir une distribution aléatoire des lectures à travers le génome (avec un biais pour les régions ouvertes de chromatine). Quatrièmement, des précautions doivent être prises lors de l’ajout et de l’activation de la protéine A- ou de la protéine A / G-MNase afin de ne pas trop digérer la chromatine: ne surchauffez pas les échantillons avec vos mains, maintenez les échantillons à une température de glace / bain-marie (0 ° C) et chélatez la réaction au moment approprié. Cinquièmement, des précautions doivent être prises tout au long de l’expérience uliCUT&RUN et de la préparation de la bibliothèque, en raison de la faible teneur en matériaux. Par exemple, une incubation prolongée sur le rack magnétique pendant la fixation des billes pour s’assurer que le surnageant a éliminé et en prenant soin de ne pas déranger les perles lors du retrait du surnageant sont essentielles pour un rendement suffisant. Sixièmement, selon les questions abordées, le nombre d’expériences sur une seule cellule est une considération importante. Certaines des expériences à cellule unique échoueront (comme pour toutes les expériences à faible entrée) et, par conséquent, le nombre de résultats expérimentaux positifs requis pour une interprétation appropriée doit être pris en compte avant le début de l’expérience. Le nombre de cellules à inclure dans l’expérience dépend de la quantité de données expérimentales requises par l’investigateur et de la qualité de l’anticorps. Enfin, notez que des résultats équivalents pourraient être obtenus avec des volumes réduits de nombreux aspects de ce protocole. Les étapes où le volume a été réduit de 50 % comprennent le volume de tampon NE, le tampon de lavage, le mélange d’anticorps primaires (y compris la quantité d’anticorps primaires), le mélange pA-MNase (y compris la quantité de pA-MNase) et toutes les étapes de la préparation de la bibliothèque.

Compte tenu de la nature complexe du profilage des facteurs sur la chromatine, il existe de nombreuses sources potentielles de problèmes et d’endroits où le dépannage peut devenir nécessaire. Bien qu’il puisse y avoir de nombreuses étapes où des problèmes peuvent survenir, trois problèmes majeurs ont été observés: 1) faible rendement en ADN pour l’entrée dans la construction de la bibliothèque; 2) signal de fond élevé dans les échantillons expérimentaux et 3) faible rendement après la construction de la bibliothèque. S’il n’y a pas suffisamment d’ADN pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque (point 1), notez les conseils de dépannage suivants: a) il peut y avoir eu une lyse membranaire incomplète et donc le temps de lyse avec le tampon NE peut être augmenté; b) il peut y avoir eu une liaison inefficace du noyau aux microsphères paramagnétiques conjuguées ConA et cela pourrait être corrigé par un mélange approprié lors de l’ajout de ces perles; c) il peut y avoir eu trop peu d’anticorps ajoutés, et il est donc recommandé d’effectuer une titration d’anticorps pour identifier la quantité la plus efficace; d) les temps d’incubation avec l’anticorps primaire ou la protéine A- ou la protéine A/G-MNase sont soit trop courts (c.-à-d. pas assez de temps pour permettre la liaison), soit trop longs (il s’agit d’échantillons natifs non réticulés) et pourraient être optimisés; e) l’interaction de la protéine cible avec la chromatine pourrait être trop transitoire pour être capturée dans des conditions natives et donc la réticulation cut&run pourrait être effectuée28. Bien que les ensembles de données unicellulaires produisent un arrière-plan élevé, il peut y avoir un arrière-plan excessivement élevé où le signal est difficile à interpréter à partir de l’arrière-plan (point 2). Pour ce problème, notez les conseils suivants: a) l’étape de blocage avec EDTA pour empêcher la digestion préventive de la MNase pourrait être augmentée ou optimisée; b) s’il y a une coupe excessive, cela pourrait être dû à une trop grande quantité de protéine A- ou de protéine A / G-MNase, et donc un titrage de quantités appropriées peut être effectué; c) une digestion excessive par la MNase pourrait entraîner un fond élevé et, par conséquent, le mélange approprié de chlorure de calcium lors de l’addition et l’optimisation du temps de digestion de la MNase devraient être évalués. Enfin, de l’ADN efficace enrichi en uliCUT&RUN peut avoir été récupéré, mais une faible quantité de bibliothèque peut être récupérée (point 3). Pour ce problème, les éléments suivants sont recommandés: a) la manipulation et l’utilisation appropriées de billes de polystyrène-magnétite pour assurer la purification correcte et aucune perte d’ADN; plus précisément, il est recommandé d’avoir 15 min d’incubation et un minimum de 5 min pour magnétiser les perles afin d’éviter la perte; b) la sous-amplification de la bibliothèque au stade de la PCR entraînerait un faible rendement et, par conséquent, les cycles appropriés devraient être déterminés à l’aide de la qPCR (comme établi précédemment pour les bibliothèques ATAC-seq29).

Comme pour toutes les technologies, il existe des limitations à uliCUT&RUN qui doivent être prises en compte avant de lancer toute expérimentation. Tout d’abord, ces expériences sont conçues et optimisées pour les conditions natives, et donc si une protéine n’interagit que transitoirement avec la chromatine, une approche de réticulation peut être nécessaire pour assurer la récupération de l’interaction. Deuxièmement, comme pour toutes les techniques à base d’anticorps, la qualité de l’anticorps est importante. Il faut veiller à assurer la qualité et la cohérence de l’anticorps avant d’entreprendre toute expérience. Troisièmement, une découpe de fond MNase peut se produire et, bien qu’il y ait un signal de fond constamment inférieur dans CUT&RUN par rapport à d’autres expériences, le signal de fond peut être élevé dans les expériences à cellule unique et, par conséquent, des contrôles et des analyses appropriés doivent être effectués. Alors que la nature binaire des données de profilage unicellulaire limite la visualisation, des technologies génomiques computationnelles plus avancées, telles que la réduction dimensionnelle et d’autres, peuvent être effectuées (comme décrit précédemment27). Enfin, bien que le profilage à cellule unique ait été étendu ici au format 96 puits, il s’agit d’un faible débit par rapport à d’autres technologies à cellule unique qui utilisent 10xGenomics ou d’autres formats.

Les technologies de profilage basées sur le partage de connexion telles que ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 et uliCUT&RUN23 peuvent déterminer la localisation des facteurs sur la chromatine avec une chronologie expérimentale plus rapide, un arrière-plan inférieur et un coût inférieur à celui des technologies de profilage traditionnelles, telles que ChIP-seq. Par conséquent, il s’agit de technologies très intéressantes pour une application à des échantillons précieux tels que des échantillons de patients ou des échantillons de développement précoce. En outre, l’application à des cellules individuelles peut fournir des études complémentaires réalisées à l’aide d’autres expériences unicellulaires telles que scRNA-seq et scATAC-seq30. Comme décrit à l’aide de ces technologies unicellulaires plus largement utilisées, de nouvelles connaissances peuvent être acquises par rapport aux expériences sur les cellules en vrac. Le profilage protéique unicellulaire sur la chromatine devrait devenir plus régulièrement utilisé à mesure que les technologies continuent de s’améliorer et de permettre une plus grande parallélisation.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent lié à ce projet.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du Hainer Lab d’avoir lu et commenté une version antérieure de ce manuscrit. Ce projet a utilisé le NextSeq500 disponible au centre de séquençage des sciences de la santé de l’Université de Pittsburgh à l’hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh pour le séquençage, avec des remerciements particuliers à son directeur, William MacDonald. Cette recherche a été soutenue en partie par le Center for Research Computing de l’Université de Pittsburgh grâce aux ressources informatiques fournies. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (à S.J.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL clear microfuge tubes ThermoFisher Scientific 90410
1.5 mL tube magnetic rack ThermoFisher Scientific 12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge Eppendorf 5404000537
10 cm sterile tissue culture plates ThermoFisher Scientific 150464
10X T4 DNA Ligase buffer New England Biolabs B0202S
15 mL conical tubes VWR 89039-656
1X TE buffer ThermoFisher Scientific 12090015
200 µL PCR tubes Eppendorf 951010022
2X quick ligase buffer New England Biolabs M2200 Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) Fisher Scientific BDB559925
96-well magnetic rack ThermoFisher Scientific 12027 or 12331D
96-well plate VWR 82006-636
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest varies
ATP ThermoFisher Scientific R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads Polysciences 86057-10 ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher Scientific AAJ62905AP
Cell sorter BD FACSAria II cell sorter Requires training
Cell-specific media for cell culture Varies
Chloroform ThermoFisher Scientific C298-500 Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns Epoch Life Sciences 1920-250
dNTP set New England Biolabs N0446S
EGTA Sigma Aldrich E3889
Electrophoresis equipment varies
Ethanol Fisher Scientific 22032601 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Fisher Scientific BP2482100
FBS Sigma Aldrich F2442
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycogen VWR 97063-256
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in homemade Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl) Fisher Scientific A144-212 Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control ThermoFisher Scientific 51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood Bakery Company SG404
Manganese Chloride (MnCl2) Sigma Aldrich 244589
Micropipette set Rainin 30386597
Minifuge Benchmark Scientific C1012
NEB Adaptor New England Biolabs E6612AVIAL Adaptor
NEB Universal primer New England Biolabs E6611AVIAL Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit New England Biolabs E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L Indexed Primers
Negative control antibody Antibodies-Online ABIN101961
Nuclease Free water New England Biolabs B1500S
PCR thermocycler Eppendorf 2231000666
Phase lock tubes Qiagen 129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) ThermoFisher Scientific 15593049 Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10814010
Pipette aid Drummond Scientific # 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000 VWR A16151
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-1 CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors ThermoFisher Scientific 78430
ProteinA/G-MNase Epicypher 15-1016 pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN Addgene 86973
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer New England Biolabs M2200S
RNase A New England Biolabs T3010
Sodium Acetate  (NaOAc) ThermoFisher Scientific BP333-500
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) ThermoFisher Scientific BP166-500 SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-1 NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine Sigma Aldrich S2626
Standard Inverted Light Microscope Leica 11526213
Standard lab agarose gel materials Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips Varies
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203S
T4 PNK New England Biolabs M0201S
Tabletop vortexer Fisher Scientific 2215414
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S
Thermomixer Eppendorf 5384000020 Alternatively, can use a waterbath
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Triton X-100 Sigma Aldrich 9002-93-1 Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin Fisher Scientific MT25052
Tube rotator VWR 10136084
USER enzyme New England Biolabs M5505S

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Biologie numéro 180
Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase
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Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease. J. Vis. Exp. (180), e63536, doi:10.3791/63536 (2022).

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