Summary
CUT&RUN и его варианты могут быть использованы для определения занятости белка на хроматине. Этот протокол описывает, как определить локализацию белка на хроматине с помощью одноклеточного uliCUT & RUN.
Abstract
Определение мест связывания белка на хроматине имеет важное значение для понимания его функции и потенциальных регуляторных целей. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения локализации белка в течение более 30 лет и определяется использованием антитела для извлечения интересующего белка из ультразвукового или ферментативно переваренного хроматина. Совсем недавно методы привязки антител стали популярными для оценки локализации белка на хроматине из-за их повышенной чувствительности. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT & RUN) является геномным производным иммуноочистения хроматина (ChIC) и использует рекомбинантный белок A, привязанный к микрококковой нуклеазе (pA-MNase), для идентификации постоянной области IgG антитела, нацеленного на интересующий белок, что позволяет сайт-специфическое расщепление ДНК, фланкирующее интересующий белок. CUT&RUN может использоваться для профилирования модификаций гистонов, факторов транскрипции и других хроматин-связывающих белков, таких как факторы ремоделирования нуклеосом. Важно отметить, что CUT&RUN может быть использован для оценки локализации эвхроматических или гетерохроматически-ассоциированных белков и модификаций гистонов. По этим причинам CUT&RUN является мощным методом определения профилей связывания широкого спектра белков. Недавно CUT&RUN был оптимизирован для профилирования транскрипционного фактора в низких популяциях клеток и отдельных клеток, а оптимизированный протокол был назван сверхнизким входным CUT&RUN (uliCUT&RUN). Здесь представлен подробный протокол для профилирования одноклеточного фактора с использованием uliCUT&RUN в ручном 96-луночном формате.
Introduction
Многие ядерные белки функционируют, взаимодействуя с хроматином, чтобы стимулировать или предотвращать деятельность, основанную на шаблонах ДНК. Чтобы определить функцию этих хроматин-взаимодействующих белков, важно определить геномные места, в которых эти белки связаны. С момента своего развития в 1985 году иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения того, где белок связывается с хроматином 1,2. Традиционная техника ChIP имеет следующий базовый рабочий процесс: клетки собираются и сшиваются (обычно с формальдегидом), хроматин сдвигается (обычно с помощью жестких методов обработки ультразвуком, требующих сшивки), интересующий белок иммунопреципитируется с использованием антитела, которое нацелено на белок (или помеченный белок), за которым следует вторичное антитело (связанное с агарозой или магнитными шариками), сшивание обратное, белок и РНК перевариваются для очистки ДНК, и эта обогащенная ChIP ДНК используется в качестве шаблона для анализа (с использованием радиомаркированных зондов 1,2, qPCR3, микрочипов 5,6 или секвенирования4). С появлением микрочипов и массово параллельного глубокого секвенирования в последнее время были разработаны ChIP-чипы 5,6 и ChIP-seq 4, которые позволяют идентифицировать локализацию белка на хроматине в масштабах всего генома. Кросслинкинг ChIP был мощным и надежным методом с момента его появления с крупными достижениями в разрешении ChIP-exo7 и ChIP-nexus8. Параллельно с разработкой ChIP-seq были созданы нативные (не сшивающие) протоколы для ChIP (N-ChIP), которые используют сбраживание нуклеазы (часто с использованием микрококковой нуклеазы или МНазы) для фрагментации хроматина, в отличие от ультразвука, выполняемого в традиционных методах сшивания ChIP9. Тем не менее, одним из основных недостатков технологий как сшивки ChIP, так и N-ChIP было требование высокого количества клеток из-за низкого выхода ДНК после экспериментальной манипуляции. Поэтому в последние годы многие усилия были направлены на оптимизацию технологий ChIP для низкосотового ввода. Эти усилия привели к разработке многих мощных технологий на основе CHIP, которые различаются по своей применимости и входным требованиям 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Тем не менее, одноклеточные технологии на основе ChIP-seq отсутствовали, особенно для негистоновых белков.
В 2004 году была разработана альтернативная технология для определения занятости белка на хроматине, называемая эндогенным расщеплением хроматина (ChEC) и иммунодеказацией хроматина (ChIC)19. Эти методы с одним локусом используют слияние МНазы либо с интересующим белком (ChEC), либо с белком A (ChIC) для прямого разрезания ДНК, прилегающей к интересующему белку. В последние годы как ChEC, так и ChIC были оптимизированы для профилирования белка по всему геному на хроматине (ChEC-seq и CUT& RUN соответственно)20,21. Хотя ChEC-seq является мощным методом определения локализации факторов, он требует разработки белков слияния MNase для каждой мишени, тогда как ChIC и его вариация генома, CUT & RUN, полагаются на антитело, направленное на интересующий белок (как в случае с ChIP) и рекомбинантный белок A-MNase, где белок A может распознавать постоянную область антитела IgG. В качестве альтернативы был разработан слияние белка A/белка G-MNase (pA/G-MNase), которое может распознавать более широкий диапазон постоянныхобластей антител 22. CUT&RUN быстро стал популярной альтернативой ChIP-seq для определения локализации белка на хроматине по всему геному.
Сверхнизкий вход CUT&RUN (uliCUT&RUN), разновидность CUT&RUN, которая позволяет использовать низко- и одноэлементные входы, был описан в 2019 году23. Здесь описана методология ручного применения одной ячейки в формате 96 скважин. Важно отметить, что с момента разработки uliCUT&RUN были разработаны две альтернативы для профилирования гистонов, CUT&Tag и iACT-seq, обеспечивающие надежное и высокопараллельное профилирование гистоновых белков24,25. Кроме того, scCUT&Tag был оптимизирован для профилирования нескольких факторов в одной клетке (multiCUT&Tag) и для применения к негистоновым белкам26. Вместе CUT&RUN предоставляет привлекательную альтернативу низкому входному ChIP-seq, где uliCUT&RUN может быть выполнен в любой лаборатории молекулярной биологии, имеющей доступ к сортировщику клеток и стандартному оборудованию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все исследования были одобрены Институциональным бюро по биобезопасности по охране научных исследований в Университете Питтсбурга.
1. Подготовьте магнитные шарики
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните перед сортировкой ячеек и держите на льду до использования.
- Пипетка 30 мкл ConA-конъюгированной парамагнитной микросферы шариковой смеси за реакцию в свежую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл и добавление 850 мкл связывающего буфера, аккуратно пипетируя для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: КонА-конъюгированные парамагнитные микросферы представляют собой магнитные шарики с лектиновым покрытием, которые обеспечивают связывание с липидной мембраной. - Поместите трубку на магнитную стойку и дайте шарикам намагничиваться в течение 1-2 мин. Как только супернатант очистится, удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Извлеките трубку из магнитной стойки и вымойте шарики, повторно развернув в 1 мл связывающего буфера.
- Повторите шаги 1.2 и 1.3.
- Намагничьте бусины на 2 мин и удалите супернатант для выбрасывания.
- Извлеките трубку из магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 30 мкл связывающего буфера за реакцию.
- Подержите промытую бисероплетение на льду до тех пор, пока ячейки не будут отсортированы.
2. Заготавливайте клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг написан для прилипших клеток и оптимизирован для мышиных эмбриональных стволовых клеток E14. Культивирование и сбор клеток зависит от типа клеток.
- Извлеките клетки из инкубатора с температурой 37 °C и изучите их под микроскопом, чтобы убедиться в качестве.
- Аспирировать среду с клеточной пластины и промыть 5 мл 1x PBS.
- Аспирируйте PBS с тарелки и собирайте клетки (используя традиционные методы сбора клеток, которые будут отличаться в зависимости от типа клеток). Получите одноклеточную суспензию, осторожно пипетируя вверх и вниз серологической пипеткой против чашки для культивирования, если это необходимо.
- Переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл и открутите вниз при 200 х г в течение 5 мин.
- Аспирировать со среды, чтобы выбросить и промыть ячейку гранулы с 5 мл PBS + 1% FBS.
- Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 5 мл PBS + 1% FBS.
- Подсчитайте клетки и перенесите 1 мл 1 х 106 клеток в свежую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 5 мкл 7-амино-актиномицина D (7-AAD), переверните трубку для смешивания, а затем нанесите образец на сортировщик клеток для сортировки живых одиночных клеток в отдельные колодцы из 96-луночной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель 7-AAD исключается из живых клеток и, следовательно, может использоваться при сортировке живых клеток.
3. Сортировка и лизис клеток
- Подготовьте совместимую с сортировщиком ячейку 96-луночную пластину со 100 мкл буфера ядерной экстракции (NE) в каждой скважине перед сортировкой ячеек.
- Отсортируйте ячейки по 96-луночным пластинам в соответствии с инструкциями производителя.
- Быстро вращайте пластину (600 х г в течение 30 с), чтобы ячейки находились в буфере внутри скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В предварительном эксперименте стоит проверить, надежно ли используемые ячейки доводятся до дна скважин. - Подержите пробы на льду в течение 15 минут.
- Раскрутите образцы при 600 х г в течение 5 мин при 4 °C и осторожно выньте пипетку, чтобы удалить супернатант (оставив после себя 5 мкл).
- Повторно суспендируйте каждый образец в 55 мкл NE-буфера и добавьте 30 мкл предварительно промытых ConA-сопряженных парамагнитных микросфер (из стадии 1.7; в Буфер связывания) к каждой реакции.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Предварительно блокированные образцы для предотвращения раннего пищеварения MNase
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте бусинам связываться в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
- Добавьте 100 мкл блокирующего буфера к шарикам, связанным с ядром, и перемешайте с мягким пипетированием.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Добавление первичных антител
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием.
- Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование шариков в 25 мкл промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием.
- Сделайте первичную смесь антител: 25 мкл Wash Buffer + 0,5 мкл антитела за реакцию.
- Осторожно вращая связанные ядра шарики, добавляйте 25 мкл первичной смеси антител к каждому образцу, обрабатываемому антителом, антителом, нацеленным на интересующий белок (обычно конечное разведение 1:100). Добавьте 25 мкл Wash Buffer без антител, если выполняете контроль.
- Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Поместите образцы на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение как минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Снимите пластину с магнитной стойки и вымойте шарики с помощью 100 мкл wash Buffer, повторно используя путем пипетки.
6. Добавление пА-МНазы или пА/Г-МНазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок А имеет высокое сродство к молекулам IgG некоторых видов, таких как кролики, но не подходит для IgG других видов, таких как мыши или крысы. В качестве альтернативы можно использовать протеин A/G-МНазу. Этот гибрид связывает IgGs кролика, мыши и крысы, избегая необходимости во вторичных антителах при использовании первичных антител для мыши или крысы.
- Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Извлеките пластину из магнитной стойки и повторно суспендируйте каждый образец в 25 мкл wash Buffer.
- Сделайте мастер-смесь пА-МНазы (25 мкл промывочного буфера + оптимизированное количество пА-МНазы за реакцию).
- При плавном вихре добавьте 25 мкл мастер-смеси pA-MNase к каждому образцу, включая контрольные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация пА-МНазы изменяется при приготовлении, если она приготовлена в домашних условиях, и должна быть проверена перед использованием при каждой независимой очистке. Для пА/Г-МНазы следует использовать 2,5 мкл из 20-кратного запаса. - Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Снимите пластину с магнитной стойки и вымойте шарики с помощью 100 мкл wash Buffer, повторно используя путем бережной пипетки.
7. Направленное переваривание ДНК
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
- Извлеките образцы из магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 50 мкл wash Buffer путем бережной пипетки.
- Уравновешивайте образцы до 0 °C в смеси лед/вода в течение 5 мин.
- Извлеките образцы со ледяной/водяной бани при температуре 0 °C и добавьте 1 мкл 100 мМ CaCl2 с помощью многоканальной пипетки. Хорошо перемешать (3-5 раз) при щадящем пипетке с использованием многоканальной пипетки большего объема, а затем вернуть образцы до 0 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее смешивание здесь имеет важное значение. CaCl2 добавляют для активации переваривания МНазы ДНК, фланкирующей интересующий белок. - Запустите 10-минутный таймер, как только тарелка вернется на ледяную / водяную баню.
- Остановите реакцию, пипетировав 50 мкл буфера 2XRSTOP+ в каждую скважину, в том же порядке, в котором был добавлен CaCl2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте буфер 2XRSTOP+ до окончания 10-минутного пищеварения, чтобы предотвратить переваривание.
8. Фракционирование образцов
- Инкубируйте образцы в течение 20 мин при 37 °C.
- Вращайте пластину при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут и перенесите супернатанты на свежую 96-луночную пластину. Выбросьте бусины.
9. Извлечение ДНК
- Добавьте 1 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 0,83 мкл 20 мг/мл протеиназы K к каждому образцу.
ВНИМАНИЕ: Порошок SDS вреден при вдыхании. Пользователи должны использовать в хорошо проветриваемых помещениях в очках, перчатках и респираторе класса N95, обращаясь с осторожностью. - Перемешайте образцы путем бережного пипетирования.
- Инкубируйте образцы в течение 10 мин при 70 °C.
- Верните пластину к комнатной температуре и добавьте 46,6 мкл 5 M NaCl и 90 мкл 50% PEG 4000. Перемешать путем бережного пипетирования.
- Добавьте 33 мкл полистирол-магнетитовых шариков к каждому образцу и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно доведите полистирол-магнетитовые шарики до комнатной температуры (~30 мин) и хорошо перемешайте перед использованием. - Поместите пластину на магнитную стойку и дайте супернатанту очиститься в течение ~ 5 минут, а затем осторожно выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Промыть 2x 150 мкл 80% этанола, не нарушая шарики.
ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и вызывает раздражение кожи, глаз и легких. Выполните этот шаг с соответствующей лабораторной одеждой и в вентилируемом капюшоне. - Вращайте пластину ненадолго при 1000 х г в течение 30 с. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите все остатки EtOH, не нарушая бусины.
- Высушите образцы на воздухе в течение ~2-5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не сушите бусины дольше 5 минут. Если вы усердно удаляете EtOH, достаточно 2-3 минут сушки. - Повторно суспендировать шарики с 37,5 мкл 10 мМ Tris-HCl (рН 8) и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину на магнитную стойку и дайте бусинам скрепиться в течение 5 минут.
- Перенесите 36,5 мкл супернатанта на свежую термоциклерную совместимую 96-луночную пластину. Выбросьте бусины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно остановить здесь, сохранив образцы при -20 °C или продолжить сборку библиотеки (шаги 10-15).
10. Восстановление конца, фосфорилирование, аденилирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Источники реагентов указаны в Таблице материалов. Приведенный ниже протокол следует методу, аналогичному коммерческому набору, такому как комплект NEBNext Ultra DNA II.
- Разбавить 5 ЕД/мкл ДНК-полимеразы Т4 1:20 в 1x T4 ДНК-лигазном буфере.
- Приготовьте конечную репарацию/3'А мастер-микс: 2 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера, 2,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1,25 мкл 10 мМ АТФ, 3,13 мкл 40% ПЭГ 4000, 0,63 мкл 10 ЕД/мкл Т4 ПНК, 0,5 мкл разбавленной ДНК-полимеразы Т4, 0,5 мкл 5U/мкл TAQ ДНК-полимеразы с общим объемом 13,5 мкл за реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пипеткой обязательно доведите 40% PEG 4000 до комнатной температуры. - Добавьте 13,5 мкл концевой репарации/3'А мастер-микса к 36,5 мкл ДНК.
- Смешайте реакцию быстрым вихрем, а затем быстрым спином (500 х г в течение 10 с).
- Инкубировать с использованием следующих реакционных условий в предварительно охлаждаемом термоциклере с нагретой крышкой для температур >20 °C. Используйте реакционные условия: 12 °C в течение 15 мин, 37 °C в течение 15 мин, 72 °C в течение 20 мин, держать при 4 °C.
11. Перевязка адаптера
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы на льду, настраивая следующую реакцию. Дайте буферу лигазы достичь комнатной температуры перед пипеткой. Разбавляют адаптер (см. Таблицу материалов) в растворе 10 мМ Tris-HCl, содержащем 10 мМ NaCl (рН 7,5). Из-за низкой урожайности не стоит предварительно количественно оценивать ДНК, обогащенную CUT&RUN. Вместо этого генерируйте 25-кратное разбавление адаптера, используя конечную рабочую концентрацию адаптера 0,6 мкМ.
- Сделайте мастер-смесь лигирования: 55 мкл буфера лигазы (2x), 5 мкл ДНК-лигазы T4 и 5 мкл разбавленного адаптера с общим объемом 65 мкл на реакцию.
- Добавьте 65 мкл главной лигационной смеси к 50 мкл ДНК со стадии 10,5.
- Перемешать быстрым вихрем с последующим быстрым вращением (500 х г в течение 10 с).
- Инкубировать при 20 °C в термоциклере (без нагретой крышки) в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно перейдите к следующему шагу.
12. Пищеварение ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ
- Добавьте 3 мкл фермента USER к каждому образцу, вихрю и спину (500 х г в течение 10 с).
- Инкубировать в термоциклере при 37 °C в течение 15 мин (нагретая крышка установлена на 50 °C).
13. Очистка полистирол-магнетитовых шариков после реакции лигирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте полистирол-магнетитовым шарикам уравновеситься при комнатной температуре (~30 мин). Вихрь для гомогенизации бисерного раствора перед использованием. Выполните следующие действия при комнатной температуре.
- Добавьте 39 мкл (0,33x) раствора полистирол-магнетитовых шариков в каждую скважину, содержащую ДНК, лигированную адаптером.
- Тщательно перемешайте путем пипетки, а затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы ПОЗВОЛИТЬ ДНК связаться с шариками.
- Поместите образцы на магнитную стойку с 96 лунками и инкубируйте в течение 5 минут, пока супернатант не станет прозрачным.
- Держите пластину на магнитной стойке и осторожно снимите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
- Промойте бусины 200 мкл 80% EtOH, не нарушая бусины.
- Инкубируйте в течение 30 с на магнитной стойке с 96 лунками, чтобы раствор очистился.
- Удалите и выбросьте супернатант, не потревожив бусины.
- Повторите шаги 13.5-13.7, чтобы выполнить в общей сложности две стирки.
- Вращайте пластину ненадолго при 500 x g в течение 10 с, поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите остаточный EtOH, не нарушая бусины.
- Держите пластину на магнитной стойке и высушите образцы на воздухе в течение 2 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины. - Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 28,5 мкл 10 мМ Tris-HCl (рН 8).
ВНИМАНИЕ: Соляная кислота очень коррозионна. Пользователи должны обращаться с ним с осторожностью в химическом вытяжном капюшоне в очках, перчатках и лабораторном халате. - Тщательно повторно суспендируйте бусины путем пипетки, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте раствору очиститься в течение 5 минут.
- Переложите 27,5 мкл супернатанта на новую пластину ПЦР и выбросьте шарики.
14. Обогащение библиотеки
ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки разбавляют тем же раствором, что и адаптер. Для сборки этой библиотеки используйте конечную рабочую концентрацию праймера 0,6 мкМ.
- Добавьте 5 мкл разбавленной индексированной грунтовки (см. Таблицу материалов) к каждому образцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец нуждается в отдельном индексе, который должен быть идентифицирован после виртуализации. - Приготовьте мастер-смесь ПЦР: 10 мкл 5-кратного высокоточного ПЦР-буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТП, 5 мкл разбавленной универсальной грунтовки, 1 мкл 1 U высокоточной полимеразы горячего старта с общим объемом мастер-смеси 17,5 мкл на образец.
- Добавьте 17,5 мкл ПЦР-смеси к 32,5 мкл очищенной адапторно-лигированной ДНК (в этот объем включено 5 мкл индексированного праймера).
- Перемешать раствор путем пипетки.
- Инкубировать в термоциклере с использованием следующих условий реакции с максимальной скоростью рампы 3 °C/с: 98 °C в течение 45 с, 98 °C в течение 45 с, 60 °C в течение 10 с, повторить вторую и третью стадии 21 раз, 72 °C в течение 1 мин, держать при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре 4 °C для краткосрочного хранения или -20 °C для длительного хранения.
15. Очистка полистирол-магнетитовых шариков
- Добавьте 60 мкл (1,2x) шариков полистирола-магнетита в каждый образец.
- Повторно суспендировать шарики путем пипетки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным.
- Выбросьте супернатант и промойте бусины 200 мкл 80% EtOH, не нарушая бусины.
- Повторите этап стирки в общей сложности для двух 80% стирок EtOH.
- Раскрутите пластину при 500 х г в течение 10 с, поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте бусинам связываться в течение 5 минут.
- Пипетка для удаления излишков EtOH, не нарушая бусин и дайте бусинам высохнуть на воздухе в течение 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины. - Повторно суспендировать шарики в 21 мкл воды без нуклеазы и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину на магнитную стойку и дайте раствору очиститься в течение 5 мин.
- Перенесите 20 мкл супернатанта на новую пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно остановить здесь, сохранив образец при -20 °C. - Количественная оценка библиотечных концентраций с помощью флуорометра (см. Таблицу материалов) с использованием реагента HS 1x.
- Если концентрация позволяет, запустите 30 нг образца на 1,5% агарозном геле с низкомолекулярной лестницей для визуализации. Кроме того, можно визуализировать на анализаторе фрагментов или связанном инструменте.
- Библиотеки последовательностей на платформе Illumina для получения ~50 000-100 000 уникально сопоставленных операций чтения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь представлен подробный протокол профилирования одноклеточного белка на хроматине с использованием 96-луночного ручного формата uliCUT&RUN. Хотя результаты будут варьироваться в зависимости от профилируемого белка (из-за обилия белка и качества антител), типа клеток и других способствующих факторов, ожидаемые результаты для этого метода обсуждаются здесь. Качество клеток (внешний вид клеток и процент жизнеспособных клеток) и сортировка одиночных клеток должны быть оценены до или во время сортировки живых клеток в буфер NE. Пример колоний клеток ES и сортировки клеток показан на рисунке 2A,B. В частности, не следует использовать клетки низкого качества, и если качество является проблемой, следует соблюдать рекомендации для конкретного типа клеток. Кроме того, до начала экспериментов следует оценивать точную сортировку ячеек с помощью инструмента сортировки ячеек. Например, тестовые клетки могут быть отсортированы и окрашены с использованием окрашивания Hoechst 33342 и подсчитаны, чтобы гарантировать, что в каждой лунке обнаружено либо 0, либо 1 клетка. Если отдельные ячейки не найдены, необходимо оптимизировать условия сортировки. После подготовки библиотеки образцы могут быть оценены либо на агарозном геле (если концентрация допускает нагрузку 30 нг или более, так как существует нижний предел визуализации ДНК на агарозном геле), либо на анализаторе фрагментов (или аналогичном устройстве, таком как ленточный провод или биоанализатор) до секвенирования, и примеры результатов показаны на рисунке 2C, D. В частности, ожидаемое распределение размеров составляет от ~150 до ~500 bp. В более высоких клеточных количествах CUT&RUN, выполняемый на больших белках (таких как гистоны), будет иметь правостороннее распределение по размеру, где большая часть ДНК будет видна ~ 270 bp; однако это плечо обычно не наблюдается в одноклеточных экспериментах.
После секвенирования качество чтения последовательности следует оценивать с помощью FASTQC. Следует определить процент однозначно сопоставлений чтения. Как правило, 0,5%-10% однозначного отображения показаний наблюдаются в экспериментах с одной клеткой. Эти проценты картирования аналогичны другим одноклеточным методам на основе ДНК30. Затем следует определить распределение размеров считываемых чисел после сопоставления, чтобы гарантировать, что профиль аналогичен предварительному секвенированию (при этом последовательность адаптера больше не влияет на размеры считывания).
После оценки качества данных заполняемость белка может быть визуализирована с использованием различных методов: изображения одного локуса в браузере генома могут быть визуализированы с помощью браузера генома UCSC или IGV (рисунок 3A), а паттерны занятости всего генома над конкретными геномными координатами могут быть визуализированы с помощью метасюжетов (рисунок 3B, внизу), тепловых карт (рисунок 3B, вверху) или тепловых карт 1D (рисунок 3C). Для получения дополнительной информации об анализе данных обратитесь к исследованию Patty and Hainer27. Одноклеточные данные из диплоидной клетки приведут к четырем чтениям, способствующим каждому локусу (четыре чтения, если клетка находилась в митозе), но чаще всего одно или два чтения. Таким образом, данные являются двоичными, и высокий фон может быть легче ошибочно принят за занятость по сравнению с экспериментами с высокими клетками. Поэтому рекомендуется провести параллельный эксперимент CUT&RUN на высоком количестве клеток (от 5000 до 100 000 клеток), по возможности получить все возможные места связывания интересующего белка. Затем одноклеточные данные можно сравнить с возможными местами привязки. В примерах, показанных на рисунке 3, одноклеточные результаты CTCF uliCUT&RUN сравниваются с высококлеточными CTCF uliCUT&RUN (рисунок 3A) или ChIP-seq (рисунок 3B, C). Как было продемонстрировано ранее, одноклеточные пики CTCF, SOX2 и NANOG uliCUT&RUN в значительной степени представляли собой более сильные пики из наборов данных23 с высокими ячейками ChIP-seq.
Рисунок 1: Схема протокола uliCUT&RUN. Ячейки собирают и сортируют в 96-луночную пластину, содержащую буфер NE. Отдельные ядра затем связываются с КонА-конъюгированными парамагнитными микросферами и последовательно добавляют антитело (нацеленное на интересующий белок) и пА-МНазу или пА/Г-МНазу. Смежная к белку ДНК расщепляется с помощью МНазы, а затем ДНК очищается для использования в подготовке библиотеки. Эта фигура была создана с Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример результатов сортировки клеток и контроля качества библиотек uliCUT&RUN. (A) Изображение высококачественных эмбриональных стволовых клеток мышей (ES). Шкала: 200 мкм. (B) Выход из одноэлементной сортировки после добавления 7AAD к собранным ячейкам ES и сортировки на приборе FACS. (C) Окрашенный бромидом этидия агарозный гель с изображением завершенных библиотек uliCUT&RUN. Полоса 1 представляет собой низкомолекулярную лестницу, а полосы 2-21 являются примерами успешных отдельных одноклеточных библиотек uliCUT &RUN до секвенирования. (D) Окрашенный бромидом этидия агарозный гель, изображающий неоптимальные и оптимальные завершенные библиотеки uliCUT&RUN. Полоса 1 представляет собой низкомолекулярную лестницу, полоса 2 является неоптимальной библиотекой из-за неэффективного переваривания МНазы, а полоса 3 является успешной библиотекой с соответствующим пищеварением. (E) Распределение анализатора фрагментов одной единственной ячейки библиотеки uliCUT&RUN перед секвенированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример ожидаемых результатов для данных uliCUT&RUN одной ячейки ES. (A) Браузерный трек высокого числа клеток (5000 клеток) CTCF или отрицательный контроль (No Antibody, No Ab) uliCUT & RUN (два верхних трека) и одноклеточный CTCF uliCUT & RUN. Изображение воспроизводится, с разрешения, от Patty and Hainer27. (B) Тепловые карты (вверху) и метасюжеты (внизу) одноклеточных CTCF или отрицательного контроля (No Ab) uliCUT&RUN над ранее опубликованными сайтами CTCF ChIP-seq (GSE11724). Изображение воспроизводится, с разрешения, из Hainer et al.23. (C) 1D тепловые карты одноэлементного CTCF или отрицательного контроля (No Ab) uliCUT&RUN над ранее опубликованными сайтами CTCF ChIP-seq (GSE11724). Изображение воспроизводится, с разрешения, из Hainer et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав различных буферов, используемых в данном протоколе. Объем необходимого запасного раствора указан с окончательной концентрацией, записанной в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT&RUN является эффективным протоколом для определения локализации белка на хроматине. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими протоколами, в том числе: 1) высокое отношение сигнал/шум, 2) быстрый протокол и 3) низкое покрытие секвенирования считывания, что приводит к экономии средств. Использование белка A- или белка A/G-MNase позволяет применять CUT&RUN с любым доступным антителом; поэтому он обладает потенциалом для быстрого и легкого профилирования многих белков. Однако адаптация к одноклеточному профилированию любого белка на хроматине была затруднена, особенно по сравнению с одноклеточной транскриптомикой (т.е. scRNA-seq), из-за низкого числа копий ДНК по сравнению с РНК (от двух до четырех копий ДНК против возможных тысяч копий РНК).
В протоколе, подробно описанном выше, следует рассмотреть несколько важных шагов. Во-первых, соответствующая сортировка клеток зависит от типа клеток (или тканей), и следует позаботиться о точной сортировке. Рекомендуется проверить эффективность одноклеточной сортировки с помощью прибора перед любым экспериментом. Во-вторых, эффективный выбор антител имеет важное значение. Прежде чем приступить к одноклеточному применению, рекомендуется протестировать антитело в эксперименте с высоким числом клеток (а также другие стандартные тесты на антитела, такие как подтверждение специфичности с использованием вестерн-блот после нокдауна, титрование антитела в экспериментах CUT&RUN и т.д.). В-третьих, используйте отрицательный контроль, такой как IgG или отсутствие первичного антитела, потому что соответствующее сравнение с экспериментальными образцами имеет важное значение для интерпретации качества данных и биологических результатов. При сравнении экспериментальных результатов с одной клеткой с набором данных с высоким числом клеток отрицательные контрольные одноклеточные эксперименты должны иметь меньший охват чтения по тем сайтам связывания, которые были идентифицированы в эксперименте с высокими клетками, и скорее иметь случайное распределение считываний по всему геному (с уклоном на открытые области хроматина). В-четвертых, следует соблюдать осторожность при добавлении и активации белка А- или белка A/G-МНазы, чтобы не переваривать хроматин: не перегревайте образцы руками, поддерживайте образцы в температуре ледяной/водяной бани (0 °C) и хелатируйте реакцию в соответствующее время. В-пятых, следует проявлять осторожность на протяжении всего эксперимента uliCUT&RUN и подготовки библиотеки из-за низкого материала. Например, расширенная инкубация на магнитной стойке во время связывания бусин, чтобы убедиться, что супернатант очищен, и забота о том, чтобы не потревожить бусины при удалении супернатанта, необходимы для достаточного выхода. В-шестых, в зависимости от рассматриваемых вопросов, количество проводимых экспериментов с одной клеткой является важным фактором. Некоторые из одноклеточных экспериментов потерпят неудачу (как и все эксперименты с низким входом), и, следовательно, количество положительных экспериментальных результатов, необходимых для соответствующей интерпретации, должно быть рассмотрено до начала эксперимента. Количество клеток, включаемых в эксперимент, зависит от количества экспериментальных данных, требуемых исследователем, и качества антитела. Наконец, следует отметить, что эквивалентные результаты могут быть достигнуты при сокращении объемов многих аспектов этого протокола. Этапы, на которых объем был уменьшен на 50%, включают объем ne-буфера, промывочного буфера, смесь первичных антител (включая количество первичного антитела), смесь pA-MNase (включая количество pA-MNase) и все этапы подготовки библиотеки.
Исходя из сложного характера профилирования факторов на хроматине, существует множество потенциальных источников проблем и мест, где устранение неполадок может стать необходимым. Хотя может быть много шагов, где могут возникнуть проблемы, были отмечены три основные проблемы: 1) низкий выход ДНК для ввода в создание библиотеки; 2) высокий фоновый сигнал в экспериментальных образцах и 3) низкий выход после сборки библиотеки. Если днк недостаточно для подготовки библиотеки и секвенирования (пункт 1), обратите внимание на следующие рекомендации по устранению неполадок: а) возможно, был неполный мембранный лизис и, следовательно, время лизиса с буфером NE может быть увеличено; б) возможно, имело место неэффективное связывание ядра с КонА-конъюгированными парамагнитными микросферами, и это может быть исправлено путем соответствующего смешивания при добавлении этих шариков; в) возможно, было добавлено слишком мало антител, и поэтому рекомендуется выполнить титрование антител для определения наиболее эффективного количества; d) время инкубации либо с первичным антителом, либо с белком А- или белком A/G-МНазой либо слишком короткое (т.е. недостаточное время для обеспечения связывания), либо слишком длинное (это нативные, несшитые образцы) и может быть оптимизировано; д) взаимодействие целевого белка с хроматином может быть слишком преходящим для захвата в нативных условиях, и поэтому сшивание CUT&RUN может быть выполнено28. В то время как наборы данных с одной ячейкой будут давать высокий фон, может быть чрезмерно высокий фон, когда сигнал трудно интерпретировать с фона (пункт 2). По этому вопросу обратите внимание на следующие рекомендации: а) блокирующий шаг с ЭДТА для предотвращения упреждающего переваривания МНазы может быть увеличен или оптимизирован; b) если имеет место чрезмерное сокращение, это может быть связано с наличием слишком большого количества белка A- или белка A/G-МНазы, и поэтому может быть выполнено титрование соответствующих количеств; c) чрезмерное переваривание МНазой может привести к высокому фону, и поэтому следует оценить соответствующее смешивание хлорида кальция при добавлении и оптимизации времени переваривания МНазы. Наконец, эффективная ДНК, обогащенная uliCUT &RUN, возможно, была восстановлена, но небольшой объем библиотеки может быть восстановлен (пункт 3). Для решения этой проблемы рекомендуется следующее: а) надлежащее обращение и использование полистирол-магнетитовых шариков для обеспечения правильной очистки и отсутствия потери ДНК; в частности, рекомендуется иметь 15 минут инкубации и минимум 5 минут для намагничивания бусин для предотвращения потерь; b) недостаточное усиление библиотеки на стадии ПЦР приведет к низкому выходу, и поэтому соответствующие циклы должны определяться с использованием qPCR (как ранее установлено для библиотек ATAC-seq29).
Как и во всех технологиях, существуют ограничения для uliCUT & RUN, которые следует учитывать перед началом каких-либо экспериментов. Во-первых, эти эксперименты разработаны и оптимизированы для нативных условий, и поэтому, если белок только временно взаимодействует с хроматином, для обеспечения восстановления взаимодействия может потребоваться сшивающий подход. Во-вторых, как и во всех методах, основанных на антителах, качество антитело важно. Следует позаботиться о том, чтобы обеспечить качество и консистенцию антитела до проведения каких-либо экспериментов. В-третьих, может происходить фоновое вырезание МНазы, и, хотя в CUT&RUN наблюдается постоянно более низкий фоновый сигнал по сравнению с другими экспериментами, фоновый сигнал может быть высоким в экспериментах с одной ячейкой, и поэтому следует выполнять соответствующие элементы управления и анализы. В то время как двоичная природа данных профилирования одной клетки ограничивает визуализацию, могут быть выполнены более продвинутые вычислительные геномные технологии, такие как уменьшение размеров и другие (какописано ранее 27). Наконец, в то время как профилирование одной ячейки было расширено здесь до формата 96 лунок, это низкая пропускная способность по сравнению с другими одноэлементными технологиями, которые используют 10xGenomics или другие форматы.
Технологии профилирования на основе привязки, такие как ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 и uliCUT&RUN23, могут определять локализацию факторов на хроматине с более быстрой экспериментальной временной шкалой, более низким фоном и более низкой стоимостью, чем традиционные технологии профилирования, такие как ChIP-seq. Таким образом, это очень интересные технологии для применения к драгоценным образцам, таким как образцы пациентов или образцы раннего развития. Кроме того, применение к отдельным клеткам может обеспечить дополнительные исследования, выполненные с использованием других одноклеточных экспериментов, таких как scRNA-seq и scATAC-seq30. Как описано с использованием этих более широко используемых одноклеточных технологий, можно получить новые идеи относительно экспериментов с объемными клетками. Ожидается, что профилирование одноклеточного белка на хроматине станет более регулярно использоваться, поскольку технологии продолжают совершенствоваться и допускать большее распараллеливание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов, связанных с этим проектом.
Acknowledgments
Мы благодарим членов Лаборатории Хайнера за чтение и комментарии к более ранней версии этой рукописи. Этот проект использовал NextSeq500, доступный в Университете Питтсбурга Health Sciences Sequencing Core в детской больнице UPMC в Питтсбурге для секвенирования с особой благодарностью его директору Уильяму Макдональду. Это исследование было частично поддержано Центром исследовательских вычислений Университета Питтсбурга через предоставленные компьютерные ресурсы. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Номер гранта R35GM133732 (S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
