Method Article

Stabilire gli organoidi dal dente umano come un potente strumento verso la ricerca meccanicistica e la terapia rigenerativa

DOI:

10.3791/63671

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven), 2Biomedical Research Institute (BIOMED), UHasselt, Hasselt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali a partire dal dente umano. Gli organoidi sono robustamente espandibili e ricapitolano le cellule staminali epiteliali del dente, compresa la loro capacità di differenziazione degli ameloblasti. L'esclusivo modello organoide fornisce uno strumento promettente per studiare la biologia dentale umana (cellule staminali) con prospettive per approcci rigenerativi dei denti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I denti sono di fondamentale importanza nella vita non solo per la masticazione alimentare e la parola, ma anche per il benessere psicologico. Le conoscenze sullo sviluppo e la biologia dei denti umani sono scarse. In particolare, non si sa molto sulle cellule staminali epiteliali del dente e sulla loro funzione. Siamo riusciti a sviluppare un nuovo modello organoide a partire dal tessuto dentale umano (cioè follicolo dentale, isolato dai denti del giudizio estratti). Gli organoidi sono espandibili in modo robusto e a lungo termine e ricapitolano il compartimento delle cellule staminali epiteliali del dente umano proposto in termini di espressione del marcatore e attività funzionale. In particolare, gli organoidi sono in grado di dispiegare un processo di differenziazione degli ameloblasti come avviene in vivo durante l'amelogenesi. Questo modello unico di organoidi fornirà un potente strumento per studiare non solo lo sviluppo dei denti umani, ma anche la patologia dentale e potrebbe aprire la strada alla terapia rigenerativa dei denti. La sostituzione dei denti persi con un dente biologico basato su questo nuovo modello organoide potrebbe essere un'alternativa interessante all'attuale impianto standard di materiali sintetici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I denti hanno ruoli essenziali nella masticazione alimentare, nella parola e nel benessere psicologico (immagine di sé). Il dente umano è costituito da tessuti altamente mineralizzati di varia densità e durezza1. Lo smalto dentale, il componente principale della corona del dente, è il tessuto mineralizzato più alto del corpo umano. Durante la formazione dello smalto (amelogenesi), quando i denti si sviluppano, le cellule staminali epiteliali dentali (DESC) si differenziano in cellule che formano lo smalto (ameloblasti). Una volta formato, lo smalto viene raramente riparato o rinnovato a causa della perdita apoptotica degli ameloblasti all'inizi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico ricerca UZ/KU Leuven (13/0104U). I terzi molari estratti (denti del giudizio) sono stati ottenuti dopo il consenso informato dei pazienti.

1. Preparativi

  1. Preriscaldare una piastra di coltura a 48 pozzetti per 15-20 ore in un incubatore CO2 all'1,9 % a 37 °C.
  2. Liquefare un'aliquota di Matrigel (fattore di crescita ridotto; priva di fenolo rosso; ulteriormente indicata come matrice di membrana basale; BMM) su ghiaccio (4 °C) per un minimo di 2 ore prima del punto 2.1.
    NOTA: Evitare cicli di congelamento/scongelamento del BMM.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sviluppo organoide dentale
Forniamo un protocollo dettagliato per stabilire colture organoidi da tessuto DF umano acquisito dopo l'estrazione del dente del giudizio (Figura 1A). Il DF isolato è dissociato enzimaticamente e meccanicamente. Le cellule ottenute vengono coltivate all'interno di BMM in mezzi che sono stati definiti empiricamente per lo sviluppo e la crescita ottimale degli organoidi (mezzo organoide dentale; TOM)19.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la generazione efficiente e riproducibile di organoidi a partire dal dente umano. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima metodologia per stabilire organoidi di concetto corrente (epiteliali) a partire dal tessuto dentale umano. Gli organoidi sono espandibili a lungo termine e mostrano un fenotipo di staminalità epiteliale dentale, duplicando i DESC precedentemente riportati nel compartimento ERM del DF7. Inoltre, gli organoidi replicano le caratteristiche funzionali D.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'autore corrispondente garantisce che tutti gli autori abbiano divulgato tutti i conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati a tutti i membri dello staff della Chirurgia Orale e Maxillo-Facciale (MKA) di UZ Leuven, così come ai pazienti, per il loro inestimabile aiuto nella raccolta dei terzi molari appena estratti. Vorremmo anche ringraziare la dott.ssa Reinhilde Jacobs e la dott.ssa Elisabeth Tijskens per il loro aiuto nella raccolta dei campioni. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. è un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLEppendorf30120.086
Provetta per centrifuga da 15 mLCorning430052
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM-6250
Piastre a fondo piatto a 48 pozzettiCorning3548
Provetta da centrifuga da 50 mLCorning430290
A83-01Sigma-Aldrich
AgarosioLonza50004
Albumina Bovina (grado di coltura cellulare)Serva47330.03
AMELX anticorpoSanta Cruzsc-365284
Amfotericina BGibco15200018
B27 (senza vitamina A)Gibco12587-010
CassettaVWR
Catalasi da fegato bovinoSigma-AldrichC100
CD44 anticorpoAbcamab34485
Filtro cellulare, 40 &; mFalcon352340
Tossina coleraSigma-AldrichC8052
Acido citricoSigma-AldrichC0759
CK14 anticorpoThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
Vetro di coperturaVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific 375353
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 senza FeInvitrogen074-90715A
DMEM in polvere Gibco ad alto contenuto di glucosio52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Siero d'asinoSigma-AldrichD9663 - 10ML
Stazione di lavoro per incorporamento, da 220 a 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Assoluto di etanolo, ≥ 99,8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= FGF di base)R& D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTInclude l'1% di β-mercaptoetanolo disciolto in tampone di lisi
Pipetta Pasteur in vetroNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
Soluzione Y-27632 (inibitore ROCK, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulina da pancreas bovinoSigma-AldrichI6634
ITGA6Sigma-AldrichHPA012696
L-GlutamminaGibco25030024
Matrigel (fattore di crescita ridotto; senza rosso fenolo)Corning15505739
Vetrino per microscopioThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Unità filtro per siringa, 0,22  μ mMilliporeSLGV033R
Minimo essenziale aquila media (α MEM)Sigma-AldrichM4526
topo IgG (Alexa 555) anticorpo secondarioThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetil L-cisteinaSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 anticorpoAbcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EAPenna di marcatura
Paraformaldeide (PFA), 16%Merck8.18715
Penicillina G sale sodicoSigma-AldrichP3032
Penicillina-streptomicina (Pen/Strep)Gibco15140-122
Piastradi PetriCorning353002
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco10010-015
Pipetta (P20, P200, P1000)Eppendorf o altri2231300006
Pipetta di trasferimento in plastica (3,5  mL)Sarstedt86.1171.001
IgG di coniglio (Alexa 488) anticorpo secondarioThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Bisturi (lama chirurgica)Swann-Morton207
SHHR& D Systems464-SH-200
Stampi in silicone (blocco riscaldante)VWR720-1918
Cloruro di sodio (NaCl)BDH102415K
Carbonato acido di sodio (NaHCO3)Merck106329
Piruvato di sodio (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
Anticorpo SOX2Abcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificSistema di PCR
Stericup-GP, 0,22 µ mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Unità filtrante sterile per centrifuga superiore, 0,22 μ mMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μ L. puntali per pipette con filtroGreiner740288
Sterile 20 μ L. puntali per pipette con filtroGreiner774288
Sterile 200 μ L puntali per pipette con e senza filtroGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
Sale di streptomicina solfatoSigma-AldrichS6501
Superscript III sintesi del primo filamentoSupermix Invitrogen11752-050Kit di trascrizione inversa
Processore di tessutiThermo Scientific
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Mezzo di montaggio Vectashield + DAPILabconsult NVH-1200Supporto di montaggio antifading con DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xileni, 99%, per biochimica e istologiaVWR2,89,75,325
SML07887202191 Anticorpo in tempo reale12505356

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tooth OrganoidsDental FollicleEpithelial Stem CellsAmeloblast DifferentiationEnamel FormationOrganoid CultureBasement Membrane MatrixTooth RegenerationStem Cell BiologyMarker Expression

Related Articles