Summary
我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。
Abstract
歯は、食物の咀嚼やスピーチだけでなく、心理的幸福のためにも人生において非常に重要です。人間の歯の発達と生物学に関する知識は乏しい。特に、歯の上皮幹細胞とその機能についてはあまり知られていません。ヒトの歯組織(抜いた親知らずから単離された歯包)を起点とした新規オルガノイドモデルの開発に成功しました。オルガノイドは堅牢かつ長期的に拡張可能であり、マーカー発現および機能活性の点で提案されたヒト歯上皮幹細胞区画を再現する。特に、オルガノイドは、アメロジェネシス中に インビボで 起こるようなアメロブラスト分化過程を展開させることができる。このユニークなオルガノイドモデルは、ヒトの歯の発達だけでなく、歯の病態を研究するための強力なツールを提供し、歯の再生治療への道を開く可能性があります。この新しいオルガノイドモデルに基づいて失われた歯を生物学的歯に置き換えることは、合成材料の現在の標準的な移植に代わる魅力的な代替手段となる可能性があります。
Introduction
歯は、食物咀嚼、スピーチ、心理的幸福(自己イメージ)に不可欠な役割を担っています。人間の歯は、さまざまな密度と硬度1の高度に石灰化された組織で構成されています。歯冠の主成分である歯科用エナメル質は、人体で最も高い石灰化組織です。エナメル質形成(アメロジェネシス)の間、歯が発達すると、歯科上皮幹細胞(DESC)はエナメル質形成細胞(アメロブラスト)に分化する。一度形成されると、エナメル質は、歯の噴火の開始時にアメロブラストのアポトーシス損失のためにめったに修復または更新されない1。損傷したエナメル質組織の修復は、外傷または細菌性疾患によって引き起こされるように、現在、合成材料を使用して達成されている。しかし、これらは、マイクロリーク、劣悪なオッセオインテグレーションとアンカー、有限寿命、および完全に機能する修復の欠如などの重要な欠点に悩まされています2。したがって、アメロブラストを生成する能力と石灰化組織を生成する可能性を備えたヒトDESCの堅牢で信頼性の高い培養は、歯科再生分野における大きな前進となるでしょう。
ヒトDESC表現型および生物学的機能に関する知識は乏しい3,4,5。興味深いことに、ヒト歯のDESCは、マラセスの上皮細胞レスト(ERM)に存在することが提案されているが、これは未発火の歯を囲む歯包(DF)内に存在し、歯が噴出すると歯根の周りの歯周靭帯に存在する1。歯髄と共培養したERM細胞は、アメロブラスト様細胞に分化し、エナメル質様組織を生成することが分かっている6。しかしながら、エナメル質(再)生成におけるERM細胞の特定の役割に関する深遠な研究は、信頼できる研究モデルの欠如のために制限されている7。現在のERMインビトロ培養システムは、8、9、10、11、12に標準的に使用されている2D条件における限られた寿命および表現型の迅速な喪失によって妨げられている。したがって、ヒトDESCを忠実に拡張、研究、および区別するための扱いやすいin vitroシステムが強く必要とされている。
過去10年間、上皮幹細胞をインビトロで増殖させる強力な技術は、いくつかのタイプの(ヒト)上皮組織に適用され、その生物学および疾患を研究することに成功している13、14、15、16。この技術により、組織上皮幹細胞は、細胞外マトリックス(ECM)を模倣した足場(典型的にはマトリゲル)に播種され、組織の幹細胞ニッチシグナル伝達および/または胚発生を複製する定義された培地で培養されると、3D細胞構造(すなわち、オルガノイド)に自己発達する。オルガノイド発生に必要な典型的な成長因子には、上皮成長因子(EGF)および翼なし型MMTV集積部位(WNT)活性化剤14、15、16が含まれる。得られたオルガノイドは、組織の元の上皮幹細胞を模倣する際の持続的な忠実度、ならびにそれらの表現型および機能的特性を保持しながら高い拡張性によって特徴付けられ、それによって診療所から取得されたしばしば制限された原発性ヒト組織の利用可能性を克服する。オルガノイドを樹立するために、培養前の異種組織(すなわち、間葉系細胞などの他の細胞型を含む)からの上皮幹細胞の単離は、間葉系細胞がECMに付着しない、またはECMで繁栄しないように必要ではなく、最終的に純粋に上皮オルガノイド13、16、17、18、19をもたらす.この有望で汎用性の高い技術は、様々なヒト上皮組織からの多様体オルガノイドモデルの開発につながった。しかし、歯の発達、再生、および疾患の深い研究に貴重なヒト歯由来オルガノイドは、まだ確立されていませんでした20,21。我々は最近、青年期患者19から抽出した第3大臼歯(親知らず)からのDF組織を起点としたこのような新しいオルガノイドモデルの開発に成功した。
ここで、我々は、成体ヒト歯から(すなわち、第3大臼歯のDFから)上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコールを記載する(図1A)。得られたオルガノイドは、ERM関連ステムネスマーカーを発現しながら、長期的に拡張可能である。興味深いことに、他のほとんどのオルガノイドモデルとは対照的に、典型的に必要とされるEGFは、堅牢なオルガノイドの発生および成長のために冗長である。興味深いことに、ステムネスオルガノイドはアメロブラスト分化特性を示し、それによって インビボで起こるERM/DESCの特徴およびプロセスを模倣する。ここで説明する新しくユニークなオルガノイドモデルは、DESCの生物学、可塑性、分化能力を探求することを可能にし、歯の再生アプローチへの第一歩を踏み出すための扉を開きます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、倫理委員会研究UZ/KUルーヴェン(13/0104U)によって承認されています。抽出された第3大臼歯(親知らず)は、患者のインフォームドコンセントの後に得られた。
1. 準備
- 48穴培養プレートを37°Cの1.9%CO2インキュベーター内で15〜20 時間予温する。
- マトリゲルアリコートを液化する(成長因子還元;フェノールレッドフリー;さらに基底膜マトリックスと呼ばれる;BMM)を氷上(4°C)上で、ステップ2.1の前に最低2時間使用してください。
メモ: BMM の凍結/解凍サイクルは避けてください。BMMを氷上で15〜20時間液化し、微量遠心チューブに1mLでアリコートし、-20°Cで保存する。 - 遠心分離機を4°Cに冷却する。
- 培地を調製し、0.22μmのフィルターで溶液をろ過する。以下の体積は、典型的には同時に抽出される4つの第3大臼歯すべてからのDFの収集に基づいている。
- 20mLのDF収集培地(表1)を調製する:10%ウシ胎児血清(FBS)、0.5%アムホテリシンBおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを含む最小必須培地ワシ(αMEM)。4 mL の DF 収集培地を 15 mL チューブに移し、チューブを氷上で移す。
注:サンプル採取には、患者1人につき1本の15mLチューブで十分です(すなわち、3分の4の大臼歯の場合)。 - 20mLの歯オルガノイド培地(さらにTOMと呼ばれる; 表2)無血清定義培地(SFDM; 表3)。TOMを4°Cで最大2週間保管してください。
- 8 mLの解離培地(表4)、すなわち、コラゲナーゼVI(3mg/mL)およびディスパーゼII(4mg/mL)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製する。解離培地を37°Cの水浴中で使用前に少なくとも10分間予温し、2本の15mLチューブ(チューブあたり4mL)に移して4つのDF組織を解離させる。
- 70%EtOHを含む3つのウェル、PBSを含む3つのウェル、およびDF収集培地を含む3つのウェルを含む洗浄プレート(12ウェル)を準備する。
- サンプルあたり15mLの培地Aを作る(すなわち、患者あたり2つのDFあたり5mL; 表5)。
注: 次の手順は、滅菌条件下で実行する必要があります。
- 20mLのDF収集培地(表1)を調製する:10%ウシ胎児血清(FBS)、0.5%アムホテリシンBおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを含む最小必須培地ワシ(αMEM)。4 mL の DF 収集培地を 15 mL チューブに移し、チューブを氷上で移す。
2. 歯卵胞解離
- 関連するDFを有する第3大臼歯が収集媒体(氷上)に収集されたら、チューブの内容物をペトリ皿に移す。
- ピンセットで歯を持ち、手術用ブレードを使用してDFを慎重に隔離します。
メモ: この手順には練習が必要です。刃には注意してください。 - DFから残りの血液を洗浄するには、DF組織を70%EtOHの最初のウェル(洗浄プレート)に20秒間短時間置き、次に次のEtOHウェルに20秒間移し、さらに3番目のEtOHウェルに移します(合計で70%EtOHで最大1分;インキュベーション時間が長くなると細胞生存率が低下します)。
- 次に、3つのPBSウェルでリンスを継続する(合計で最大2分間)。
- 残りの3つのDF収集培地ウェルでDFをすすぎます(合計で最大20分まで)。
- すすぎたDFを新しいペトリ皿に移します。
- パラホルムアルデヒド(PFA)固定用のDFの1つ(〜5mm2)の小片を切断し(セクション7を参照)、PFA固定まで500μLのDF収集培地を含む微量遠心チューブに氷上(最大6時間)に保管する。
- 残りのDFを小片(約1 mm 2)に細かく刻みます。
注:凍結保存された組織から開始するのではなく、最適なオルガノイド形成および成長効率を得るために、新たに単離されたDF組織を直ちに処理することが推奨され、効率が低下する。それにもかかわらず、この工程で一次DF組織を凍結保存することができる(セクション5の凍結保存媒体およびプロトコールを参照のこと)。 - ミンチDFsを、予め加温した解離培地4mLを含む15mLチューブに移し、37°Cの水浴中で2時間インキュベートする。
注: 最適な解離を保証するために、4 mL の予備加温解離媒体 (1 本のチューブ) に 2 つの DF を追加します。 - 15分ごとに、DF解離媒体をガラスパスツールピペットを使用して上下に混ぜ合わせ、組織崩壊をスピードアップする。DF片が観察されなくなったら(通常は1時間後)、狭く磨かれた火で磨かれたパスツールピペットを使用してDF解離を進めます。
注: DF 解離を最適化するには、DF 分離の 1 時間以内に火の研磨によって狭められたパスツールピペットに切り替えてください。- その間に、50 μLのDNase(0.2 mg/mL; 表5)。
- 解離したDFを有する各チューブに5mLの培地A(DNaseを含む)を加え、室温(RT)で1分間インキュベートした。
- 細胞懸濁液(単一細胞および小細胞凝集塊を含む)を40μmの細胞ストレーナーを通して濾過し、残りの大きな断片および(ほとんどの)繊維組織を除去する。
- このステップで1人の患者からの解離したDFといくつかのチューブを組み合わせる。
- フィルターを 1 mL の培地 A. ろ過した細胞懸濁液を 200 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
- 上清を除去し、ペレットを1 mLのSFDMに再懸濁し(表3)、細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心管に移した。
- 自動セルカウンターを使用して細胞濃度を計算します。残っている細胞集塊を無視してください。
- 200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
歯牙オルガノイド培養の確立(図1A 、図2A)
- 得られた細胞数に基づいて、播種できるウェル数を算出する。1つの20 μL液滴は20,000個の細胞を含むべきである。最終混合物は、細胞懸濁液およびBMMから30:70の比率で構成される。
- 適量の上清を除去し、氷冷BMMに再懸濁し、BMM:めっき用の細胞懸濁液を70:30の比で得た。例えば、200,000個の細胞が得られたら、20μLのプレート10液滴をプレート化する。したがって、細胞懸濁液の60 μLが残るまで上清を除去し、140 μLの氷冷BMMを加えて再懸濁する。
- 気泡の発生を避けるためにゆっくりと再懸濁してください。BMMに再懸濁したら、微量遠心チューブを氷上に保管してください。
注:微量遠心チューブを氷上に保つことは、BMMの凝固を避けるために重要です。
- 気泡の発生を避けるためにゆっくりと再懸濁してください。BMMに再懸濁したら、微量遠心チューブを氷上に保管してください。
- 予熱した48ウェル培養プレートのウェルの中央に20 μL BMM液滴をピペットする。
- プレートをひっくり返し、1.9%CO2インキュベーター(SFDM緩衝液によれば%CO2)に入れ、37°Cで少なくとも20分間固化させる。
- ROCK阻害剤(RI;10μM)およびアムホテリシンB(0.1%)をTOMに加え、37°Cの水浴中で培地を予温する。
注:アムホテリシンBは光に敏感です。 - インキュベーターから48ウェルプレートを取り出し、直立させて、調製した予温培地250 μLをBMM液滴/細胞とともに各ウェルに追加し、プレートを1.9%CO2 インキュベーターに戻します。
- 培地をリフレッシュするには(好ましくは2~3日ごと)、48ウェルプレートを45°の角度で傾け、BMM液滴に触れないようにしながら前の培地を静かに取り除き、250μLの新しい予温したTOM培地を加えます。
注:重要な栄養素や成長因子の枯渇を避けるために、少なくとも週に3回リフレッシュすることをお勧めします。RIをTOMに添加する必要があるのは、最初の播種時と各継代の最初の日(セクション4を参照)で、アノイキスによる細胞死を防ぎ、オルガノイドの伸長を増強するためです。アムホテリシンBは、通過0(P0)の間に培地に添加されるだけで、真菌汚染の可能性を遮断する。
歯オルガノイド培養物の増幅と継代(図1B 、図2B)
- オルガノイドを培養の10〜14日間に継代する。
注:長期間の培養はオルガノイドの再増殖および継代性を制限する可能性があるため、長期間の培養は避けてください。初期発生時(P0)のみ、オルガノイドは、その増殖速度に応じて最大20日間(直径が最大±200μmに達するまで)培養することができる。 - 継代する必要があるオルガノイドを含むウェルから培地を除去する。1つの培養条件内で、最大4つのコンフルエントウェルをプールする( 図2C参照)。
- オルガノイドを採取するには、1ウェルあたり400 μLの氷冷SFDMをBMM液滴に直接加え、BMM液滴全体が外れるまで培地を上下に繰り返しピペッティングします。
- ウェルをプールする場合は、400 μL を最初のウェルから次のウェルに移し (以下同様)、プールする必要があるすべてのウェルのオルガノイド含有 BMM 液滴を除去します。
- 外れたBMMオルガノイドアセンブリを1.5mLの微量遠心チューブに移し、すべてのオルガノイド構造がウェルから収集されるまでステップ4.3を再度繰り返す。
- 200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- TrypLE Expressのアリコート(5μMでRIを補充)を37°Cの水浴中で予備温める。オルガノイドの微量遠心チューブあたり、400 μL の TrypLE Express の容量が必要です。
- 遠心分離後、上清を除去し、ペレットを400μLのTrypLEに再懸濁する。懸濁液を37°Cの水浴中で12分間インキュベートする。
- 400 μLの氷冷SFDMを加えて酵素を失活させ、200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を取り除きます。
- 先端(体積については下記参照)を氷冷SFDMでプレコートし、オルガノイドペレットを再懸濁する。
- オルガノイドの損失を避けるために、滅菌を危険にさらすことなく、できるだけ同じ(コーティング済みの)チップを再利用してください。
注:ペレットを再懸濁させるのに必要なSFDMの体積は、得られたオルガノイド構造の数および現在の継代数に依存する。 - 経験則として、継代の場合、P0〜P2-3(一般に、まだ少数のオルガノイドが成長している)は、200μLのSFDMの容量を使用する。継代から、P3-4以上(一般に、より多くのオルガノイドを生じる)は、700μLのSFDMの容量を使用する。
メモ: どちらの手順も、それぞれ「低通過」および「高通過」方式と呼ばれます (ステップ 4.10 および 4.11 を参照)。異なる方法を正しく適用することは、オルガノイドの効率的な継代のために重要である。より高い継代法では、オルガノイドはより容易に失われ、少数のオルガノイド(すなわち、P0〜P2−3)には適用すべきではない。しかしながら、より多くのオルガノイドを効率的に解離させるためには、より高い継代法が必要である。
- オルガノイドの損失を避けるために、滅菌を危険にさらすことなく、できるだけ同じ(コーティング済みの)チップを再利用してください。
- 低通過法:ペレットを200μLの氷冷SFDMに再懸濁する。完全に空になったピペットチップを微量遠心管の底部に押し付けて直径を小さくします。直径が十分に小さいかどうかを確認します(吸引が遅く、流れは歪んでいますが、ブロックされていません)。オルガノイドを機械的に破壊するために5分間上下にピペットをピペットします。
- より高い継代方法:P1000チップでペレットを700μLの氷冷SFDMに再懸濁する。このP1000チップの上にP200チップ(フィルターなし)を追加し、氷冷SFDMでプレコートします。ミディアムボリュームの少なくとも90%(オルガノイドを使用)を目指すためにピペットのボリューム設定を調整することで、気泡の形成を防ぎます。オルガノイドを機械的に破壊するために5分間上下にピペットをピペットします。
- 光学顕微鏡(倍率4倍)で、主に(唯一の)少数の未分散構造を有する単一細胞が得られるかどうかを確認してください。
- 500 μLの氷冷SFDMを微量遠心管に加え、解離した細胞混合物と新鮮なSFDMをピペッティングによって穏やかに混合する。
- 氷上に微量遠心管を垂直に配置して10分間、大きな未分散構造体を沈降させる。
注:非分散構造はオルガノイドの通過性に悪影響を及ぼすため、除去する必要があります。オルガノイド開始(P0)の場合、この沈降工程は不要である。 - 単一細胞および小細胞集塊を含む上清(継代法に応じて〜500〜1,000μL)を収集する。新しい微量遠心チューブに移し、190 x g で4°Cで10分間遠心分離した。
- 自動セルカウンターを使用して細胞濃度を計算します。残っている細胞集塊を無視してください。
- 播種できるウェルの数を数え、上記のように適切な細胞懸濁液/BMM比を計算します(セクション3)。
- BMMの70%を細胞ペレットに加え、微量遠心チューブを氷上に維持する。
注:BMMの固化を避けるために、微量遠心チューブを氷上に保持することが重要です。 - ステップ3.3から3.7まで進み、培養10日目から14日目の間に再度継代する。
5. 歯オルガノイドの凍結保存
- 継代のために上記のようにオルガノイドを集めて解離させる(ステップ4)。細胞懸濁液を200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、SFDM(70%)、FBS(20%)、およびDMSO(10%)を含む1mLの凍結保存培地にペレットを再懸濁する。
- 懸濁液をクライオビアルに移し、氷の上に置きます。クライオバイアルをクライオボックスに入れ、-80°C(少なくとも4時間)に移します。
- 1ヶ月以内に、凍結サンプルを液体窒素に移し、長期(>12ヶ月)保存してください。
6. 凍結保存歯オルガノイドの融解
- 解凍手順を開始する前に、20% FBS を含む 10 mL の SFDM を含む氷上にクライオビアごとに 15 mL チューブを 1 本置きます。
- 凍結槽を液体窒素から取り出し、氷の上に置きます。
注: 次の手順をできるだけ迅速に実行し、解凍時間が長すぎる (>5 分) およびステップ間の間隔が長すぎる (>5 分) ことは避けてください。このような延長は細胞の生存率を低下させるためです。 - 凍結槽を融解(〜1〜2分)するまで温水浴(37°C)に入れる。
- 直ちにクライオビアの内容物を氷冷15mLチューブに移し、200 x g で4°Cで5分間遠心分離した。
- 9 mLの上清を除去し、残りの1 mLを200 x g で4°Cで5分間遠心分離した。 上清を除去し、ペレットを1mLの氷冷SFDMで洗浄する。
- 細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、自動セルカウンターを使用して細胞を計数する。
- 播種できるウェルの数を数え、上記のように適切な細胞懸濁液/BMM比を計算します(セクション3)。
- 200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 BMM:TOMの70:30の比率でペレットを再懸濁し、氷上に保持する。
- ステップ3.3から3.7まで進み、培養の10日目から14日目まで継代します。
7. 歯オルガノイドの固定とパラフィン包埋
注:この手順(セクション8および9を含む)は、一次DF組織にも適用することができる。
- PFAにおける歯オルガノイドの固定
- ステップ 4.2 と同様に、各ウェルから培地を除去します。
- BMM液滴を脱落させてオルガノイドを回収する(ステップ4.3)。BMMオルガノイド混合物を1.5mL微量遠心管に移す。
- 200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 上清を除去し、500μLの4%PFAを加え、オービタルシェーカー上で穏やかに混合しながらRTで最低30分間(最大1時間)インキュベートする。
警告: PFA を使用するときは、化学フードを使用してください。 - 200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清を除去し、オルガノイドペレットをPBSで穏やかに振とうしながらRTで10分間すすいだ。
- オルガノイドペレットをさらに2回洗浄する(ステップ7.1.5)。固定オルガノイドを200 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
- ペレットを500 μLの70%EtOH(脱イオン水中)に再懸濁する。オルガノイドを4°Cの70%EtOH中に最大1ヶ月間保存する。
- 歯オルガノイドのアガロースおよびパラフィン埋め込み
注:パラフィンにオルガノイドを効率的に埋め込むには、アガロースに埋め込む追加のステップが必要です。- PFA固定オルガノイドを70%EtOH中、200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清を取り除きます。
- ガラス瓶に30mLのPBS中の2%アガロース溶液を調製する。ゲル状の構造が観察されるまで(600Wで約2.5分)、アガロース-PBS混合物をマイクロ波で温めます。
- 並行して、30mLのPBSを別のガラス瓶に加え、電子レンジで温めます(600Wで約2.5分)。アガロース溶液を1分間冷却する。
- P200チップの端を切断して、アガロース溶液を正確に操作し、気泡を避けます。
- 温かいPBS内のP200チップを数回上下にピペッティングして予温します。
- 予温したアガロース溶液150 μLをオルガノイドペレットに加え、気泡を避けながらオルガノイド - アガロース混合物を(最小限の再懸濁で)穏やかにピペッティングする。
注:最小限の再懸濁により、オルガノイドが互いに近接するため、ミクロトーム切片化時にアガロースゲル中のオルガノイドをよりよく配置することができます。 - 直ちにオルガノイド - アガロース混合物を同じ微量遠心チューブキャップに移し、チューブを水平に置き、アガロースを固化させる(RTで〜20分)。その間、カセットにラベルを付けます。
- 固化したら、ピンセットを用いて微量遠心機キャップからアガロースゲルを取り出し、標識カセットに移す。
- アガロース含有カセットを脱イオン水中の50%EtOHを含むビーカーに移す。EtOHの蒸発を避けるために、ビーカーをパラフィルムで覆う。
注:ビーカーの容積はカセットの数によって異なります。 - サンプルを組織処理装置で一晩処理します。
注:パラフィンはRTで固化するので、次の手順を迅速に実行する必要があります。 - 埋め込みワークステーションの加熱ブロックを15分間予温します。
- カセットに封入されたオルガノイド含有アガロースゲルを取り出し、予め加温した加熱ブロックに入れる。カセットからキャップを取り外し、後で使用するために脇に置いておきます。
- 残りの加熱ブロックをパラフィンで満たします。
メモ:ピンセットで、オルガノイド含有アガロースゲルがまだ加熱ブロックの底部にあるかどうかを確認します。軽量のため、浮遊し始め、サンプルが失われる可能性があります。 - カセットキャップを加熱ブロックの上に置きます。コールドプレート上で30分間固化させます。加熱ブロックを取り外し、パラフィンブロックを4°Cで保存する。
8. 歯牙オルガノイドのミクロトーム切片化と染色(図2Bおよび図3A-C)
- オルガノイド含有パラフィンブロックのミクロトーム切片化
- ミクロトームを用いてパラフィンブロック中の歯オルガノイドの5μm切片をスライスする。
- パラフィンスライスを顕微鏡スライドガラスの上に置きます。顕微鏡スライドガラスを37°Cの暖かいプレートの上に置き、パスツールピペットを用いてイオン交換水で覆った。
- 顕微鏡のスライドガラスを一晩乾燥させます。
- 歯オルガノイド切片の染色
- オルガノイド切片(顕微鏡スライドガラス上)をオーブン中で58°Cで1時間脱パラフィンする。
- オルガノイド切片(顕微鏡スライドガラス上)を化学フード内のEtOHシリーズを以下の順序で減少させて再水和します。
キシレン 2x 各 3 分
100% EtOH 2x 各 3 分間
95% EtOH 2x 各 3 分間
90% EtOH 2x 各 3 分間
70% EtOH 3x 各 3 分間
警告: キシレンを使用するときは、化学フードを使用してください。 - 顕微鏡スライドガラスを水道水でRTで5分間すすいでください。その後、PBSでRTで5分間すすいでください。
- オルガノイド切片(顕微鏡スライドガラス上)を、予め加温したクエン酸緩衝液(pH6の脱イオン水中にクエン酸10mM;プラスチック容器中;95°Cの水浴中で10分間予備加温)に95°Cの水浴中で30分間置くことにより、抗原賦活化を行う。
- 顕微鏡スライドガラスをRTで20分間冷却します。顕微鏡スライドガラスをPBSでRTで5分間すすぎ、次に0.1%Triton-X(PBT)を含むPBSでRTで5分間すすぎます。
- マーキングペンを使用して、各スライドの境界線に疎水性バリアを作成します。
- ブロッキングバッファー(1.5 mg/mL グリシン、2 mg/mL アルブミンを PBT に溶解したウシ血清 (BSA) を含む) に加え、10% ロバ血清を加えた RT で最低 1 時間ブロックします。
注: 通常、顕微鏡スライドガラスあたり 300 μL のブロッキングバッファーと 10% ロバ血清が必要です。 - 顕微鏡スライドガラスを湿気の多いチャンバー内に設置する。すべてのスライドが収まる気密ボックスを使用し、いくつかの紙のティッシュを水で濡らしてボックスの底に置きます。これにより、後続の染色ステップ中にスライドが乾燥するのを防ぐことができます。
- ブロッキングバッファーを取り出し、ブロッキングバッファーで調製した一次抗体(表6)に1%ロバ血清を加え、抗体溶液で覆われたスライドを4°Cの湿気の多いチャンバー内で一晩インキュベートした。 必要に応じて、ペンの境界線のマーキングをやり直します。
- 顕微鏡スライドガラスをPBTでRTで3回、オービタルシェーカー(75-150rpm)で穏やかに混合しながら10分間洗浄します。
- 1%ロバ血清を加えたブロッキングバッファーで調製した二次抗体(表6)を加え、RTで湿潤チャンバー内で1時間インキュベートした。
- ブロッキングバッファーを取り出し、顕微鏡スライドガラスをRTでPBTで3回、オービタルシェーカー上で穏やかに混合しながら10分間洗浄します。
- DAPI(1~3液滴)の入った退色防止マウント剤をガラスカバースリップに加え、オルガノイド切片(顕微鏡スライドガラス上)の上に取り付けます。イメージングを続行します。スライドを4°Cで最大1週間保管してください。
9. 歯オルガノイドのRNA抽出とRT-qPCR(図2Bおよび図3D)
- 歯オルガノイドのRNA抽出
- 各ウェルから培地を除去する(ステップ4.2)。
- BMM液滴を脱落させてオルガノイドを回収し(ステップ4.3)、BMMオルガノイド混合物を1.5mL微量遠心チューブに移し、200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 上清を取り出し、溶解緩衝液(材料表)に溶解した350 μLの1%β-メルカプトエタノールに激しく懸濁し、氷上においた。
警告: すべての手順は、化学フードにβ-メルカプトエタノールを入れて行ってください。
注:サンプルは、このステップで-80°Cで最大1ヶ月間保存できます。 ステップ 9.1.4 に進む前に、サンプルを氷上で解凍します。 - オルガノイド構造が観察されなくなるまでサンプルを渦巻きます。
- 製造元の指示に従って、RNA抽出キット(材料表)を使用してRNA抽出を進めます。
- 歯オルガノイドのRT-qPCR(表7)
- 逆転写キット(材料表)を用いてRNA19を製造者の指示に従って逆転写(RT)する。
- 得られたcDNAサンプルを、リアルタイムPCRシステムを用いてSYBRグリーンベースの定量PCR(qPCR)19 で分析します(材料表)。
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Representative Results
歯のオルガノイド発生
我々は、親知らずの抜歯後に取得したヒトDF組織からオルガノイド培養を確立するための詳細なプロトコールを提供する(図1A)。単離されたDFは酵素的および機械的に解離する。得られた細胞は、最適なオルガノイドの発達および増殖について経験的に定義された培地(歯オルガノイド培地;トム)19。
オルガノイドは、典型的には、DF細胞播種後2週間以内に発達する(P0; 図2A)。オルガノイドは長期間拡張可能です(これまでに最大11通路)(図2B、P4で示す)。BMM液滴あたり約20,000個の細胞を(P0およびさらなる継代の両方で)播種すると、最適な密度のオルガノイドが得られますが(図2C)、細胞数を増やすと、増殖するスペースが不十分であるため、最適ではないオルガノイドの増殖(すなわち、高すぎる密度でより小さなオルガノイド)につながります(図2D)。最終的に最適化された培養条件により、DFサンプルからのオルガノイドを100%の効率で開発することができます19。
歯のオルガノイドの特性評価と検証
発達したオルガノイドは、ERM細胞7で同様に観察されるように、緻密な外観を示し、高い核細胞質比を示す細胞を含む(図3A)。さらに、そしてさらなる類推において、オルガノイドはERMマーカーサイトケラチン14(CK14)22を発現し、それによってそれらの上皮起源(図3B)、ならびに他の提案されたERMマーカー(例えばP63、CD44およびITGα612、22、23(図3B)を確認する。さらに、オルガノイドは、マウスにおいてよく知られているDESCマーカーであるSOX2を発現し、発達中のヒト歯の上皮にも存在する(図3B)1。興味深いことに、エナメル質マトリックスの主成分であるアメロゲニン(AMELX)は、オルガノイドにおいても発現が見られ、ERM24においても検出される(図3C)。さらに他のERM/ステムネスマーカーの発現は、我々の最近の研究19に記載されており、得られたオルガノイドをさらに認証するために使用することができる。さらに、オルガノイドは継代中にERM/ステムネス表現型を保持し、とりわけERM/幹細胞マーカーの安定した発現によって示される(図3D)。最後に、歯由来オルガノイドはアメロブラスト(様)細胞への分化能を示し、得られたオルガノイド培養物を検証するためにも適用することができ、分化培地への移入後に象原性アメロブラスト関連タンパク質(ODAM)およびアメロチン(AMTN)などの成熟アメロブラストマーカーの発現を示す(19参照)。
図1:歯オルガノイドの発生、特性評価、および応用の概略ワークフロー。 (A)噴出していない第3大臼歯から単離された歯包(DF)組織からの歯オルガノイドの発生。(B)歯オルガノイドの増幅、特性評価、および適用可能性。d, 日;P、パッセージ。BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:歯のオルガノイドの発達 。 (A)DF組織からのオルガノイドの発達。播種後の異なる日(d)に示された代表的な明視野画像(P0;P、パッセージ;(B)歯オルガノイドライン(2.5x)の堅牢な通過性を示す明視野画像。(C)継代直後の歯オルガノイドライン(d0;左;2.5x)をウェル当たり20,000細胞の密度で播種し、得られたコンフルエントなオルガノイド培養物を継代する準備ができていることを示す明視野画像(d14;右;2.5x)。(D)歯のオルガノイド系統を示す明視野画像は、>20,000細胞の密度で播種され、d14(2.5倍)で高密度でより小さなオルガノイドをもたらした。スケール バー: 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:歯のオルガノイド特性評価。 (A)TOMにおいて14日目に発達した緻密な構造を示す異なる倍率でのDF由来オルガノイド培養物の明視野画像(P4;5-20x))。オルガノイドのヘマトキシリンおよびエオジン染色(P1、11日目)。ボックスが拡大されます。矢印は、高い核細胞質比を有する細胞を示す。(B) TOM増殖オルガノイドにおける上皮/ERM/ステムネスマーカーの免疫蛍光染色(20倍)。(c)TOM増殖オルガノイド(20x)におけるアメロゲニン(AMELX)の免疫蛍光染色。DAPI(青色)は、核を標識するために使用された。(D) 培養14日目におけるP1およびP5 TOM増殖オルガノイドにおけるERM/ステムネスマーカーの遺伝子発現レベル(GAPDHに対する)(SEM±平均;n = 3生物学的複製)。スケールバー:特に断りのない限り、50μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 歯の卵胞(DF)採取培地 | |
| 名前 | 濃度 |
| 最小必須ミディアムイーグル(αMEM) | |
| ウシ胎児血清(FBS) | 10% |
| アムホテリシンB | 0.5% |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(ペン/ストレップ) | 1% |
表1:歯の卵胞(DF)採取培地。この表は、DF 収集媒体の構成員をリストします。
| 歯オルガノイド培地(TOM) | |
| 名前 | 濃度 |
| 無血清定義培地(SFDM) | 組成については表3を参照のこと |
| A83-01 · | 0.5 μM |
| B27(ビタミンA不使用) | 2% |
| コレラ毒素 | 100 ng/mL |
| FGF2(=基本FGF) | 20 ng/mL |
| FGF8 | 200 ng/mL |
| FGF10 | 100 ng/mL |
| L-グルタミン | 2ミリオンユーロ |
| IGF-1 | 100 ng/mL |
| N2 · | 1% |
| N-アセチルL-システイン | 1.25 ミリアン ペア月間 |
| ニコチンアミド | 10ミリオンメートル |
| 頭 | 100 ng/mL |
| RSPO1 | 200 ng/mL |
| SB202190 (p38i) | 10 μM |
| しーっ | 100 ng/mL |
| WNT3a | 200 ng/mL |
表2:歯オルガノイド培地(TOM) 表は、歯オルガノイド培地を調製するために必要な成分およびそれらのそれぞれの濃度をリストする。
| 無血清規定培地(SFDM)(pH 7.3) | |
| 名前 | 濃度 |
| 滅菌H2O | |
| DMEM 1:1 F12 (Feなし) | 16.8グラム/L |
| トランスフェリン | 5ミリグラム/リットル |
| ウシ膵臓からのインスリン | 5ミリグラム/リットル |
| ペニシリンGナトリウム塩 | 35ミリグラム/リットル |
| 硫酸ストレプトマイシン塩 | 50ミリグラム/リットル |
| エタノール絶対、≥99.8%(EtOH) | 600 μL/L |
| ウシ肝臓由来のカタラーゼ | 50 μL/L |
| 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) | 1グラム/リットル |
| ウシのアルブミン(細胞培養グレード) | 5グラム/L |
表3:無血清規定培地(SFDM)(pH 7.3)。 表は、無血清定義培地の組成を列挙する。
| 解離媒体 | |
| 名前 | 濃度 |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | |
| コラゲナーゼIV | 3ミリグラム/mL |
| ディスパーゼII | 4ミリグラム/mL |
表4:解離培地。 解離培地を調製するための構成成分およびそれらの必要な濃度のリスト。
| 培地A(pH 7.3) | |
| 名前 | 濃度 |
| 滅菌H2O | |
| DMEM粉末高グルコース | 13.38グラム/L |
| ヘーペス | 5.958グラム/L |
| ピルビン酸ナトリウム(C3H3NaO3) | 110 ミリグラム/リットル |
| ペニシリンGナトリウム塩 | 35ミリグラム/リットル |
| 硫酸ストレプトマイシン塩 | 50ミリグラム/リットル |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | 0.5グラム/L |
| 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) | 1グラム/リットル |
| ウシのアルブミン(細胞培養グレード) | 3グラム/L |
| ドナーゼ* | 0.2 ミリグラム/ミリリットル |
| *言及されたら追加 |
表5:培地A(pH7.3)。 表は、培地Aを調製するために使用された構成成分の濃度をリストする。
| 一次抗体 | ||
| 名前 | ホスト | 濃度 |
| アメルクス | 鼠 | 1:100 |
| CD44 · | 鼠 | 1:200 |
| CK14 · | 鼠 | 1:200 |
| ティッカー | 兎 | 1:200 |
| P63 · | 兎 | 1:1000 |
| ソックス2 | 兎 | 1:2000 |
| セクンダリー抗体 | ||
| 名前 | ホスト | 濃度 |
| マウスIgG (アレクサ 555) | 驢馬 | 1:1000 |
| ウサギIgG (アレクサ 488) | 驢馬 | 1:1000 |
表6:抗体およびその希釈物のリスト。 表は、この研究で使用された抗体およびそれらのそれぞれの希釈を列挙する。
| プライマー | ||
| 遺伝子 | フォワードプライマー | リバースプライマー |
| ガプド | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 · | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| ティッカー | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| ソックス2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| ティッカー | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
表7:プライマーのリスト。 この表は、この研究で使用したGAPDH、P63、ITGA6、SOX2、およびPITX2のプライマーをリストしています。
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Discussion
このプロトコルは、ヒトの歯から始まるオルガノイドの効率的かつ再現性のある生成を記述する。我々の知る限り、これはヒトの歯科組織から始まる現在の概念(上皮)オルガノイドを確立するための最初の方法論である。オルガノイドは長期拡張可能であり、歯の上皮ステムネス表現型を示し、DF7のERMコンパートメントで以前に報告されたDESCを複製する。さらに、オルガノイドは、アメロブラスト分化プロセスの展開を含む機能的なDESC/ERM特性を複製する7,25,26。独立した患者オルガノイド系統19で同等の結果が見出されたので、所見は頑健である。
この歯のオルガノイドプロトコルを実行する際には、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。第1に、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を初期播種時および各継代直後に添加することは、単一細胞がアノイキス27を受けるのを防ぐために不可欠である。さらに、アムホテリシンBは、(経口)真菌の増殖を避けるために、P0中のすべての培地軽食において必要とされる。第二に、凍結保存された組織から開始するのではなく、最適なオルガノイド形成および成長効率を得るために、新たに単離されたDF組織を直ちに処理することが推奨される。第3に、培養のために凍結保存されたオルガノイド系統を融解する場合、ステップをできるだけ迅速に行い、時間の延長が細胞生存率を低下させるため、解凍時間が長すぎること、およびステップ間の間隔が長すぎることを避ける。第四に、早期継代時のオルガノイド(P0−P3)の数は限られたままであり得、また、限られた数のERM(幹細胞)細胞のみが特異的に単離されたDF組織サンプル中に存在し得るので、留意されたい。したがって、早期通過時のオルガノイド培養物は、注意と配慮をもって取り扱うべきである。したがって、(i)オルガノイド培養の急速な拡大を避けることが推奨される(すなわち、P3-4から1:3以上で、1:0.5または1:1より前にのみ分裂を開始する)。(ii)記載された適切な分割方法(低通路−高通路)を使用する。この文脈の中で、ERM細胞は歯の発達および28歳とともに数が減少するため、若い青年期患者(15〜19歳)の未発疹の親知らずを採取することが推奨される。第五に、DF組織から細胞懸濁液中に未分散の硬組織断片が(濾過後でさえも)残存すると、BMMドロップの安定性が低下し、培養中に脱落する可能性が高くなる。解離したDF細胞懸濁液中に複数の未分散の硬組織断片が観察される場合は、BMMの割合(80%など)を高くすることをお勧めします。第六に、培養10日目から14日目の間にオルガノイドを継代することを強くお勧めします、なぜなら、より長い培養は、最適でない解離のためにオルガノイドの拡張性に悪影響を及ぼすからです。いずれかの理由でオルガノイドを14日より長く培養する場合、TryplE Expressの量とオルガノイド解離のためのインキュベーション時間を延長して効率的な解離を図ることができますが、酵素曝露の15分を超えるべきではありません。同じ文脈の中で、栄養と成長因子の枯渇を防ぐために、培養培地を2〜3日ごとにリフレッシュする必要があります。オルガノイドが適切に膨張しない場合は、上記の重要な点にかかわらず、氷上での継代中に使用されるすべてのツール(BMM、プレコーティングチップ用の氷冷SFDM、微量遠心チューブ)を維持することに集中する必要があります。さらに、オルガノイドの効率的な継代のためには、別個の継代法(低継代法と高継代法)を正しく適用することが重要です。
以前にも、他のグループは、初代ヒトDESC/ERM組織のインビトロ増殖を報告している8、9、10、11、12、21。しかし、このオルガノイドモデルのような培養物は主に2D(単層)であり、3Dではなく、しかも短期的な増殖と表現型保持しか示さなかった。あるいは、しばしば(自発的に)不死化された細胞が使用されたが、これは生理学的ではなく、起源の組織または細胞との限られた類似性しか示さない。さらに、これらの細胞株は、胚組織および/または動物由来であった。さらに、アメロブラスト分化は、記載されていないか、または限定的に文書化されているにすぎない。したがって、ここで提示されたオルガノイドモデルは、(i)起源の組織/細胞の忠実な反復、(ii)長期拡張性、(iii)in vivo構成をより密接に表す3Dで培養すること、(iv)ヒト起源および出生後の年齢、および(v)成熟した歯科細胞(アメロブラスト細胞型)に分化することができる(19参照)。
したがって、これまでに報告されなかった貴重な研究ツールを作成し、いくつかの興味深いアプリケーションを保持しました(図1B)。オルガノイドは、ヒトDESC/ERMのステム性および可塑性の研究に適用することができる。これは、免疫蛍光、遺伝子発現、および(単一細胞)トランスクリプトーム分析によって、まだ謎めいたERM細胞集団の生物学へのさらなる洞察を得る機会を提供する。さらに、オルガノイドは、病原性メカニズムを解読し、(新しい)治療標的を同定し、創薬およびスクリーニングツールを生成するヒト疾患モデリングに特に適している29。より具体的には、このモデルは、健康な歯由来オルガノイドと比較することができる歯原性嚢胞(信頼できる研究モデルが利用できない)に適用することができる。さらに、この歯のオルガノイドアプローチは、細菌の影響から歯の異常に関連する遺伝子変異(CRISPR-Casなどの最先端の遺伝子編集法を使用して導入できるP63の変異など)30に至るまでの歯の疾患をモデル化および研究するために利用され、最終的には可能性と新規な治療標的、および治療法につながる可能性があります。歯オルガノイドプロトコルの他の用途には、多様な人や疾患からオルガノイドラインを収集するためのバイオバンキング(現在、Future Health Biobankなどの歯髄ですでに利用可能)31が含まれる(例えば、薬物スクリーニングなどの基礎研究およびトランスレーショナル研究のため)。さらに、上皮だけでなく、起源組織の他の細胞型も含む複合オルガノイドモデルに関するいくつかの報告が最近発表されている32,33。歯の組成はかなり複雑で、間葉系、免疫系、および内皮系細胞を収容するため、これらの細胞型と組み合わせてこの上皮オルガノイドモデルを適用して、それらのin vivo対応物をより詳細に表現することは魅力的な視点です。また、このシステムは、現時点ではほとんど理解されていないが、確かに上皮 - 間葉相互作用に依存しているヒト歯におけるアメロジェネシスを探索することを可能にする。アメロブラストの解読開発は、歯の典型的な成分であるエナメル質の生産が歯科組織修復において非常に追求されている目標であるため、歯科科学および臨床の世界における重要な飛躍を表すことが期待されています。さらに、この研究で詳述されたオルガノイドモデリングは、インビトロでの石灰化組織の形成に向けた開始を意味し、補充療法のための生体工学的歯(または少なくとも部分)の開発への道を開く可能性がある。
オルガノイドモデルの限界の1つは、それが組織の上皮成分のみを表すことである。しかしながら、上記で詳細に説明したように、この欠点は、歯科用間葉19のような他の細胞/組織タイプの添加によって解決することができる。限定として認識され得る別の態様は、ここで使用されるBMM(マトリゲル)の起源である。このBMMはマウスの肉腫(Engelbrecht-Holm-Swarm)に由来するため、オルガノイドアプローチを診療所に翻訳する前に交換する必要があります。最近、マトリゲルを合成ヒドロゲル34、35で置き換えるためにいくつかの努力がなされている。しかし、このような非天然ゲル中でオルガノイドを正常に増殖させるためには、より多くの研究が必要である。オルガノイド技術は、将来の歯科再生療法(例えば、バイオエンジニアリングされた歯の開発)のための興味深いアプローチを提供するが、細胞ドナーのプライバシーおよびヒトオルガノイドおよびそれに由来する組織の商業化に関して倫理的疑問が提起されるべきである。これまでのところ、再生目的でのオルガノイドの商業化に関する結論は得られていない36。歯髄バイオバンク31、ならびに薬物スクリーニングの目的で、いくつかの、主に癌組織からのオルガノイドバイオバンクが増加している。オルガノイドを細胞、配偶子、組織、または器官(これらはすべて法律によって規制されている)として分類することができないことを考えると、臨床的、科学的、または商業的環境におけるその使用のための法的地位を描写することが緊急に必要である。オルガノイドは、皮下移植時に石灰化組織を沈着させることが示されているが19、天然のヒト歯と同様のエナメル質を沈着させる可能性を分析するためには、さらなる研究が必要である。
全体として、開発された新しいオルガノイドモデルは、ヒト歯(幹細胞)生物学とアメロジェネシスを研究するための有望で貴重なツールを提示しますが、どちらも現時点ではあまり探求されておらず、歯の疾患モデリングと再生療法に向けた将来の見通しがあります。
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Disclosures
対応する著者は、すべての著者がすべての利益相反を開示したことを保証します。
Acknowledgments
UZ Leuvenの口腔および顎顔面外科(MKA)のすべてのスタッフと患者、新しく抽出された第3大臼歯の収集における貴重な支援に感謝しています。また、ラインヒルデ・ジェイコブス博士とエリザベス・ティスケンス博士のサンプル収集に協力してくれたことにも感謝します。この研究は、ルーヴェン大学(BOF)とFWO-フランダース(G061819N)からの助成金によって支援されました。L.H.はFWO博士研究員(1S84718N)です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
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