Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utveckla epitelorganoidkulturer med utgångspunkt från mänsklig tand. Organoiderna är robust expanderbara och rekapitulerar tandens epitelstamceller, inklusive deras ameloblastdifferentieringskapacitet. Den unika organoidmodellen ger ett lovande verktyg för att studera människans tandbiologi med perspektiv för tandregenerativa metoder.
Abstract
Tänder är av avgörande betydelse i livet, inte bara för matmastik och tal utan också för psykologiskt välbefinnande. Kunskap om mänsklig tandutveckling och biologi är knapp. I synnerhet är inte mycket känt om tandens epitelstamceller och deras funktion. Vi lyckades utveckla en ny organoidmodell med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad (dvs. tandfollikel, isolerad från extraherade visdomständer). Organoiderna är robust och långsiktigt expanderbara och rekapitulerar det föreslagna humana tandepiteliala stamcellsfacket när det gäller marköruttryck såväl som funktionell aktivitet. I synnerhet kan organoiderna utveckla en ameloblastdifferentieringsprocess som förekommer in vivo under amelogenes. Denna unika organoidmodell kommer att ge ett kraftfullt verktyg för att studera inte bara mänsklig tandutveckling utan också tandpatologi och kan bana väg för tandregenerativ terapi. Att ersätta förlorade tänder med en biologisk tand baserad på denna nya organoidmodell kan vara ett tilltalande alternativ till den nuvarande standardimplantationen av syntetiska material.
Introduction
Tänder har viktiga roller i matmasticering, tal och psykologiskt välbefinnande (självbild). Den mänskliga tanden består av mycket mineraliserade vävnader med varierande densitet och hårdhet1. Tandemaljen, huvudkomponenten i tandkronan, är den högsta mineraliserade vävnaden i människokroppen. Under emaljbildning (amelogenes), när tänderna utvecklas, differentieras tandepitelstamceller (DESC) till emaljbildande celler (ameloblaster). När den väl har bildats repareras eller förnyas emaljen sällan på grund av den apoptotiska förlusten av ameloblasterna vid början av tandutbrott1. Restaurering av skadad emaljvävnad, orsakad av trauma eller bakteriell sjukdom, utförs för närvarande med hjälp av syntetiska material; dessa är dock oroliga med viktiga brister som mikroleakage, sämre osseointegration och förankring, ändlig livslängd och brist på fullt fungerande reparation2. Därför skulle en robust och pålitlig odling av humana DESC med kapacitet att generera ameloblaster och potential att producera mineraliserad vävnad vara ett stort steg framåt inom det dentala regenerativa området.
Kunskap om human DESC fenotyp och biologisk funktion är knapp 3,4,5. Intressant nog har DESC av mänskliga tänder föreslagits att existera i Epitelcellsvila i Malassez (ERM), cellkluster som finns i tandfollikeln (DF), som omger oeruperade tänder och förblir närvarande i det parodontala ligamentet runt roten när tanden bryter ut1. ERM-celler samodlade med tandmassa har visat sig differentieras till ameloblastliknande celler och generera emaljliknande vävnad6. Djupgående studier av ERM-cellernas specifika roll i emaljgenerering (åter) har dock begränsats på grund av bristen på tillförlitliga studiemodeller7. Nuvarande ERM-in vitro-odlingssystem hämmas av begränsad livslängd och snabb förlust av fenotyp under de 2D-förhållanden som vanligtvis används 8,9,10,11,12. Därför behövs ett lätthanterligt in vitro-system för att troget expandera, studera och differentiera humana DESC.
Under det senaste decenniet har en kraftfull teknik för att odla epitelstamceller in vitro framgångsrikt tillämpats på flera typer av (mänskliga) epitelvävnader för att studera deras biologi såväl som sjukdom 13,14,15,16. Denna teknik gör det möjligt för vävnadsepitelstamcellerna att självutvecklas till 3D-cellkonstruktioner (dvs. organoider) när de sås in i en extracellulär matris (ECM) -härmande ställning (vanligtvis Matrigel) och odlas i ett definierat medium som replikerar vävnadens stamcellsnischsignalering och / eller embryogenes. Typiska tillväxtfaktorer som behövs för organoidutveckling inkluderar epidermal tillväxtfaktor (EGF) och mmtv-integrationsställen (WNT) av vinglös typ 14,15,16. De resulterande organoiderna kännetecknas av varaktig trohet när det gäller att efterlikna vävnadens ursprungliga epitelstamceller, liksom hög expanderbarhet samtidigt som de behåller sin fenotyp och funktionella egenskaper och därigenom övervinner den ofta begränsade primära mänskliga vävnadstillgängligheten som förvärvats från kliniken. För att etablera organoider krävs inte isolering av epitelstamcellerna från den heterogena vävnaden (dvs. innefattande andra celltyper såsom mesenkymala celler) före odling eftersom mesenkymala celler inte fäster vid eller trivs i ECM, vilket så småningom resulterar i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denna lovande och mångsidiga teknik har lett till utvecklingen av mångfaldiga organoidmodeller från olika mänskliga epitelvävnader. Emellertid var mänskliga tand-härledda organoider, värdefulla för djup studie av tandutveckling, regenerering och sjukdom, inte etablerade ännu20,21. Vi lyckades nyligen utveckla en sådan ny organoidmodell med utgångspunkt från DF-vävnad från tredje molar (visdomständer) extraherade från ungdomar19.
Här beskriver vi protokollet för att utveckla epitelorganoidkulturer från den vuxna mänskliga tanden (dvs från DF för tredje molar) (Figur 1A). De resulterande organoiderna uttrycker ERM-associerade stamhetsmarkörer samtidigt som de är långsiktigt expanderbara. Intressant nog, i motsats till de flesta andra organoidmodeller, är den vanligtvis nödvändiga EGF överflödig för robust organoidutveckling och tillväxt. Intressant nog visar stamorganoiderna ameloblastdifferentieringsegenskaper och efterliknar därmed ERM / DESC-egenskaper och processer som förekommer in vivo. Den nya och unika organoidmodellen som beskrivs här gör det möjligt att utforska DESC-biologi, plasticitet och differentieringskapacitet och öppnar dörren för att ta de första stegen mot tandregenerativa tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av etikkommittén Research UZ/KU Leuven (13/0104U). Extraherade tredje molarer (visdomständer) erhölls efter patienternas informerade samtycke.
1. Förberedelser
- Förvarma en odlingsplatta med 48 brunnar i 15-20 timmar i en 1,9%CO2-inkubator vid 37 °C.
- Kondensera en Matrigel alikvot (tillväxtfaktorreducerad; fenol rödfri; vidare kallad källarmembranmatris; BMM) på is (4 °C) i minst 2 timmar före steg 2.1.
OBS: Undvik frysnings- / upptiningscykler av BMM. Kondensera BMM i 15-20 timmar på is och alikvot vid 1 ml i mikrocentrifugrör och förvara vid -20 °C. - Kyl centrifugen till 4 °C.
- Förbered media och filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter. Följande volymer är baserade på insamlingen av DFs från alla fyra tredje molarer som vanligtvis extraheras samtidigt.
- Förbered 20 ml DF-uppsamlingsmedium (tabell 1): minsta essentiella mediumörn (αMEM) som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,5% Amfotericin B och 1% penicillin-streptomycin. Överför 4 ml DF-uppsamlingsmedium till ett 15 ml rör och överför rören på is.
OBS: Ett 15 ml rör är tillräckligt per patient för provtagning (dvs. för fyra tredje molar). - Gör 20 ml tandorganoidmedium (vidare kallat TOM; Tabell 2) användning av serumfritt definierat medium (SFDM; Tabell 3). Förvara TOM vid 4 °C i högst 2 veckor.
- Bered 8 ml dissociationsmedium (tabell 4), dvs. fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande kollagenas VI (3 mg/ml ) och dispas II (4 mg/ml). Förvarda dissociationsmediet i ett 37 °C vattenbad i minst 10 minuter före användning och överför det till två 15 ml rör (4 ml per rör) för att dissociera fyra DF-vävnader.
- Förbered en tvättplatta (12-brunn) som innehåller: tre brunnar med 70% EtOH, tre brunnar med PBS och tre brunnar med DF-uppsamlingsmedium.
- Gör 15 ml medium A per prov (dvs. 5 ml per två FÖRSÄMRING per patient; Tabell 5).
OBS: Följande steg bör utföras under sterila förhållanden.
- Förbered 20 ml DF-uppsamlingsmedium (tabell 1): minsta essentiella mediumörn (αMEM) som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,5% Amfotericin B och 1% penicillin-streptomycin. Överför 4 ml DF-uppsamlingsmedium till ett 15 ml rör och överför rören på is.
2. Dental follikel dissociation
- När de tredje molarna med tillhörandeDF har samlats upp i uppsamlingsmediet (på is), överför rörens innehåll till en petriskål.
- Håll tanden med en pincett och isolera försiktigt DF med ett kirurgiskt blad.
OBS: Detta steg kräver övning; var försiktig med bladet. - För att tvätta det återstående blodet från DFs, placera DF-vävnaderna kort i den första brunnen på 70% EtOH (tvättplatta) i 20 s och överför sedan till nästa EtOH-brunn i 20 s och vidare till den tredje EtOH-brunnen (maximalt 1 min i 70% EtOH totalt; längre inkubationstid kommer att resultera i minskad cellviabilitet).
- Fortsätt sedan sköljningen i de tre PBS-brunnarna (max 2 min totalt).
- Skölj DFs i de tre återstående DF-uppsamlingsmediebrunnarna (upp till maximalt 20 minuter totalt).
- Överför de sköljda DFs till en ny petriskål.
- Skär en liten bit av en av DFs (~ 5 mm2) för paraformaldehyd (PFA) fixering (se avsnitt 7) och förvara den på is (i högst 6 timmar) i ett mikrocentrifugrör som innehåller 500 μL DF-uppsamlingsmedium tills PFA-fixering.
- Hacka resten av DFs i små bitar (~ 1 mm2).
OBS: Det rekommenderas att omedelbart bearbeta de nyligen isolerade DF-vävnaderna för optimal organoidbildning och tillväxteffektivitet, snarare än att börja från kryokonserverad vävnad, vilket resulterar i lägre effektivitet. Det är dock möjligt att kryokonservera primär DF-vävnad vid detta steg (se kryokonserveringsmedium och protokoll i avsnitt 5). - Överför de malda försämringsfaktorerna till ett 15 ml rör som innehåller 4 ml förvärmt dissociationsmedium och inkubera i ett 37 °C vattenbad i 2 timmar.
OBS: Lägg till två DFs per 4 ml förvärmt dissociationsmedium (ett rör) för att säkerställa optimal dissociation. - Var 15: e minut pipetterar DF-dissociationsmediet upp och ner med en Pasteur-pipett i glas för att påskynda vävnadsupplösningen. När DF-bitar inte längre observeras (vanligtvis efter 1 h), fortsätt med DF-dissociation med en smalare eldpolerad Pasteur-pipett.
OBS: För optimal DF-dissociation, byt till en Pasteur-pipett som smalnar av eldpolering senast 1 h DF-isolering.- Under tiden bereda 10 ml medium A innehållande 50 μl DNas (0,2 mg/ml; Tabell 5).
- Tillsätt 5 ml medium A (innehållande DNas) till varje rör med dissocierad DF och inkubera i 1 min vid rumstemperatur (RT).
- Filtrera cellsuspensionen (innehållande enstaka celler och små cellklumpar) genom en 40 μm cellsil för att avlägsna de återstående stora fragmenten och (det mesta av) den fibrösa vävnaden.
- Kombinera flera rör med dissocierad DF från en patient i detta steg.
- Skölj filtret med 1 ml medium A. Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen vid 200 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera pelleten i 1 ml SFDM (tabell 3) och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Beräkna cellkoncentrationen med hjälp av en automatiserad cellräknare. Försumma cellklumparna som finns kvar.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
3. Etablering av tandorganoidkultur (figur 1A och figur 2A)
- Baserat på det erhållna cellnumret beräknar du antalet brunnar som kan seedas. En droppe på 20 μl bör innehålla 20 000 celler. Den slutliga blandningen består av cellsuspension och BMM i förhållandet 30:70.
- Ta bort lämplig mängd supernatant och återsuspendera i iskall BMM för att få ett förhållande 70:30 av BMM: cellsuspension för plätering. Till exempel, när 200 000 celler erhålls, platta 10 droppar med 20 μL. Avlägsna således supernatanten tills 60 μL av cellsuspensionen är kvar, tillsätt 140 μL iskall BMM och återsuspendera.
- Resuspendera långsamt för att undvika luftbubbelbildning. När du har återsuspenderat i BMM, håll mikrocentrifugröret på is.
OBS: Att hålla mikrocentrifugröret på is är avgörande för att undvika BMM-stelning.
- Resuspendera långsamt för att undvika luftbubbelbildning. När du har återsuspenderat i BMM, håll mikrocentrifugröret på is.
- Pipettera de 20 μl BMM-dropparna i mitten av brunnarna på den förvärmda 48-brunns odlingsplattan.
- Vänd plattan upp och ner, lägg den i en 1,9% CO2-inkubator (% CO2 enligt SFDM-buffert) och låt den stelna i minst 20 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt ROCK-hämmare (RI; 10 μM) och Amfotericin B (0,1 %) till TOM och förvar mediet i ett 37 °C vattenbad.
OBS: Amfotericin B är ljuskänsligt. - Ta 48-brunnsplattan från inkubatorn, placera upprätt och tillsätt 250 μL av det beredda förvärmda mediet till varje brunn med BMM-dropp / celler och återför plattan till 1,9% CO2-inkubatorn .
- För att uppdatera mediet (helst var 2-3: e dag), luta 48-brunnsplattan i en 45 ° vinkel, ta försiktigt bort det tidigare mediet samtidigt som du undviker att röra vid BMM-droppen och tillsätt 250 μL nytt förvärmt TOM-medium.
OBS: Det rekommenderas att uppdatera minst tre gånger i veckan för att undvika utarmning av viktiga näringsämnen och tillväxtfaktorer. RI behöver endast läggas till TOM vid den första sådden och de första dagarna av varje passaging (se avsnitt 4) för att förhindra celldöd av anoikis och förbättra organoidutväxten. Amfotericin B tillsätts endast till mediet under passage 0 (P0) för att blockera eventuell svampförorening.
4. Förstärkning och passering av tandorganoidkultur (figur 1B och figur 2B)
- Passage organoiderna mellan 10 och 14 dagars kultur.
OBS: Undvik odling under en längre period eftersom långvarig kultur kan begränsa organoid återväxt och passagebarhet. Endast vid initial utveckling (P0) får organoider odlas i upp till 20 dagar beroende på deras tillväxthastighet (tills maximalt ±200 μm i diameter uppnås). - Ta bort mediet från brunnarna med organoider som måste passeras. Inom ett odlingsvillkor, slå samman upp till fyra sammanflytande brunnar (se figur 2C).
- För att samla organoiderna, tillsätt 400 μL iskall SFDM per brunn direkt på BMM-droppen och pipettera mediet upprepade gånger upp och ner tills hela BMM-droppen lossnar.
- Om brunnar poolas, överför 400 μL från den första brunnen till nästa (och så vidare) för att lossa de organoidhaltiga BMM-dropparna från alla brunnar som måste poolas.
- Överför den lossnade BMM-organoidenheten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och upprepa steg 4,3 igen tills alla organoidstrukturer har samlats upp från brunnarna.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Förvarda en alikvot av TrypLE Express (kompletterad med RI vid 5 μM) i ett vattenbad på 37 °C. Per mikrocentrifugrör av organoider behövs en volym på 400 μL TrypLE Express.
- Efter centrifugering, ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 400 μL TrypLE. Inkubera suspensionen i ett 37 °C vattenbad i 12 minuter.
- Tillsätt 400 μl iskall SFDM för att inaktivera enzymet och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
- Förbelägg en spets (för volym se nedan) med iskall SFDM och återsuspendera organoidpelleten.
- För att undvika organoidförlust, återanvänd samma (förbelagda) spets så mycket som möjligt utan att äventyra steriliteten.
OBS: Volymen SFDM som krävs för att återsuspera pelleten beror på antalet erhållna organoidstrukturer och det aktuella passagenumret. - Som en tumregel, för passager, använder P0 till P2-3 (i allmänhet fortfarande ett lågt antal organoider) en volym på 200 μL SFDM. Från passager använder P3-4 eller högre (som i allmänhet ger ett större antal organoider) en volym på 700 μL SFDM.
ANMÄRKNING: Båda förfarandena kallas metoder för "låg passage" respektive "högre passage" (se steg 4.10 och 4.11). Korrekt tillämpning av de distinkta metoderna är avgörande för effektiv passering av organoiderna. Med den högre passagemetoden förloras organoider lättare och bör inte appliceras på lågt antal organoider (dvs vid P0 till P2-3). Den högre passagemetoden behövs dock för att effektivt dissociera större mängder organoider.
- För att undvika organoidförlust, återanvänd samma (förbelagda) spets så mycket som möjligt utan att äventyra steriliteten.
- Metod med låg passage: Resuspendera pelleten i 200 μL iskall SFDM. Tryck den helt tömda pipettspetsen mot botten av mikrocentrifugröret för att minska dess diameter. Kontrollera om diametern är tillräckligt liten (långsammare aspiration, flödet är skevt men inte blockerat). Pipettera upp och ner i 5 minuter för att mekaniskt störa organoiderna.
- Metod med högre passage: Resuspendera pelleten i 700 μL iskall SFDM med en P1000-spets. Lägg till en P200-spets (inget filter) ovanpå denna P1000-spets och förbelägg med iskall SFDM. Förhindra luftbubbelbildning genom att justera pipettens volyminställning för att sträva efter minst 90% av medelvolymen (med organoider). Pipettera upp och ner i 5 minuter för att mekaniskt störa organoiderna.
- Kontrollera under ljusmikroskopet (vid 4x förstoring) om huvudsakligen enstaka celler med (endast) några få odisperserade strukturer erhålls.
- Tillsätt 500 μL iskall SFDM till mikrocentrifugröret och blanda försiktigt den dissocierade cellblandningen med den färska SFDM genom pipettering.
- Låt stora odisperserade strukturer sedimentera i 10 minuter genom att vertikalt placera mikrocentrifugröret på is.
OBS: Det är nödvändigt att ta bort de odisperserade strukturerna eftersom de negativt påverkar organoid passagens passage. För organoidinitiering (P0) behövs inte detta sedimenteringssteg. - Samla supernatanten (~ 500-1,000 μL beroende på passeringsmetoden) som innehåller enstaka celler och små cellkluster; överför till ett nytt mikrocentrifugrör och centrifugera vid 190 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Beräkna cellkoncentrationen med hjälp av en automatiserad cellräknare. Försumma cellklumparna som finns kvar.
- Räkna hur många brunnar som kan sås och beräkna lämpligt förhållande mellan cellsuspension och BMM enligt beskrivningen ovan (avsnitt 3).
- Tillsätt 70% BMM till cellpelleten och håll mikrocentrifugröret på is.
OBS: Det är viktigt att hålla mikrocentrifugröret på is för att undvika BMM-stelning. - Fortsätt med steg 3.3 till 3.7 och passera igen mellan dag 10 och dag 14 av kultur.
5. Kryokonservering av tandorganoider
- Samla och dissociera organoiderna som nämnts ovan för passaging (steg 4). Centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml kryokonserveringsmedium innehållande SFDM (70%), FBS (20%) och DMSO (10%).
- Överför suspensionen till en kryovial och lägg den på is. Placera kryotyperna i en kryolåda och överför till -80 °C (i minst 4 timmar).
- Inom 1 månad, överför de frysta proverna till flytande kväve för långvarig (>12 månader) lagring.
6. Upptining av kryokonserverade tandorganoider
- Innan du börjar upptiningsproceduren, placera ett 15 ml rör per kryomedialt på is som innehåller 10 ml SFDM med 20% FBS.
- Ta bort kryomedialen från flytande kväve och lägg den på is.
OBS: Utför följande steg så snabbt som möjligt och undvik för lång upptiningstid (>5 min) samt för långa intervall mellan stegen (>5 min), eftersom sådan förlängning kommer att minska cellöverlevnaden. - Placera kryomedialen i ett varmt vattenbad (37 °C) tills det tinats (~1-2 min).
- Överför omedelbart kryobusens innehåll till det iskalla 15 ml-röret och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Avlägsna 9 ml av supernatanten och centrifugera de återstående 1 ml vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml iskall SFDM.
- Överför cellsuspension till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare.
- Räkna hur många brunnar som kan sås och beräkna lämpligt förhållande mellan cellsuspension och BMM enligt beskrivningen ovan (avsnitt 3).
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C. Resuspend pelleten i ett förhållande 70:30 av BMM: TOM och håll på is.
- Fortsätt med steg 3.3 till 3.7 och passera mellan dag 10 och dag 14 i kulturen.
7. Fixering och paraffininbäddning av tandorganoider
OBS: Denna procedur (inklusive avsnitt 8 och 9) kan också tillämpas på den primära DF-vävnaden.
- Fixering av tandorganoider i PFA
- Ta bort mediet från varje brunn som i steg 4.2.
- Samla upp organoiderna genom att lossa BMM-droppen (steg 4.3). Överför BMM-organoidblandningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 500 μL 4% PFA och inkubera i minst 30 min (högst 1 timme) vid RT med försiktig blandning på en orbitalskakare.
VARNING: Använd kemikaliehuven när du arbetar med PFA. - Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och skölj organoidpelleten med PBS i 10 minuter vid RT med försiktig skakning.
- Tvätta organoidpelleten (steg 7.1.5) ytterligare två gånger. Snurra ner de fasta organoiderna vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Resuspendera pelleten i 500 μL 70% EtOH (i avjoniserat vatten). Förvara organoiderna i upp till 1 månad i 70 % EtOH vid 4 °C.
- Agaros- och paraffininbäddning av tandorganoider
OBS: För att effektivt bädda in organoider i paraffin behövs ytterligare ett steg för inbäddning i agaros.- Centrifugera de PFA-fixerade organoiderna i 70 % EtOH vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
- Förbered en 2% agaroslösning i 30 ml PBS i en glasflaska. Värm upp agaros-PBS-blandningen i en mikrovågsugn tills en gelliknande struktur observeras (cirka 2,5 min vid 600 W).
- Parallellt tillsätt 30 ml PBS till en annan glasflaska och värm upp i mikrovågsugnen (cirka 2,5 min vid 600 W). Låt agaroslösningen svalna i 1 min.
- Skär änden på en P200-spets för att möjliggöra arbete med agaroslösningen exakt och för att undvika luftbubblor.
- Förkriga P200-spetsen i den varma PBS genom att pipettera upp och ner några gånger.
- Tillsätt 150 μL förvärmd agaroslösning till organoidpelleten och pipettera försiktigt upp organoid-agarosblandningen (med minimal resuspension) samtidigt som luftbubblor undviks.
OBS: Den minimala resuspensionen gör det möjligt att bättre lokalisera organoiderna i agarosgelen vid mikrotomsektionering eftersom organoiderna då är närmare varandra. - Överför omedelbart organoid-agarosblandningen till samma mikrocentrifugrörslock, sätt röret horisontellt och låt agarosen stelna (~ 20 min vid RT). Under tiden märker du kassetterna.
- När den har stelnat, ta bort agarosgelen från mikrocentrifuglocket med en pincett och överför den till en märkt kassett.
- Överför den agarosinnehållande kassetten till en bägare som innehåller 50% EtOH i avjoniserat vatten. Täck bägaren med parafilm för att undvika avdunstning av EtOH.
OBS: Bägarens volym beror på antalet kassetter. - Bearbeta proverna i en vävnadsprocessor över natten.
OBS: När paraffin stelnar vid RT måste följande steg utföras snabbt. - Förvarda ett värmeblock i inbäddningsarbetsstationen i 15 min.
- Ta bort den organoidinnehållande agarosgelen som är innesluten i kassetten och placera den i det förvärmda värmeblocket. Ta bort locket från kassetten och lägg det åt sidan för senare användning.
- Fyll det återstående värmeblocket med paraffin.
OBS: Kontrollera med en pincett om den organoidinnehållande agarosgelen fortfarande finns längst ner på värmeblocket. På grund av sin lätta vikt kan den börja flyta, vilket resulterar i provförlust. - Placera kassettlocket ovanpå värmeblocket. Låt det stelna i 30 min på en kall tallrik. Ta bort värmeblocket och förvara paraffinblocken vid 4 °C.
8. Mikrotomsektionering och färgning av tandorganoider (figur 2B och figur 3A-C)
- Mikrotomsektionering av organoidinnehållande paraffinblock
- Skiva 5 μm sektioner av tandorganoiderna i paraffinblocken med hjälp av en mikrotom.
- Placera paraffinskivorna ovanpå ett mikroskopglasglasglas. Placera mikroskopglasglaset på en varm platta vid 37 °C och täck det med avjoniserat vatten med en Pasteur-pipett.
- Låt mikroskopglaset glida torrt över natten.
- Färgning av tandorganoidsektioner
- Deparaffinera organoidsektionerna (på mikroskopets glasglas) i en ugn i 1 timme vid 58 °C.
- Rehydrera organoidsektionerna (på mikroskopglasglaset) i minskande EtOH-serie inuti den kemiska huven i följande ordning:
Xylen 2x i 3 min vardera
100% EtOH 2x i 3 min vardera
95% EtOH 2x i 3 min vardera
90% EtOH 2x i 3 min vardera
70% EtOH 3x i 3 min vardera
VARNING: Använd den kemiska huven när du arbetar med Xylene. - Skölj mikroskopglasglaset i kranvatten i 5 min vid RT. Skölj den sedan i PBS i 5 minuter vid RT.
- Utför antigenhämtning genom att placera organoidsektionerna (på mikroskopets glasglas) i förvärmd citratbuffert (10 mM citronsyra i avjoniserat vatten med pH 6; i en plastbehållare; förvärmd i 10 minuter i ett 95 ° C vattenbad) i 30 minuter i ett 95 ° C vattenbad.
- Låt mikroskopglaset svalna i 20 min vid RT. Skölj mikroskopglasglaset i PBS i 5 min vid RT och sedan i PBS innehållande 0,1% Triton-X (PBT) i 5 min vid RT.
- Använd en markeringspenna för att skapa en hydrofob barriär vid gränserna för varje bild.
- Blockera i minst 1 timme vid RT i blockerande buffert (innehållande 1,5 mg/ml glycin, 2 mg/ml albumin bovint serum (BSA) upplöst i PBT) plus 10 % åsneserum.
OBS: Vanligtvis behövs 300 μl blockerande buffert plus 10% åsneserum per mikroskopglasglasglas. - Placera mikroskopglasglaset i en fuktig kammare. Använd en lufttät låda där alla diabilder passar och blöt några pappersnäsdukar med vatten att placera längst ner i lådan. Detta förhindrar att bilderna torkar ut under de efterföljande färgningsstegen.
- Ta bort blockeringsbufferten, tillsätt den primära antikroppen (tabell 6) beredd i blockerande buffert plus 1% åsneserum och inkubera bilden täckt med antikroppslösning över natten i den fuktiga kammaren vid 4 °C. Gör om markeringspennans kantlinje om det behövs.
- Tvätta mikroskopglasglasglaset tre gånger i PBT vid RT i 10 min med mild blandning på en orbital shaker (75-150 rpm).
- Tillsätt den sekundära antikroppen (tabell 6), beredd i blockerande buffert plus 1% åsneserum, och inkubera i 1 timme i den fuktiga kammaren vid RT.
- Ta bort blockeringsbufferten och tvätta mikroskopglasglasglaset tre gånger i PBT vid RT i 10 min med försiktig blandning på en orbitalskakare.
- Lägg till antifade monteringsmedium med DAPI (1 till 3 droppar) på ett glasöverdrag och montera detta ovanpå organoidsektionerna (på mikroskopglasglaset). Fortsätt med avbildning; Förvara diabilder i högst 1 vecka vid 4 °C.
9. RNA-extraktion och RT-qPCR av tandorganoider (figur 2B och figur 3D)
- RNA-extraktion av tandorganoider
- Ta bort mediet från varje brunn (steg 4.2).
- Samla upp organoiderna genom att lossa BMM-droppen (steg 4.3), överför BMM-organoidblandningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera kraftigt i 350 μL 1% β-merkaptoetanol upplöst i lysbuffert (materialtabell) och lägg på is.
VARNING: Utför alla steg med β-merkaptoetanol i en kemisk huva.
OBS: Prover kan förvaras i detta steg i upp till 1 månad vid -80 °C. Tina proverna på is innan du fortsätter med steg 9.1.4. - Virvla proverna tills inga organoidstrukturer observeras längre.
- Fortsätt med RNA-extraktion med hjälp av RNA-extraktionssatsen (materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner.
- RT-qPCR för tandorganoider (tabell 7)
- Omvänd transkribering (RT) RNA19 med hjälp av omvänd transkriptionssats (materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner.
- Analysera de resulterande cDNA-proverna med SYBR Green-based quantitative PCR (qPCR)19 med hjälp av ett PCR-system i realtid (materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tandorganoid utveckling
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att etablera organoidkulturer från mänsklig DF-vävnad som förvärvats efter extraktion av visdomstand (figur 1A). Isolerad DF dissocieras enzymatiskt och mekaniskt. De erhållna cellerna odlas inom BMM i media som empiriskt definierades för optimal organoidutveckling och tillväxt (tandorganoidmedium; TOM)19.
Organoiderna utvecklas vanligtvis inom 2 veckor efter DF-cellsådd (P0; Figur 2A). Organoiderna är långsiktigt expanderbara (upp till 11 passager hittills) (figur 2B, visas på P4). Sådd av cirka 20 000 celler per BMM-droppe (vid både P0 och ytterligare passager) ger en optimal densitet av organoider (figur 2C), medan sådd av högre cellnummer leder till suboptimal organoid utväxt (dvs. mindre organoider med för hög densitet) eftersom det inte finns tillräckligt med utrymme att växa (Figur 2D). De så småningom optimerade odlingsförhållandena möjliggör utveckling av organoider från DF-prover vid 100% effektivitet19.
Tandorganoidkarakterisering och validering
De utvecklade organoiderna visar ett tätt utseende och innehåller celler som uppvisar ett högt nukleo-cytoplasmatiskt förhållande, vilket på liknande sätt observerats i ERM-celler7 (figur 3A). Dessutom, och i ytterligare analogi, uttrycker organoiderna ERM-markören cytokeratin 14 (CK14)22, vilket bekräftar deras epiteliala ursprung (figur 3B), liksom andra föreslagna ERM-markörer (såsom P63, CD44 och ITGα6 12,22,23 (figur 3B). Dessutom uttrycker organoider SOX2, en välkänd DESC-markör hos möss och även närvarande i epitelet för att utveckla mänskliga tänder (Figur 3B)1. Intressant är att amelogenin (AMELX), huvudkomponenten i emaljmatrisen, som också finns uttryckt i organoiderna, också detekteras i ERM24 (Figur 3C). Uttryck av ytterligare andra ERM/stemness-markörer beskrivs i vår nyligen genomförda studie19 och kan användas för att ytterligare certifiera de erhållna organoiderna. Dessutom behåller organoiderna sin ERM/stamhetsfenotyp under passering, bland annat genom stabilt uttryck av ERM/stamcellsmarkörer (figur 3D). Slutligen visar de tand-härledda organoiderna differentieringskapacitet till ameloblast (-liknande) celler, som också kan tillämpas för att validera de erhållna organoidkulturerna, vilket visar uttryck av mogna ameloblastmarkörer såsom odontogent-ameloblastassocierat protein (ODAM) och amelotin (AMTN) efter överföring till differentieringsmedium (se19).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde för tandorganoidutveckling, karakterisering och applikationer. (B) Förstärkning, karakterisering och appliceringspotential hos tandorganoider. d, dag; P, passage. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tandorganoidutveckling. Representativa ljusfältsbilder som visas vid olika dagar (d) efter sådd (P0; P, passage; 2,5x). (B) Brightfield-bilder som visar robust passage av en tandorganoidlinje (2,5x). (C) Brightfield-bilder som visar en tandorganoidlinje omedelbart vid passering (d0; vänster; 2,5x) sådd med en densitet av 20 000 celler per brunn, och den resulterande konfluenta organoidkulturen redo att passeras (d14; höger; 2,5x). (D) Brightfield-bilder som visar en tandorganoidlinje, som hade ådrats med en densitet på >20 000 celler, vilket ledde till mindre organoider med för hög densitet vid d14 (2,5x). Skalstreck: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
(A) Brightfield-bilder av DF-härledda organoidkulturer vid olika förstoringar som visar täta strukturer utvecklade vid 14 dagar i TOM (P4; 5-20x)). Hematoxylin och eosinfärgning av en organoid (P1, dag 11). Lådan är förstorad. Pilar indikerar celler med ett högt nukleo-cytoplasmatiskt förhållande. (B) Immunofluorescerande färgning för epitelial/ERM/stamhetsmarkörer i TOM-odlade organoider (20x). (C) Immunofluorescerande färgning för amelogenin (AMELX) i TOM-odlad organoid (20x). DAPI (blå) användes för att märka kärnor. D) Genuttrycksnivåer (i förhållande till GAPDH) för ERM/stemnessmarkörer i P1- och P5 TOM-odlade organoider vid odlingsdag 14 (medelvärde ± SEM; n = 3 biologiska replikat). Skalstreck: 50 μm, om inget annat anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Dental follikel (DF) samlingsmedium | |
| Namn | Koncentration |
| Minsta essentiella mellanörn (αMEM) | |
| Fetalt bovint serum (FBS) | 10% |
| Amfotericin B | 0.5% |
| Penicillin-streptomycin (Penna/Strep) | 1% |
Tabell 1: Uppsamlingsmedium för tandfollikel (DF). Tabellen visar beståndsdelarna i DF-insamlingsmediet.
| Tandorganoidmedium (TOM) | |
| Namn | Koncentration |
| Serumfritt definierat medium (SFDM) | Se tabell 3 för sammansättning |
| A83-01 | 0,5 μM |
| B27 (utan vitamin A) | 2% |
| Koleratoxin | 100 ng/ml |
| FGF2 (= grundläggande FGF) | 20 ng/ml |
| FGF8 | 200 ng/ml |
| FGF10 | 100 ng/ml |
| L-glutamin | 2 mM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| N2 | 1% |
| N-acetyl L-cystein | 1,25 mM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Skalle | 100 ng/ml |
| RSPO1 | 200 ng/ml |
| SB202190 (s38i) | 10 μM |
| Shh | 100 ng/ml |
| WNT3a | 200 ng/ml |
Tabell 2: Tandorganoidmedium (TOM). Tabellen visar de beståndsdelar och deras respektive koncentrationer som krävs för att förbereda tandorganoidmediet.
| Serumfritt definierat medium (SFDM) (pH 7.3) | |
| Namn | Koncentration |
| SterilH2O | |
| DMEM 1:1 F12 utan Fe | 16,8 g/l |
| Transferrin | 5 mg/l |
| Insulin från bovin bukspottkörtel | 5 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfatsalt | 50 mg/l |
| Absolut etanol, ≥99,8 % (EtOH) | 600 μl/l |
| Katalas från bovin lever | 50 μl/l |
| Natriumvätekarbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Bovin (cellodlingskvalitet) | 5 g/l |
Tabell 3: Serumfritt definierat medium (SFDM) (pH 7.3). Tabellen visar sammansättningen av det serumfria definierade mediet.
| Dissociation medium | |
| Namn | Koncentration |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | |
| Kollagenas IV | 3 mg/ml |
| Dispase II | 4 mg/ml |
Tabell 4: Dissociationsmedium. Förteckning över beståndsdelar och de koncentrationer som krävs för beredning av dissociationsmediet.
| Medium A (pH 7,3) | |
| Namn | Koncentration |
| SterilH2O | |
| DMEM pulver hög glukos | 13,38 g/l |
| HEPES | 5,958 g/ L |
| Natriumpyruvat (C3H3NaO3) | 110 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfatsalt | 50 mg/l |
| Natriumklorid (NaCl) | 0,5 g/l |
| Natriumvätekarbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Bovin (cellodlingskvalitet) | 3 g/l |
| Dnase* | 0,2 mg/ml |
| *lägg till när det nämns |
Tabell 5: Medium A (pH 7,3). Tabellen visar koncentrationen av de beståndsdelar som används för att framställa medium A.
| Primära antikroppar | ||
| Namn | Värd | Koncentration |
| AMELX | mus | 1:100 |
| CD44 | mus | 1:200 |
| CK14 | mus | 1:200 |
| ITGA6 | kanin | 1:200 |
| P63 | kanin | 1:1000 |
| SOX2 | kanin | 1:2000 |
| Sekundära antikroppar | ||
| Namn | Värd | Koncentration |
| mus IgG (Alexa 555) | åsna | 1:1000 |
| kanin IgG (Alexa 488) | åsna | 1:1000 |
Tabell 6: Förteckning över antikroppar och deras utspädningar. Tabellen visar antikropparna och deras respektive utspädningar som används i denna studie.
| Grundfärger | ||
| Gen | Framåt grundfärg | Omvänd primer |
| GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| ITGA6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| SOX2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| PITX2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabell 7: Lista över primers. Tabellen visar primers av GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 och PITX2 som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver den effektiva och reproducerbara genereringen av organoider med utgångspunkt från den mänskliga tanden. Såvitt vi vet är detta den första metoden för att etablera nuvarande koncept (epiteliala) organoider med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad. Organoiderna är långsiktigt expanderbara och uppvisar en tandepitelstamhetsfenotyp, som duplicerar DESC som tidigare rapporterats i ERM-facket i DF7. Dessutom replikerar organoiderna funktionella DESC / ERM-egenskaper, inklusive utvecklingen av en ameloblastdifferentieringsprocess 7,25,26. Resultaten är robusta eftersom jämförbara resultat hittades med oberoende patientorganoidlinjer19.
Vid körning av detta tandorganoidprotokoll måste flera kritiska punkter beaktas. För det första är tillsatsen av Rho-associerad kinashämmare (ROCK) Y-27632 vid initial sådd och omedelbart efter varje passaging avgörande för att förhindra att de enskilda cellerna genomgår anoikis27. Dessutom krävs Amfotericin B i alla medier förfriskningar under P0 för att undvika (oral) svamputväxt. För det andra rekommenderas det att omedelbart bearbeta de nyligen isolerade DF-vävnaderna för optimal organoidbildning och tillväxteffektivitet, snarare än att börja från kryokonserverad vävnad, vilket resulterar i lägre effektivitet. För det tredje, när du tinar en kryokonserverad organoidlinje för odling, utför steg så snabbt som möjligt och undvik för lång upptiningstid samt för långa intervall mellan stegen eftersom tidsförlängning minskar cellöverlevnaden. För det fjärde bör det noteras att antalet organoider vid tidig passage (P0-P3) kan förbli begränsat, även på grund av att endast ett begränsat antal ERM-celler (stamceller) kan finnas i de specifika isolerade DF-vävnadsproverna. Därför bör organoidkulturerna vid tidig passage hanteras med försiktighet och omtanke. Därför rekommenderas att (i) undvika snabb expansion av organoidkulturen (dvs. börja bara dela sig vid 1:3 eller mer från P3-4 och före vid 1:0,5 eller 1:1); ii) använda lämplig delningsmetod (låg passage - högre passage) enligt beskrivningen. I detta sammanhang rekommenderas det att samla in oeruperade visdomständer hos unga tonårspatienter (15 till 19 år) eftersom ERM-celler minskar i antal med tandutveckling och28 års ålder. För det femte orsakar återstående oupptäckta hårdvävnadsfragment från DF-vävnaden i cellsuspensionen (även efter filtrering) att BMM-droppen blir mindre stabil och mer benägna att lossna under odling. En högre andel BMM (såsom 80%) rekommenderas om flera odisperserade hårdvävnadsfragment observeras i den dissocierade DF-cellsuspensionen. För det sjätte rekommenderas det starkt att passera organoiderna mellan dag 10 och dag 14 i kulturen eftersom längre kultur kommer att påverka organoidutvidgbarheten negativt på grund av mindre optimal dissociation. Om organoider av en eller annan anledning odlas längre än 14 dagar, kan TryplE Express kvantitet och inkubationstid för organoiddissociation förlängas för effektiv dissociation, även om 15 min enzymatisk exponering inte bör överträffas. Inom samma sammanhang måste odlingsmediet uppdateras var 2-3: e dag för att förhindra konsumtion av näringsämnen och tillväxtfaktorer. Om organoider inte expanderar ordentligt, oavsett de kritiska punkterna som nämns ovan, bör man fokusera på att hålla alla verktyg (BMM, iskall SFDM för förbeläggningsspets, mikrocentrifugrör) som används under passering på is. Dessutom är det viktigt att korrekt tillämpa de distinkta passeringsmetoderna (låg passage och högre passagemetod) för effektiv passering av organoiderna.
Tidigare har andra grupper rapporterat in vitro-tillväxt av primär human DESC/ERM-vävnad 8,9,10,11,12,21. Kulturer var emellertid huvudsakligen 2D (monolager) och inte 3D, såsom denna organoidmodell, som dessutom bara visade kortvarig tillväxt och fenotypretention. Alternativt användes ofta (spontant) odödliga celler, som dock inte är fysiologiska och endast visar begränsad likhet med ursprungsvävnaden eller cellerna. Dessutom härrörde dessa cellinjer från embryonal vävnad och/eller från djur. Dessutom är ameloblastdifferentiering antingen inte beskriven eller endast begränsat dokumenterad. Således erbjuder den organoidmodell som presenteras här flera fördelar, som är (i) trogen rekapitulation av ursprungsvävnaden / cellerna, (ii) långsiktig expanderbar, (iii) odlad i 3D som närmare representerar in vivo-konfigurationen, (iv) av mänskligt ursprung och postnatal ålder, och (v) kan differentieras till mogna tandceller (ameloblastcelltyp) (se19).
Således genererade vi ett värdefullt forskningsverktyg, som inte rapporterats tidigare, med flera intressanta applikationer (figur 1B). Organoiderna kan användas för att studera human DESC/ERM-stamhet och plasticitet. Det ger möjlighet att få ytterligare inblick i biologin hos den fortfarande gåtfulla ERM-cellpopulationen med hjälp av immunofluorescerande, genuttryck och (encelliga) transkriptomiska analyser. Dessutom är organoider särskilt lämpade för modellering av mänskliga sjukdomar för att dechiffrera patogenetiska mekanismer, identifiera (nya) terapeutiska mål och generera läkemedelsupptäckts- och screeningverktyg29. Mer specifikt kan denna modell tillämpas på odontogena cyster (för vilka ingen tillförlitlig forskningsmodell finns tillgänglig), som kan jämföras med friska tand-härledda organoider. Dessutom kan detta tandorganoida tillvägagångssätt utnyttjas för att modellera och studera tandsjukdomar som sträcker sig från effekterna av bakterier till genetiska mutationer associerade med tandanomalier (såsom mutationer i P63, som kan introduceras med hjälp av banbrytande genredigeringsmetoder som CRISPR-Cas)30, vilket så småningom leder till potentiella och nya terapeutiska mål och behandlingar. Andra tillämpningar av tandorganoidprotokollet kan inkludera biobanking (för närvarande redan tillgängligt för tandmassa, såsom Future Health Biobank)31 för att samla in organoidlinjer från många personer och sjukdomar (t.ex. för grundforskning och translationell forskning som läkemedelsscreening). Dessutom har flera rapporter om sammansatta organoidmodeller som inte bara innehåller epiteliala utan även andra celltyper av ursprungsvävnad nyligen publicerats 32,33. Eftersom tandkompositionen är ganska komplex, som rymmer mesenkymala, immun- och endotelceller, är det ett tilltalande perspektiv att tillämpa denna epitelorganoidmodell i kombination med dessa celltyper för att mer detaljerat representera deras in vivo-motsvarighet. Dessutom tillåter detta system att utforska amelogenes i den mänskliga tanden, för närvarande endast dåligt förstådd, men säkert beroende av epitel-mesenkymala interaktioner. Dechiffrering av ameloblastutveckling förväntas representera ett viktigt steg framåt i den den dentala vetenskapliga och kliniska världen eftersom produktionen av emalj, den viktigaste komponenten i våra tänder, är ett mycket jagat mål inom reparation av tandvävnad. Dessutom kan organoidmodellering som beskrivs i denna studie innebära starten mot bildandet av mineraliserade vävnader in vitro och bana väg för att utveckla en bioteknisk tand (eller åtminstone delar) för ersättningsterapi.
En av begränsningarna med organoidmodellen är att den enbart representerar epitelkomponenten i vävnad. Men som beskrivits i detalj ovan kan denna brist lösas genom tillägg av andra cell- / vävnadstyper, såsom tandmesenkymet19. En annan aspekt som kan erkännas som en begränsning är ursprunget till BMM som används här (Matrigel). Denna BMM härrör från en sarkom (Engelbrecht-Holm-Swarm) hos en mus och måste därför bytas ut innan organoidmetoden översätts till kliniken. Nyligen har flera ansträngningar gjorts för att ersätta Matrigel med syntetiska hydrogeler34,35. Emellertid, Mer forskning behövs för att framgångsrikt odla organoider i sådana icke-naturliga geler. Även om organoidtekniken ger ett intressant tillvägagångssätt för framtida tandregenerativ terapi - till exempel utvecklingen av en bioteknisk tand - bör etiska frågor tas upp angående celldonatorernas integritet samt kommersialiseringen av mänskliga organoider och vävnader som härrör från dem. Hittills har inga slutsatser om organoid kommersialisering för regenerativa ändamål nåtts36. Biobanker för tandmassa har ökat31, liksom organoidbiobanker från flera, främst cancervävnader, för läkemedelsscreening. Med tanke på att organoider inte kan kategoriseras som celler, könsceller, vävnader eller organ (som alla regleras av lag), finns det ett brådskande behov av att skildra dess juridiska status för dess användning i kliniska, vetenskapliga eller kommersiella miljöer. Även om organoiderna har visat sig deponera mineraliserad vävnad när de subkutant transplanteras in vivo19, krävs ytterligare studier för att analysera deras potential att deponera emalj som liknar den hos en naturlig mänsklig tand.
Sammantaget presenterar den nya organoidmodellen som utvecklats ett lovande, värdefullt verktyg för att studera mänsklig tand (stamcell) biologi och amelogenes, båda för närvarande endast dåligt utforskade, med framtida perspektiv mot tandsjukdomsmodellering och regenerativa terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den korresponderande författaren ser till att alla författare har avslöjat alla intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för alla anställda vid oral och maxillofacial kirurgi (MKA) av UZ Leuven, liksom patienterna, för deras ovärderliga hjälp med att samla in nyligen extraherade tredje molarer. Vi vill också tacka Dr. Reinhilde Jacobs och Dr. Elisabeth Tijskens för deras hjälp med provinsamlingen. Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven (BOF) och FWO-Flandern (G061819N). L.H. är en FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V.
