Method Article

Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

DOI:

10.3791/63684

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March 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane.

Abstract

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La mancanza di un robusto modello in vitro dell'epitelio respiratorio umano ostacola la comprensione della biologia e della patologia dell'apparato respiratorio. Descriviamo un protocollo definito per derivare organoidi polmonari umani da cellule staminali adulte nel tessuto polmonare e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree. Gli organoidi polmonari vengono poi espansi consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree vengono utilizzati per simulare morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Pertanto, stabiliamo un robusto modello organoide dell'epitelio delle vie aeree umane. L'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari e degli organoidi differenziati delle vie aeree genera una fonte stabile e rinnovabile, consentendo agli scienziati di ricostruire ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree umane nei piatti di coltura. Il sistema organoide polmonare umano fornisce un modello in vitro unico e fisiologicamente attivo per varie applicazioni, tra cui lo studio dell'interazione virus-ospite, test antidroga e modellazione della malattia.

Introduction

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Gli organoidi sono diventati uno strumento robusto e universale per la modellazione in vitro dello sviluppo degli organi e lo studio della biologia e delle malattie. Quando coltivate in un terreno di coltura definito dal fattore di crescita, le cellule staminali adulte (ASC) da una varietà di organi possono essere espanse in 3 dimensioni (3D) e auto-assemblate in cluster cellulari simili a organi composti da più tipi di cellule, denominati organoidi. Il laboratorio di Clevers ha riportato la derivazione del primo organoide derivato dall'ASC, organoide intestinale umano, nel 2009 1,2. Successivamente, ....

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Protocol

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Tutti i esperimenti che utilizzano tessuti umani qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta dei tessuti.

1. Derivazione dell'organoide polmonare umano

  1. Preparazione di materiali sperimentali
    1. Preparare il mezzo basale integrando il mezzo DMEM / F12 avanzato con 2 mM di glutammina, 10 mM HEPES, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina.
    2. Preparare il mezzo di espansione organoide polmonare umano i....

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Results

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Questo protocollo consente la derivazione di organoidi polmonari umani con un alto tasso di successo. Il tessuto polmonare umano fresco viene tritato in piccoli pezzi e quindi decomposto con collagenasi. Le singole cellule risultanti sono incorporate nella matrice basale e incubate nel mezzo di espansione organoide polmonare integrato con un cocktail di fattori di nicchia per la crescita delle cellule staminali epiteliali (fase 1.1.2). La Figura 1 mostra la microfotografia di cellule polmona.......

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Discussion

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Le vie aeree umane sono rivestite con l'epitelio delle vie aeree, noto anche come epitelio ciliato pseudostratificato. I principali tipi di cellule dell'epitelio delle vie aeree superiori sono le cellule ciliate che consentono il movimento coordinato delle loro ciglia apicali per espellere il muco e le particelle inalate dalle vie aeree, le cellule calici che producono e secernono muco e le cellule basali che rivestono la membrana basale e sono implicate nella rigenerazione. Nelle piccole vie aeree come i bronchioli, l'e.......

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Disclosures

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J. Z., C.L. e M.C.C. sono elencati come inventori sul brevetto degli organoidi delle vie aeree (pubblicazione n.: US-2021-0207081-A1). Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, per l'assistenza nell'imaging confocale e nella citometria a flusso. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai finanziamenti del Fondo per la salute e la ricerca medica (HMRF, 17161272 e 19180392) dell'Ufficio per la salute e la salute; Fondo generale di ricerca (GRF, 17105420) del Consiglio per le sovvenzioni alla ricerca; e Health@InnoHK Commissione per l'innovazione e la tecnologia, il governo della Regione amministrativa speciale di Hong Kong.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenti per coltura di organoidi polmonari
Advanced DMEM/F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 supplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutammina)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetilcisteinaSigma-AldrichA91651.25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (mezzo condizionale)fatto incasa-10x
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 &; g/mL
Rspondin1 (terreno condizionale)fatto incasa-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µ M
Y-27632Tocris12545 µ M
Differenziazione prossimale medio
DAPTTocris263410 &; M
Soluzione di eparinaStemCell Technology79804 µ g/mL
Soluzione madre di idrocortisoneStemCell Technology79251 &; M
PneumaCult-ALI 10X Supplementointerfaccia aria-liquido
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001interfaccia aria-liquido mezzo basale
PneumaCult-ALI Supplementointerfaccia aria-liquido Supplemento di manutenzione
Y-27632Tocris125410 &; M
Equipment
Cabina di sicurezza biologicaBaker1-800-992-2537
Microscopio confocaleCarl Zeiss LSM 780 o 800Zeiss
Incubatore a CO2Thermo Fisher Scientific42093483
StereomicroscopioOlympus CorporationCKX31SF
CentrifugaEppendorf5418BG040397
Pipettatore sierologicoEppendorf
ZEN nero o ZEN blu softwareanalisiZeiss
Consumabili
12mm Trans-wellStemCell Technology#38023
Piastra per colture cellulari a 12 pozzettiCellstar665970
Provette coniche da 15 e 50 mlThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
Piastra per colture cellulari a 24 pozzettiCellstar662160
Tecnologia StemCellTrans-well da 6,5 mm#38024
Unità filtro per siringa medica, 0,22 &; mSigma-AldrichSLGPR33RB
Provette per microfugeEppendorf
Puntali per micropipetteThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pipetta Pasteur in vetroThermo Fisher Scientific22-378893
Pipette sierologiche (5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Anticorpi
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Capra Anti-Ratto Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Topo Anti-Citocheratina 5Abcamab128190
Topo Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Topo Anti-Mucina 5ACAbcamab3649
Topo Anti-β-tubulina 4SigmaT7941
Coniglio Anti-p63Abcamab124762
Ratto Anti-Uteroglobina/CC-10R& Sistemi DMAB4218-SP
Altri reagenti
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701l'enzima di dissociazione
di manutenzione Micropipetta Eppendorf di

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. S....

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