Summary
Protokollet presenterar en metod för att härleda mänskliga lungorganoider från primära lungvävnader, expandera lungorganoiderna och inducera proximal differentiering för att generera 3D- och 2D-luftvägsorganoider som troget fenoskopierar det mänskliga luftvägsepitelet.
Abstract
Bristen på en robust in vitro-modell av det mänskliga andningsepitelet hindrar förståelsen av andningsorganens biologi och patologi. Vi beskriver ett definierat protokoll för att härleda humana lungorganoider från vuxna stamceller i lungvävnaden och inducera proximal differentiering för att generera mogna luftvägsorganoider. Lungorganoiderna expanderas sedan i följd i över 1 år med hög stabilitet, medan de differentierade luftvägsorganoiderna används för att morfologiskt och funktionellt simulera humant luftvägsepitel till en nästan fysiologisk nivå. Således etablerar vi en robust organoidmodell av det mänskliga luftvägsepitelet. Den långsiktiga expansionen av lungorganoider och differentierade luftvägsorganoider genererar en stabil och förnybar källa, vilket gör det möjligt för forskare att rekonstruera och expandera de mänskliga luftvägsepitelcellerna i odlingsrätter. Det mänskliga lungorganoidsystemet ger en unik och fysiologiskt aktiv in vitro-modell för olika applikationer, inklusive studier av virus-värdinteraktion, läkemedelstestning och sjukdomsmodellering.
Introduction
Organoider har blivit ett robust och universellt verktyg för in vitro-modellering av organutveckling och studier av biologi och sjukdom. När de odlas i ett tillväxtfaktordefinierat odlingsmedium kan vuxna stamceller (ASC) från en mängd olika organ expanderas i 3-dimension (3D) och självmonteras till organliknande cellulära kluster som består av flera celltyper, så kallade organoider. Clevers laboratorium rapporterade härledningen av den första ASC-härledda organoiden, human tarmorganoid, 2009 1,2. Efteråt har ASC-härledda organoider etablerats för en mängd olika mänskliga organ och vävnader, inklusive prostata 3,4, lever 5,6, mage 7,8,9, bukspottkörtel10, bröstkörtel11 och lunga 12,13 . Dessa ASC-härledda organoider behöll de kritiska cellulära, strukturella och funktionella egenskaperna hos det inhemska organet och upprätthöll genetisk och fenotypisk stabilitet i långsiktig expansionskultur 14,15.
Organoider kan också härledas från pluripotenta stamceller (PSC), inklusive embryonala stamceller (ES) och inducerad pluripotent stam (iPS) cell16. Medan PSC-härledda organoider utnyttjar mekanismerna för organutveckling för deras etablering, kan ASC tvingas att bilda organoider genom att återuppbygga förhållanden som efterliknar stamcellsnischen under fysiologisk vävnadsförnyelse eller vävnadsreparation. PSC-härledda organoider är gynnsamma modeller för att utforska utveckling och organogenes, även om de inte kan nå den jämförbara mognadsnivån för ASC-härledda organoider. Den fosterliknande mognadsstatusen för PSC-härledda organoider och komplexiteten för att etablera dessa organoider förhindrar väsentligt deras breda tillämpningar för att studera biologi och patologi i mogna vävnader.
Den mänskliga luftvägarna, från näsa till terminal bronkiol, är fodrad med luftvägsepitelet, även kallat det pseudostratifierade cilierade epitelet, som består av fyra huvudcelltyper, dvs cilierad cell, bägarecell, basalcell och klubbcell. Vi etablerade den ASC-härledda mänskliga lungorganoiden från mänskliga lungvävnader i samarbete med Clevers lab12,13. Dessa lungorganoider expanderas i följd i expansionsmediet i över ett år; den exakta varaktigheten varierar mellan olika organoidlinjer erhållna från olika givare. Men jämfört med det inhemska luftvägsepitelet är dessa långsiktiga expanderbara lungorganoider inte tillräckligt mogna eftersom cilierade celler, den största cellpopulationen i den mänskliga luftvägarna, är underrepresenterade i dessa lungorganoider. Således utvecklade vi ett proximalt differentieringsprotokoll och genererade 3D- och 2D-luftvägsorganoider som morfologiskt och funktionellt fenoskopierar luftvägsepitelet till en nästan fysiologisk nivå.
Här tillhandahåller vi ett videoprotokoll för att härleda mänskliga lungorganoider från de primära lungvävnaderna, expandera lungorganoiderna och inducera proximal differentiering för att generera 3D- och 2D-luftvägsorganoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med mänskliga vävnader som beskrivs häri godkändes av Institutional Review Board vid University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 och UW21-695). Informerat samtycke erhölls från patienter före vävnadsinsamling.
1. Härledning av human lungorganoid
- Framställning av experimentella material
- Förbered basalt medium genom att komplettera avancerat DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin.
- Förbered humant lungorganoidexpansionsmedium genom att komplettera basalt medium med 10% R-spondin 1 konditionerat medium, 10% Noggin konditionerat medium, 1x B27-tillskott, 1,25 mM N-acetylcystein, 10 mM nikotinamid, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / ml fibroblst tillväxtfaktor (FGF) -7, 20 ng / ml FGF-10 och 100 μg / ml primocin (se materialtabell).
OBS: Det R-spondin 1 och Noggin konditionerade mediet kan ersättas med kommersiellt rekombinant R-spondin 1 (500 ng/ ml) och Noggin (100 ng / ml). - Förwarm en 24-brunns suspensionsodlingsplatta i en cellodlingsinkubator. Använd en vanlig cellodlingsinkubator med 5%CO2 och fuktad atmosfär vid 37 °C. Tina källarmatrisen i ett kylskåp på 4 °C. Håll källarmatrisen och odlingsmediet på is under experiment.
- Cellisolering från mänskliga lungvävnader för 3D-organoidkultur
- Skaffa nyrekterade mänskliga lungvävnader i storlek runt 0,5 cm från patienter som genomgår kirurgisk resektion på grund av olika sjukdomar. Transportera lungvävnaderna i 30 ml basalmedium vid rumstemperatur och bearbeta så snabbt som möjligt inuti en biosäkerhetshuv.
- Hacka lungvävnader i små bitar (0,5-1 mm) med en steril skalpell i en 10 cm cellodlingsskål. Tvätta vävnadsstycken med 10 ml kallt basalt medium i ett 15 ml centrifugrör, följt av centrifugering vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 8 ml basalt medium kompletterat med kollagenas vid en slutlig koncentration på 2 mg/ml. Smält vävnadsbitarna genom att skaka röret vid 120 rpm i 30-40 min vid 37 °C.
- Pipettera upp och ner i 20x för att skjuva de smälta vävnadsbitarna med en 10 ml serologisk pipett. Stapla en 100 μm sil på ett 50 ml centrifugrör och filtrera suspensionen.
- Återvinn vävnadsbitar på silen med basalmediet och överför dem till ett 15 ml centrifugrör, följt av en andra omgång skjuvning och filtrering. Ytterligare skjuvningsfiltrering kan utföras 1x-2x för att isolera fler celler, särskilt när en liten bit vävnad (t.ex. <0,5 cm) anskaffas.
- Tillsätt FBS till genomströmningen med en slutlig koncentration på 2 % för att avsluta matsmältningen, följt av centrifugering vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml basalmedium, följt av centrifugering vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- (Valfritt) Om många erytrocyter ses i pelleten (uppskattad av pelletens färg), återsuspendera cellpelleten i 2 ml röda blodkroppar lysbuffert och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt sedan 10 ml basalt medium till röret, följt av centrifugering vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Resuspend pelleten i kall källarmatris och håll på is. Tillsätt 80-160 μL källarmatris för celler som återvunnits från en lungvävnad av storlek runt 0,5 cm; mängden är tillräcklig för att fröa 2-4 droppar.
- Dispensera 40 μL suspension till varje brunn på en förvärmd 24-brunns suspensionsodlingsplatta. Inkubera odlingsplattan vid 37 °C i 10-15 min. Låt källarmatrisen stelna för att bilda en droppe.
- Tillsätt 500 μL humant lungorganoider expansionsmedium kompletterat med 5 nM Heregulin beta-1 till varje brunn och inkubera plattan i en cellodlingsinkubator.
- Uppdatera mediet var 3: e dag. Ta bort det gamla mediet medan du håller droppen intakt och tillsätt färskt medium med försiktighet. Passage organoiderna efter inkubation i 10-14 dagar. Använd Heregulin beta-1 endast i den ursprungliga kulturen före den första passagen.
- Observera organoiderna under ett mikroskop för att säkerställa att organoiderna inte är inbäddade med en mycket hög celltäthet. Om en droppe sönderfaller på grund av en alltför hög celltäthet, återhämta och bädda in organoiderna och cellerna med en högre volym källarmatris för att göra fler droppar med en lägre och önskvärd celltäthet.
2. Expansion av humana lungorganoider
- Förbered en Pasteur-pipett genom att bränna spetsen på en Pasteur-pipett på en låga, till exempel en Bunsen-brännare, för att minska öppningen från 1,5 mm till cirka 1,0 mm i diameter. Kyl ner pipetterna, följt av autoklavering för att sterilisera. Våt pipetterna med basalmediet för att undvika cellfästning och förlust under mekanisk skjuvning.
- Lungorganoider passage med mekanisk skjuvning
- Använd en 1 ml spets och pipet upp och ner för att bryta dropparna som erhållits ovan. Överför sedan organoiderna tillsammans med mediet till ett 15 ml centrifugrör och justera volymen till 10 ml med kallt basalmedium. Kassera supernatanten efter centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C
- Tvätta organoiderna med 10 ml kallt basalmedium igen. Resuspendera organoiderna i 2 ml kallt basalmedium. Pipettera upp och ner för att skjuva organoiderna i små bitar med en Pasteur-pipett.
- Komplettera med basalt medium till en total volym på 10 ml, följt av centrifugering vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. Resuspendera organoidfragmenten med kall källarmatris som är tillräcklig för att möjliggöra en 1: 3 till 1: 5 expansion. Håll på isen.
- Placera 40 μl organoidsuspension i varje brunn på en förvärmd 24-brunnsplatta. Inkubera odlingsplattan vid 37 °C i 10-15 min. Låt källarmatrisen stelna.
- Tillsätt 500 μL lungorganoidexpansionsmedium till varje brunn och inkubera i en cellodlingsinkubator. Uppdatera mediet var 3: e dag. Passera organoiderna var 2: e vecka med ett förhållande av 1:3 till 1:5.
- Lungorganoider passage med trypsinisering
OBS: Trypsinisering föredras när det är svårt att skjuva lungorganoiden i små bitar med hjälp av en Pasteur-pipett, eller storleken på organoiderna är mycket varierande, eller de efterföljande experimenten kräver organoider av mer enhetlig storlek.- Skörda lungorganoiderna enligt steg 2.2.1. Resuspendera organoiden i 1 ml dissociationsenzym och inkubera i ett 37 °C vattenbad i 3-5 minuter.
- Tillsätt 1 ml basalmedium till röret. Skjuva organoiderna mekaniskt genom att pipettera organoiderna upp och ner i små bitar med hjälp av en Pasteur-pipett. Kontrollera storleken på organoidstycken under ett mikroskop vid 4x förstoring. Tillsätt sedan 40 μl FBS för att avsluta matsmältningen.
OBS: Bestäm storleken på organoidfragment under mikroskopet enligt det experimentella arrangemanget. Om ett experiment behöver fler organoider eller organoider av mer enhetlig storlek, skjuva organoider i mindre bitar eller till och med enstaka celler. Sedan tar det längre tid, förmodligen 3 veckor, innan organoiderna är redo för experiment. - Fyll på med basalt medium till en slutlig volym på 10 ml, följt av centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Resuspendera organoidbitarna i kall källarmatris med en volym som är tillräcklig för att passera med ett förhållande av 1: 5-1:10. Håll på isen.
- Placera 40 μl organoidsuspension i varje brunn på en förvärmd 24-brunnsplatta. Inkubera odlingsplattan vid 37 °C i 10-15 min. Låt källarmatrisen stelna.
- Komplettera med 500 μL lungorganoid expansionsmedium per brunn och inkubera i en cellodlingsinkubator. Uppdatera expansionsmediet var 3:e dag. Passage organoiderna efter 2-3 veckor.
OBS: Cirka 100 organoider är monterade i en 40 μL droppe källarmatris. Lungorganoiderna växer normalt bättre med en relativt hög celltäthet. Bädda in organoiderna igen med en lägre celltäthet om droppar sönderfaller eller de växande organoiderna fäster ihop på grund av den alltför höga celltätheten.
3. Proximal differentiering för att generera mogna luftvägsorganoider
- Förbered proximalt differentieringsmedium (PD-medium) genom att komplettera basalmediet för luftvätskegränssnitt med 1x luftvätskegränssnittstillägg, 1x underhållstillägg för luftvätskegränssnitt, 4 μg / ml heparin, 1 μM hydrokortison, 10 μM Y-27632 och 10 μM DAPT (se materialtabell).
- 3D-luftvägsorganoider
- Inkubera lungorganoider i expansionsmediet i 7-10 dagar efter passering via mekanisk skjuvning. Byt ut expansionsmediet mot PD-mediet. Inkubera organoiderna i PD-mediet i 14 dagar i en cellodlingsinkubator.
- Kassera PD-mediet i varje brunn. Tillsätt celllysatbuffert för att skörda den differentierade luftvägsorganetoiden för RNA-extraktion och detektion av cellulärt genuttryck genom RT-qPCR-analys.
- Alternativt kan du inkubera organoiderna vid 37 °C i 60 minuter efter tillsats av 10 mM EDTA för att separera organoiderna i enskilda celler, följt av flödescytometrianalys för att undersöka cellpopulationer. Organoiderna är redo för olika experimentella manipuleringar.
- 2D luftvägsorganoid
- Förbered tillräckliga 3D-lungorganoider för 2D-differentieringskultur. Totalt 1,3 x 105 och 4,5 x 105 celler krävs för en 24-brunns permeabel stödinsats respektive en 12-brunns permeabel stödinsats.
- Efter att 3D-lungorganoider växer i expansionsmediet i 2 veckor, smälta organoiderna i enstaka celler och frö i 24-brunns- och 12-brunnsinsatserna för att generera 2D-luftvägsorganoider.
- Förinkubera insatserna med basalmediet över natten i en cellodlingsinkubator. Tillsätt 250 μL och 500 μL basalmedium i den övre respektive nedre kammaren på en 24-brunnsplatta. För en 12-brunnsplatta, tillsätt 500 μL och 1 000 μL basalmedium i den övre respektive nedre kammaren.
- Skörda 3D-lungorganoider enligt beskrivningen i steg 2.2.1. Resuspendera organoiderna med 1 ml dissociationsenzym och inkubera i ett 37 °C vattenbad i 3-5 minuter.
- Tillsätt 1 ml basalmedium till röret. Pipettera upp och ner för att skjuva organoiderna till enstaka celler med en Pasteur-pipett och kontrollera cellerna under ett mikroskop. Tillsätt sedan 40 μl FBS för att avsluta matsmältningen.
- Filtrera cellerna genom en 40 μm sil i ett 50 ml centrifugrör. Överför den filtrerade cellsuspensionen till ett 15 ml rör. Fyll på med basalmedium till en total volym på 10 ml, följt av centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Resuspend pelleten, uppsamlad från 24 droppar (40 μL), i 1-2,5 ml lungorganoid expansionsmedium beroende på celltätheten i dropparna. Räkna antalet celler med en cellräknare under ett mikroskop. Justera cellkoncentrationen till 1,3 x 106/ml (för skär med 24 brunnar) eller 9 x 105/ml (för skär med 12 brunnar).
- Ta bort basalmediet från de övre och nedre kamrarna. Tillsätt 500 μL och 1 000 μL expansionsmedium i bottenkammaren på 24-brunnsinsatsen respektive 12-brunnsinsatsen. Frö 100 μL och 500 μL cellsuspension framställd i steg 3.3.7 på den apikala kammaren i 24-brunnsinsatsen respektive 12-brunnsinsatsen.
- Inkubera i en cellodlingsinkubator i 2 dagar. Byt ut expansionsmediet mot PD-mediet i både apikal och bottenkammare på plattorna. Inkubera organoiderna i cellodlingsinkubatorn i 14 dagar och uppdatera PD-mediet var 3: e dag.
OBS: Mobila cilia kan urskiljas i 3D- och 2D-organoiderna under ett mikroskop från dag 7 efter inkubation i PD-mediet. Efter 14 dagars differentieringskultur i PD-mediet är luftvägsorganen mogna för olika experimentella manipuleringar. - Mät transepitelial elektrisk resistans (TEER) varannan dag med hjälp av ett system för mätning av elektriskt motstånd enligt ett standardprotokoll som beskrivs i17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör härledning av humana lungorganoider med hög framgångsgrad. Färsk mänsklig lungvävnad hakas i små bitar och sönderdelas sedan med kollagenas. De resulterande enskilda cellerna är inbäddade i källarmatrisen och inkuberas i lungorganoidexpansionsmediet kompletterat med en cocktail av nischfaktorer för utväxt av epitelstamceller (steg 1.1.2). Figur 1 visar mikrofotografen av nyligen isolerade lungceller inbäddade i reducerad tillväxtfaktor källarmembranmatris typ 2 (BME; Figur 1A, vänster). Cystiska organoider uppträder och förstoras med tiden (figur 1A, höger). Under tiden genomgår de orelaterade cellerna celldöd gradvis. Fibroblaster är närvarande i kulturen under den första eller andra passagen. Därefter innehåller kulturen epitelorganoider uteslutande, vilka är lungorganoider härledda från epitelstamceller som finns i de primära lungvävnaderna. Dessa lungorganoider passeras var 2-3: e vecka genom mekanisk skjuvning i förhållandet 1: 3 till 1: 5 eller genom trypsinisering i förhållandet 1: 5 till 1: 10 (steg 2.2-2.3). De representativa mikrofotografierna av lungorganoider efter den fjärde passagen visas i figur 1B. Efter mekanisk skjuvning bildar de organoidfragment som är inbäddade i BME cystiska domäner inom ett par timmar (figur 1B, vänster). En mikrofotograf av samma fält på dag 5 (figur 1B, höger) visar organoider som växer över tiden. Dessa expanderande mänskliga lungorganoider har alla de fyra stora luftvägsepitelcelltyperna, inklusive ACCTUB + eller FOXJ1 + cilierad cell, P63 + basalcell, CC10 + klubbcell och MUC5AC + bägarecell18 (figur 1C), i ett för tidigt tillstånd. I synnerhet kan dessa mänskliga lungorganoider vara i följd och stabilt passaged i över 1 år. När de hålls i källarmatrisen är det mest troligt att lungorganoider visar en apikal polaritet, mindre än 2% -3% av lungorganoiderna visar en apikal polaritet13. Som ett resultat är celltoppar inte lättillgängliga om inte 3D-organoiderna klipps upp.
Men jämfört med det inhemska mänskliga luftvägsepitelet är dessa långsiktiga expanderbara lungorganoider inte tillräckligt mogna eftersom den dominerande cellpopulationen i det inhemska mänskliga luftvägsepitelet, cilierad cell, är underrepresenterad i lungorganoiden. Vi definierade sedan ett proximalt differentieringsmedium (PD) för att förbättra mognadsstatusen för humana lungorganoider. Organoiderna inkuberade i expansionsmediet och PD-mediet utvecklade distinkt morfologi över tiden (figur 2A). Rörliga flimmerhår var rikligare i organoiderna i PD-mediet än de i expansionsmediet. Efter 2 veckors differentieringskultur i PD-mediet kan rörliga cilia urskiljas i varje enskild organoid (figur 2B och kompletterande video 1). Intressant nog driver de slående cilia cellskräpet och utsöndrat mucin inuti organoidlumenet för att virvla enkelriktat, vilket på ett adekvat sätt rekapitulerar mucociliary escalator för att ta bort de inhalerade partiklarna (Kompletterande video 1), en viktig självrengörande mekanism för de mänskliga luftvägarna. Vi visar att de cilierade cellerna ökade dramatiskt till cirka 50% i de differentierade organoiderna jämfört med de ursprungliga lungorganoiderna. För att bedöma procentandelarna av fyra typer av epitelceller analyserades 2D-luftvägsorganoiderna med flödescytometri. Kortfattat dissocierades organoiderna med 10 mM EDTA i 60 minuter vid 37 °C, fixerades med 4% PFA och permeabiliserades med 0,1% ytaktivt medel. Därefter inkuberades cellerna med primära antikroppar (se materialtabell) i 1 timme vid 4 °C följt av färgning med sekundära antikroppar. Ett FACS-system användes för att analysera proverna. Flödescytometrianalysen visade differentierade organoider som rymmer fyra luftvägsepitelcelltyper (figur 2C). Därför utvecklade vi ett proximalt differentieringsprotokoll för att generera luftvägsorganoider som troget kan simulera det mänskliga luftvägsepitelet till en nästan fysiologisk nivå.
För att göra det möjligt för den organoida apikala ytan att vara lättillgänglig och bättre modellera den mänskliga luftvägsepitelets exponering för andningspatogener genererade vi 2D-monolager av luftvägsorganoider. Efter 2 veckors differentieringskultur utvecklade 2D-luftvägsorganoider en intakt epitelbarriär (figur 3A,B). Vi utförde också en dextranblockeringsanalys för att bedöma integriteten hos epitelbarriären som bildas i 2D-luftvägsorganoider. På dag 10 efter odling i transwellinsatser tillsattes fluoresceinitiocyanat-dextran (MW 10 000) i mediet i den övre kammaren och inkuberades vid 37 °C i 4 timmar. Medierna i de övre och nedre kamrarna skördades för en fluorescensanalys. Dextranblockeringsindex avser fluorescensintensiteten hos mediet i den övre kammaren jämfört med den i bottenkammaren (figur 3B). Dessa 2D-luftvägsorganoider innehåller också rikliga cilierade celler (figur 3C). Cilierade celler märktes av anti-β-Tubulin IV-antikropp (ACCTUB) och get-anti-mus 488 sekundär antikropp. Konfokala bilder förvärvades med hjälp av ett konfokalmikroskop. Flerkanaliga bilder förvärvades med hjälp av lasrarna 405 nm för DAPI, 488 nm för ACCTUB och 633/640 nm för falloidin. Bildparametrar justerades enligt bruksanvisningen för konfokalmikroskopet. Kortfattat var pinhålstorleken inställd på 1 AU, huvudförstärkningen ställdes in på 650 V till 750 V med digital förstärkning på 1,0 och lasereffekten justerades för varje kanal inom intervallet 0,2% till 5%. Bildbehandling utfördes med hjälp av den tillhandahållna analysprogramvaran.
Den mänskliga luftvägarna är fodrade med två olika typer av epitel, dvs luftvägsepitel och alveolar epitel. Den förstnämnda leder luftvägarna från näshålan till den terminala bronkiolen och består av fyra huvudtyper av epitelceller, dvs cilierad cell, bägarecell, klubbcell och basalcell. Dessutom visar luftvägsepitelet som fodrar de proximala och distala luftvägarna en variabel cellulär komposition längs den proximal-distala axeln. Det proximala luftvägsepitelet är pseudostratifierat, bestående av rikliga cilierade celler och slemutsöndrande bägareceller; medan det distala luftvägsepitelet är ett enda lager av kuboidala cilierade och klubbceller med mindre basala och bägare celler19. Mänskliga lungvävnader som används för att härleda lungorganoider har anskaffats från patienter som genomgick kirurgiska resektioner på grund av olika sjukdomar. Vi använder normala lungvävnader intill de sjuka vävnaderna för organoidodling. Dessa lungvävnader innehåller vanligtvis bronkioler av varierande storlek omgivna av alveolära säckar. Under den initiala kulturen överlever luftvägsepitelstamceller eller luftvägsprogenitorceller i lungvävnaderna och sprider sig på grund av nischfaktorerna i expansionsmediet. Expansionsmediet möjliggör initial härledning och långsiktig expansion av lungorganoider genom att rikta organoiderna mot ett omoget tillstånd, medan luftvägsdifferentieringsprotokollet genererar luftvägsorganoider som fenoskopierar det ursprungliga luftvägsepitelet morfologiskt och funktionellt. Modellsystemet, inklusive härledning, expansion och differentiering av lungorganoider, beskrivs i figur 4. Den cellulära sammansättningen i det proximala och distala luftvägsepitelet illustreras också i figur 4.
Figur 1: Härledning, expansion och karakterisering av humana lungorganoider. På dag 5 växer cystiska organoider (höger). Skalstången är 0,5 mm. (B) En representativ mikrofotografi av lungorganoider på dagen för den fjärde passagen och dag 5 efter passage. Skalstången är 0,5 mm. P1 och P4 representerar den första och fjärde passagen. Bilderna togs med 10x förstoring. (C) Konfokala bilder av fyra luftvägsepitelcelltyper i humana lungorganoider. Fyra linjer av luftvägsepitelceller finns i lungorganoiderna, inklusive ACCUB + och FOXJ1 + cilierade celler, P63 + basalceller, CC10 + klubbceller och MUC5AC + bägare celler. Kärnor och cellulära aktinfilament motverkas med DAPI (blå) respektive Phalloidin-647 (lila). Skalstången är 10 μm. Denna siffra har antagits från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Proximal differentiering av humana lungorganoider. (A) Humana lungorganoider odlades i PD-mediet eller expansionsmediet (Exp) parallellt i 16 dagar. Ljusfältmikrofotografer av organoider vid de angivna dagarna visas. Skalstången är 0,4 mm. (B) Cilia i de differentierade luftvägsorganenoiderna visas (svart pil). Skalstrecket är 20 μm. (C) Procentandelarna av enskilda celltyper i organoider inkuberade i PD-medium (överst) och expansionsmedium (botten) som detekterats genom FACS-analys. De representativa histogrammen för en organoidlinje visas. Experimentet utfördes i tre olika organoidlinjer. Denna siffra har antagits från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generering av 2D-differentierade luftvägsorganoider. (A) Transepitelial elektronisk resistans (TEER) mättes vid den angivna dagen efter inkubation i PD-mediet. Data visar medelvärdet ± standardavvikelsen (SD) för 2D-monolager i 10 skär. (B) På dag 10 efter odling i permeabla stödplattor tillsattes fluoresceinisotiocyanat-dextran och medierna i de övre och nedre kamrarna skördades för en fluorescensanalys efter 4 timmar. Dextranblockeringsindex avser fluorescensintensiteten hos mediet i den övre kammaren jämfört med den i bottenkammaren. Diametern på permeabla stödinsatser som används i vårt experiment är 0,4 μm. Utan att så några celler kan dextran fritt tränga in i de normala 2D-insatserna. Således bör dextranblockeringsindexet för en normal 2D (fältet märkt med Blank) vara 1. Data representerar medelvärdet ± SD på 10 insatser sådda med 2D luftvägsorganoider (2D-organoid) och de i två tomma insatser (tomma). (C) Konfokala bilder av rikliga ACCTUB + cilierade celler (gröna) i 2D-luftvägsorganoider. Cellulära aktinfilament motverkas med Phalloidin-647 (lila). Skalstången är 20 μm. Denna siffra har antagits från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk illustration av härledning, expansion och differentiering av humana lungorganoider. Enstaka celler isolerade från mänskliga lungvävnader är direkt inbäddade i källarmatrisen och inkuberas i lungorganoidutvidgningsmediet. De härledda mänskliga lungorganoiderna kan expanderas på lång sikt med hög stabilitet och lätt återvinnas från kryokonserverade bestånd. Vid differentiering kan de genererade luftvägsorganoiderna troget simulera mänskligt luftvägsepitel. 2D- och 3D-luftvägsorganoider har utvecklats för olika experimentella manipuleringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1. De synkront slående flimmerhåren driver cellresterna att virvla enkelriktat i de differentierade luftvägsorganoiderna13. Den här videon har antagits från13. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mänskliga luftvägarna är fodrade med luftvägsepitelet, även känt som det pseudostratifierade cilierade epitelet. De viktigaste celltyperna i det övre luftvägsepitelet är cilierade celler som möjliggör den samordnade rörelsen av deras apikala cilia för att driva ut slem och inhalerade partiklar från luftvägarna, bägare celler som producerar och utsöndrar slem och basala celler som kantar källarmembranet och är inblandade i regenerering. I de små luftvägarna som bronkioler innehåller det kuboidala luftvägsepitelet sekretoriska klubbceller och färre cilierade celler än i de övre luftvägsregionerna. Vi beskriver ett robust protokoll för att härleda humana lungorganoider från epiteliala stamceller i mänskliga lungvävnader. Dessa humana lungorganoider bibehålls i expansionsmediet och passeras i följd i över 1 år med hög stabilitet. Viktiga tillväxtfaktorer i expansionsmediet inkluderar R-spondin, en Wnt-agonist20; och Noggin, som är en hämmare av BMP-signalering21, liksom FGF7 och FGF10. Tidigare studier har avslöjat en avgörande roll för Wnt-, FGF- och BMP-signalering i homeostasen hos andningsepitel 22,23,24. Expansionsmediet möjliggör initial härledning och långsiktig expansion av lungorganoider genom att rikta organoiderna mot ett omoget tillstånd. Vi vidareutvecklar en proximal differentieringsmetod för att generera 3D- och 2D-luftvägsorganoider, som rymmer fyra stora luftvägscelltyper och simulerar det mänskliga luftvägsepitelet till en nästan fysiologisk nivå. Under hela proceduren, inklusive initial härledning, långsiktig expansion och proximal differentiering, krävs varken tråkig cellrening eller matar- och stromaceller. Således etablerar vi en organoid modell av det mänskliga luftvägsepitelet. Kulturens två faser, expansionskultur och differentieringskultur, utesluter varandra. Lungorganoiderna ger en stabil källa för långsiktig expansion, medan differentierade luftvägsorganoider troget fenoskopierar det mänskliga luftvägsepitelet. Dessa organoider är mottagliga för olika experimentella manipuleringar, inklusive avbildning, RNA-sekvensering, flödescytometrianalys, genetisk redigering etc.13,14,25,26,27.
För att säkerställa hög effektivitet för att härleda lungorganoider måste expansionsmediet rekonstitueras exakt och noggrant, vilket är avgörande för den höga etableringshastighet som protokollet möjliggör. En viktig begränsning av denna organoidmodell är den rena epitelkompositionen, bristen på stromaceller och immunceller som finns i den mänskliga andningsslemhinnan, vilket kan orsaka att luftvägsorganenoiderna avviker från det inhemska luftvägsepitelet i viss utsträckning. Således strävar vi efter att generera nästa generation av andningsorganoider genom att införliva immunceller och andra biologiskt relevanta komponenter i vår nuvarande organoidmodell.
De luftvägsorganoider som vi etablerade simulerar troget den multicellulära sammansättningen och funktionaliteten hos det inhemska mänskliga andningsepitelet till en nästan fysiologisk nivå, vilket är omöjligt i några homogena cellinjer. Våra organoidmodeller gör det möjligt för forskare att rekonstruera och stabilt expandera det inhemska mänskliga luftvägsepitelet i odlingsplattor. Dessa luftvägsorganoider är ett universellt verktyg för att studera biologin och patologin hos de mänskliga luftvägarna. Primära luftvägsepitelceller som används i forskningslaboratorier är inte utbyggbara på grund av den begränsade replikativa kapaciteten och fungerar knappast som ett reproducerbart och lättillgängligt forskningsverktyg.
Organoider, inklusive mänskliga andningsorganoider, har avslöjat deras unika och styrka för att studera mänskliga patogener, inklusive SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Som ett universellt och fysiologiskt aktivt verktyg kan mänskliga lungorganoider användas i stor utsträckning för att utforska biologin och patologin i de mänskliga luftvägarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L. och M.C.C. är listade som uppfinnare på patentet på luftvägsorganoider (publikation nr: US-2021-0207081-A1). De andra författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Medicinska fakulteten, University of Hong Kong, för hjälp med konfokal avbildning och flödescytometri. Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) från Food and Health Bureau; Forskningsbidragsrådets allmänna forskningsfond (GRF, 17105420); och Health@InnoHK, innovations- och teknikkommissionen, regeringen i den särskilda administrativa regionen Hongkong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
