Summary
L’épaisseur des coupes tissulaires limitait l’étude morphologique de l’innervation de la peau. Le présent protocole décrit une technique unique de nettoyage des tissus pour visualiser les fibres nerveuses cutanées dans des coupes de tissus épaisses de 300 μm sous microscopie confocale.
Abstract
L’innervation de la peau est une partie importante du système nerveux périphérique. Bien que l’étude des fibres nerveuses cutanées ait progressé rapidement, la plupart de la compréhension de leurs caractéristiques distributives et chimiques provient de la coloration histochimique et immunohistochimique conventionnelle sur des coupes de tissus minces. Avec le développement de la technique de nettoyage des tissus, il est devenu possible de voir les fibres nerveuses cutanées sur des sections de tissus plus épaisses. Le présent protocole décrit de multiples colorations fluorescentes sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 300 μm à partir de la peau plantaire et dorsale de l’arrière-pied de rat, les deux sites typiques de la peau poilue et glabre. Ici, le peptide lié au gène de la calcitonine marque les fibres nerveuses sensorielles, tandis que la phalloïdine et le récepteur hyaluronane endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques marquent respectivement les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Sous un microscope confocal, les fibres nerveuses sensorielles marquées ont été suivies complètement sur une plus longue distance, en faisceaux dans la couche cutanée profonde et en style libre dans la couche superficielle. Ces fibres nerveuses couraient parallèlement ou entouraient les vaisseaux sanguins, et les vaisseaux lymphatiques formaient un réseau tridimensionnel (3D) dans la peau poilue et glabre. Le protocole actuel fournit une approche plus efficace pour étudier l’innervation de la peau que les méthodes conventionnelles existantes du point de vue de la méthodologie.
Introduction
La peau, le plus grand organe du corps, servant d’interface clé avec l’environnement, est densément innervée par de nombreuses fibres nerveuses 1,2,3. Bien que l’innervation de la peau ait été largement étudiée précédemment avec diverses méthodes histologiques, telles que la coloration sur des coupes de peau et de tissus de monture entière 4,5,6, la démonstration efficace détaillée des fibres nerveuses cutanées reste un défi 7,8. Compte tenu de cela, le présent protocole a développé une technique unique pour exposer plus clairement les fibres nerveuses cutanées dans la section de tissu épais.
En raison de la limite par l’épaisseur des sections, l’observation des fibres nerveuses de la peau innervées n’est pas assez précise pour décrire avec précision la relation entre les fibres nerveuses peptidiques liées au gène de la calcitonine (CGRP) et les tissus et organes locaux à partir des informations d’image acquises. L’émergence de la technologie de nettoyage des tissus 3D fournit une méthode réalisable pour résoudre ce problème 9,10. Le développement rapide d’approches de nettoyage des tissus a offert de nombreux outils pour étudier les structures tissulaires, les organes entiers, les projections neuronales et les animaux entiers ces derniers temps11. Le tissu cutané transparent pourrait être imagé dans une section beaucoup plus épaisse par microscopie confocale pour obtenir les données permettant de visualiser les fibres nerveuses cutanées.
Dans la présente étude, la peau plantaire et dorsale d’un pied postérieur de rat a été sélectionnée comme les deux sites cibles de la peau poilue et glabre 3,4,7. Pour tracer les fibres nerveuses cutanées à une plus grande distance, le tissu cutané a été tranché à l’épaisseur de 300 μm pour la coloration immunohistochimique et histochimique, suivie d’un traitement de nettoyage des tissus. Le CGRP a été utilisé pour marquer les fibres nerveuses sensorielles12,13. En outre, pour mettre en évidence les fibres nerveuses cutanées sur le fond tissulaire, la phalloïdine et le récepteur hyaluronique endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques (LYVE1) ont également été utilisés pour marquer les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques, respectivement14,15.
Ces approches ont fourni une méthode simple qui peut être appliquée pour démontrer une vue à haute résolution des fibres nerveuses cutanées et aussi pour visualiser la corrélation spatiale entre les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques de la peau, ce qui peut fournir beaucoup plus d’informations pour comprendre l’homéostasie de la peau normale et l’altération cutanée dans les conditions pathologiques.
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Protocol
La présente étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (numéro de référence D2018-04-13-1). Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Trois rats mâles adultes (Sprague-Dawley, poids 230 ± 15 g) ont été utilisés dans cette étude. Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température et une humidité contrôlées et ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau.
1. Perfusion et préparation des échantillons
- Injecter 250 mg/kg de solution de tribromoéthanol (voir tableau des matériaux) par voie intrapéritonéale dans le rat pour induire l’euthanasie.
- Une fois la respiration arrêtée, utilisez des ciseaux chirurgicaux en acier inoxydable pour ouvrir la cavité thoracique du rat. Utiliser des aiguilles de 20 G pour perfuser via le ventriculecardiaque gauche 13 à raison de 3 mL/min avec 100 mL de solution saline normale à 0,9 % suivie de 250 à 300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figure 1A,B).
- Après la perfusion, utilisez un scalpel pour enlever la peau du dos et de la plante de la patte postérieure.
- Pour les échantillons nécessitant une section congelée, post-fixer les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 M PB pendant 2 h; puis cryoprotéger les tissus dans 25% de saccharose dans 0,1 M PB pendant plus de 24 h à 4 °C
- Pour les échantillons dont la section épaisse nécessite un nettoyage des tissus, post-fixer les tissus dans 4% de paraformaldéhyde dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) pendant 2 h; puis cryoprotéger les tissus dans 1x PBS à 4 °C (Figure 1C–E).
2. Triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 suivie d’un traitement de nettoyage des tissus
REMARQUE: Une triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 a été appliquée pour révéler les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques dans la peau poilue et glabre sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 300 μm après un traitement de nettoyage des tissus.
- Préparer 2% d’agarose dans 1x PBS en chauffant dans un micro-four pendant 2 min jusqu’à ce que l’agarose se dissout (voir tableau des matériaux).
- Après le lavage, incorporez les tissus cutanés dans de l’agarose à 2 % à 37 °C et placez-les à l’intérieur de la glacière pour le refroidissement (Figure 1F, G).
- Fixez le tissu monté sur le microtome vibratoire avec l’eau glacée et coupez-les en tranches à une épaisseur de 500 μm dans le sens transversal. Utilisez les paramètres suivants pour régler la trancheuse de vibration et terminer le tranchage : vitesse, 0,50 mm/s, et amplitude, 1,5 mm (Figure 1H-K).
- Après le tranchage, retirez l’agarose des sections et stockez-les dans une plaque à six puits avec 1x PBS (pH 7,4) (Figure 1L).
- Incuber les coupes tissulaires dans une solution de Triton X-100 à 2 % dans 1x PBS (TriX-PB) pendant la nuit à 4 °C. Reportez-vous à la figure 2 pour la procédure suivante.
- Placez les sections de tissu dans le tampon bloquant et faites pivoter à 72 tr/min sur le shaker pendant la nuit à 4 °C.
REMARQUE: La composition tampon bloquante est de 10% de sérum d’âne normal, de 1% de Triton-X 100 et de 0,2% d’azoture de sodium dans 1x PBS (voir tableau des matériaux). - Transférer les coupes tissulaires dans la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-CGRP monoclonal de souris (1:500) et de l’anticorps polyclonal anti-LYVE1 de mouton (1:500) dans un tampon de dilution dans le tube de microcentrifugation (voir tableau des matériaux), et faire pivoter sur le shaker pendant 2 jours à 4 °C.
REMARQUE: La composition tampon de dilution est de 1% de sérum d’âne normal, 0,2% de Triton-X 100 et 0,2% d’azoture de sodium dans 1x PBS. - Lavez les coupes de tissu deux fois avec un tampon de lavage à température ambiante, puis conservez-les sur le shaker pendant la nuit à 4 ° C dans le tampon de lavage.
REMARQUE: La composition du tampon de lavage est de 0,2% Triton-X 100 dans 0,1 M PB (pH 7,4). - Le lendemain, transférer les coupes de tissus dans la solution mélangée contenant les anticorps secondaires de l’âne anti-souris IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) et de l’âne anti-mouton IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), ainsi que de la phalloïdine Alexa-Flour594 (1:1000) (voir table des matériaux) dans un tube de microcentrifuge et tourner à 72 tr/min sur le shaker pendant 5 h à 4 °C.
- Lavez les sections de tissu dans une plaque à six puits avec tampon de lavage pendant 1 h, deux fois, à température ambiante. Conservez les sections de tissus dans un tampon de lavage sur le shaker pendant la nuit à 4 °C.
- Transférer les coupes de tissu dans le réactif de nettoyage des tissus (voir Tableau des matériaux, son volume était cinq fois supérieur au volume de l’échantillon) et faire pivoter doucement à 60 tr/min sur le shaker pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE: Après ce traitement, les sections de tissu deviennent claires (Figure 2B). - Montez les tissus nettoyés sur la glissière, encerclez les tissus avec une entretoise et collez l’espace avec un réactif de nettoyage des tissus frais et un couvercle.
3. Triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 suivant l’approche conventionnelle
NOTE: À titre de comparaison, la même coloration a été effectuée sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 30 μm selon les techniques conventionnelles.
- Trancher les coupes de tissu à 30 μm sur un microtome dans le sens transversal et les monter sur la lame.
- Ajouter la solution bloquante avec 3% de sérum d’âne normal et 0,3% de Triton X-100 dans 0,1 M PB et incuber les sections pendant 30 min à température ambiante.
- Retirer la solution bloquante et incuber les sections avec la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-CGRP monoclonal de souris (1:500) et de l’anticorps polyclonal anti-LYVE1 de mouton (1:500) dans un tampon de dilution pendant la nuit à 4 °C.
- Le lendemain, laver les coupes de tissu avec 0,1 M PB (pH 7,4) trois fois, ajouter la solution mélangée contenant les anticorps secondaires de l’âne anti-souris IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) et de l’âne anti-mouton IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), ainsi que de la phalloïdine Alexa-Flour594 (1:1000) sur les sections et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Avant l’observation microscopique, laver les sections dans 0,1 M PB (pH 7,4) trois fois, puis les recouvrir de couvercles dans 50% de glycérine.
4. Imagerie et analyses
- Observez les échantillons colorés sous un microscope fluorescent, puis prenez les images à l’aide d’un microscope confocal.
- Capturez 30 images (piles Z), chacune dans des images de 10 μm, de chaque section de 300 μm d’épaisseur et intégrez une seule image mise au point à l’aide d’un processeur d’image du système de microscopie confocale (voir Tableau des matériaux).
- Effectuez les étapes suivantes dans le logiciel de traitement d’image de la configuration confocale pour l’analyse tridimensionnelle (3D) : Définir le plan focal de départ | Définir le plan focal d’extrémité | Définir la taille des | Choisissez le motif de profondeur | | de capture d’image Série Z.
REMARQUE: Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence bleue étaient respectivement de 401 nm et 421 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence verte étaient respectivement de 499 nm et 519 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence rouge étaient respectivement de 591 nm et 618 nm. 152 μm est le diamètre du sténopé confocal (objectif 10x, NA: 0,4). La résolution de capture d’image était de 1024 × 1024 pixels.
- Effectuez les étapes suivantes dans le logiciel de traitement d’image de la configuration confocale pour l’analyse tridimensionnelle (3D) : Définir le plan focal de départ | Définir le plan focal d’extrémité | Définir la taille des | Choisissez le motif de profondeur | | de capture d’image Série Z.
- Pour les échantillons conventionnels (étape 3), capturez 30 images (piles Z) dans des images de 1 μm de chaque section de 30 μm d’épaisseur et traitez ces images comme mentionné ci-dessus (étapes 4.1-4.2).
- Démontrez les images dans le modèle de reconstruction 3D avec le système de traitement d’image.
- Effectuez des reconstructions 3D en important des images confocales Z-stack dans Imaris 9.0 (logiciel d’imagerie cellulaire, voir Tableau des matériaux) et créez des rendus de surface basés sur l’intensité des taches : Ajoutez de nouvelles surfaces | Choisissez le canal source | Déterminez les paramètres dans l’option lisse de Surfaces Detail | Déterminez les paramètres dans l’option de seuil de l’intensité absolue | Classer les surfaces | Terminer.
- Acquérir des données dans la surface des fibres nerveuses positives avec le logiciel d’imagerie cellulaire. Sélectionnez l’image rendue | Statistiques | | détaillées Valeurs spécifiques | Volume.
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Representative Results
Après une triple coloration fluorescente, les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques ont été clairement marqués avec CGRP, phalloïdine et LYVE1, respectivement, dans la peau poilue et glabre (Figure 3,4). Avec le traitement de nettoyage, les fibres nerveuses CGRP positives, les vaisseaux sanguins phalloïdine positifs et les vaisseaux lymphatiques LYVE1 positifs peuvent être imagés à une plus grande profondeur pour acquérir l’information structurelle complète de la peau (Figure 3). Lorsque ces structures tissulaires ont été reconstruites dans un motif 3D, leur distribution est devenue plus facile à tracer. Il a été démontré que les fibres nerveuses CGRP positives passaient à travers le tissu sous-cutané et le derme jusqu’à l’épiderme. Ces fibres nerveuses couraient en faisceaux dans le tissu sous-cutané, se ramifiaient dans le derme et se terminaient dans l’épiderme (Figure 3). En revanche, les vaisseaux sanguins phalloïdine positifs et les vaisseaux lymphatiques LYVE1 positifs sont distribués dans le tissu sous-cutané et le derme (Figure 3). Généralement, les fibres nerveuses CGRP positives étaient parallèles ou entouraient les vaisseaux sanguins et lymphatiques, formant un réseau 3D dans la peau poilue et glabre.
Avec l’approche conventionnelle, bien que les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques aient été clairement marqués avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 dans les sections minces, l’observation de ces structures est limitée par l’épaisseur de la tranche et ne peut pas être observée complètement (Figure 4). La technique d’imagerie a rendu des images approfondies pour chaque élément d’objet à partir de différents signaux fluorescents positifs. Après avoir généré l’image, la surface des fibres nerveuses CGRP positives a été acquise via le logiciel Imaris. Dans la section d’une épaisseur de 30 μm, il n’y avait aucune différence entre la peau poilue et la peau glabre dans la surface des fibres nerveuses CGRP positives. Dans les coupes de tissus de 300 μm d’épaisseur, par rapport à la peau velue, la surface des fibres nerveuses CGRP positives de la peau glabre a été significativement augmentée (*P < 0,05, test non paramétrique de Kruskal-Wallis, n = 3, figure 5). Par conséquent, pour comparer avec précision la surface des fibres nerveuses positives, la section dégagée de 300 μm est meilleure que la section traditionnelle de 30 μm. À titre de comparaison, il est possible d’acquérir plus d’opportunités pour une image 3D idéale à partir de la section de tissu épais avec le traitement de nettoyage que dans la section mince conventionnelle.
Figure 1 : Photographies des outils expérimentaux et des étapes clés de l’étude. (A) Outils chirurgicaux (scalpel, cisailles, etc.). (B) La pompe de perfusion. (C) Côtés plantaire et dorsal de la patte postérieure après perfusion. (D) Les peaux de la plante et du dos ont été retirées de la patte postérieure. (E) Tissus cutanés coupés. (F,G) Tissus cutanés montés avec 2% d’agarose à 37 °C et 4 °C. (H) Microtome vibratoire. (I) Tissus cutanés fixes sur le support de coupe. (J) Définir les paramètres de tranchage. K) Procédé de tranchage. (L) Les sections représentatives ont une épaisseur de 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : La procédure de coloration fluorescente et le nettoyage des tissus cutanés. (A) Une représentation des étapes du protocole impliquées dans cette étude. (B) Vues extérieures du tissu cutané avant et après le traitement de nettoyage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Corrélation spatiale des fibres nerveuses, des vaisseaux sanguins et des vaisseaux lymphatiques après un traitement de nettoyage tissulaire sur la section de peau épaisse. (A, B) Des images représentatives de la section épaisse de la peau plantaire et dorsale de l’arrière-pied de rat montrent la distribution des fibres nerveuses, des vaisseaux sanguins et des vaisseaux lymphatiques dans la peau glabre (A) et poilue (B). (A1-A3) Le panneau A a été présenté séparément avec l’étiquetage CGRP (A1), l’étiquetage Pha (A2) et l’étiquetage LYVE1 (A3). (A4,A5; B1,B2) Les panneaux (A) et (B) ont été ajustés selon un motif 3D et montrés avec les vues avant (A4, B1) et arrière (A5, B2), respectivement. Même barre d’échelle pour tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Corrélation spatiale des fibres nerveuses, des vaisseaux sanguins et des vaisseaux lymphatiques sur la section mince de la peau avec l’approche conventionnelle. (A, B) Des images représentatives de la section épaisse de la peau plantaire et dorsale de l’arrière-pied de rat montrent la distribution des fibres nerveuses, des vaisseaux sanguins et des vaisseaux lymphatiques dans la peau glabre (A) et poilue (B). (A1,A2; B1,B2): Les panneaux (A) et (B) ont été ajustés selon un modèle 3D et affichés avec les vues avant (A1, B1) et arrière (A2, B2), respectivement. Même barre d’échelle pour tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Un histogramme montrant la surface des fibres nerveuses CGRP positives dans la peau poilue et glabre. (A) Dans la section d’une épaisseur de 30 μm, il n’y avait aucune différence entre la peau poilue et la peau glabre dans la surface des fibres nerveuses CGRP positives. (B) Dans la section d’une épaisseur de 300 μm, par rapport à la peau velue, la surface des fibres nerveuses CGRP positives de la peau glabre a été significativement augmentée (*P < 0,05, n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La présente étude fournit une démonstration détaillée des fibres nerveuses cutanées dans la peau poilue et glabre en utilisant l’immunofluorescence sur des sections de tissus plus épaisses avec un traitement de nettoyage et une vue 3D pour mieux comprendre l’innervation de la peau. Le temps d’incubation des anticorps allant jusqu’à 1-2 jours et un processus de nettoyage de nuit sont importants. Ces deux étapes clés affectent directement l’effet de coloration par immunofluorescence des sections épaisses. Un autre problème a été soulevé à partir du choix des anticorps, qui ne conviennent pas tous aux sections épaisses. Nous supposons que les anticorps de plus petit poids moléculaire pourraient être idéaux pour la coloration par immunofluorescence de sections épaisses. Ainsi, la difficulté de sélection des anticorps est une limitation majeure de cette approche. Les présents travaux avaient observé les différences dans la distribution des vaisseaux sanguins, des vaisseaux lymphatiques et des nerfs sur la peau poilue et sans poils des rats. Pour l’homme, la structure de la peau est très différente de celle des rongeurs; nous sommes impatients d’utiliser la technologie de nettoyage des tissus pour observer et rechercher la peau humaine à la prochaine étape.
Des études antérieures ont fait de nombreux efforts pour révéler les fibres nerveuses cutanées 4,5,6,7,8. Contrairement à l’étude conventionnelle de la section tissulaire, les techniques de nettoyage des tissus, y compris CUBIC, CLARITY et vDISCO, ont été largement utilisées pour étudier des organes entiers et des corps entiers d’animaux au cours des dernières années 16,17,18,19. Habituellement, il est difficile de tracer les fibres nerveuses cutanées avec une structure longue et complète dans la section mince 4,5,6,7,8; comparativement, le traitement de nettoyage des tissus sur l’échantillon de grande taille peut prendre beaucoup de temps 16,17,18,19. Compte tenu de leurs avantages et inconvénients, le présent protocole est un choix approprié pour examiner la structure détaillée des fibres nerveuses cutanées dans la section épaisse traitée de manière transparente, ce qui est pratique pour être observé et enregistré sous microscopie confocale ordinaire. En utilisant cette approche, on peut observer des fibres nerveuses cutanées plus longues dans la section épaisse par rapport à la section mince, et économiser du temps expérimental pour le traitement des tissus par rapport aux échantillons de grande taille avec nettoyage des tissus.
Dans cette étude, les fibres nerveuses cutanées ont été marquées avec du CGRP. Ces types de fibres nerveuses appartiennent aux fibres sensorielles C et Aδ, jouant le rôle de transport des signaux nociceptifs et de modulation de la vasodilatation12,13. Étant donné que les fibres nerveuses CGRP positives sont situées à proximité des vaisseaux sanguins et lymphatiques dans la couche sous-cutanée, il a également été suggéré de participer à la cicatrisation des plaies en améliorant l’angiogenèse et la lymphangiogenèse20,21. Semblable aux études précédentes 14,20,21,22, la phalloïdine a été fortement exprimée dans les vaisseaux sanguins avec cette expérience de triple marquage. En outre, LYVE1 est une glycoprotéine membranaire intégrale et est efficacement utilisée comme biomarqueur pour le tri des cellules endothéliales lymphatiques dermiques de rat 15,23,24. Tirant parti de la triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1, ainsi que de la technique de nettoyage des tissus, une image haute résolution pour un meilleur aperçu du réseau de fibres nerveuses, de vaisseaux sanguins et de vaisseaux lymphatiques dans la peau poilue et glabre est présentée.
Il est à noter que seules les fibres nerveuses CGRP positives ont été démontrées dans cette étude. Outre ce type de fibre nerveuse sensorielle, ce protocole peut également convenir à l’examen d’autres types de fibres nerveuses cutanées avec les anticorps correspondants. En outre, étant donné que la phalloïdine est fortement exprimée dans la composante cytosquelettique des cellules musculaires et endothéliales lisses 21,22,25, outre les vaisseaux sanguins, les tissus musculaires et épidermiques ont également été marqués avec de la phalloïdine. Cependant, selon la caractéristique morphologique, il n’est pas difficile d’identifier les vaisseaux sanguins des autres types de tissus.
En résumé, le présent protocole explore efficacement l’innervation de la peau poilue et glabre sur des sections plus épaisses en utilisant une combinaison d’immunofluorescence et de traitement de nettoyage. Du point de vue de la méthodologie, il serait avantageux d’étudier les autres types de fibres nerveuses cutanées et leur corrélation spatiale avec les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Fonds d’innovation de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (Code de projet no. CI2021A03404) et le Fonds national d’innovation interdisciplinaire en médecine traditionnelle chinoise (Code de projet no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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