Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63807
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

Abstract

עצבנות העור היא חלק חשוב ממערכת העצבים ההיקפית. למרות שהמחקר של סיבי העצב העוריים התקדם במהירות, רוב ההבנה של המאפיינים ההפצתיים והכימיים שלהם מגיעה מהכתמים היסטוכימיים ואימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים על חלקי רקמה דקים. עם התפתחות טכניקת ניקוי הרקמה, ניתן היה לראות את סיבי העצב העוריים על חלקי רקמה עבים יותר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כתמים פלואורסצנטיים מרובים על מקטעי רקמות בעובי של 300 מיקרומטר מהעור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה, שני אתרי העור השעירים והזוהרים האופייניים. כאן, הפפטיד הקשור לגן קלציטונין מסמן את סיבי העצב החושיים, בעוד שפלואידין וקולטן אנדותל היאלורונן אנדותל כלי הלימפה 1 מסמנים את הדם וכלי הלימפה, בהתאמה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סיבי העצב החושיים המסומנים היו במעקב מלא במרחק ארוך יותר, רצים בצרורות בשכבה העורית העמוקה ובסגנון חופשי בשכבה השטחית. סיבי עצב אלה זרמו במקביל לכלי הדם או הקיפו אותם, וכלי הלימפה יצרו רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) בעור השעיר והזוהר. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה יותר לחקר העצבנות של העור מאשר השיטות הקונבנציונליות הקיימות מנקודת המבט המתודולוגית.

Introduction

העור, האיבר הגדול ביותר בגוף, המשמש כממשק מפתח לסביבה, מופנם בצפיפות על ידי סיבי עצב רבים 1,2,3. למרות שעיוורון העור נחקר באופן נרחב בעבר בשיטות היסטולוגיות שונות, כגון צביעה על מקטעי עור ורקמות שלמים 4,5,6, ההדגמה היעילה המפורטת של סיבי עצב עוריים היא עדיין אתגר 7,8. בהתחשב בכך, הפרוטוקול הנוכחי פיתח טכניקה ייחודית להצגת סיבי עצב עוריים בצורה ברורה יותר בחלק הרקמה העבה.

בגלל הגבול של עובי החלקים, התצפית על סיבי עצב עור פנימיים אינה מדויקת מספיק כדי לתאר במדויק את הקשר בין סיבי עצב פפטידים הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) לבין רקמות ואיברים מקומיים ממידע התמונה שנרכש. הופעתה של טכנולוגיית ניקוי רקמות תלת-ממדית מספקת שיטה אפשרית לפתרון בעיה זו 9,10. ההתפתחות המהירה של גישות לניקוי רקמות הציעה כלים רבים לחקר מבני רקמות, איברים שלמים, הקרנות עצביות ובעלי חיים שלמים בתקופה האחרונה11. ניתן היה לדמות את רקמת העור השקופה בקטע עבה הרבה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל את הנתונים כדי לדמיין סיבי עצב עוריים.

במחקר הנוכחי, העור הכפי והגבי של כף רגל אחורית של חולדה נבחר כשני אתרי המטרה של עור שעיר וגלברוס 3,4,7. כדי להתחקות אחר סיבי העצב העוריים במרחק רב יותר, רקמת העור נחתכה בעובי של 300 מיקרומטר לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית, ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות. CGRP שימש לסימון סיבי העצב החושיים12,13. בנוסף, כדי להדגיש את סיבי העצב העוריים על רקע הרקמה, נעשה שימוש נוסף בפלואידין ובקולטן היאלורונן אנדותל לימפתי 1 (LYVE1) כדי לתייג את כלי הדם וכלי הלימפה, בהתאמה14,15.

גישות אלה סיפקו שיטה פשוטה שניתן ליישם כדי להדגים תצוגה ברזולוציה גבוהה של סיבי העצב העוריים וגם כדי לדמיין את המתאם המרחבי בין סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור, אשר עשוי לספק הרבה יותר מידע כדי להבין את ההומאוסטזיס של העור הרגיל ואת השינוי העורי בתנאים הפתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ו- Moxibustion, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-04-13-1). כל ההליכים נערכו בעקבות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). במחקר זה נעשה שימוש בשלוש חולדות זכר בוגרות (ספראג-דאולי, משקל 230 ± 15 גרם). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ואפשרו גישה חופשית למזון ולמים.

1. פרפוזיה והכנת דגימה

  1. הזריקו 250 מ"ג/ק"ג של תמיסת טריברומואתנול (ראו טבלת חומרים) באופן תוך-צפקי לתוך החולדה כדי לגרום להמתת חסד.
  2. לאחר הפסקת הנשימה, השתמשו במספריים כירורגיים מפלדת אל-חלד כדי לפתוח את חלל בית החזה של החולדה. השתמשו במחטים של 20 גרם כדי לחדור דרך חדר הלב השמאלי13 בקצב של 3 מ"ל לדקה עם 100 מ"ל של 0.9% ממס תמיסה רגילה ואחריה 250-300 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M מאגר פוספט (PB, pH 7.4) (איור 1A,B).
  3. לאחר זלוף, יש להשתמש באזמל כדי להסיר את עור הגב והסוליה מהכף האחורית.
    1. עבור הדגימות הדורשות חתך קפוא, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 0.1 M PB במשך 2 שעות; ולאחר מכן להגן על הרקמות ב 25% סוכרוז ב 0.1 M PB במשך יותר מ 24 שעות ב 4 °C (76 °F)
    2. עבור הדגימות עם החלק העבה הדורש ניקוי רקמות, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 1x מלוחים בופר פוספט (1x PBS) במשך 2 שעות; לאחר מכן הגן על הרקמות ב-1x PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1C–E).

2. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות

הערה: צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו- LYVE1 הוחלה כדי לחשוף את סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור שעיר וגלברוס על חלקי רקמה בעובי של 300 מיקרומטר לאחר טיפול בפינוי רקמות.

  1. מכינים 2% אגרוז ב-1x PBS על ידי חימום במיקרו-תנור למשך 2 דקות עד שהאגרוז מתמוסס (ראו טבלת חומרים).
  2. לאחר הכביסה, הטמיעו את רקמות העור ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והניחו אותן בתוך קופסת הקרח לקירור (איור 1F,G).
  3. קבעו את הרקמה המותקנת על המיקרוטום הרוטט עם מי הקרח וחתכו אותם בעובי של 500 מיקרומטר בכיוון הרוחבי. השתמש בפרמטרים הבאים כדי להגדיר את חיתוך הרטט ולסיים חיתוך: מהירות, 0.50 מ"מ לשנייה, משרעת, 1.5 מ"מ (איור 1H-K).
  4. לאחר החיתוך, הסירו את האגרוז מהמקטעים ואחסנו אותם בצלחת בעלת שש בארות עם 1x PBS (pH 7.4) (איור 1L).
  5. דגירה של חלקי הרקמה בתמיסה של 2% טריטון X-100 ב-1x PBS (TriX-PB) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ראו איור 2 להליך הבא.
  6. מכניסים את חלקי הרקמה למאגר החוסם ומסובבים ב-72 סל"ד על השייקר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב המאגר החוסם הוא 10% סרום חמור רגיל, 1% טריטון-X 100 ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS (ראו טבלת חומרים).
  7. מעבירים את חלקי הרקמה לתמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכברים (1:500) ונוגדן אנטי-LYVE1 רב-שבטי של כבשים (1:500) במאגר דילול בצינור המיקרו-צנטריפוג' (ראו טבלת חומרים), ומסובבים על השייקר במשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב מאגר הדילול הוא 1% סרום חמורים רגיל, 0.2% Triton-X 100, ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS.
  8. שטפו את חלקי הרקמות פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר, ואז השאירו אותם על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במאגר הכביסה.
    הערה: הרכב מאגר הכביסה הוא 0.2% Triton-X 100 ב-0.1 M PB (pH 7.4).
  9. למחרת, העבירו את חלקי הרקמה לתמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם אלקסה-קמח594 פאלואידין (1:1000) (ראו טבלת חומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה וסובבו ב-72 סל"ד בשייקר במשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
  10. יש לשטוף את חלקי הרקמות בצלחת בת שש בארות עם חיץ כביסה למשך שעה, פעמיים, בטמפרטורת החדר. שמור את חלקי הרקמות במאגר שטיפה על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. מעבירים את חלקי הרקמה לריאגנט ניקוי הרקמה (ראו טבלת חומרים, נפחו היה גדול פי חמישה מנפח הדגימה) ומסובבים ב-60 סל"ד על השייקר בעדינות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר טיפול זה, חלקי הרקמה מתבהרים (איור 2B).
  12. הרכיבו את הרקמות המנוקות על המגלשה, הקיפו את הרקמות עם ספייסר, והדביקו את הפער עם ריאגנט לניקוי רקמות טריות וכיסויים.

3. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 בעקבות הגישה המקובלת

הערה: לשם השוואה, אותה צביעה בוצעה על חתכי רקמה בעובי של 30 מיקרומטר בעקבות טכניקות קונבנציונליות.

  1. פורסים את חלקי הרקמה ב-30 מיקרומטר על מיקרוטום בכיוון הרוחבי ומרכיבים אותם על המגלשה.
  2. הוסיפו תמיסת חסימה עם סרום חמורים תקין של 3% ו-0.3% Triton X-100 ב-0.1 M PB ודגמו את החלקים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את תמיסת החסימה ודגדג את החלקים עם התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכבר (1:500) ונוגדן פוליקלונלי נגד LYVE1 של כבשים (1:500) במאגר דילול לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, שטפו את חלקי הרקמות עם 0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, הוסיפו את התמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) על החלקים ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. לפני תצפית מיקרוסקופית, שטפו את החלקים ב-0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, ואז כסו אותם בכיסויים ב-50% גליצרין.

4. הדמיה וניתוחים

  1. שימו לב לדגימות המוכתמות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולאחר מכן צלמו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
  2. צלם 30 תמונות (Z-stacks), כל אחת במסגרות של 10 מיקרומטר, מכל מקטע בעובי 300 מיקרומטר ושלב תמונה אחת ממוקדת באמצעות מעבד תמונה של מערכת המיקרוסקופיה הקונפוקלית (ראו טבלת חומרים).
    1. בצע את השלבים הבאים בתוכנת עיבוד התמונה של ההגדרה הקונפוקלית לניתוח תלת-ממדי (תלת-ממדי): הגדר מישור מוקד התחלה | הגדרת מישור מוקד קצה | הגדרת גודל שלב | בחר תבנית עומק | לכידת תמונה | סדרת Z.
      הערה: אורכי הגל של העירור והפליטה של אותות פלואורסצנטיים כחולים היו 401 ננומטר ו-421 ננומטר, בהתאמה. אורכי הגל של עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים ירוקים היו 499 ננומטר ו-519 ננומטר, בהתאמה. אורכי גל עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים אדומים היו 591 ננומטר ו-618 ננומטר, בהתאמה. 152 μm הוא קוטר חור הסיכה הקונפוקלי (עדשה אובייקטיבית פי 10, NA: 0.4). רזולוציית לכידת התמונה הייתה 1024 × 1024 פיקסלים.
  3. עבור הדגימות הקונבנציונליות (שלב 3), צלם 30 תמונות (Z-stacks) במסגרות של 1 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 30 מיקרומטר והתייחס עוד יותר לתמונות אלה כאמור לעיל (שלבים 4.1-4.2).
  4. הדגימו את התמונות בתבנית של שחזור תלת-ממדי באמצעות מערכת עיבוד התמונה.
  5. בצע שחזורים תלת-ממדיים על-ידי ייבוא תמונות קונפוקליות של Z-stack לתוך Imaris 9.0 (תוכנת הדמיית תאים, ראה טבלת חומרים) וצור עיבודי משטח המבוססים על עוצמות כתמים: הוסף משטחים חדשים | בחר את ערוץ המקור | קביעת הפרמטרים באפשרות החלקה של Surfaces Detail | קביעת הפרמטרים באפשרות הסף של עוצמה מוחלטת | סיווג משטחים | סיום.
  6. קבל נתונים בשטח הפנים של סיבי עצב חיוביים באמצעות תוכנת הדמיית התאים. בחר את התמונה המעובדת | סטטיסטיקה | | מפורט ערכים ספציפיים | נפח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר צביעה פלואורסצנטית משולשת, סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1, בהתאמה, בעור השעיר והזוהר (איור 3,4). עם הטיפול המנקה, סיבי העצב החיוביים ל-CGRP, כלי הדם החיוביים לפאלואידין וכלי הלימפה החיוביים ל-LYVE1 ניתנים לדמיון בעומק רב יותר כדי לקבל את המידע המבני המלא של העור (איור 3). כאשר מבני רקמות אלה שוחזרו עוד יותר בתבנית תלת-ממדית, תפוצתם נעשתה קלה יותר לאיתור. הודגם כי סיבי העצב החיוביים ל-CGRP עברו דרך הרקמה התת-עורית והדרמיס אל האפידרמיס. סיבי העצב האלה רצו בצרורות ברקמה התת-עורית, הסתעפו בתוך הדרמיס, והסתיימו באפידרמיס (איור 3). לעומת זאת, כלי דם חיוביים לפאלואידין וכלי הלימפה החיוביים ל-LYVE1 מופצים ברקמה התת-עורית ובדרמיס (איור 3). באופן כללי, סיבי העצב החיוביים ל-CGRP פעלו במקביל או הקיפו את כלי הדם וכלי הלימפה, ויצרו רשת תלת-ממדית בעור השעיר והזוהר.

בגישה המקובלת, למרות שסיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה סומנו בבירור ב-CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 בקטעים הדקים, התצפית על המבנים האלה מוגבלת על ידי עובי הפרוסה ולא ניתן לצפות בה לחלוטין (איור 4). טכניקת ההדמיה עיבדה תמונות מעמיקות עבור כל פריט אובייקט מאותות פלואורסצנטיים חיוביים שונים. לאחר יצירת התמונה, שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים CGRP נרכש באמצעות תוכנת Imaris. בחלק עם עובי של 30 מיקרומטר, לא היה הבדל בין עור שעיר לעור גלברוס באזור הפנים של סיבי עצב חיוביים ל-CGRP. בקטעי הרקמה בעובי של 300 מיקרומטר, בהשוואה לעור שעיר, שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים ל-CGRP של עור גלברוס הוגדל באופן משמעותי (*P < 0.05, בדיקה לא-פרמטרית של Kruskal-Wallis, n = 3, איור 5). לכן, כדי להשוות את שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים במדויק, החלק המנוקה של 300 מיקרומטר טוב יותר מהקטע המסורתי של 30 מיקרומטר. לשם השוואה, ניתן לרכוש יותר הזדמנויות לתמונה תלת-ממדית אידיאלית מקטע הרקמה העבה עם טיפול הסליקה מאשר בקטע הדק הקונבנציונלי.

Figure 1
איור 1: תצלומים של כלים ניסיוניים ושלבי מפתח במחקר. (B) המשאבה לזלוף. (C) דפנות פלנטריות וגבותיות של כף אחורית לאחר זלוף. (ד) עורות הסוליה והדורסום הוסרו מהכף האחורית. (E) רקמות עור גזומות. (ו,ז) רקמות עור רכובות עם 2% אגרוז ב-37 מעלות צלזיוס ו-4 מעלות צלזיוס (H) מיקרוטום ויברטורי. (I) רקמות עור קבועות על תומך החיתוך. (J) הגדרת פרמטרים לחיתוך. (יא) תהליך החיתוך. (L) עובים של מקטעים מייצגים הוא 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הליך צביעה פלואורסצנטי וניקוי רקמת העור. (B) מבטים חיצוניים על רקמת העור לפני ואחרי הטיפול בפינוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קורלציה מרחבית של סיבי עצב, כלי דם וכלי דם לימפתיים בעקבות טיפול בפינוי רקמות בחלק העור העבה. (A,B) תמונות מייצגות של החלק העבה של העור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה מראות את התפלגות סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור הגלברוס (A) והשעיר (B). (א1-א3) לוח A הוצג בנפרד עם תיוג CGRP (A1), תיוג Pha (A2) ותיוג LYVE1 (A3). (א4,א5; ב1,ב2) הלוחות (A) ו- (B) הותאמו בתבנית תלת-ממדית והוצגו עם התצוגות הקדמיות (A4,B1) והאחוריות (A5,B2), בהתאמה. אותו סרגל קנה מידה עבור כל הפאנלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מתאם מרחבי של סיבי עצב, כלי דם וכלי הלימפה בחלק העור הדק עם הגישה הקונבנציונלית. (A,B) תמונות מייצגות של החלק העבה של העור הכפי והגבי של rat hindfoot מראות את התפלגות סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור הגלברוס (A) והשעיר (B). (א1,א2; B1,B2): לוחות (A) ו- (B) הותאמו בתבנית תלת-ממדית והוצגו עם התצוגות הקדמיות (A1,B1) והאחוריות (A2,B2), בהתאמה. אותו סרגל קנה מידה עבור כל הפאנלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: היסטוגרמה המציגה את שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים ל-CGRP בעור שעיר וגלברוסי. (B) בחלק בעובי של 300 מיקרומטר, בהשוואה לעור שעיר, שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים ל-CGRP של עור גלברוס הוגדל באופן משמעותי (*P < 0.05, n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המחקר הנוכחי מספק הדגמה מפורטת של סיבי העצב העוריים בעור השעיר והזוהר על ידי שימוש באימונופלואורסצנציה על חלקי רקמות עבים יותר עם טיפול ניקוי ותצוגה תלת-ממדית כדי להבין טוב יותר את העצבנות של העור. זמן הדגירה של הנוגדנים של עד 1-2 ימים ותהליך ניקוי לילה חשובים. שני שלבים מרכזיים אלה משפיעים ישירות על אפקט הכתם החיסוני של חתכים עבים. בעיה נוספת הועלתה מבחירת הנוגדנים, שלא כולם מתאימים למקטעים עבים. אנו משערים כי נוגדנים עם משקלים מולקולריים קטנים יותר עשויים להיות אידיאליים להכתמת אימונופלואורסצנציה של חתכים עבים. לפיכך, הקושי בבחירת נוגדנים הוא מגבלה מרכזית של גישה זו. העבודה הנוכחית ראתה את ההבדלים בהתפלגות כלי הדם, כלי הלימפה והעצבים על עור שעיר וחסר שיער של חולדות. עבור בני אדם, מבנה העור שונה מאוד מזה של מכרסמים; אנו מצפים להשתמש בטכנולוגיית ניקוי רקמות כדי להתבונן ולחקור את העור האנושי בשלב הבא.

מחקרים קודמים עשו מאמצים רבים לחשוף סיבי עצב עוריים 4,5,6,7,8. בניגוד למחקר הקונבנציונלי של מקטעי הרקמות, טכניקות ניקוי רקמות הכוללות CUBIC, CLARITY ו-vDISCO שימשו באופן נרחב לחקר איברים שלמים וגוף שלם של בעלי חיים בשנים האחרונות 16,17,18,19. בדרך כלל, קשה לעקוב אחר סיבי העצב העוריים עם מבנה ארוך ושלם בחלק הדק 4,5,6,7,8; באופן השוואתי, טיפול בפינוי רקמות על המדגם הגדול יכול להימשך זמן רב 16,17,18,19. בהתחשב ביתרונותיהם ובחסרונותיהם, הפרוטוקול הנוכחי הוא בחירה נכונה לבחינת המבנה המפורט של סיבי העצב העוריים בתוך החלק העבה שטופל בשקיפות, שנוח לצפייה ולתיעוד תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית רגילה. תוך שימוש בגישה זו, ניתן להבחין בסיבי עצב עוריים ארוכים יותר בתוך החלק העבה בהשוואה לחלק הדק, ולחסוך זמן ניסוי לטיפול ברקמות בהשוואה לדגימות הגדולות עם ניקוי רקמות.

במחקר זה, סיבי העצב העוריים סומנו עם CGRP. סוגים אלה של סיבי עצב שייכים לסיבים חושיים C ו- Aδ, וממלאים את התפקיד של הובלת אותות nociceptive ומודולציה של vasodilatation12,13. מאחר שסיבי עצב חיוביים ל-CGRP ממוקמים קרוב לכלי הדם ולכלי הלימפה בשכבה התת-עורית, הוצע גם להשתתף בריפוי פצעים על ידי שיפור אנגיוגנזה ולימפנגיוגנזה20,21. בדומה למחקרים קודמים 14,20,21,22, פאלואידין התבטא מאוד בכלי הדם בניסוי זה של תיוג משולש. בנוסף, LYVE1 הוא גליקופרוטאין ממברנה אינטגרלית והוא משמש למעשה כסמן ביולוגי למיון תאי אנדותל לימפתיים עוריים של חולדות 15,23,24. תוך ניצול ההכתמה הפלואורסצנטית המשולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1, יחד עם טכניקת ניקוי הרקמה, מוצגת תמונה ברזולוציה גבוהה לתובנה טובה יותר על רשת סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור השעיר והזוהר.

יש לציין כי רק סיבי העצב החיוביים ל- CGRP הודגמו במחקר זה. מלבד סוג זה של סיבי עצב חושיים, פרוטוקול זה עשוי להתאים גם לבחינת סוגים אחרים של סיבי עצב עוריים עם הנוגדנים המתאימים. בנוסף, מכיוון שפאלואידין מתבטא מאוד במרכיב הציטוסקטלי בתאי שרירים ואנדותל חלקים 21,22,25, מלבד כלי הדם, רקמות השרירים והאפידרמיס סומנו גם עם פאלואידין. עם זאת, על פי המאפיין המורפולוגי, לא קשה לזהות כלי דם מסוג אחר של רקמות.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי בוחן ביעילות את העצבנות של העור השעיר והזוהר על חלקים עבים יותר על ידי שימוש בשילוב של אימונופלואורסצנציה עם טיפול סליקה. מנקודת המבט המתודולוגית, יהיה זה יתרון לחקור את הסוגים האחרים של סיבי עצב עוריים ואת המתאם המרחבי שלהם עם כלי הדם וכלי הלימפה בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הסינית לחדשנות במדעי הרפואה של סין (קוד פרויקט מס'. CI2021A03404) והקרן הלאומית הלאומית לחדשנות בין-תחומית ברפואה סינית מסורתית (קוד פרויקט מס' ZYYCXTD-D-202202).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate-buffered saline Solarbio Life Sciences P1020 pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol Sigma Life Science T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy Olympus Corporation Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 Abcam plc. ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 Abcam plc. ab175676
EP tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001 1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system Leica Biosystems CM1860
Imaris Software Oxford Instruments v.9.0.1
IRIS standard scissor WPI (World Precision Instruments Inc.) 503242
iSpacer SunJin Lab co. IS005
Micro forceps-Str RWD F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody Santa cruz biotechnology, Inc. sc-57053
Neutral buffered Formalin Solarbio Life Sciences G2161 10%
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 mL
Peristaltic pump Longer Precision Pump Co., Ltd BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A12381
RapiClear 1.52 solution SunJin Lab co. RC152001 10 mL
Regular agarose Gene Company Limited G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str RWD F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody R&D Systems, Inc. AF7939
Six-well plate Corning Incorporated 3335
Sodium azide Sigma Life Science S2002 25 g
Sucrose Sigma Life Science V900116 500 g
Super Glue Henkel AG & Co. Pattex 502
Surgical Handles RWD S32003-12
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 mL
Urethane Sigma Life Science U2500 500 g
VANNAS spring scissors RWD S1014-12
Vibratory microtome Leica Biosystems VT1200S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 183 עצבנות העור פפטיד הקשור לגנים של קלציטונין סיבי עצב חושיים כלי הלימפה כלי הדם טכניקת ניקוי רקמות
הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X., Cao, W., Shi, J., Zhang,… More

Wang, X., Cao, W., Shi, J., Zhang, X., Qu, Z., Xu, D., Wan, H., Su, Y., He, W., Jing, X., Bai, W. Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches. J. Vis. Exp. (183), e63807, doi:10.3791/63807 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter